Dendrimer-tesaglitasari konjugaat kutsub esile mikrogliia fenotüübi muutuse ja suurendab amüloidse fagotsütoosi† 2. osa

In vitro bioloogilised analüüsid

Rakukultuur. BV2 hiire mikrogliia rakuliin saadi Michigani lastehaigla rakukultuuri rajatisest.

Viimastel aastatel on teadlased leidnud, et rakukultuur on tihedalt seotud inimese mäluga. Uuringud on näidanud, et rakukultuuri uurimise kaudu on võimalik avastada mälu- ja õppeprotsessi molekulaarseid mehhanisme, parandades seeläbi inimese kognitiivseid võimeid ja mälu.

Rakukultuur viitab protsessile, mille käigus asetatakse bioloogilised rakud in vitro tingimustes kasvamiseks ja paljunemiseks olulisi toitaineid sisaldavasse söötmesse. Rakud on elu põhiüksused ja rakukultuur annab teadlastele platvormi rakkude käitumise ja elutegevuse uurimiseks. Rakkude uurimise kaudu on teadlased avastanud palju teavet neuronite kasvu ja sünaptiliste ühenduste kohta. Need leiud ei aita inimestel mitte ainult paremini mõista, kuidas aju töötab, vaid aitavad ka välja töötada uusi ravimeetodeid ja ravimeid.

Viimaste aastate uuringud on näidanud, et rakukultuur on tihedalt seotud ka inimese mäluga. Teadlased on leidnud, et inimese mälu kujunemine ja säilitamine nõuab palju molekulaarset reguleerimist ja signaali edastamist. Nendel signaali edastamise ja reguleerimise mehhanismidel on palju sarnasusi rakukultuuri mehhanismidega. Uurides rakukultuuris signaali edastamise ja reguleerimise mehhanisme, saavad teadlased paremini mõista inimese mälu ja õppimismehhanisme.

Lisaks on mõned uuringud näidanud, et rakukultuur võib teatud viisil parandada inimese mälu ja õppimisvõimet. Näiteks "elektrilise stimulatsiooni" nimelise meetodi abil saab stimuleerida rakkude aktiivsust ja neuronite vahelist ühendust, parandades seeläbi inimese kognitiivset võimekust ja õppimisvõimet. Kuigi see meetod on alles laboratoorsete uuringute staadiumis, loodetakse sellest tulevikus saada uus kognitiivse koolituse meetod.

Kokkuvõtlikult võib öelda, et rakukultuuri ja inimese mälu vahel on tihe seos. Rakkude uurimise kaudu saame paremini mõista inimese kognitiivset mehhanismi ja mälumehhanismi ning samuti aidata välja töötada uusi ravimeetodeid ja kognitiivseid treeningmeetodeid. Jääme ootama rakukultuuritehnoloogia panust inimkonda tulevikus! On näha, et me peame parandama mälu ja Cistanche võib oluliselt parandada mälu, kuna Cistanche'il on antioksüdantne, põletikuvastane ja vananemisvastane toime, mis võib aidata vähendada oksüdatsiooni ja põletikulisi reaktsioone ajus, kaitstes seeläbi aju tervist. närvisüsteem. Lisaks võib Cistanche soodustada ka närvirakkude kasvu ja paranemist, parandades seeläbi närvivõrkude ühenduvust ja funktsiooni. Need mõjud võivad aidata parandada mälu, õppimisvõimet ja mõtlemiskiirust ning võivad samuti ära hoida kognitiivse düsfunktsiooni ja neurodegeneratiivsete haiguste teket.

Mälu suurendamiseks klõpsake valikul Tea toidulisandeid

BV2 rakke kultiveeriti Dulbecco modifitseeritud EaglesMedium (DMEM) söötmes, mis sisaldas 10% kuumaga inaktiveeritud veiseloote seerumit (HI FBS) ja 1% penitsilliini/streptomütsiini (P/S) 37 kraadi ja 5% CO2 juures.

