Alox15 kustutamine parandab neerufunktsiooni häireid ja pärsib fbroosi suurenenud PGD2 poolt neerudes
Mar 12, 2022
CISTANCHE PARANDAB NEERU-/NEERUINFEKTSIOONI
Sissejuhatus
Polüküllastumata rasvhapped (PUFA) ja nende metaboliidid on seotud põletiku ja selle lahustumisega mitmes elundis [1]. Oksülipiinid, mida toodetakse PUFA oksüdeerumisel, on olulised PUFA bioloogilise aktiivsuse jaoks lipiidide vahendajatena [1, 2]. Oksülipiinide biosünteesi vahendavad mitmed ensüümid, nagu lipoksügenaas (LOX), tsüklooksügenaas (COX) ja tsütokroom P450 (CYP) [3]. Need ensüümid toodavad mitmeid lipiidide metaboliite, nagu prostaglandiinid, leukotrieenid ja lipoksiinid, mis kõik on tugevalt seotud põletiku reguleerimisega [1, 4]. Näiteks LOX-i peamisel alatüübil ALOX15 on metaboliitide kaudu proinflammatiivsete ja infammatiivsete omaduste kahekordne aspekt[5]: ALOX15 on väga väljendatud eosinofiilides, bronhoalveolaarsetes epiteelirakkudes ja alveolaarsetes makrofaagides mittepatoloogilistes tingimustes [5, 6] ning see soodustab astma [7], kopsukahjustuse [8] ja südamepuudulikkuse [9] raskust, samas kui see neutraliseerib põletikku artriidis [10] ja isheemilises ajus [11]. Lisaks mõjutavad lipiidide vahendajad ja nende ensüümid elundifibroosi ja põletikku. Spetsiifilised lipiidide vahendajad on seotud kopsu[12], maksa [13] ja südame [14] fibroosi patogeneesiga. Samamoodi on eespool nimetatud ALOX15 seotud ka fibroosi patogeneesiga, näiteks nahafibroosiga [15].
Üks levinumaid kroonilisi haigusi on krooniline neeruhaigus(CKD), mis mõjutab ligikaudu 8–16% elanikkonnast kõigis etappides kokku [16]. Kuigi CKD patogenees on keeruline ja varieerub sõltuvalt põhihaigusest,neerkude muutub üldiselt düsfunktsionaalseks, mis viib lõppstaadiumisNeerupuudulikkuspõhjustatud kroonilisest põletikust ja sellele järgnevast fibroosist [17]. Nagu mainitud, on PUFA-dest saadud lipiidide vahendajad tugevalt seotud põletiku ja sellest tuleneva fibroosiga. Näiteks lipoksiinid ja settiinid pärsivad neerufibroosi [18, 19], kuid neid efecte ei uurita veel kahjustatud CKD mudelis.neerufunktsioon.Lisaks on CKD-s põhjalikud lipidomilised profiilidneerKudedest ei teatata ikka veel. Seega on lipiidide metaboolsete ensüümide ja nende toodete roll CKD patogeneesis jäänud halvasti mõistetavaks.Selle uuringu eesmärk oli selgitada rasvhapete metaboliseerivate ensüümide ja nende toodete kaasamistNeeru5/6 nefrrectomiseeritud (Nx) CKD mudeli hiirte kahjustus. See uuring näitas, et nii Alox15 transkriptsiooni kui ka valgu ekspressiooni taset suurendati CKD-sNeerud, ja Alox15−/− hiirtel on paranenudneerdüsfunktsioon ja fibroos CKD mudelis. Lisaks PGD2, mis on suurenenud lipiidide metaboliit CKD-sNeerudalox15−/− hiirtel, inhibeeris epiteeli-mesenhümaalset üleminekut (EMT) proksimaalsetes torukujulistes kultiveeritud rakkudes. Seetõttu võib Alox15 inhibeerimine ja / või PGD2 manustamine olla CKD ja fibroosi uudne terapeutiline sihtmärk.
