Uute ravimite katsed neeruhaiguste raviks: grafeenoksiid kui metotreksaadi ravimite kohaletoimetamise kandja

Kontakt:ali.ma@wecistanche.com

Hani Nasser Abdelhamid et al

Tistanche pulbri kasu tervisele neeruhaiguste korral, proovi saamiseks klõpsake siin

Abstraktne:

Nanomaterjalid, sealhulgas süsinikupõhiseid nanoosakesi, on kasutatud vähivastaste ravimite kandjatena. Selles lühikeses teatises kirjeldati metotreksaadi sünteesi, tsütotoksilisust ja ravimite kohaletoimetamist, kasutades kandjana grafeenoksiidi (GO). GO sünteesiti Hummeri meetodil. Seda iseloomustati röntgendifraktsiooni (XRD), transmissioonielektronmikroskoobi (TEM) ja skaneeriva elektronmikroskoobi (SEM) abil. Andmete analüüs kinnitab kõrge kristallilisuse ja lamellide morfoloogiaga GO sünteesi. GO näitas suurt tsütoühilduvust inimese EA.hy926 endoteelirakkude suhtes. GO-d on kasutatud vähivastase ravimi kandjana; metotreksaat. Ravimi manustamist testiti inimese embrüonaalsete hepatotsellulaarsete kartsinoomirakkude (HepG2 rakkude) suhtesneerudrakud (HEK293A rakud) ja sea naha fibroblastid (PEF).

Märksõnad:süsiniknanomaterjalid; ravimite kohaletoimetamine; keemiaravi; metotreksaat.

1. Sissejuhatus

Vähihaigust on peetud tõsiseks ohuks inimestele. Maailma Terviseorganisatsioon (WHO, 2018) teatas, et vähk põhjustab iga kuuenda surmajuhtumi. 2020. aastal tehtud uuringu kohaselt on aastas 19 miljonit vähijuhtu [1], mis põhjustavad 8,8 miljonit surmajuhtumit (mis moodustab 15,7 protsenti iga-aastastest surmajuhtumitest) [2,3]. On teatatud, et mitmed ravimid on paljutõotavad vähivastased ravimid [4–11]. Neil puudub aga kõrge rakkude sisestamine, rakkude läbilaskvus, biosaadavus, selektiivsus ja suurenenud efektiivsus [5, 6, 12–19]. Seega teatati ravimite kohaletoimetamiseks mitmetest kandjatest, sealhulgas looduslikest polümeeridest [20], polüsahhariididest [13], magnetkandjatest [21] ja rakuvälistest kandjatest (EV) [22]. Neil on kõrge ravimi laadimisvõime, kontrollitud vabanemine ja suurenenud rakkude sisestamine. Nanotehnoloogial on arenenud biomeditsiini valdkonnad, sealhulgas vähiravi [23–29].

Grafeen on uus allotroop (kahemõõtmeline, 2D).süsiniknanomaterjalidühe sp{0}}hübridiseeritud süsinikuaatomite kihiga [30–39]. Grafeeni süntees pälvis 2010. aastal Nobeli keemiaauhinna. Grafeenil põhinevnanomaterjalidnagu grafeenoksiid (GO), on arenenud biomeditsiin, sealhulgas ravimite kohaletoimetamine [40, 42]. Need võivad areneda karkassiks [43, 45], kiududeks [46] ja hüdrogeelideks [47]. Grafeenil põhinevad materjalid pakkusid mitmeid eeliseid, sealhulgas suurt ravimi laadimis- ja vabanemisvõimet [47]. GO-sse saab laadida segatud vähivastaseid ravimeid, nagu doksorubitsiin (DOX) ja kamptotetsiin (CPT) [49]. Seega saavad nad korraga manustada rohkem kui ühte ravimit. Ravimit saab laadida grafeeni kovalentselt ristsiduva keemia [50], elektrostaatiliste ja füüsikaliste absorptsiooni interaktsioonide, näiteks π-π kooperatiivse interaktsiooni [51] kaudu. Ravimi kohaletoimetamist saab kontrollida pH [50, 52], ensümaatilise [53], lähiinfrapuna (NIR) valguse [54] ja elektrilise juhtimise [55] abil. Pinna modifikatsioon tagab ravimi suure vabanemise [56]. Grafeeni saab modifitseerida ka teiste nanoosakestega, sealhulgas fototermilise töötlemise magnetiliste nanoosakestega [57]. Grafeenipõhised materjalid pakuvad multifunktsionaalsust [58–61]. Polaarsed rühmad muudavad materjali väga hüdrofiilseks. Seega kasutati neid kandjana vähivastaste ravimite, nagu DOX [62], kvertsetiin ja gefitiniib [63], sumatriptaansuktsinaat (SS)[64] ja tsütarabiin (CYT)[65], kohaletoimetamisel.

