Mineraal-orgaaniliste nanoosakeste tuvastamine ja iseloomustamine inimese neerudes

Tsui-Yin Wong^1,2,*, Cheng-Yeu Wu^1,2,3,* et al

Emakaväline lupjumine on seotud erinevate inimeste haigustega, sealhulgas ateroskleroosi, vähi,kroonilineneerudhaigusjadiabeetmellitus. Kuigi lupjunud veresoontest on leitud mineraalseid nanoosakesi, jääb nende osakeste olemus ja roll inimkehas ebaselgeks. Siin näitame esimest korda seda inimestneerudlõppstaadiumist saadud kudedkroonilineneerudhaigusvõi neeruvähiga patsiendid sisaldavad ümaraid, mitmekihilisi mineraalosakesi laiusega 50–1500 nm, samas kui tervetel kontrollidel osakesi ei täheldata. Mineraalosakesi leidub peamiselt rakuvälises maatriksis, mis ümbritseb keerdunud tuubuleid, Henle kogumiskanaleid ja -silmuseid, samuti tuubuleid piiritlevate rakkude tsütoplasmas ning koosnevad polükristallilisest kaltsiumfosfaadist, mis on sarnane luudes ja emakavälises lupjumises leiduva mineraaliga. Theneerudmineraalsed nanoosakesed sisaldavad mitmeid seerumivalke, mis pärsivad ektoopilist lupjumist kehavedelikes, sealhulgas albumiin, fetuiin-A ja apolipoproteiin A1. Kuna mineraal-orgaanilisi nanoosakesi ei leidu mitte ainult lupjunud ladestustel, vaid ka mikroskoopiliste kaltsifikatsioonideta piirkondades, näitavad meie tähelepanekud, et nanoosakesed võivad olla inimeste kaltsifikatsiooni ja neerukivide eelkäijad.

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Emakaväline lupjumine on seotud ateroskleroosi, vähi,kroonilineneerudhaigusja suhkurtõbi 1–3. Hiljutised uuringud näitavad, et ateroskleroosi jakroonilineneerudhaigusveresoonte lupjumise nähtudega patsientidel on suurenenud haigestumus- ja suremusrisk, mis viitab sellele, et emakaväline lupjumine kahjustab inimeste tervist1,3. Soovimatut lupjumist täheldatakse ka vananevatel inimestel ja enamikul üle 60-aastastel inimestel on veresoonte lupjumise tunnused4. Nendel põhjustel on emakavälist lupjumist esile kutsuvate tegurite dešifreerimine ja tõhusa ravi väljatöötamine olulised eesmärgid.

Emakavälist lupjumist võib defineerida kui tasakaalustamatust organismi kaltsifikatsiooni inhibiitorite ja indutseerijate vahel. Lupjumise inhibiitorite hulka kuuluvad seerumivalgud, nagu albumiin, fetuiin-A, osteopontiin ja maatriks-GLA valk, samuti väikesed ühendid, nagu pürofosfaat, samas kui hüperfosfateemia ja põletik on peamised kaltsifikatsiooni indutseerijad5–7. Hiljutised uuringud näitavad, et kaltsifikatsiooni indutseerijad aktiveerivad rakuprotsessi, mis sarnaneb luu moodustumisega veresoonte lupjumise ajal7, 8. Lubjastunud pehmetes kudedes on tuvastatud ka maatriksvesiikuleid, mis on sarnased arenevates luudes mineraliseerumist esilekutsuvatele. Need maatriksvesiikulid vabastavad tõenäoliselt veresoonte silelihasrakud, mis diferentseeruvad osteoblastilaadseteks rakkudeks, mis kutsuvad esile lupjumise7.

Pehmetes kudedes on tuvastatud mineraalsed nanoosakesed (NP-d), millel on ektoopilise lupjumise tunnused. Price et al. leidis, et kas bisfosfonaatetidronaadi või D-vitamiiniga ravitud rottide seerum sisaldab mineraalide-valgu komplekse, mis sisaldavad kaltsifikatsiooni inhibiitoreid fetuiin-A ja maatriksi GLA valku10,11. Samamoodi on Jahnen-Dechent jt. täheldas, et kaltsifitseeriva peritoniidiga patsientide astsiidivedelikus võib tuvastada fetuiin-A-d sisaldavaid mineraalkomplekse, mida nimetati kaltsiproteiini osakesteks (CPP-d). Hiljutine Bertazzo jt uuring. näitasid mineraalsete NP-de olemasolu nii aterosklerootilise kui ka reumaatilise palavikuga patsientide aordiklappides ja koronaararterites13. Kui mineraalosakeste moodustumist käsitlevad uuringud on tavaliselt keskendunud inimese südame-veresoonkonna süsteemile, jääb ebaselgeks, kas neid osakesi võib leida ka teistest kudedest ja kas need üksused mängivad rolli tervises või haigustes.

Varem täheldasime, et mineraalid-orgaanilised NPS-id tekivad spontaanselt inimeste ja loomade kehavedelikes 14–28. Neid mineraalseid NP-sid kirjeldati algselt nanobakteritena (NB) ja arvati, et need ei ole mitte ainult väikseimad rakud maa peal29, vaid ka paljude haiguste, sealhulgas Alzheimeri tõve, ateroskleroosi, vähi,neerudkivimoodustumine, polütsüstilineneerudhaigusja prostatiit 30–32. Kuid meie tulemused on näidanud, et NB on tegelikult elutud mineraalsed NP-d, mis jäljendavad tavalisi baktereid nende morfoloogia, kasvu, proliferatsiooni ja subkultuuri poolest 15, 18, 22. Tuleb veel uurida, kas inimese kudedes võib leida nn NB-ga sarnaseid mineraalosakesi ja kas need osakesed mängivad haiguses rolli.