Kui rakud saavutasid kultiveerimiskolvis konfluentsuse, suunati rakud uude kolbi, kasutades 0,05% trüpsiin-etüleendiamiintetraäädikhapet (EDTA). Katsete jaoks külvati BV2 rakud DMEM-i, milles oli 5% HIFBS ja 1% P/S. 24–48 tundi hiljem stimuleeriti rakke 100 ng ml-1 (300 EU ml-1) LPS-iga 3 tundi, et võimaldada rakkudel siseneda põletikueelsesse (M1) fenotüüpi, et simuleerida paljude neuroloogiliste haiguste korral esinevat neuroinflammatoorset keskkonda.

Seejärel töödeldi rakke LPS-ga ja kas vaba Tesa või D-Tesaga erinevates kontsentratsioonides 48 korda, seejärel koguti supernatant ja rakud töötlemiseks. Kontrollrühmadeks olid rakud, mida ei töödeldud kunagi LPS-iga (ilma LPS-ita) ja rakud, mida oli alati töödeldud ainult LPS-iga (ainult LPS). Vaba Tesa ja D-Tesa põhilahused steriliseeriti, kasutades polü(eetersulfoone) 0,2 µm filtreid.

D-Tesa oli rakusöötmes lahustuv. Tesa lahustati, kasutades dimetüülsulfoksiidi (DMSO) lõppkontsentratsioonil alla 0,1% (maht/maht). Tsütotoksilisus, lämmastikoksiidi test ja TNF-ELISA. Tsütotoksilisuse testi jaoks töödeldi rakke ülalkirjeldatud viisil 96-süvendiplaadil ning seejärel hinnati vaba Tesa ja D-Tesa tsütotoksilisust MTT testiga, järgides tootja juhiseid.

Lämmastikoksiidi testi jaoks töödeldi rakke ülalkirjeldatud viisil 12-süvendiga plaatidel, seejärel koguti töödeldud rakkude supernatandid ja koheselt määrati lämmastikoksiidi tasemed, järgides Griessi reaktiivi tootja protokolli.

TNF-ELISA jaoks töödeldi rakke ülalkirjeldatud viisil 12-süvendiga plaatidel ja seejärel koguti töödeldud rakkude supernatandid ja säilitati kuni edasiseks töötlemiseks temperatuuril -80 kraadi.

Seejärel sulatati proovid jääl ja TNF-ELISA viidi läbi, järgides tootja protokolli. Nende uuringute jaoks töödeldi nii D-Tesat kui ka vaba Tesat ultraheliga ja segati keerisega, kuni need mõlemad täielikult lahustuvad. Vaba Tesa lahustamiseks lahustati see enne lahjendamist esmalt DMSO-s, kus DMSO lõppkontsentratsioon oli kõigi vabade Tesa proovide puhul alla 0,1% (maht/maht).

Kuna D-Tesa oli rakukultuurisöötmes lahustuv, ei lisatud nendele proovidele DMSO-d. Allin vitro uuringutes kanti rakkudele nii vaba Tesa kui ka D-Tesa rühmas samaväärne kogus vaba või konjugeeritud ravimit.

Kvantitatiivne reaalajas PCR (qRT-PCR). Rakke töödeldi ülalkirjeldatud viisil 12-süvendiga plaatidel ja pärast supernatandi kogumist koguti rakud Invitrogen™ TRIzol™ reagendisse (firmalt Fisher Scientific) ja RNA ekstraheeriti vastavalt tootja protokollile. Saadud RNA kontsentratsiooni ja puhtust analüüsiti Nanodropi abil.

Iga proovi RNA ekvivalentsed kogused konverteeriti cDNA-ks, järgides tootja protokolli High CapacitycDNA pöördtranskriptsioonikomplekti jaoks (Thermo Fisher Scientific firmalt Applied Biosystems).

Saadud cDNA-d kasutati QRT-PCR analüüsiks, kasutades FAST-SYBR rohelist reaktiivi ja järgides tootja protokolli. Ct väärtused arvutati masinaga ja andmeid analüüsiti, kasutades 2-ΔΔCt meetodit.