Siin uuriti grafeenoksiidi (GO) kasutamist metotreksaadi (MTX) kohaletoimetamiseks. GO sünteesimiseks järgiti Hummeri meetodit, millele järgnes ultraheliga töötlemine, et tagada kõrge dispersioon. GO kristallilisust ja morfoloogiat iseloomustati röntgendifraktsiooni (XRD) ja elektronmikroskoobi (ülekanne (TEM), skaneerimine (SEM)) abil. Materjal segati metotreksaadiga. Metotreksaadiga laetud GO-d testiti inimese embrüonaalsete hepatotsellulaarsete kartsinoomirakkude (HepG2 rakkude) abil.neerudrakud(HEK293A rakud) ja sea naha fibroblastid (PEF).

2. Materjalid ja meetodid

Grafiidihelbed osteti firmalt Alfa Aesir (Saksamaa). 3-[4,5-dimetüültiasool-2-üül]-2, 5-difenüültetrasooliumbromiid (MTT), väävelhape ja kaaliumpermanganaat (KMnO4) osteti ettevõttelt Sigma-Aldrich (USA).

2.1. GO süntees.

GO valmistati Hummeri meetodil [32,66]. Looduslik grafiit (1.0 g) dispergeeriti väävelhappe (15.0 ml) ja lämmastikhappe (10.0 ml) segus. jäävann. Happesegule lisati segamise ajal järk-järgult kaaliumpermanganaati (3.{12}} g). 12 tunni pärast tilgutati vesinikperoksiidi (15,0 ml). GO koguti ja pesti HCl ja veega, et eemaldada kõik lisandid. GO lahus (1 mg/ml) valmistati ultraheliga (140 W) 2 päeva jooksul 60 kraadi juures.

2.2. Instrumendid.

Röntgendifraktsioon (XRD) registreeriti PANalytical X'Pert Pro difraktomeetriga (Cu K1, λ 1,54Å). Transmissioonelektronmikroskoopia (TEM) pilt jäädvustati JEM-2100 instrumendiga (JEOL, Jaapan). Skaneeriva elektronmikroskoopia (SEM) kujutis tehti JSM-7000 instrumendi (JEOL) abil. UV-Vis spektrid registreeriti kasutades Thermo Scientific Evolution{7}}. Fourier' teisenduse infrapuna (FT-IR) spektreid hinnati tahkel kujul, kasutades Shimadzu-470 KBr-ketta tehnikat kasutades.

2.3. Kaudne tsütotoksilisuse test.

Inimese EA.hy926 endoteelirakke kasvatati Dulbecco modifitseeritud Eagle söötmes (DMEM; Invitrogen, USA), millele oli lisatud 10 protsenti veise loote seerumit (FBS; Hyclone, USA) ja 1 protsenti penitsilliini/streptomütsiini (p/s, Gibco, USA) niisutatud inkubaatoris 37 kraadi ja 5% CO2 juures. Rakud koguti trüpsiinipõhise meetodi abil. GO-st valmistati väljavõtted võimalike toksikoloogiliste riskide uurimiseks. Substraat steriliseeriti gaasilise etüleenoksiidiga ja segati seerumivaba DMEM-iga, millele oli lisatud 1% p/s söödet temperatuuril 37 kraadi /120 p/min 72 tundi, vastavalt suhtestandardile 0,2 g/ml sööde [67]. Seejärel supernatant tsentrifuugiti ja filtriti, et lõpuks valmistada eelkonditsioneeritud sööde.

