DNA-sõltuv proteiinkinaasi katalüütiline alaühik (DNA-PKcs) soodustab kroonilise neeruhaiguse progresseerumist isastel hiirtel

Neeruvigastusalgatab epiteeli dediferentseerumise ja müoÜhendusbroblasti aktiveerimine ajalkroonilise neeruhaiguse progresseerumine. Siin meieÜhendusja et DNA-PKcs ekspressioon on märkimisväärneÜhendusaastal järsult suurenenudmõlema kroonilise neeruhaiguse neerukudedpatsientidel ja isastel hiirtelpõhjustatud ühepoolsest kusejuha obstruktsioonistjaühepoolne isheemia-reperfusioonikahjustus. In vivo DNA-PKcs-de väljalülitamine või töötlemine selle spetsiifigaÜhendusc inhibiitor NU7441 takistabkroonilise neeruhaiguse arengisastel hiirtel. In vitro DNA-PKcs deÜhendussäilib epiteelirakkude fenotüüp ja pärsibfikasvufaktor-beeta 1 transformeerimisega indutseeritud broblasti aktivatsioon. Lisaks näitavad meie tulemused, et TAF7 kui DNA-PKcs võimalik substraat suurendab mTORC1 aktivatsiooni, reguleerides RAPTOR ekspressiooni, mis seejärel soodustab metaboolset ümberprogrammeerimist vigastatud epiteelirakkudes ja müoosÜhendusbroblastid. Kokkuvõttes saab DNA-PKcs-d inhibeerida, et parandada metaboolset ümberprogrammeerimist TAF7 / mTORC1 signaaliülekande kaudu.krooniline neeruhaigusja olla ravi potentsiaalseks sihtmärgikskrooniline neeruhaigus. 

TŠISTANŠI TAIMSE VALMISTAMISE TEADMISEKS KLÕPSAKE SIIAKROONILINE NEERUHAIGUS

Krooniline neeruhaigus(CKD) mõjutab 10% täiskasvanutest kogu maailmas1. Krooniline neeruhaigus kujutab ülemaailmsele rahvatervisele tohutut koormust, kuna selle progresseerumise tõenäosus on suurlõppstaadiumis neeruhaigus(ESRD), mis nõuab dialüüsi või neerusiirdamist1,2. Neerude interstitsiaalne fibroos on CKD2–4 üks peamisi patoloogilisi tunnuseid. Paljusid neerufibroosi patofüsioloogilisi tunnuseid jagavad teised fibrootilised haigused, nagu maksatsirroos ja kardiomüopaatiad5. Kroonilise neeruhaiguse jaoks puuduvad tõhusad ravimeetodid, mis rõhutab tungivat vajadust patoloogiliste mehhanismide paremaks mõistmiseksaluseks olev krooniline neeruhaigus.

Vigastatud neerudes hõlmab interstitsiaalne fibroos profibrootiliste tegurite, nagu transformeeriv kasvufaktor-beeta 1 (TGF- 1), epiteeli dediferentseerumine ja müofibroblastide aktivatsioon2, ebanormaalset ekspressiooni. Interstitsiaalse fibroosi peamise vahendajana ei aktiveeri TGF- 1 mitte ainult fibrootiliste geenide, sealhulgas silelihase aktiini (-SMA), fibronektiini (FN) ja kollageenide ekspressiooni, vaid soodustab ka Warburgi efekti sarnast metaboolset ümberprogrammeerimist. neerurakud 6,7. Hiljuti on ilmnenud tõendid näidanud seost metaboolse düsregulatsiooni ja interstitsiaalse fibroosi vahel, mis näitab, et metaboolne ümberprogrammeerimine toimub neerurakkudes (neerutuubulite epiteelirakud 8, 9 ja müofibroblastid 10) neerukahjustuse ajal ja aitab kaasa kroonilise neeruhaiguse arengule. Metaboolne ümberprogrammeerimine neerurakkudes põhjustab rasvhapete oksüdatsiooni (FAO) drastilist vähenemist ja metaboolset nihet glükolüüsile, aidates kaasa immuunrakkude infiltratsioonile ja interstitsiaalsele fibroosile 7, 11, 12. Lisaks on kliinilised andmed näidanud, et ainevahetus- ja põletikuteed on kroonilise neeruhaigusega patsientidel reguleerimata7. FAO taastamine või glükolüüsi inhibeerimine geneetiliste või farmakoloogiliste meetodite abil nõrgendab fibroosi mitmesugustes neerufibroosi loommudelites 11, 13–15.