Märksõnad:krooniline neeruhaigus; Lipoksügenaas; ALOX15; Vahendaja lipidoomika; Polüküllastumata rasvhapped; Neeru
CISTANCHE PARANDAB NEERU/NEERU FUNKTSIOONI
Materjalid ja meetodid
Loomad ja eksperimendidSelles uuringus kasutati 8-nädalaseid isaseid C57BL / 6 J hiiri (CLEA Japan), mis olid aklimatiseerunud 1 nädal enne kõigi katsete läbiviimist. Lisaks loodi Alox15−/− hiired C57BL/6 J taustaga (Jackson Laboratory) ja 5/6 Nx mudel loodi vastavalt eelmisele uuringule [20]. Kogusime vereproove, et hinnataneerufunktsioonjaneerkoeproovid immunoblottinguks ja polümeraasi ahelreaktsiooniks 8 nädalat pärast 5/6 Nx ja histoloogiliseks analüüsiks 40 nädala jooksul pärast 5/6 Nx. Kõik katsed vastasid TMDU loomkatsete suunistele ning TMDU loomahoolduse ja -kasutamise komitee kiitis heaks meie uuringuprotokolli (kinnitusnumber: A2019-117C4).
LC–MS/MS-põhine vahendaja lipidoomikaViisime läbi LC-MS/MS analüüsi, nagu eespool kirjeldatud [21, 22]. Menetluse üksikasju kirjeldatakse täiendavates meetodites,Muud eksperimentaalsed meetodidMe kirjeldasime teisi eksperimentaalseid meetodeid täiendavates meetodites.
Tulemused
Alox15 mRNA tase on tõusnud 5/6 Nx neerusOksülipiini ensüümide kvantitatiivsed muutused CKD-sneeruuriti, rakendades C57BL/6 hiirt võltsoperatsioonile või 5/6 Nx nagu varem kirjeldatud [20]. Neerudes väljendatud suurte oksülipiini ensüümide ekspressiooni analüüsimiseks (Alox15, Alox5, Ptgs1 (COX1), Ptgs2 (COX2), Cyp4a12 ja Cyp2c44) [23, 24] ekstraheerisimeneerProovid. Ensüümide hulgas on Alox15 5/6 NxNeerudoli oluliselt kõrgem mRNA tase (P =0,0004) võrreldes võltstasemegaNeerud(Joonis 1). Seevastu teiste peamiste ensüümide mRNA tase ei muutunud selles CKD mudelis oluliselt.
Alox15 valgusisaldust suurendati neeruproksimaalsetes torukujulistes rakkudesIn 5/6 NxNeerudsamuti tõsteti ALOX15 valgusisaldust (P=0,0078), mida eeldas transkriptsioonitaseme tõus (joonis 2a). Et teha kindlaks, millised rakutüübid olid CKD-s suurendanud Alox15 valgu tasetneeruurisime Alox15 mRNA lokaliseerimist in situ hübridisatsiooni teel. In situ hübridiseerimine mRNA-le näitas, et Alox15 kõrge ekspressioonitase paiknesNeerutorukujulised rakud 5/6 Nx mudelis, kuid mitte glomerulis (joonis 2b). Histoloogilised tunnused näitasid, et Alox15 mRNA oli tugevalt väljendatud proksimaalsetes tubulites.