Iga erineva markeri jaoks arvutati ΔΔCt väärtus, lahutades LPS-i rühma ΔCt iga proovi ΔCt-st. ΔCt väärtus oli huvipakkuva geeni Ct väärtus miinus GAPDH Ct iga antud proovi kohta.

Kui 2−ΔΔCt oli arvutatud kõigi rühmade jaoks, normaliseeriti need kõik LPS-i rühmaks, mis andis LPS-i rühmale suhtelise ekspressioonitaseme 1.0 kõigi markerite jaoks. QRT jaoks kasutati edasi- ja tagasisuunalisi praimerite järjestusi. -PCR on näidatud allolevas tabelis. Kõik jadad kirjutatakse ümber alates 5′→3′.

Lisaks osteti ettevõttelt BIORAD kaubanduslikult saadavad praimerid iNOS/Nos2 (qmmuCID0023087), TLR4 (qmmuCID0023548), CD206/Mrc1 (qmmuCID0012670), TGF- 1 (qmmuCID0017), qmmuCID0017 (qmmuCID0017) (qmmuCID0017) 1 (qmmucid0024846), CD36 (qmmucid0014852), Ide(qmmucid0049796), MMP9 (qmmucid0021296), CCL1 (qmmuced0038249), TLR8 (qmmuced0039837), CD6060060000 404) ja PPAR (qmmucid0018821). Fagotsütoosi analüüs.

-amüloidi vaba Tesa ja D-Tesa onfagotsütoosi mõju määrati eelnevalt kirjeldatud meetodil.47 Lühidalt, HiLyte™ jahu 488-märgistatud -amüloid1–42 (firmalt Anaspec Inc.) lahustati DMSO-s (DMSO lõppkontsentratsioon). alla 0,5% (v/v)) ja lahjendati PBS-is kuni 5 µg ml-1.

Pärast rakkude töötlemist Tesa ja D-Tesaga ülaltoodud raviskeemiga kanti rakkudele 2 tunniks -amüloidi lahust. Seejärel pesti rakke kolm korda kahevalentsete katioonidega (kaltsium ja magneesium) Hanki tasakaalustatud soolalahusega, eemaldati süvenditest trüpsiini abil ja resuspendeeriti FACS puhvris (firmast Invitrogen).

Proove säilitati jääl ja töödeldi kohe Sony Cell Sorter SH800 voolutsütomeetria masinaga ning andmeid analüüsiti seotud tarkvaraga.

Värav määrati fluorestseeruva amüloidiga töötlemata rakkude abil ja näidatud tulemused on iga rühma rakkude protsent, mille fluorestsents oli suurem kui taustfluorestsents.

Iga rühma kohta teatati ka HiLyte™ 488-märgistatud amüloidi keskmine fluorestsentsi intensiivsus (MFA). See test viidi läbi kahes eksemplaris. Statistika. Kõik näidatud andmed on kolme eraldi katse tulemus, millest igaüks viidi läbi kolmes eksemplaris, kui pole märgitud teisiti. Statistika tegemiseks kasutati GraphPad Prism 5 ja Microsoft Excelit.

Viidi läbi kahepoolsed paaris Studenti t-testid koos BonferroniCorrectioniga. Kõrvalväärtuste määramiseks kasutati Grubbsi testi. Andmete joonistamiseks kasutati GraphPad Prism 5 for Windows (San Diego, CA). Näidatud andmed on keskmine + SEM.

Tulemused ja arutelu

D-Tesa süntees ja iseloomustus

Et võimaldada sihipärast intratsellulaarset kohaletoimetamist aju aktiveeritud mikrogliiarakkudesse, konjugeeriti Tesa G{0}}PAMAM-OH pinnale kovalentselt lõhustuvate estersidemetega ravimi ja dendrimer-linkeri vahel (joonis 1).

Esimeses etapis pandi Tesa (1) reageerima tetrametüleenglükoolasiidiga (TEG-asiid) (2), saades Tesa-TEG-asiidi (3), millel on esterside ravimi ja linkeri vahel (joonis 1A).