Metaboolse ümberprogrammeerimise molekulaarsetes mehhanismides toimib rapamütsiini (mTOR), mis on tsütoplasmaatiline seriini / treoniini proteiinkinaas, imetaja sihtmärk rakkude metabolismi moduleerimiseks ja metaboolse homöostaasi säilitamiseks16, 17. MTOR-i kaks erinevat funktsionaalset kompleksi on määratletud selle siduvate valkude järgi. MTOR-kompleks 1 (mTORC1) interakteerub oma spetsiifilise regulaatoriga RAP TOR ja on tundlik rapamütsiini suhtes18,19. mTOR kompleksi 2 (mTORC2) reguleerib RICTOR20. Krooniline mTORC1 aktiveerimine soodustab metaboolset ümberprogrammeerimist mitmesugustes patoloogilistes seisundites, sealhulgas neerude interstitsiaalses fibroos 9, 21–23, kuid seda aktiveerimist reguleerivad mehhanismid, eriti interstitsiaalse fibroosi korral, jäävad suuresti teadmata.

DNA-sõltuv proteiinkinaas (DNA-PK), trimeerne kompleks, mis koosneb katalüütilisest subühikust (DNA-PKcs) ja Ku70/80 heterodimeerist, aktiveeritakse DNA kaheahelaliste katkestuste (DSB) 24, 25 või ROS26 abil. DNA-PK hästi tuntud funktsioon on mittehomoloogse otsühenduse (NHEJ) vahendamine, mis ühendab V (D) J rekombinatsiooni käigus loodud programmeeritud DSB-sid ja mängib võtmerolli lümfotsüütide rekombinatsioonis25. Selle tulemusena peatavad mutatsioonid DNA-PKcs-s T- ja B-lümfotsüütide arengu V (D) J rekombinatsiooni puudulikkuse tõttu27, 28. Siiski ei ilmnenud kasvupeetust ega T-rakulise lümfoomi arengu kõrget sagedust DNA-PKcs knock-out hiirtel28. Kuigi tegemist on DNA DSB-sensoriga, on DNA-PKcs-l mõned ebatavalised omadused, näiteks akumuleerumine rakkudes tasemeni, mis ületab NHEJ29 jaoks tõenäoliselt vajalikku. Lisaks paiknevad DNA-PKcs nii tuumas kui ka tsütoplasmas30. Kooskõlas selle ebatavaliste omadustega näitavad hiljutised tõendid, et DNA-PKcs-l on lisaks NHEJ31-le ka muid funktsioone. Näiteks DNA-PKcs-vahendatud transkriptsioonifaktori USF-1 fosforüülimine soodustab insuliini poolt indutseeritud rasvhapete sünteesi32 ja DNA-PKcs soodustab metaboolset langust vananemise ajal33. DNA PKcs-i mitte-NHEJ-funktsioonide, nagu ainevahetus ja vananemine, uurimine on just alanud ja mitmed küsimused on vastuseta31. Lisaks leiti, et DNA-PK reguleerib ühe fosfoinositiidi 3-kinaasiga (PI3K) seotud kinaasidest mTOR aktivatsiooni34.

Selles töös näitavad meie tulemused, et DNA-PKcs vahendab RAPTOR / mTORC1 signaaliülekande aktiveerimist TATA-kastiga seonduva valguga seotud faktori 7 (TAF7) fosforüülimise kaudu CKD-s. DNA-PKcs inhibeerimine korrigeerib metaboolset ümberprogrammeerimist kahjustatud epiteelirakkudes ja müofibroblastides kroonilise neeruhaiguse korral. DNA-PKcs võib olla CKD ravi uus potentsiaalne sihtmärk.