Käesolevas uuringus töötasime välja nanomaterjalide lähenemisviisi mineraalide-orgaaniliste NP-de tuvastamiseks ja analüüsimiseks haigetel inimestel.neerudkoed. Näitame, et lõppstaadiumis kroonilise neeruhaiguse ja neeruvähiga patsientide neerukuded sisaldavad multilamellaarseid mineraalseid NP-sid, mis on sarnased biomimeetiliste mineraalosakestega, mis in vitro kehavedelikes spontaanselt sadestuvad. Meie tulemused näitavad kriitilisi teadmisi nende mineraalide-orgaaniliste osakeste biokeemilise koostise, moodustumise mehhanismi ja bioloogilise funktsiooni kohta ning valgustavad ektoopilise lupjumise ja haiguste initsiatsiooni mehhanisme inimkehas.

Tulemused

Uurisime kroonilise neeruhaiguse lõppstaadiumis (n=2) või neeruvähiga (n=18) inimpatsientidelt kirurgiliselt eemaldatud neerukudesid; vt tabelit 1; neeruvähi proovide puhul keskendusime mitte. -koe vähiosa). Tervete kontrollidena uurisime neerubiopsiaid, mis saadi patsientidelt, kellel oli trauma või hematoom, kuid kellel ei olnud varasemat ebanormaalset neerufunktsiooni (n=2; tabel 1).

Tervete isikute neerukudedel ilmnesid normaalsed histoloogilised tunnused ja pärast von Kossa värvimist ei täheldatud ektoopilist lupjumist (joonis 1A, B). Teisest küljest näitasid haigetelt inimestelt saadud ja hematoksüliini ja eosiiniga (H&E) värvitud neerukuded koekahjustusi (joonised 2A–C, näidatud nooltega) ja 80 protsendil uuritud haigetest kudedest ilmnesid mineraliseerunud ladestused. von Kossa värvimisega (joon. 1C–T, joon. 2E, F, lupjumine on nähtav musta materjalina, mida tähistavad mustad nooled; vt ka tabel 1). Ajukoores ja medullas, sealhulgas distaalseid keerdunud tuubuleid ümbritsevas rakuvälises ruumis, proksimaalsetes keerdunud tuubulites, Henle kogumiskanalites ja -silmuses, samuti tuubuleid ja kanaleid piiritlevate rakkude tsütoplasmas märgati kaltsineeritud ladestusi (joonis 1C–T ja joonis fig. 2E, F). Neerukehas kaltsifikatsiooni ei tuvastatud (joonis 2D).

Mineraalsete sademete olemuse uurimiseks valmistasime ette üliõhukesed neerulõigud, mida saab jälgida transmissioonielektronmikroskoopia (TEM) abil. Mikroskoopilisi mineraalsademeid sisaldavates proovides tuvastati mineraalosakesed või graanulid neeruepiteelirakkude tsütoplasmas, basaalmembraani all olevas ekstratsellulaarses maatriksis ning proksimaalsete ja distaalsete keerdunud tuubulite luumenis (joonis 3A, B, osakesed on suurendatud). paneelides A1–A4 ja B1–B4). Mineraalseid NP-sid täheldati ka Henle silmuseid ja kogumistorusid vooderdavates rakkudes (joonis 3C, D, suurendatud paneelides C1, C2 ja D1). Mõned osakesed leiti neerurakkude intratsellulaarsetes vesiikulites (joonis 3A, paneelid A1 ja A2). Siin kasutatud elektronmikroskoopia meetod võimaldas visualiseerida ka mineraalosakeste sisemust; osa osakesi sisaldasid elektrontihedaid rõngaid, mis vahelduvad heledate, elektronide helendavate kihtidega (joonis 3A, paneelid A3 ja A4, joonis 3C, paneel C1). Mitmed veresooned, nagu vasa recta rents (neeru sirged arterid), on meid ümbritsetud suure hulga mineraalsete NP-dega (joonis 3D, paneel D1). Seega leiti mineraalseid NP-sid kõigis inimese neerukudedes erinevates kohtades, millel olid ektoopilise lupjumise tunnused, samas kui uuritud tervetes kontrollides osakesi ei leitud.

Neerukudedes leitud mineraalosakesed näivad olevat väga sarnased meie varasemates uuringutes 15, 17 kehavedelikes spontaanselt moodustuvate mineraal-orgaaniliste NP-dega (mida oleme nimetanud bioonideks24). Selle võimaluse kontrollimiseks valmistasime mineraalsed orgaanilised NP-d (või bioonid), kasutades sadestamismeetodit, nagu me eelnevalt kirjeldasime . See meetod seisneb sadestavate ioonide (nt kaltsiumi ja fosfaadi) lisamises rakukultuuri söötmesse (Dulbecco modifitseeritud Eagle'i sööde või DMEM), mis sisaldab kehavedelikku nagu inimese seerum (HS), millele järgneb inkubeerimine rakukultuuri tingimustes (vt meetodid). Sel viisil toodetud osakesed (HS-NPS) olid kas sfäärilised või ellipsoidsed ning neil oli sile või kristalne mineraalne pind (joonis 4A–E), mis sarnanes varem kirjeldatud osakestega kehavedelikes22,23, aga ka inimese astsiitides12 ja lupjunud arterid 13. Mineraalosakesed olid oma üldise morfoloogia, mitmekihilise struktuuri ja pinnaomaduste poolest väga sarnased neerukudedes täheldatud mineraalsete NP-de või graanulitega (joonis 4F-J). HS-st saadud osakeste ja neerugraanulite suurus olid samuti võrreldavad, varieerudes läbimõõduga 50–1500 nm (joonis 4A–E, F–J). Nagu eespool märgitud, olid mõned neerugraanulid ümbritsetud lipiidmembraaniga, mis võib-olla kujutas endast rakusiseseid lastivesiikuleid või rakuväliseid membraanivesiikuleid (joonis 4H, I, membraanid on tähistatud nooltega); sellised membraansed struktuurid puudusid in vitro valmistatud HS-NP proovides (joonis 4-E). Need tähelepanekud viitavad sellele, et neerugraanulid on sarnased seerumis kokku pandud mineralo-orgaaniliste NP-dega.