Rakke kultiveeriti tihedusega 5 × 104 rakku süvendi kohta 24 süvendiga plaatidel 24 tundi, kasutades täielikku söödet. Sööde aspireeriti, seejärel lisati pärast 10% FBS-i ühendamist 500 ui konditsioneeritud või kontrollsöödet. Negatiivse kontrollina kultiveeriti rakke DMEM-ga, samas kui positiivsetes kontrollisüvendites kasvatati rakke 20-protsendilise dimetüülsulfoksiidi (DMSO) juuresolekul. Rakkude elujõulisust uuriti kvalitatiivselt 3. päeval, kasutades Live/Dead analüüsikomplekti (kaltseiin-AM/etiidiumbromiidi homodimeer, Invitrogen) vastavalt tootja juhistele, vaadeldes seda fluorestsentsmikroskoobi all (Olympus, Jaapan).

2.4. Ravimi laadimine.

Vähivastane ravim laaditi, lisades 4,0 ml GO-le puhverlahuses (25 µg/mL) 1.0 ml metotreksaati (100 µg/mL; Sigma Aldrich) ja segades 48 °C. tundi pimedas toatemperatuuril.

2.5. Ravimite kohaletoimetamise testimine.

Hepatotsellulaarsed kartsinoomirakud (HepG2 rakud), inimese embrüonaalsedneerudrakke (HEK293A rakud) ja sea naha fibroblaste (PEF) kultiveeriti DMEM-is, millele oli lisatud 10% FBS-i, niisutatud 5% CO2 atmosfääris inkubaatoris temperatuuril 37 °C. Rakud koguti 90% konfluentsetelt rakukultuuriplaatidelt ja resuspendeeriti enne plaadistamist täiesti värskes söötmes. Rakud (3 × 104) külvati 24-süvendiga plaadile. Rakke kultiveeriti 24 tundi, pesti kaks korda fosfaatpuhverdatud soolalahusega (PBS) ja seejärel inkubeeriti kas MTX-GO või MTX (20 µg/mL) või GO-ga (20 µg/mL), mis sisaldas ainult DMEM söödet. 37 kraadi 24 tundi. Rakkude elujõulisust hinnati MTT testi abil. Aktiivsed rakud redutseerivad kollase värvi MTT-d lillavärvilisteks formazaani värvikristallideks. Lühidalt, igasse süvendisse lisati 50 µl MTT lahust (5 mg/ml) ja inkubeeriti 37 kraadi juures 4 tundi. Pärast MTT-d sisaldava söötme äraviskamist kultiveeriti 350 µl rakke 20% DMSO juuresolekul. Pärast 10-minutilist inkubeerimist pipeteeriti süvenditest võetud 100 µl alikvoodid teise 96-süvendi plaadile. Tekkinud värvus kvantifitseeriti, registreerides spektrofotomeetriga neeldumise lainepikkusel 570 nm.

3. Tulemused ja arutelu

3.1. Materjali iseloomustus.

GO sünteesiti grafiidi oksüdatsiooni teel, kasutades KMnO4 happelises lahuses (joonis 1) [39,68,69]. GO XRD mustril on tugev Braggi difraktsioonipiik 10,9 kraadi juures, mis vastab (002) tasandi Milleri indeksile (joonis 2a). Valmistatud materjali d-vahe on 0,9 nm (joonis 2a). GO morfoloogiat hinnati TEM- ja SEM-piltide abil (joonis 3). GO läbipaistvus TEM-pildil näitab, et GO koosneb mõnest 2D-kihist (joonis 3a). SEM-pildid kinnitavad GO lamellide morfoloogiat (joonis 3b). TEM- ja SEM-pildid näitavad, et GO-l on murenev morfoloogia (joonis 3).