Tulemused

DNA-PKcs on suurenenud kroonilise neeruhaigusega patsientide ja neerufibroosiga hiirte neerudes

DNA-PKcs aktiivsust analüüsiti S2056 autofosforüülimise immunohistokeemilise värvimisega DNA-PKcs-s (p-DNA-PKcs) tervetes ja kroonilise neeruhaigusega inimese neerukudedes. Nefrektoomia proovide mittekasvajalisi osi kasutati "tervete" neerukudedena, mis koguti neerurakulise kartsinoomiga patsientidelt. Tulemused näitasid, et p-DNA-PKcs oli nendes normaalsetes neerukudedes peaaegu tuvastamatu, kuid p-DNA-PKcs valgu tase tõusis märkimisväärselt kroonilise neeruhaigusega inimese neerukudedes (joonis 1a). DNA-PKcs aktiivsuse ja neerufibroosi olulisuse määramiseks in vivo analüüsiti immunohistokeemilise värvimise teel fibronektiini (FN), mis on neerufibroosiga seotud oluline geen, ekspressiooni ning interstitsiaalse fibroosi astme analüüsimiseks viidi läbi ka värvimine Sirius punasega. kroonilise neeruhaigusega patsientidel (joonis 1a). Meie tulemused näitasid positiivset seost p-DNA-PKcs valgu taseme ja interstitsiaalse fibroosi astme vahel (P=0.005, joonised 1b, c). Lisaks analüüsiti DNA-PKcs ekspressioonitasemeid ka varem avaldatud inimese CKD mikrokiibi andmekogumite (Nephroseq) abil. Leidsime, et DNA-PKcs mRNA tasemed suurenesid 48 kroonilise neeruhaigusega patsiendi neerubiopsia kudedes märkimisväärselt rohkem kui 1{20}} korda võrreldes kontrollidega (täiendav joonis 1a), mis näitab olulist positiivset korrelatsiooni kahjustuse astmega. neerufibroosiga patsientidel (täiendav joonis 1b). Lisaks näitasid p-DNA-PKcs-de immunofluorestsents-koosvärvimise tulemused Lotus tetragonolobus lektiiniga (LTL) (neerutuubulite marker) või -SMA-ga (müofibroblastide marker), et DNA-PKcs oli ülesreguleeritud nii tubulaarsetes epiteelirakkudes kui ka kroonilise neeruhaigusega patsientide neerukudede müofibroblastid (joonis 1d, e). Saadaoleva veebipõhise neeru üherakulise RNA järjestuse andmebaasi (http://humphreyslab.com/SingleCell/) analüüs näitas, et DNA-PKcs mRNA ekspresseeriti laialdaselt neerurakkudes ja reguleeriti inimese diabeediga neerudes võrreldes kontrollneerudega (täiendav joonis 1). 1c).

DNA-PKcs aktiivsuse ja neerufibroosi arengu vahelise seose edasiseks kindlakstegemiseks uurisime järgmisena DNA-PKcs ekspressiooni ja aktiivsust kahes neerufibroosi hiiremudelis, ühepoolses ureetra obstruktsioonis (UUO) ja ühepoolses isheemia-reperfusioonis (UIR). p-DNA-PKcs immunohistokeemiline värvimine näitas, et p-DNA PKcs indutseeriti 3. päeval märgatavalt võrreldes UUO mudeli võltskontrollidega ja p-DNA-PKcs valgu tase tõusis veelgi, kuna 3. päevast tekkis neerufibroos. 14 (joonis 1f). Western blot ja qRT-PCR tulemused näitasid, et ka DNA-PKcs koguvalgu ja mRNA tase oli UUO hiirte neerukudedes oluliselt ülesreguleeritud võrreldes võltskontrollidega (joonis 1g ja täiendav joonis 1e). Sarnaseid tulemusi täheldati ka UIR-hiirtel (joonis 1h ja täiendav joonis 1d, f). Võimalik seos DNA-PKcs ja CKD vahel ajendas meid täiendavalt uurima DNA PKcs rolli ja mehaanilisi mõjusid CKD-s.