Ühendi (3) HPLC näitas retentsiooniaega 13,4 minutit puhtusega üle 99% (joonis S1B†). Ühendi (3) massispekter näitas tippväärtust 610,13 [M + 1]+, mis vastab Tesa-TEG-asiidi molekulmassile, kinnitades veelgi produkti moodustumist (joonis S2†). Eraldi pandi G4-PAMAM-OH dendrimer (4) reageerima 5-heksüünhappega, kasutades esterdamisreaktsiooni D-YNE (5) saamiseks (joonis 1B).

Lõpuks reageeriti Tesa-TEG-asiidil (3) ja D-YNE-l (5) ülitõhusa vask-katalüüsidasiid-alküüni tsükloadditsiooni (CuAAC) klõpsatusreaktsiooniga, saades D-Tesa (6) (joonis 1B).48 1H NMR. kinnitas kõigi vahesaaduste ja lõpptoote edukat sünteesi; D-Tesa (6) sisaldas dendrimeeri ja ravimilinkeri prootonite iseloomulikke piike, mis näitavad D-Tesa edukat sünteesi (joonis 2A).

Lõpliku D-Tesa konjugaadi NMR näitas, et iga dendrimeeri külge oli kinnitatud keskmiselt kümme Tesa molekuli. HPLC kinnitas edukat kovalentset konjugatsiooni, kuna D-Tesa näitas nihet nii D-YNE kui ka TesaTEG-asiidi suhtes (joonis 2B ja S1†).

Tesa lahustuvus vees on halb, hinnanguliselt 0,0035 mg ml-1,49 Tesa onhüdroksüüldendrimeeri konjugatsioon parandas selle vees lahustuvust mitme suurusjärgu võrra võrreldes selle hinnanguga. D-Tesa lahustuvus vees oli 22 mg ml-1 ja kuna Tesa moodustab ∼ 19% D-Tesa massist, lahustati 4,2 mg ml-1 ekvivalent Tesat (joonis 3A).

Dendrimeeri suurem lahustuvus muudab formuleerimise lihtsamaks ja eemaldab vajaduse potentsiaalselt toksiliste abiainete järele.50 Need eelised on kõik lisaks dendrimeeri suurepärasele võimele viia vabu ravimeid BBB kaudu mikrogliiasse in vivo ja potentsiaalselt vähendada terapeutilise efekti saavutamiseks vajalik annus.18–28 Lõpuks oli D-Tesa keskmine suurus 7,75 ± 0,29 nm (joonis S3†) ja zeta-potentsiaal 2.86 ± 0,38 mV (vastavalt N=5 ja N=3 mõõtmine).

Ravimi vabastamine

Disainisime D-Tesa, et vabastada Tesa rakusiseselt aktiveeritud mikrogliia madala pH ja kõrge esteraasi kontsentratsiooniga keskkonna inendosoomides/lüsosoomides. Oleme varem teatanud, et PAMAM-i dendrimeerid sisenevad rakkudesse peamiselt vedelikufaasi endotsütoosi kaudu ja konjugaate sisaldavad vesiikulid muunduvad lüsosoomideks.

Me inkubeerisime D-Tesat 37 kraadi juures naatriumtsitraatpuhvris (pH 5,5) esteraaside juuresolekul, et jäljendada lüsosoomide tingimusi, nagu varem tehtud.52–54 Uurisime ka vabanemist tingimustes, mis jäljendavad plasmatingimusi (fosfaatpuhverdatud soolalahus [PBS) ] puhver, pH 7,4).

Plasma tingimustes vabaneb 48 tunni pärast ainult umbes 1,5% Tesast ja 25. päevaks vabaneb vähem kui 20% Tesast, mis viitab konjugaadi plasmastabiilsusele (joonis 3B).

Lüsosomaalsetes tingimustes vabaneb D-Tesast esimese 48 tunni jooksul umbes 60% Tesast ja 19 päeva jooksul peaaegu 100% Tesast. Need tulemused näitavad, et D-Tesa tagab vaba ravimi püsiva, käivitatud vabanemise esimese kahe nädala jooksul, mida inkubeeritakse füsioloogiliselt olulistes lüsosomaalsetes tingimustes.