Kasutades valitud ala elektronide difraktsioonianalüüsi, täheldasime, et in vitro valmistatud HS-NP-de mineraalne faas koosnes polükristallilisest nanomaterjalist (joonis 4E, sisestus; märkige nõrgad kontsentrilised rõngad). Sarnased tulemused saadi neerugraanulite (joonis 4J, sisestus) ning luude ja emakavälise lupjumise korral, nagu on kirjeldatud varasemates uuringutes33,35.

Uurisime HS-NP-de ja neerugraanulite keemilist koostist, kasutades energiat hajutavat röntgenspektroskoopiat (EDX). HS-NP-d näitasid süsiniku (C), kaltsiumi (Ca), hapniku (O) ja fosfori (P) (joonis 4K) peamisi piike, mis on kooskõlas kaltsiumfosfaadi mineraali olemasoluga. HS-NP-des (joonis 4K) täheldati ka räni (Si) madalat tippu, mis võib-olla esindab väiksemat osakeste koostisosa. Neerugraanulites ilmnesid ka süsiniku, kaltsiumi, hapniku ja fosfori piigid, mis viitavad kaltsiumfosfaadi mineraalile, lisaks räni ja raua (Fe) piigid (joonis 4L). Uraanipiigid (U) omistati uraanüülatsetaadile, mida kasutati kontrastse reagendina proovi ettevalmistamisel (uraani olemasolu mõnes mineraalosakeste proovis, nagu neerugraanulid, ja selle puudumine kontrollkoes joonisel 4M võib olla tingitud kõrgest uraani afiinsus fosfaadi suhtes, nagu varem teatatud35). Osakesi ümbritseva neerukoe kontroll-EDX-spektrid näitasid süsiniku ja hapniku piike (joonis 4M), mis viitab sellele, et kaltsiumi ja fosforit leiti peamiselt mineraalosakestes.

Kaltsiumi ja fosfori (Ca:P) suhe HS-NP-des ja neerugraanulites varieerus vahemikus 0,65 kuni 1,18. Need suhted erinevad stöhhiomeetrilise hüdroksüapatiidi teoreetilisest väärtusest 1, 67, kuid jäävad endiselt kaltsiumfosfaadi ja apatiidi kristallide erinevatel kristalliseerumisastmetel täheldatud vahemikku. Need leiud koos kinnitavad, et neerugraanulid koosnevad kaltsiumfosfaadi NP-dest.

On leitud, et mitmesugused valgud pärsivad kehas süsteemselt emakavälist lupjumist36,37. Lisaks arvatakse, et sünteetiliste NP-de pinnalt leitud valgukoroon määrab osakeste bioloogilise jaotumise ja mõju rakkudele in vivo 38, 39. Teisest küljest on inimese neerukudedes leiduvate mineralo-orgaaniliste NP-de valgu koostis endiselt ebatäielikult mõistetav. Varem leidsime, et albumiin, fetuiin-A ja apolipoproteiin-A1 (apo-A1) esindavad peamisi valke, mis interakteeruvad kehavedelikes moodustunud mineralo-orgaaniliste NP-dega 17, 20. Siin kasutasime immunokulda märgistamist, et uurida nende valkude olemasolu ja ultrastruktuurilist asukohta neerugraanulites.

HS-NP-des ja neerugraanulites seerumivalkude olemasolu uurimiseks kasutasime inimese seerumi albumiini (HSA), inimese seerumi fetuiin-A (HSF), inimese apo-1A ja terve HS-i vastaseid polüklonaalseid antikehi. Polüklonaalsete antikehade (valmistatud nagu varem kirjeldatud25) spetsiifilisust kontrolliti Western blot analüüsiga (joonis 5). Kõik polüklonaalsed antikehad reageerisid positiivselt nii in vitro valmistatud HS-NP-dega kui ka inimese neerukudedes leitud mineraalsete graanulitega (joonis 6A, B, paneelid A1-A3 ja B1-B3; mustad punktid). Antikehad reageerisid peamiselt HS-NP-de ja neerugraanulite elektrontihedate kihtide või tumeda südamikuga (joonis 6A, B), mis näitab, et need tumedad alad võivad sisaldada kõrgemat valkude taset võrreldes elektron-lutsentsete aladega. Ilma primaarse antikehata läbiviidud negatiivsed kontrollid reaktsiooni ei andnud (joonis 6A, B, paneelid A4 ja B4, kontroll). Jõudsime järeldusele, et neerugraanulid esindavad HS-NP-dega sarnaseid mineralo-orgaanilisi NP-sid, mis põhinevad mitte ainult nende morfoloogial ja mineraalsel koostisel, vaid ka nende seondumisel seerumis esinevate peamiste kaltsifikatsiooni inhibiitoritega.