GO UV-Vis spekter näitab maksimaalseid neeldumisribasid lainepikkustel 250 nm ja 355 nm, mis vastavad aromaatsete C–C sidemete π → π* üleminekule ja C=C n → π* üleminekule (joonis 2b) [70] . Keemilise struktuuri põhjal näitab MTX tugevat π – π * või σ – σ * üleminekut UV-Vis piirkonnas maksimaalse neeldumise korral 368 nm ja 274 nm (joonis 2b). MTX lõplik neeldumisriba 368 nm juures nihutati pärast konjugeerimist GO-ga 361 nm-ni, mis näitab tugevat koostoimet GO ja MTX vahel.

Keemilisi funktsionaalrühmi enne ja pärast interaktsioone iseloomustati FT-IR spektrite abil (joonis 2c). GO vibratsiooniribad on 3569 cm-1, 1707 cm-1, 1628 cm-1, 1412 cm-1 ja 1029 cm-1, mis vastavad O− H-venitamine, karboksüülhapperühmade C=O venitamine, aromaatne C-C venitamine, O-H deformatsioon ja C-O (joonis 2c). MTX FT-IR spekter näitab iseloomulikke ribasid 1380 cm-1, 1644 cm-1 ja 3400 cm-1, mis vastavad C−N, −NH2 ja N−H, vastavalt (joonis 2c). MTX-GO-l on mõlemale materjalile iseloomulikud omadused. Kuid MTX vibratsiooniribad kaovad peamiselt, mis näitab tugevat koostoimet GO-ga (joonis 2c).

3.2. GO tsütoühilduvus.

Esitati ka EA.hy926 rakkude fluorestsentskujutised (joonis 4). Pildid näitavad suurt rakutihedust, mis näitab GO kõrget bioühilduvust (joonis 4).

3.3. Ravimi kohaletoimetamine.

Metotreksaadi manustamiseks kasutati GO-d (joonis 1). GO kihtide mõlemad pooled võivad MTX-i adsorbeerida mittekovalentsete interaktsioonide, sealhulgas elektrostaatilise ja π-π interkalatsiooni kaudu. GO kihtide tasanditevaheline kaugus on 1 nm lähedal, mis pakub kihtide vahel MTX interkalatsiooni. Seega saab GO-d kasutada MTX kohaletoimetamise kandjana. MTX laadimine GO-le saavutati mõlema liigi segamisel vesilahuses ultrahelitöötluse abiga. Ravimi vabanemist hinnati HepG2, HEK293A ja PEF rakkude abil.

MTT test näitas, et paljas GO ei põhjusta kolmele rakutüübile märkimisväärset tsütotoksilist toimet; HepG2, HEK293A ja PEF rakud (joonis 5). Vaba MTX võtsid tuumori rakuliin (HepG2 rakud) ja normaalsed rakud (HEK293A ja PEF rakud) peaaegu sarnase tsütotoksilisusega kõigi kolme rakutüübiga ilma ilmse selektiivsuseta. Pärast MTX-i konjugeerimist GO-ga kandjana näitas MTX-GO olulist spetsiifilist tsütotoksilisust kasvaja rakuliinile (HepG2 rakud) võrreldes normaalsete rakkudega (HEK293A ja PEF-rakud). Tulemused võivad avada uusi võimalusi GO-põhiste materjalide kasutamiseks kliinilistes ja kirurgilistes rakendustes [71–74].

4. Järeldused

GO on sünteesitud ja kasutatud kandjana metotreksaadi kohaletoimetamisel. Sellel on kõrge biosobivus. Ravimi laadimine on lihtne. Rakkude elujõulisus HepG2, HEK293A ja PEF rakkude puhul näitas kontrollitud vabanemist. Need leiud avavad uusi võimalusi grafeenoksiidi kui ravimite kohaletoimetamise kandja biomeditsiinilisteks rakendusteks.