DNA-PKcs-vahendatud CKD progresseerumine hiirtel

Järgmisena lõime DNA-PKcs knockout hiired, kellel DNA-PKcs kodeeritud geen Prkdc koputati välja, kasutades CRISPR/cas9, nagu on kirjeldatud meetodites (täiendav joonis 2a). DNA-PKcs heterosügootsed (+/-) ja homosügootsed (-/-) knockout ja metsiktüüpi (WT) hiired eristati genotüpiseerimisega, nagu on näidatud täiendaval joonisel 2a. Prkdc mRNA-d (täiendav joonis 2c) ja DNA-PKcs valgu taset (joonis 2e) DNA-PKcs-/- hiirte neerukudedes ei tuvastatud, mis näitab DNA-PKcs edukat väljalülitamist hiirtel. DNA-PKcs knockout strateegia mõju hindamiseks neerukahjustusele ja fibroosile viidi täiskasvanud (6–8 nädala vanused) DNA-PKcs-/- ja WT kontrollrühma isased hiired UUO-le ja surmati 7 päeva pärast operatsiooni. PAS-i värvimine näitas, et UUO poolt indutseeritud tubulaarse atroofia ja dilatatsiooni aste oli DNA-PKcs-/- hiirtel WT kontrollidega võrreldes märgatavalt paranenud (joonis 2a). Neerufibroos paranes oluliselt ka DNA-PKcs-/- hiirtel võrreldes WT hiirtega, nagu täheldati ja kvantifitseeriti Massoni värvimisega (joonis 2b). Interstitsiaalse kollageeni I ladestumise ja -SMA immuunmärgistuse pildid näitasid, et mõlemad klassikalised profibrootilised markerid vähenesid oluliselt DNA-PKcs-/- hiirte UUO neerudes võrreldes WT kontrollidega (joonis 2c, d). Profibrootiliste markerite, sealhulgas FN ja -SMA valgu tase vähenes samuti oluliselt DNA-PKcs-/- hiirte UUO neerudes, mida analüüsiti Western blot meetodil (joonis 2e). QRT-PCR analüüs näitas, et DNA-PKcs väljatõrjumine hiirtel vähendas märkimisväärselt oluliste neerufibroosi geenide, sealhulgas Col1a1, Col3a1, Fn1 ja Acta2 ekspressioonitaset, mis olid UUO neerudes oluliselt ülesreguleeritud. Kooskõlas vähenenud fibroosiga vähendas DNA PKcs knockout ka UUO poolt indutseeritud neerukahjustuse markeri KIM{36}} mRNA taset (täiendav joonis 2c). Lisaks on põletik neerufibroosi peamine tunnus ja sellel on oluline roll neerufibroosi patogeneesis. Seega analüüsisime qRT-PCR abil põletikuga seotud markereid, sealhulgas tsütokiine Il1, Il6, Tnf ja Mcp1. UUO mudelis leidsime, et UUO poolt indutseeritud põletikuliste tsütokiinide ülesreguleerimine vähenes märkimisväärselt DNA-PKcs väljalangemise tõttu (täiendav joonis 2c). Kuna nii kliinilistes uuringutes kui ka loommudelites ilmneb tugev korrelatsioon makrofaagide ja neerufibroosi ulatuse vahel, hinnati UUU-neerukudedesse infiltreerunud makrofaage makrofaagimarkeri F4/80 immunohistokeemilise värvimisega. Piltidel ilmnes 7 päeva pärast UUO-d WT hiirte ummistunud neerudes palju infiltreerunud makrofaage, mida DNA-PKcs väljatõrjumine märkimisväärselt vähendas (joonis 2f). Huvitav, DNA-PKcs

Neerutuubulaarsete DNA-PKcs-de mõju edasiseks hindamiseks neerufibroosile konstrueerisime CRISPR/cas9 knockin-hiirte abil in vivo spetsiifilise DNA-PKcs-i väljalülitusega proksimaalse neerutuubulaarse epiteeliraku (täiendav joonis 2e, f). Pärast adeno-assotsieerunud viiruse (AAV) subkapsulaarset süstimist, mis sisaldas DNA-PKcs jaoks juht-RNA-d (gRNA), tehti proksimaalsetele neerutuubulite spetsiifilistele DNA-PKcs knockout hiirtele UUO ja eutaniseeriti 7 päeva pärast operatsiooni. DNA-PKcs-de immunofluorestsentsvärvimine näitas DNA-PKcs-de puudumist neerutorukeste rakkudes (joonis 2h), kuid see ekspressioon oli siiski AAV-gRNA-ga süstitud cas9 hiirte -SMA-positiivsetes müofibroblastides (täiendav joonis 2g), võrreldes need cas9 hiirtel, kellele süstiti DNA PKcs jaoks ilma gRNAta AAV-d. Western blot analüüs näitas, et DNA PKcs ja profibrootiliste markerite, sealhulgas FN ja -SMA valgu tase vähenes oluliselt ka AAV-sgRNA-ga süstitud cas9 hiirte UUO neerudes võrreldes kontrollrühma omadega (joonis 2g). . Sarnaselt UUO mudeliga olid DNA-PKcs knockout hiired kaitstud ka UIR-indutseeritud CKD eest (täiendav joonis 2h-m). Need tulemused näitavad koos, et DNA-PKcs deletsioon nõrgendab CKD progresseerumist hiirtel.