Järgmisena kasutati immunofluorestsentsmikroskoopiat, et kinnitada HSA-d ja HSF-i sisaldavate mineraalsete graanulite olemasolu haigestunud inimese neerudes. Seda tehnikat kasutades näitasid inimese neerukuded

kahe valgu positiivne värvumine erinevates piirkondades, sealhulgas neerutuubuleid ümbritsevas interstitiumis ja tuubuleid piiritlevate rakkude tsütoplasmas (joonis 7A, paneelid A1 ja A2). Nendes piirkondades täheldati ka valguagregaate, mis sisaldasid nii albumiini kui ka fetuiin-A, kuigi väiksemates kogustes võrreldes üksikute valkude värvumisega (joonis 7A ja paneel A3, ühendatud värvimine kollasega). Eelkõige märkasime, et immunofluorestsentsiga tuvastatud valgu värvumine kattub tihedalt von Kossa värvimise abil täheldatud ektoopilise lupjumise mustriga (joonis 7A, B, kaltsifikatsioon on nähtav musta materjalina, mis on näidatud nooltega punktis B). Need tulemused toetavad täiendavalt mineralo-orgaaniliste osakeste olemasolu uuritud inimese neerukudedes.

Arutelu

Kuigi sünteetiliste NP-de ja inimrakkude vastastikmõjude mõistmisel on tehtud edusamme, teame tunduvalt vähem kehavedelikes spontaanselt moodustuvate mineralo-orgaaniliste NP-de mõjust. Meie varasemad uuringud on näidanud, et need osakesed moodustuvad bioloogilistes vedelikes, kui kaltsiumi ja fosfaadi kontsentratsioonid ületavad küllastumist15,16. Samuti täheldasime, et immuunrakud sisestavad need osakesed, kuid ainult suured osakesed kutsuvad esile põletikueelseid immuunreaktsioone23. Kuid nende osakeste jaotumist inimese kudedes ja seda, kas neil on kehas füsioloogilisi või patoloogilisi rolle, pole seni uuritud.

Käesolevas uuringus tuvastasime esimest korda mineralo-orgaanilised NP-d kas lõppstaadiumis neeruhaiguse või neeruvähi all kannatavate inimpatsientide neerudes. Avastatud mineralo-orgaanilised NP-d sisaldavad halvasti kristalliseerunud kaltsiumfosfaati, mis on sarnane luu mineraaliga, samuti albumiini, fetuiin-A ja apo-A1, mis toimivad kehavedelikes süsteemsete lupjumise inhibiitoritena. Meie tulemused on kooskõlas varasemate aruannetega, mis kirjeldasid mineraal-valgu komplekside olemasolu veresoonte kudedes ja kehavedelikes 12, 13, 34, 40. Kuna meie vaadeldud osakesed leiti piirkondadest, mis ei sisaldanud mikroskoopilisi lupjumisi, viitavad meie tähelepanekud sellele, et osakesed võivad olla inimese kudedes ektoopilise lupjumise eelkäijad. Arvestades võimalust, et mineralo-orgaaniliste NP-de suurus võib järk-järgult kasvada ja läbida soodsates tingimustes osakestest kileks konversiooni, nagu on kirjeldatud meie varasemates uuringutes 15, 18, näitavad siin esitatud tähelepanekud, et mineraalsed lähteained võivad põhjustada suuremate ainete moodustumist. mineraalide ladestused in vivo, nagu Randalli naast ja neerukivid.

Meie tähelepanekud, et neerude erinevates anatoomilistes struktuurides leidub mineraalseid emakaväliseid kaltsifikatsioone ja mineraloorgaanilisi NP-sid, on kooskõlas varasemate leidudega ektoopiliste kaltsifikatsioonide kohta selles elundis41. Evani jt tähelepanekud näitasid, et neerukivitõvega patsientide neerude mineraliseerumine võib alata ja esineda peamiselt Henle ahelate interstitsiaalses koes40,42. Need autorid märkisid, et selles piirkonnas moodustuvad mineraalsed ladestused võivad uroteeli basaalküljest välja ulatuda ja põhjustada neerukivide moodustumist. Meie tähelepanekud viitavad sellele, et lisaks Henle silmustele võivad teised neerupiirkonnad sisaldada mineraalseid NP-sid, mis võivad lõpuks areneda, moodustades inimese neerudes suuri mineraalide ladestusi. Samuti uurime võimalust, et vereringes moodustuvad mineraalsed NP-d võivad siirduda neerukudedesse ja kutsuda esile emakavälise lupjumise ja kivide moodustumise neerudes.

Mitmed käesolevas uuringus tuvastatud neerugraanulid leitakse rakusiseste või rakuväliste vesiikulite sees (joonis 4H, I) ja need on sarnased maatriksi vesiikulitega, mis indutseerivad luudes ja hammastes kaltsifikatsiooni7,8. Hiljuti täheldasime, et inimese ja looma seerumist eraldatud vesiikulid kutsuvad esile mineraalsete NP-de ja mikroskoopiliste sademete moodustumise in vitro . Schlieper et al.34 märkisid ka, et arterites leiduvad mineraalosakesed on seotud membraanistruktuuridega, ja pakkusid välja, et maatriksvesiikulid või apoptootilised kehad võivad esindada neis kudedes mineraalosakeste tuuma tekitajaid. Samamoodi on Khan et al. teatas, et idiopaatiliste neerukividega inimpatsientide neerudes leitud kaltsiumfosfaadi ladestused on seotud kollageenikiudude ja maatriksi vesiikulitega9. Need tulemused viitavad sellele, et neerukudedes tuvastatud mineralo-orgaanilised NP-d võivad moodustuda membraani vesiikuleid hõlmava mehhanismi kaudu, mis on analoogne aterosklerootiliste arterite puhul 7, 8. Teisest küljest näitas hiljutine uuring, et naiste rinnaarterites leitud ektoopiline lupjumine ei olnud seotud osteogeensete või apoptootiliste rakumarkeritega43, mis viitab sellele, et lupjumise mehhanism võib olla spetsiifiline seotud elundi või bioloogilise kontekstiga. Lisaks võivad inimese neerukuded moodustuda ka mineraalorgaanilised NP-d, nagu siin kirjeldatud, ioonide (nt kaltsiumi ja fosfaadi) ja kaltsifikatsiooni inhibiitorite (nt albumiin, fetuiin-A ja apo) füsioloogilise kontsentratsiooni säilitamise ebaõnnestumise tõttu. -A1) inimese kehavedelikes.