RahastamineSellel uuringul pole rahalisi vahendeid.

TänuavaldusedSellel uuringul pole tunnustust.

Huvide konfliktidAutorid ei kinnita huvide konflikti.

Viited

1. Sciacovelli, M.; Schmidt, C.; Maher, ER; Frezza, C. Metabolic Drivers in Herditary Cancer Syndromes.Aastane Ülevaade kohta Vähk Bioloogia 2020, 4, 77-97.

2. Wang, H.; Naghavi, M.; Allen, C.; Juuksur, RM; Bhutta, ZA; jt. Ülemaailmne, piirkondlik ja riiklik oodatav eluiga, igasugune suremus ja põhjusspetsiifiline suremus 249 surmapõhjuse puhul, 1980–2015: süstemaatiline analüüs 2015. aasta ülemaailmse haiguskoormuse uuringu jaoks.The Lancet 2016, 388, 1459- 1544,

3. Abdelhamid, HN; Talib, A.; Wu, H.-F. Kulla – süsiniktäppide nanokomposiidi süntees ühes potis ja selle kasutamine metallide tsütosenseerimiseks vähirakkude jaoks.Talanta 2017, 166, 357-363,

4. Abdelhamid, HN; Dowaidar, M.; Hällbrink, M.; Langel, Ü. Rakkudesse tungivad peptiidid-MOF-id: tõhus geenide kohaletoimetamise platvorm.Saadaval juures SSRN 3435895 2019.

5. Abdelhamid, HN; Dowaidar, M.; Langel, Ü. Karboniseeritud kitosaani kapseldatud hierarhiline poorne tseoliit-imidasolaat karkassi nanoosakesi geeni kohaletoimetamiseks.Mikropoorne Mesopoorsed Mater. 2020, 302, 110200

6. Abdelhamid, HN; Dowaidar, M.; Hällbrink, M.; Langel, Ü. Geeni kohaletoimetamine rakku läbistavate peptiidide-tseoliit-imidasolaadi raamistike abil.Mikropoorne Mesopoorsed Mater. 2020, 300, 110173,

7. Abdelhamid, HN; El-Bery, HM; Metwally, AA; Elshazly, M.; Hathout, RM CdS-ga modifitseeritud kitosaani kvantpunktide süntees Sesamoli ravimite kohaletoimetamiseks.Süsivesikud. Polym. 2019, 214, 90–99.

8. Sultan, S.; Abdelhamid, HN; Zou, X.; Mathew, AP CelloMOF: nanotselluloosi toega metallist orgaaniliste raamide 3D-printimine.Adv. Funktsioon. Mater. 2019, 29, 1805372,

9. Dowaidar, M.; Nasser Abdelhamid, H.; Hällbrink, M.; Langel, Ü.; Zou, X. Kitosaan suurendab oligonukleotiidide komplekside geenide kohaletoimetamist magnetiliste nanoosakeste-rakku tungiva peptiidiga.J. Biomater.Appl. 2018, 33, 392-401,

10. Dowaidar, M.; Abdelhamid, HN; Hällbrink, M.; Zou, X.; Langel, Ü. Grafeenoksiidi nanolehed kompleksis rakku tungiva toimega. peptiidid oligonukleotiidide kohaletoimetamiseks.Biochim. Biophys. Acta - Gen. Teema 2017, 1861, 2334–2341

11. Dowaidar, M.; Abdelhamid, HN; Hällbrink, M.; Freimann, K.; Kurrikoff, K.; Zou, X.; Langel, Ü. Rakku tungivate peptiidide-oligonukleotiidide komplekside magnetiline nanoosakeste abil geenide kohaletoimetamine.Sci. Rep. 2017, 7, 9159.