Lisaks on Tesa minimaalne vabanemine simuleeritud plasmatingimustes (pH 7,4 rühm) esimese 48 tunni jooksul märkimisväärne, kuna see on tüüpiline G4-PAMAM-OH tsirkulatsiooniaeg enne neerude kliirensit, sominimaalne Tesa vabaneb tõenäoliselt konjugaadid enne mikrogliiasse jõudmist.24

D-Tesa vähendas M1 markerite ekspressiooni ja suurendas M2 markereid

Et hinnata D-Tesa võimet indutseerida fenotüübi nihet M1-le M2-le, hindasime D-Tesa võimet muuta M1 ja M2 markerite ekspressiooni in vitro, kasutades hiire mikrogliia rakuliini (BV2).

BV2 rakud loodi hiire mikrogliia rakkude immortaliseerimise teel ja näidati olevat sobiv alternatiiv primaarsetele mikrogliia rakkudele, et uurida mikrogliia põletikulist reaktsiooni.55,56 Katsetes, et jäljendada mitmete neuroloogiliste haiguste korral esinevat neuroinflammatoorset keskkonda, eeltöötlesime mikrogliia 100 rakuga. ng ml−1 (300 endotoksiiniühikut (EL) ml kohta) LPS-i 3 tunni jooksul.

Seejärel töödeldi rakke LPS-iga ja kas vaba Tesa või D-Tesaga 48 tundi ning seejärel kogusime proovid. Töötlesime rakke kontsentratsioonides 1,5, 15 ja 150 uM vaba Tesa või D-Tesa samaväärsete ravimite alusel.

MTT test näitas, et vaba Tesaor D-Tesa nendel kontsentratsioonidel ei põhjustanud tsütotoksilisust (joonis S4†). Tesa ja D-Tesa abil viidi läbi esialgne annuse leidmise uuring, et määrata Tesa ja D-Tesa kõige tõhusam annus.

Töötlemine 1,5 ja 15 µM vaba Tesa ja D-Tesadiidiga ei muuda lämmastikoksiidi ega TNF- sekretsiooni, mis on määratud vastavalt Griessi reagendi ja TNF-ELISA abil (joonis S5†). Nende tulemuste põhjal ei analüüsinud me oma qRT-PCR testides neid madalamaid kontsentratsioone.

Paljude neurodegeneratiivsete haiguste puhul on põletikueelse M1 mikrogliia üheks peamiseks neurotoksiliseks funktsiooniks nende reaktiivsete hapnikuliikide (nt lämmastikoksiidi) sekretsioon, mis tapavad otseselt neuroneid.57,58 Seejärel on oletatud, et üks potentsiaalne ravistrateegia oleks nende molekulide sekretsiooni vähendamine.

Hindasime D-Tesa võimet seda efekti saavutada. Pärast LPS-i stimuleerimist vähendas D-Tesa eritunud lämmastikoksiidi ja indutseeritava lämmastikoksiidi süntaasi (iNOS) mRNA taset 3.7- korda (p < 0,0001) ja 2- korda (p {{ 7}}.011), võrreldes ainult LPS-iga töödeldud rakkudega (ainult LPS) (joonis 4A ja B).

Teisest küljest vähendas vaba Tesa sekreteeritud lämmastikoksiidi taset mõõdukamalt (14- korda, p=0,004) ega toonud kaasa iNOS-i mRNA ekspressiooni olulist vähenemist (joonis 4A ja B ).

D-Tesa oli lämmastikoksiidi sekretsiooni pärssimisel palju tõhusam kui vaba Tesain. Järgmiseks, sõltuvalt sellest, kas mikroglia on M1- või M2-fenotüübis, reguleerib mikroglia kas iNOS-i või Arginaas 1 (Arg1), et metaboliseerida L-arginiini, et toota M1 patogeeni hävitava vastuse jaoks lämmastikoksiidi, orornitiini ja karbamiidi M2-haavaparanemisreaktsiooni jaoks. 59

Kooskõlas iNOS-i alareguleerimisega suurendas D-Tesa Arg1 mRNA taset 2- korda (p=0,011) võrreldes ainult LPS-i sisaldava kontrolliga, samas kui vaba Tesa ekspressiooni märkimisväärselt ei suurendanud (p=0 .40) (joonis 4C).