Meie tulemused näitavad, et mineraalide-orgaaniliste NP-de elektrontihe kiht ja tuum võivad sisaldada valkude ja orgaaniliste molekulide kõrgemat taset võrreldes osakeste elektron-lutsentsiga (joonis 6A, B). Need elektrontihedad kihid näivad olevat mineraliseerunud, nagu on näha selle materjali kristallilisest olemusest TEM-i all (vt joonis 4-J). Teised autorid, sealhulgas Ryall41 ja Evan et al.44, on välja pakkunud, et elektron-lutsentne kiht võib esindada mineraale, samas kui elektrontihedad kihid võivad vastata orgaanilistele molekulidele. Need tõlgendused võivad olla vähemalt osaliselt tingitud proovide töötlemise ja uurimise viisist igas uuringus, samuti kasutatud lähtekudede olemusest.

Lisaks sellele, et mineraalid-orgaanilised osakesed mängivad rolli emakavälises lupjumises, võivad need põhjustada neerukudedes põletikku. Hiljuti näitasime, et kuigi mineralo-orgaanilised NP-d ei suuda indutseerida inimese makrofaagide poolt põletikueelse interleukiini -1 sekretsiooni, suudavad seda teha mineraalsed agregaadid, mis on suuremad kui 1 μm23. On näidatud, et interleukiini -1 vabanemine vastusena kristallilistele materjalidele sõltub rakusiseste molekulaarsete komplekside aktiveerimisest, mida nimetatakse põletikulisteks 45–47. Lisaks avastati mineraalosakesed kasvajatega neerudes ning seos vähi ja põletiku vahel on nüüd hästi teada48. Veel tuleb uurida võimalust, et agregeerunud mineraalosakesed võivad aktiveerida põletikku ja aidata kaasa põletiku ja vähi tekkele neerudes või muudes kudedes.

Lisaks emakavälisele lupjumisele võivad siin kirjeldatud mineraaligraanulid osaleda ka muudes haigusprotsessides. Näiteks oleme varem välja pakkunud, et mineraalsed NP-d võivad seostuda kehavedelikes erinevate valkudega ja kahandada need orgaanilised molekulid kehavedelikest 20, 26. Teisest küljest võib inimkeha normaalsetes tingimustes takistada mineraalsete NP-de teket ja kuhjumist, tuginedes kaltsifikatsiooni inhibiitorite ja retikuloendoteliaalsüsteemi (st makrofaagide) olemasolule. Mineraalsed NP-d võivad seega koguneda ainult siis, kui süsteemne või lokaalne kaltsiumi homöostaas on häiritud ja kui kaitsemehhanismid on inimkehas ebaõnnestunud.

Teeme ettepaneku, et siin välja töötatud nanomaterjalide lähenemisviisi saaks kasutada mineraal-orgaaniliste NP-de moodustumise uurimiseks loomade ja inimeste kudedes. Näiteks võib kaltsifikatsiooni inhibeerivate valkude, nagu albumiin, fetuiin-A ja apo-A1, vastu tekitatud antikehi kasutada koos mineraalanalüüsiga, et tuvastada ja iseloomustada mineralo-orgaaniliste NP-de moodustumist loommudelite kudedes. Selle lähenemisviisi abil saadud tulemusi saab rakendada inimkehavedelike kliinilistes mõõtmistes, et tuvastada bioloogilisi parameetreid, mis peegeldavad mineraalsete osakeste moodustumise ja emakavälise lupjumise seisundit kehas. Eeldame, et need teadmised võivad viia uute ravistrateegiate väljatöötamiseni, et ennetada ja ravida inimese haigusi ja ektoopilise lupjumisega seotud seisundeid.

meetodid

Neerukuded.Inimkudede kasutamise ja selles uuringus tehtud katsed kiitis heaks Chang Gungi memoriaalhaigla institutsionaalse ülevaatenõukogu; meetodid ja katsed viidi läbi kooskõlas kinnitatud juhistega. Patsientidelt saadi kirjalik teadlik nõusolek. Terved neerukoed saadi nende trauma ja hematoomiga patsientide biopsiatest, kellel ei olnud anamneesis neeruhaigust (n=2); neerukuded saadi ka neeruvähiga patsientidelt (n=20) ja lõppstaadiumis neeruhaigusega patsientidelt (n=2), kelle neerud eemaldati siirdamisoperatsiooni käigus või tehti biopsia (tabel 1). Neeruvähi kudede puhul lõigati ja analüüsiti käesolevas uuringus koe mittevähkkasvaja osa.