Et teha kindlaks, kas DNA-PKcs üleekspressioon neerus on piisav neerufibroosi tekitamiseks, viidi inimese DNA-PKcs üleekspressiooniplasmiidid (Addgene: 83317) hiire neerudesse sabaveeni kõrgsurve süstimismeetodi kaudu, nagu on kirjeldatud mitmes varasemas uuringus36. 36 tundi pärast DNA-PKcs plasmiidi süstimist tehti hiirtele UUO operatsioon 7 päeva jooksul. Kokkuvõttes näitavad meie tulemused, et inimese DNA-PKcs ektoopiline ekspressioon on piisav neerufibroosi progresseerumiseks in vivo (täiendav joonis 3).

DNA-PKcs aktiivsuse pärssimine nõrgendab CKD arengut hiirtel

Need leiud panid meid kaaluma võimalust, et DNA PKcs inhibiitoreid saab kasutada neerufibroosi eest kaitsmiseks. Meie hüpoteesi testimiseks raviti täiskasvanud (6–8 nädala vanuseid) WT isaseid hiiri iga päev väga spetsiifilise DNA-PKcs inhibiitoriga NU7441, alustades 1 päev pärast UUO operatsiooni. NU7441--ga töödeldud ja kontrollhiired surmati 7 päeva pärast UUO operatsiooni ning DNA-PKcs aktiivsust analüüsiti immunohistokeemilise värvimise teel ning tulemused näitasid, et ravi NU7441-ga inhibeeris märkimisväärselt DNA-PKcs aktivatsiooni UUO neerukudedes ( joonis 3a). UUO poolt indutseeritud tubulaarse atroofia ja dilatatsiooni aste paranes oluliselt pärast töötlemist NU7441-ga võrreldes vehiikuli kontrolliga, nagu näitas PAS-i värvimine (joonis 3b). Massoni värvimise histopatoloogilised analüüsid näitasid, et NU7441--ga töödeldud hiirte obstruktiivne (UUO) neerudes vähenes neerude interstitsiaalne fibroos ligikaudu 50% võrreldes vehiikli kontrolliga UUO neerudega (joonis 3c). Immunofluorestsentsvärvimise pildid näitasid, et UUO poolt indutseeritud interstitsiaalse kollageeni I ladestumist vähendas NU7441-ga töötlemine märkimisväärselt (joonis 3e). Profibrootiliste markerite, sealhulgas FN ja -SMA valgutasemed, mida analüüsiti Western blot meetodil, vähenesid samuti oluliselt NU7441--ga ravitud hiirte UUO neerudes võrreldes vehiikli kontrollidega (joonis 3f). QRT-PCR analüüs näitas, et NU7441 ravi vähendas märkimisväärselt oluliste neerufibroosi geenide, sealhulgas Col1a1, Col3a1, Fn1 ja Acta2 ekspressioonitaset UUO hiirte neerukudedes võrreldes vehiikli kontrollidega (täiendav joonis 4a). Lisaks vähenes pärast NU7441-ga töötlemist oluliselt makrofaagide infiltratsioon UUO hiirte neerukudedesse võrreldes vehiikli kontrollidega (joonis 3d). NU7441 vähendas ka põletikuga seotud markerite, sealhulgas tsütokiinide Il1, Il6, Tnf ja Mcp1 ekspressioonitaset UUO hiirte neerukudedes, nagu analüüsiti qRT-PCR abil (täiendav joonis 4a). Lisaks töödeldi DNA PKcs knockout hiiri ka NU7441-ga, et uurida NU7441 võimalikku sihtmärki. Meie tulemused näitasid, et NU7441-l puudus ilmne antifibrootiline toime DNA-PKcs knockout hiirtel (joonis 3g, h), mis viitab NU7441 spetsiifilisele toimele DNA-PKcs-le selles katsekeskkonnas.