D-Tesa ja vähemal määral vaba Tesa muutsid mikroglia tsütotoksilise lämmastikoksiidi vabastamise asemel L-arginiini metaboliseerimisele haavade paranemise eesmärgil, mis mõjutab neurodegeneratsioonis mikrogliia põhjustatud neurotoksilisuse vähendamist ja potentsiaalselt tagasipööramist.5–7,10

iNOS-i ja sekreteeritud lämmastikoksiidi taseme alandamine D-Tesa-raviga on tingitud varasematest töödest, mis näitasid, et PPAR-i looduslik ligand (15-deoksü-Δ12,14-prostaglandiin J2) vähendas iNOS-i ja lämmastikoksiidi ekspressiooni ja sekretsiooni LPS-ga töödeldud korral. esmane mikrogliia.60

IL-10, IL-4 ja TGF- 1 on kõik tsütokiinid, mida eritavad alternatiivselt aktiveeritud M2-mikroglia, mis võivad indutseerida ajus neuroprotektiivset põletikuvastast keskkonda.58,61,62Teel selleks suurendas D-Tesa IL-105.5-korda (p=0.011) ja IL-4 8.2-korda (p { {15}}.013) võrreldes ainult LPS-i kontrolliga (joonis 4D ja E).

Vaba Tesa ei tõstnud oluliselt ei IL-10 ega IL-4 taset, kuigi keskmised olid 1.7-kordne (p=0.066) ja 2.{{7} } korda (p=0.11) kõrgem vastavalt Tesaga töödeldud mikrogliia puhul võrreldes ainult LPS-i saanud kontrollidega (joonis 4D ja E). Lisaks suurendas D-Tesa TGF- 1 2.3- korda (p=0.015) ja vaba Tesa ekspressiooni oluliselt (joonis 4F).

Seega indutseerib D-Tesa pärast mikrogliia LPS-ravi põletikuvastaste tsütokiinide sekretsiooni, mis võib leevendada neurodegeneratiivsete haiguste korral esinevat neurotoksilist põletikueelset keskkonda.5–7,10

D-Tesa indutseeritud M2-alatüübi markerite ekspressioon

CD206, Ccl1 ja TLR8 on spetsiifilised markerid vastavalt mikrogliia alamtüüpidele M2a, M2b ja M2c.58 D-Tesa ülesreguleeritud CD206 ekspressioon 4.{{10 }}kordne (p < 0,001), Ccl1 3.5-korda (p < 0,005) ja TLR8 5-kordne (p < 0,01), samas kui vaba Tesa ei suurendanud oluliselt mõni neist kolmest markerist (joonis 5A–C).

Need andmed näitavad, et D-Tesaga töödeldud mikrogliia näitab kõigi kolme M2 alatüübi markerite olulist ülesreguleerimist, mis nõustub arusaamaga, et mikrogliia fenotüüp on plastiline, mitte binaarne.63–65

M1/M2 nomenklatuur lihtsustab liigselt keerukust, et mikrogliia võib eksisteerida aktiveerimisolekute spektris; piki seda kontiinumit on iseloomustatud kolme erinevat M2 fenotüüpi (M2a, M2b ja M2c) ning D-Tesa indutseerib markerite ekspressiooni, mis on kooskõlas kõigi nende seisunditega.58, 61, 63, 66, 67 M2a mikrogliia on seotud patogeensete fagotsütoosi suurenemisega. valke, reguleerides üles püüdurretseptoreid, parandades kudesid ja põletikuvastaseid toimeid.