Histoloogiline analüüs.Neerukuded paigaldati parafiiniplokkidele. Plokid lõigati osadeks ja koetükke kuumutati parafiini eemaldamiseks kuumutusplaadil 70 kraadi juures 30 minutit. Ülejäänud parafiini täielikuks eemaldamiseks kasteti lõigud kolm korda 15 minutiks värskesse ksüleeni lahusesse. Sektsioone rehüdreeriti 95%, 80% ja 70% etanooliga iga kord 5 minutit. Rehüdreeritud proove pesti topeltdestilleeritud veega (ddH2O) 5 minutit. Rakkude tuumad värviti hematoksüliiniga 8 minutit. Värv eemaldati proovidelt sooja veega 10 minutiks. Neeruproove loputati ddH2O-ga ja kasteti 10 korda 95% etanooli. Etanooliga töödeldud proovid värviti 1 minuti jooksul eosiin Y-ga. Proove dehüdreeriti 95-protsendilise ja 100-protsendilise etanooliga iga kord 10 minutit, millele järgnes 10-minutiline dehüdratsioonietapp ksüleenis. Lõplikud veetustatud neeruproovid paigaldati 50-protsendilise glütserooliga alusklaasidele ja vaadeldi digikaameraga varustatud valgusmikroskoobi all.

Parafineeritud ja rehüdreeritud proovid valmistati nii, nagu on kirjeldatud H&E värvimise puhul. Rehüdreeritud lõigud värviti hõbenitraadiga (5 protsenti), millele järgnes 20-minutiline kokkupuude UV-valgusega. Lahust pesti ddH2O-ga 15 minutit. Sektsioone värviti 5 minutit naatriumtiosulfaadiga (5 protsenti), millele järgnes pesemine ddH2O-ga 15 minutit. Lõiked värviti 5 minutit tuumakiire punasega (Sigma-Aldrich, St. Louis, MI). Värvitud proove dehüdreeriti järjestikku 95-protsendilise ja 100-protsendilise etanooliga 10 minutit, seejärel kuivatati ksüleenis 10 minutit. Neeruproovid paigaldati alusklaasidele ja neid uuriti ülalkirjeldatud viisil.

Elektronmikroskoopia ja EDX analüüs.Neeruproovid lõigati LGPS-i dissektsioonimikroskoobi abil (Olympus, Tokyo, Jaapan) väikesteks tükkideks, mille paksus oli alla 1 mm. Kuded fikseeriti 2,5% glutaaraldehüüdi ja 1% paraformaldehüüdiga 0,1 M kakodülaatpuhvris temperatuuril 4 kraadi üleöö. Fikseeritud proove pesti kolm korda 0,1 M kakodülaatpuhvriga 8-protsendilises sahharoosis (pH 7,2) jääl 10 minutit. Pestud kudesid inkubeeriti 2 tundi jääl fosfaatpuhverdatud soolalahuses (PBS; 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4), mis sisaldas 1 protsenti osmiumtetroksiidi ja 1,5 protsenti kaaliumferrotsüaniidi. Kudesid pesti ddH2O-ga jääl 10 minutit kolm korda. Pestud kudesid värviti jääl 1-protsendilise uranüülatsetaadiga ddH2O-s 1 tund, seejärel pesti kolm korda jääl ddH2O-ga. Neerukudesid dehüdreeriti 30-, 50-, 70-, 80- ja 90-protsendilise etanooliga iga kord 10 minutit, välja arvatud siis, kui etanoolisisaldus jõudis 70%-ni, millisel juhul hoiti proove 4 kraadi juures üleöö. Kudesid värviti 1-protsendilise fosfovolframhappega 95-protsendilises etanoolis 15 minutit, seejärel dehüdreeriti 95-protsendilise etanooliga 5 minutit. Proovid sukeldati iga kord 10 minutiks propüleenoksiidi 40-, 57-, 67- ja 100-protsendilisse etanooli, millele järgnes veel üks sukeldamine 5 minutiks 100-protsendilisse propüleenoksiidi. Neerukudedesse infiltreeriti 50, 70 ja 100 protsenti Eponate 812 (Ted Pella, Redding, CA) iga kord 1 tund. Eponaadi 812-manustatud neeruproovid valmistati, inkubeerides neid kaks korda 100-protsendilises eponaadis. Manustatud proove inkubeeriti ahjus temperatuuril 60 kraadi üleöö, et võimaldada vaigu polümerisatsiooni.

Eespool kirjeldatud viisil saadud pestud HS-NP pelletid fikseeriti glutaaraldehüüdiga (2,5 protsenti) ja paraformaldehüüdiga (1 protsenti) ddH2O-s 4 tundi temperatuuril 4 °C. Fikseeritud pelleteid pesti ddH2O-ga kolm korda 10 minutit iga kord. Pelleteid dehüdreeriti järjestikuste inkubatsioonidega 30-, 50-, 70-, 80-, 90-, 95- ja 100-protsendilises etanoolis iga kord 10 minuti jooksul, välja arvatud siis, kui etanoolisisaldus jõudis 70 protsendini, kus graanuleid hoiti 4 kraadi juures üleöö. Teised etanoolilahused puutusid pelletitega kokku ainult 10 minutit. Dehüdreeritud pelletid infiltreeriti LR valge sisestussöötmega (Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA), kasutades etanooli ja LR söötme erinevaid suhteid (3:1, 1:1 ja 1:3) igaüks 30 minutit. Pelleteid infiltreeriti enne polümerisatsiooni üleöö värske LR söötmega (100%). LR söötmega infiltreeritud pelleteid inkubeeriti ahjus 60 kraadi juures 2 päeva, et võimaldada vaigu polümerisatsiooni. Neerude ja HS-NP-de plokid lõigati, et saada 70–100 nm paksused viilud, kasutades Reichert Ultracut S mikrotoomi (Leica, Wetzlar, Saksamaa). Koelõigud värviti 4-protsendilise uranüülatsetaadiga enne visualiseerimist JEM 1230 ülekandeelektronmikroskoobiga (JEOL, Tokyo, Jaapan), mis töötas 100 kV juures. Elektronide difraktsioonimustrid saadi sama süsteemi abil. Toetusena kasutati niklivõresid.