NU7441 kaitsvat toimet UUO-indutseeritud neerukahjustuse ja neerufibroosi vastu laiendati UIR-indutseeritud CKD-le. Nagu oodatud, kaitses NU7441 ravi ka UIR-indutseeritud neerukahjustuse ja fibroosi eest võrreldes vehiikuli kontrollidega (täiendav joonis 4b – h). Need tulemused näitavad koos, et DNA-PKcs aktiivsuse pärssimine NU7441 poolt nõrgendab CKD progresseerumist hiirtel.

Joonis 3|DNA-PKcs aktiivsuse pärssimine nõrgendab CKD arengut UUO hiirtel. a p-DNA-PKcs-de immunohistokeemiline värvimine NU7441-ga (40 mg/kg) või UUO-ga (7. päev) töödeldud vehiikuliga töödeldud hiirte neerudes, skaala tulbad: 20 μm. Tulbad tähistavad kvantifitseerimise tulemusi (keskmine ± SD, n=6 hiirt igas rühmas). b NU7441-ga või UUO-le allutatud vehiikuliga töödeldud hiirte neerude PAS-värvimine, skaala ribad: 50 μm. Tulbad tähistavad kvantifitseerimise tulemusi (keskmine ± SD, n=6 hiirt igas rühmas). c NU7441-ga või UUO-le allutatud vehiikuliga töödeldud hiirte neerude Massoni värvimine, skaala tulbad: 50 μm. Tulbad tähistavad kvantifitseerimise tulemusi (keskmine ± SD, n=6 hiirt igas rühmas). d F4/80 immunohistokeemiline värvimine NU7441-ga või UUO-ga töödeldud vehiikliga hiirte neerudes, skaala tulbad: 20 μm. Tulbad tähistavad kvantifitseerimise tulemusi (keskmine ± SD, n=6 hiirt igas rühmas). e COL1A1 immunofluorestsentsvärvimine hiirte neerudes, keda on töödeldud NU7441-ga või UUO-ga vehiikuliga, skaala tulbad: 20 μm. Tulbad tähistavad kvantifitseerimise tulemusi (keskmine ± SD, n=6 hiirt igas rühmas). f FN ja -SMA valgu tase NU7441 või UUO-le allutatud vehiikuliga ravitud hiirte neerudes. Tulbad tähistavad kvantifitseerimise tulemusi (keskmine ± SD, n=6 hiirt igas rühmas). g FN ja -SMA valgu tasemed DNA-PKcs-/- või WT hiirte neerudes, keda raviti NU7441 või UUO-ga vehiikuliga. Tulbad tähistavad kvantifitseerimise tulemusi (keskmine ± SD, n=6 hiirt igas rühmas). h NU7441 või UUO-le allutatud vehiikuliga töödeldud DNA-PKcs-/- või WT hiirte neerude Sirius-punane värvimine. Tulbad tähistavad kvantifitseerimise tulemusi (keskmine ± SD, n=6 hiirt igas rühmas). A, c, e p-väärtuste määramiseks kasutati kahepoolset paaristamata t-testi. b, d, h p-väärtuste määramiseks kasutati ühesuunalist ANOVA-d, millele järgnes Tukey mitme võrdluse test. F, g p-väärtuste määramiseks kasutati kahesuunalisi ANOVA-sid, millele järgnes Šídáki mitmekordse võrdluse test. Lähteandmed esitatakse lähteandmete failina.

DNA-PKcs inhibeerimine säilitab tubulaarse epiteelirakkude fenotüübi ja reguleerib interstitsiaalset fibroblastide aktivatsiooni in vitro