M2b mikrogliia sarnaneb M1 mikrogliiaga, kuna nad ekspresseerivad IL-1, TNF- ja IL-6; aga M2b erinevad M1 mikrogliiast selle poolest, et nad ekspresseerivad kõrgel tasemel IL-10 ja vähendavad iNOS-i ekspressiooni. M2b makrofaagid ja mikrogliia stimuleerivad Th2 T-rakke, mis näitab ühte M2b rollist põletikuvastase vastuse esilekutsumisel.

M2cmicroglia osaleb haavade paranemises, kudede ümberkujundamises, raua sekvestreerimises ja STAT3 aktiveerimises, mis vähendab põletikueelset signaaliülekannet.58, 61, 63, 66 Tesa PPAR aktiivsus stimuleerib edasisuunalist ahelat, mille tulemuseks on PPAR ja selle ülesvoolu signaaliva valgu (STAT6) suurenenud ekspressioon. mis on mõlemad M2a markerid.58D-Tesa suurendas PPAR 2.3-kordistamist (p=0.0036)ja STAT6 3.4- korda (p < 0,001), samas kui vaba Tesa suurendas STAT6 1.8- korda (p=0,011) ilma PPAR-i ekspressiooni olulise suurenemiseta (158-kordne suurenemine, p=0.17) (joonis 5D ja E).

STAT6 ja PPAR suurenenud ekspressioon põhjustab põletikuvastase geeni tootmist ja põletikueelsete signaalide pärssimist, inhibeerides NF-KB aktiivsust. Kuna M2a mikrogliat saab indutseerida, töödeldes mikrogliat IL-4-ga, mis annab signaali STAT6 ja PPAR kaudu, võib nende kahe allavoolu signaaliülekande valgu ülesreguleerimine põhjustada M2a polarisatsiooni.68

Meie testides suurendas LPS-i aktiveerimine IL-6, TNF- ja IL-1 taset ning ravi D-Tesaga reguleeris veelgi nende tsütokiinide ekspressiooni (joonis S6A–D†), mis on tõenäoline. D-Tesa indutseerimise tõttu M2b fenotüüpi (joonis 5B).

Vaba Tesain suurendas IL-6 ekspressiooni ega muutnud oluliselt TNF- ja IL-1 ekspressiooni (joonis S6A–D†). Kuigi neid tsütokiine sekreteerivad M1 mikrogliia, ekspresseerivad M2b mikrogliia ka neid tsütokiine.58,61 CD86 on nii M1 kui ka M2b mikrogliia marker ja D-Tesa ravi korral suureneb selle tase (joonis S6E†).

Lisaks on tsütokiinide signaalimise supressor (SOCS) rakusiseste valkude perekond, mis reguleerib mikrogliia fenotüübilist polarisatsiooni, pärssides mitut tsütokiinide poolt aktiveeritud signaaliülekande rada.69 SOCS1 on selle perekonna üks liige ja on näidatud, et see pärsib LPS/TLR4. vahendatud NF-κB ja JAK2 signaaliülekannet, vähendades seeläbi M1 mikroglia kaudu LPS/TLR4 raja kaudu vabanevate TNF-, IL-1 ja IL-6 kogust.

D-Tesa reguleerib üles SOCS1 ekspressiooni võrreldes ainult LPS-i sisaldava kontrolliga (joonis S6F†), mis viitab sellele, et D-Tesaci poolt avaldatud IL-6, TNF- ja IL-1 suurenemine võib olla tingitud M2b fenotüüp, mitte LPS/TLR4, M{10}}indutseeriva fenotüübi täiustamine.

Lisaks edastab LPS signaale TLR4 kaudu ja liigse raku aktiveerimise vältimiseks on mikroglial negatiivne tagasiside mehhanism, mille korral TLR4 aktiveerimine viib TLR4.70 ekspressiooni vähenemiseni.

Ravi vaba Tesa ja D-Tesaga suurendas TLR4 taset vastavalt 3.6- korda (p < 0.001) ja 3.7- korda (p < 0,001) (Joonis 5F), mis viitab sellele, et Tesa ja D-Tesa muutsid tüüpilist LPS/TRL4 negatiivse tagasiside signaalirada.

For more information:1950477648nn@gmail.com