EDX-analüüsi jaoks värviti neerukudede õhukesed lõigud uranüülatsetaadiga ja pesti ddH2O-ga nagu ülalpool, millele järgnes kuivatamine elektroonilises eksikaatorikapis. Proove vaadeldi kõrge eraldusvõimega JEM 2100 ülekandeelektronmikroskoobi (JEOL) all, mis töötas 120 kV juures. EDX spektrid saadi kolmes korduses, kasutades INCA Energy EDS süsteemi (Oxford Instruments, Abingdon, UK). HS-NP-de õhukesi lõike täheldati ilma värvimiseta.

Mineraal-orgaaniliste NP-de valmistamine.Kõikide lähtelahuste pH reguleeriti väärtusele 7,4 ja steriliseeriti enne kasutamist filtrimisega läbi 0,2 μm membraanide. HS saadi tervetelt vabatahtlikelt inimestelt, kasutades tavalist veenipunktsiooni tehnikat. Inimese bioloogiliste vedelike kasutamise selles uuringus kiitis heaks Linko Chang Gungi mälestushaigla institutsionaalne läbivaatamisnõukogu ja vabatahtlikelt saadi kirjalik teadlik nõusolek. HS-NP-d valmistati, lisades kumbki 3 mM CaCl2 ja Na2HPO4 DMEM-i (Gibco, Carlsbad, CA), mis sisaldas 10 protsenti HS-i, millele järgnes ühenädalane inkubeerimine rakukultuuri tingimustes (37 kraadi, 5 protsenti CO2, niisutatud õhk). Osakesed sadestati tsentrifuugimisega 16, 000 × g 15 minutit 4 kraadi juures ja pesti kaks korda HEPES-puhvriga (20 mM HEPES, 1 mM CaCl2, 2 mM Na2HPO4, 150 mM NaCl), kasutades sama tsentrifuugimisprotseduuri.

SDS-PAGE ja Western blotting.SDS-PAGE ja Western blot analüüs viidi läbi põhimõtteliselt nagu varem15. Lühidalt, 0,2 ug (joonis 5A, D) või 1,2 ug (joonis 5B, C) HS-valke, 47 ug (joonis 5A, B, D) või 590 ug HS-NP valke (joonis 5C), 0,1 ug HSA-d (joonis 5A–D) ja 0,6 ug (joonis 5A, C, D) või {{23} },15 ug HSF-i (joonis 5B) lahustati 5-kordses "laadimispuhvris" (0,313 M Tris-HCl pH 6,8, 10 protsenti SDS, 0,05 protsenti bromofenoolsinist, 50 protsenti glütserooli, 12,5 protsenti - merkaptoetanool) lõppkontsentratsioonini 1x, enne kuumutamist 95 kraadi juures 5 minutit ja eraldamist denatureerimis- ja redutseerimistingimustes 10% SDS-PAGE abil, kasutades minigeelisüsteemi (Hoefer, Holliston, MA). NP kontroll (kasutatud 1. rajal joonistel 5A–D) koosnes mineraalsetest NP-dest, mis valmistati 3 mM CaCl2 ja Na2HPO4 lisamisega DMEM-i (lõppmaht 1 ml), millele järgnes inkubeerimine üks päev rakukultuuri tingimustes; osakesed sadestati tsentrifuugimisega 16, 000 × g juures 15 minutit, pesti kaks korda HEPES-puhvriga ja resuspendeeriti 50 ul HEPES-puhvris. Resuspendeeritud osakeste 20 ul alikvooti töödeldi SDS-PAGE jaoks nagu ülalpool. PVDF membraane blokeeriti 1 tund toatemperatuuril 5% (mass/maht) rasvatustatud piimas. Primaarseid antikehi, mis loodi ettevõttes, nagu eespool kirjeldatud,25 kasutati lahjenduses 1:1, 000 (-apo-A1 ja -HS-NP), 1:3, 000 (-HSF) või 1:6, 000 ( -HSA). Kitse küülikuvastast mädarõika peroksidaasiga konjugeeritud sekundaarset antikeha kasutati vastavalt tootja (Millipore, Billerica, MA) juhistele. Blotid tuvastati täiustatud kemoluminestsentsi (Amersham Biosciences, Amersham, UK) ja autoradiograafiliste filmide abil.

Immunoldse märgistamine.Proovid valmistati ette TEM-vaatluseks. HS-NP plokid lõigati alla 70 nm paksusteks viiludeks. Võredel olevad proovilõigud blokeeriti 1% kalaželatiiniga (Sigma) 0,1 M HEPES puhvris (pH 8,0) 25 minutiks. Võre inkubeeriti järgmiste primaarsete antikehadega: -HSA, 1:30; -HSF, 1:50; -apo-A1, 1:30; -HS-NP, 1:60. Negatiivne kontroll ei sisaldanud primaarset antikeha (1% kalaželatiini HEPES-puhvris). Inkubeeritud sektsioone loputati 15 minutit HEPES puhvriga. Loputatud lõigud blokeeriti 1-protsendilise kalaželatiiniga HEPES-puhvris 20 minutit. Proove töödeldi sekundaarse 5-nm-nm-kuldkonjugaadiga kitse küülikuvastase IgG-ga 1 tund. Proove pesti 10 minutit HEPES puhvriga, enne 10 minutit ddH2O-ga. TEM-vaatlused viidi läbi nagu ülalpool.