12. Peer, D.; Karp, JM; Hong, S.; Farokhzad, OC; Margalit, R.; Langer, R. Nanokandjad kui vähiravi arenev platvorm.Loodus Nanotehnoloogia 2007, 2, 751-760.

13. Barclay, TG; päev, CM; Petrovski, N.; Garg, S. Ülevaade polüsahhariidi osakestel põhinevast funktsionaalsest ravimi kohaletoimetamisest.Süsivesikud. Polym. 2019, 221, 94- 112.

14. Abdelhamid, HN Bioliides ZIF-8 ja biomolekulide ja nende rakenduste vahel.Bioliides Res. Rakendus Chem. 2021, 11, 8283-8297.

15. Abdelhamid, HN Nanotsütotoksilisus maatriksi abil laserdesorptsiooni ionisatsiooni massispektromeetria abil.Tulevik Microbiol. 2020, 15, 385-387.

16. Rajendran, S.; Mukherjee, A.; Shukla, R.; Abdelhamid, H. Nanotoksilisuse ennetamine ja nanomaterjalide antibakteriaalsed rakendused; Elsevier, 2020;

17. Abdelhamid, HN Peatükk 9 - Nanotoksilisuse tuvastamise ja hindamise üldmeetodid. sisseNanotoksilisus, Rajendran, S., Mukherjee, A., Nguyen, TA, Godugu, C., Shukla, RK, Eds. Elsevier: 2020; 195-214.

18. Keserani, R.; Sharma, A.; Abdelhamid, H.Nanoosakesed Ravim Kohaletoimetamine Süsteemid; Keserani, RK, Sharma, AK, toim.; CRC Press, 2019.

19. Abdelhamid, HN; Wu, H.-F. Nanoosakeste eelravim vähirakkude jaoks. sisseNanoosakesed Ravim Kohaletoimetamine Süsteemid; Keserani, RK, Sharma, AK, toim.; Apple Academic Press: USA, 2019; lk 121–150 ISBN 978- 1-77188-695-6.

20. George, A.; Shah, PA; Shrivastav, PS Looduslikel biolagunevatel polümeeridel põhinevad nanopreparaadid ravimite kohaletoimetamiseks: ülevaade.Int. J. Pharm. 2019, 561, 244-264.

21. Liu, Y.-L.; Chen, D.; Shang, P.; Yin, D.-C. Magnetsüsteemide ülevaade ravimite sihipäraseks kohaletoimetamiseks.J. Kontroll. Vabasta 2019, 302, 90– 104.

22. Gudbergsson, JM; Jønsson, K.; Simonsen, JB; Johnsen, KB Süstemaatiline ülevaade sihitud rakuvälistest vesiikulitest ravimite kohaletoimetamiseks – Metodoloogilise ja bioloogilise heterogeensuse kaalutlused.J. Kontrollitud Vabasta 2019, 306, 108- 120,

23. Abdelhamid, HN; Sharmoukh, W. Sisemine katalaasi jäljendav MOFzyme vesinikperoksiidi ja raudioonide tundlikuks tuvastamiseks.Microchem. J. 2021, 163, 105873,

24. Yousef, MS; Abdelhamid, HN; Hidalgo, M.; Fathy, R.; GómezGascón, L.; Dorado, J. Hõbesüsiniku nanoosakeste antimikroobne aktiivsus pullide sperma bakteriaalsel flooral.Teriogenoloogia 2021, 161, 219- 227,

25. Abdelhamid, HN; Mahmoud, GA-E.; Sharmouk, W. Tseeriumil põhinev MOFzyme, millel on mitme ensüümilaadne toime seente taaskolonisatsiooni katkestamiseks ja pärssimiseks.Ajakiri kohta Materjalid Keemia B 2020, 8, 7548-7556,

26. Zulfajri, M.; Abdelhamid, HN; Sudewi, S.; Dayalan, S.; Rasool, A.; Habib, A.; Huang, GG taimeosast saadud süsinikupunktid biosenseerimiseks.Biosensorid 2020, 10,