Epiteeli vigastus ja müofibroblastide aktiveerimine on CKD2 patogeneesi kesksed sündmused. Immunovärvimine näitas, et p-DNAPKcs indutseeriti ilmselgelt TGF 1 stimulatsiooniga nii HK-2 rakkudes (joonis 4a) kui ka primaarsetes tubulaarsetes epiteelirakkudes (täiendav joonis 5a). Western blot'i tulemused näitasid, et TGF 1 või H2O2-ga töödeldud HK-2 rakkudes oli oluliselt ülesreguleeritud ka DNA-PKcs fosforüülimise ja koguvalgu tase (joonis 4i ja täiendav joonis 5b). Lisaks genereeriti CRISPR-Cas9 abil DNA-PKcs knockout HK-2 rakud ning kultiveeriti WT ja DNA-PKcs−/− hiire primaarseid torukujulisi epiteelirakke. DNA-PKcs knockout HK-2 rakkude edukat ehitamist kinnitas Western blot meetod (täiendav joonis 5c). Meie tulemused näitasid, et DNA-PKcs-de väljatõrjumine või DNA-PKcs-de inhibeerimine NU7441-ga parandas neeruepiteelirakkude dediferentseerumist, mida näitab FN-i ja Col1A1 tootmise madalam tase pärast kokkupuudet TGF 1-ga DNA-PKcs-i väljalülitamise või NU{27. }}töödeldud rakud (joon. 4b–d, k, l). Kuid KU80 knockout suurendas TGF 1 poolt indutseeritud FN tootmist torukujulistes epiteelirakkudes (joonis 4m). Nagu UUO mudel, ei süvendanud DNA-PKcs väljatõrjumine H2O2 poolt indutseeritud DNA katkestusi HK-2 rakkudes (täiendav joonis 5d). KU70/80 tunneb esmalt ära DNA katkised otsad DSB-s, seejärel värbab DNA-PKcs, et moodustada DNA-PK, mis on vajalik DSB parandamiseks NHEJ37 kaudu. Need tulemused näitasid, et DNA-PKcs suurendas neeruepiteelirakkude profibrootilist toimet CKD-s, sõltumata selle DSB parandamise funktsioonist.

Et uurida, kas DNA-PKcs on seotud interstitsiaalsete fibroblastide aktiveerimise ja proliferatsiooniga, kultiveeriti. Western blot'i tulemused näitasid, et TGF 1-ga töödeldud NRK-49F rakkudes oli oluliselt ülesreguleeritud ka DNA-PKcs fosforüülitud ja üldvalgu tase (joonis 4j). Immunovärvimine näitas, et DNA-PKcs aktiivsus indutseeriti märgatavalt TGF 1-ga NRK-49F-rakkudes (joonis 4e), kuid NU7441-ga töötlemine pärssis seda märkimisväärselt. NRK-49F-rakkude töötlemine TGF 1-ga kutsus esile fibroblastide aktivatsiooni ja müofibroblastide diferentseerumise koos COL1, -SMA ja FN ülesreguleerimisega, samas kui eeltöötlus NU7441-ga vähendas profibrootilist fenotüüpi oluliselt (joonis 4f, g, n). Lisaks inhibeeris ravi NU7441-ga oluliselt TGF 1 poolt indutseeritud NRK-49F-rakkude proliferatsiooni võrreldes vehiikli kontrollidega, nagu näitas EdU värvimine (joonis 4h). Kokkuvõttes näitavad need andmed, et DNA-PKcs inhibeerimine säilitab tubulaarse epiteelirakkude fenotüübi ja reguleerib TGF 1 poolt indutseeritud interstitsiaalset fibroblastide aktivatsiooni in vitro.

Lisaks uurisime ka TGF 1-indutseeritud DNA-PKcs ekspressiooni mehhanismi. Esiteks leidsime JASPAR transkriptsioonifaktori sidumisprofiilide analüüsi abil 38 DNA-PKcs promootorpiirkonnas mitu võimalikku SMAD2 sidumissaiti. Teiseks näitasid lutsiferaasi testi tulemused, et SMAD2 üleekspressioon suurendas DNA-PKcs transkriptsioonilist aktivatsiooni (täiendav joonis 5e) . Lisaks analüüsiti ka DNA-PKcs mõju SMAD signaaliülekande aktiveerimisele. Tulemused näitasid, et DNA-PKcs knockout inhibeeris UUO hiiremudelis SMAD2/SMAD3 aktivatsiooni (täiendav joonis 5f). Need tulemused näitasid, et SMAD2/SMAD3 suurendas DNA PKcs ekspressiooni, samas kui DNA-PKcs aktiveeris SMAD2/SMAD3 (täiendav joonis 5g), moodustades positiivse ahela.

Wecistanche'i tugiteenus - Hiina suurim tsistanšeksportija:

E-post:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tel:+86 15292862950

Lisateabe saamiseks ostke:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop

25% EHHINAKOSIIDI JA 9% AKTEOSIIDI NEERUTELE LOODUSLIKU ORGAANILISE KISTAŠAEKSTRAKTI SAAMISEKS KLIKI SIIA