Fluorestsentsmikroskoopia.Ülaltoodud viisil valmistatud histoloogilised neerukoe slaidid blokeeriti 1 protsendi veise seerumi albumiiniga 1 tund toatemperatuuril. Slaide inkubeeriti primaarsete polüklonaalsete antikehadega lahjenduses 1:4, 000. Pärast pesemisetappe inkubeeriti proove sekundaarsete antikehadega kitse küülikuvastaste FITC (492/520 nm) ja kitse küülikuvastaste antikehadega TRITC (550/570 nm) (Jackson Immuno Research, West Grove, PA) 1:100. 1 h. Komplekse pesti PBST-ga 15 minutit. Fluorestseeruvat peitsi 4′,6-diamidino-2-fenüülindooli (DAPI) kasutati 15 minuti jooksul 10 ug/ml. DAPI-värvitud proove dehüdreeriti 95- ja 100-protsendilise etanooliga 10 minutit, millele järgnes dehüdratsioon ksüleenis veel 10 minutit. Dehüdreeritud neeruproovid paigaldati Vectashield fluorescence H-1000 paigaldussöötmele (Vector Laboratories, Burlingame, CA) ja neid vaadeldi Spot Flex kaameraga varustatud konfokaalse mikroskoobi (LSM510 Meta; Zeiss, Oberkochen, Saksamaa) all.

Cistanche tubulosa hoiab ära neeruhaiguse, proovi saamiseks klõpsake siin

Viited

1. Giachelli, CM Ektoopiline lupjumine: pehmete kudede mineralisatsiooni kohta tõsiste faktide kogumine. Am J. Pathol, 154, 671–675 (1999).

2. Abedin, M., Tintut, Y. & Demer, LL Vaskulaarne lupjumine: mehhanismid ja kliinilised tagajärjed. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 24, 1161-1170 (2004).

3. Alexopoulos, N. & Raggi, P. Lupjumine ateroskleroosis. Nat Rev Cardiol 6, 681–688 (2009).

4. Allison, MA, Criqui, MH & Wright, CM Süsteemse lupjunud ateroskleroosi mustrid ja riskifaktorid. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 24, 331-336 (2004).

5. Ketteler, M. et al. Kaltsiumi reguleerivate valkude puudused dialüüsipatsientidel: uudne kardiovaskulaarse lupjumise kontseptsioon ureemia korral. Kidney Int Suppl 84, S84–87 (2003).

6. Kapustin, A. & Shanahan, CM Vaskulaarse lupjumise sihtimine: kõva sihtmärgi pehmendamine. Curr Opin Pharmacol 9, 84–89 (2009).

7. Kapustin, AN & Shanahan, CM Veresoonte silelihasrakkudest pärinevate maatriksi vesiikulite kaltsiumi reguleerimine. Trends Cardiovasc Med 22, 133–137 (2012).

8. Doherty, TM jt. Lupjumine ateroskleroosi korral: luubioloogia ja krooniline põletik arterite ristteel. Proc Natl Acad Sci USA 100, 11201-11206 (2003).

9. Khan, SR, Rodriguez, DE, Gower, LB & Monga, M. Randalli naastude seos kollageenikiudude ja membraani vesiikulitega. J Urol 187, 1094–1100 (2012).

10. Price, PA, Nguyen, TM & Williamson, MK Seerumi fetuiini-mineraalkompleksi biokeemiline iseloomustus. J Biol. Chem. 278, 22153-22160 (2003).

11. Price, PA, Williamson, MK, Nguyen, TM & Than, TN Fetuiini-mineraalkompleksi tase seerumis on korrelatsioonis arterite lupjumisega rottidel. J Biol. Chem. 279, 1594-1600 (2004).

12. Heiss, A. et al. Fetuiin-A ja happeliste seerumivalkude hierarhiline roll kaltsiumfosfaadi osakeste moodustamisel ja stabiliseerimisel. J Biol. Chem. 283, 14815-14825 (2008).

13. Bertazzo, S. et al. Nanoanalüütiline elektronmikroskoopia paljastab fundamentaalseid teadmisi inimese südame-veresoonkonna kudede lupjumisest. Nat Mater 12, 576–583 (2013).

14. Martel, J. & Young, JD Väidetavad nanobakterid inimveres kaltsiumkarbonaadi nanoosakestena. Proc Natl Acad Sci USA 105, 5549–5554 (2008).

15. Young, JD et al. Oletatavad nanobakterid esindavad normaalse kaltsiumi homöostaasi füsioloogilisi jääke ja kultuuri kõrvalsaadusi. Plos One 4, e4417 (2009).

16. Young, JD et al. Kaltsiumi ja apatiidi granulatsioonide iseloomustus seerumis kui pleomorfsed mineralovalgu kompleksid ja oletatavate nanobakterite prekursorid. Plos One 4, e5421 (2009).

17. Wu, CY, Martel, J., Young, D. & Young, JD Fetuiin-A/albumiin-mineraalkompleksid, mis sarnanevad seerumi kaltsiumigraanulite ja oletatavate nanobakteritega: kahekordse inhibeerimise ja külvamise kontseptsiooni demonstratsioon. Plos One 4, e8058 (2009).

18. Young, JD & Martel, J. Nanobakterite tõus ja langus. Sci Am 302, 52–59 (2010).

19. Martel, J., Wu, CY & Young, JD Kultuuris söötjana kasutatava gammakiirgusega seerumi kriitiline hindamine ning oletatavate nanobakterite ja lupjuvate nanoosakeste demonstreerimine. Plos One 5, e10343 (2010).

20. Martel, J. et al. Inimkehavedelikest pärinevate ja vedelikkromatograafia-tandemmassispektromeetria abil analüüsitud mineraalsete nanoosakeste põhjalik proteoomiline analüüs. Anal Biochem. 418, 111–125 (2011).