Alox15−/− hiired olid 5/6 Nx mudelis neerukahjustuste ja fibroosi suhtes resistentsedIn 5/6 Nx CKDNeerud, tõusid ALOX15 transkriptsiooni- ja valguekspressiooni tasemed. Seetõttu uurisime, kas ja kuidas ALOX15 mängib CKD-s rollineerdüsfunktsioon ja neerufibroos. Selleks rakendati 5/6 Nx CKD mudelile alox15−/− hiiri. Huvitav on see, et seerumi Cre ja veri karbamiidi lämmastiku (BUN) tase oli alox15−/− 5/6 Nx hiirtel madalam
kui metsikut tüüpi (WT) hiirtel (joonis 3a), mis näitab, et Alox15 ammendumine näitas kaitsvat toimet CKD patogeneesis. Seega ngal (aneerukahjustusedmarker) valgu ekspressioon suruti Alox15−/− hiirtel maha võrreldes WT hiirte omaga (joonis 3b). Lisaks Alox15−/− hiirNeerudnäitasid Col1a1, Fn ja Acta2 (αSMA) mRNA taseme langust (joonis 3c) ning näitasid ka fibronektiini ja αSMA valgu ekspressiooni vähenemist (joonis. 3d). Lisaks alox15−/− hiirNeerudnäitas selgelt allasurutud interstitsiaalseid fibrootilisi muutusi, mis on näidatud Massoni kolmevärvilises värvimises (joonis 3e). Seetõttu leevendab Alox15 kustutamineneerdüsfunktsioon ja fibroos CKD loomamudelis.
Vahendaja lipidoomika näitas muutunud PUFA ainevahetust Alox15−/− CKD neerudesNagu on mainitud käesoleva dokumendi sissejuhatuse osas, on Alox15 bioloogilised efekid seotud Alox15 loodud lipiidide vahendajatega15. Alox15 poolt CKD-s toodetud lipiidide metaboliitide profiili selgitamiseksneeruurisime ja võrdlesime pettust ja 5/6 NxneerLC-MS/MS-põhise vahendaja lipidoomika proovid WT hiirte ja Alox15−/− CKD hiirte vaheliste lipiidide vahendajaprofiilide määramiseks (täiendav tabel 1). Tabelis 1 on näidatud lipiidide metaboliidid, mis erinesid oluliselt Alox15+/+ ja Alox15−/− hiirte vahel 5/6 Nx seisundis. Lisaks tegime lipiidide vahendajate rajakaarte, mis liigitati nende substraatide ja metaboliseerivate ensüümide järgi (joonis 4). Alox15-tuletatud PUFA metaboliitide seeriat, nagu 14-HDoHE, 17-HDoHE ja 15-HEPA [5, 25–27], suurenes märkimisväärselt CKD mudelites, mis korreleeruvad hästi ALOX15 ekspressiooni suurenenud tasemegaNeerud(P=0,0018, 0,0008,<0.0001, respectively),="" and="" their="" elevations="" under="" ckd="" conditions="" were="" completely="" suppressed="" in="" alox15−/−="" mice="" (fig. 5).="" besides="" 14-hdohe,="" 17-hdohe,="" and="" 15-hepa,="" the="" levels="" of="" 18-hepa,="" 10-hdohe,="" 11-hdohe,="" 13-hdohe,="" 16-hdohe,="" and="" dgla="" were="" also="" significantly="" decreased="" in="" alox15−/−="" ckd="">Neerudvõrreldes WT CKD neerudega, samas kui Alox15−/− CKD neerudes suurenes märkimisväärselt ainult PGD2 (joonis 6).
PGD2 allasurutud EMT kultiveeritud neerurakkudesLipiidide metaboliitide efectid, mis erinesid oluliselt Alox15++++ ja Alox15−/− hiirte vahel alla 5/6 Nx seisundi all, uuriti, manustades neid lipiide NRK-52E rakkudele, mida aktiveeris profibrootiline tsütokiin TGF-β1. Hindasime Cola1a ja Acta2 (αSMA) mRNA ekspressiooni vastuseks TGF-β1-le, et määrata kindlaks nende lipiidide väljatõmbed kultuuris (joonis 7a). Nende hulgas andis PGD2 tugeva antifibrootilise toime NRK-52E rakkudele vastuseks TGF-β1-le. PGD2 pärssiv toime COL1A1 ja αSMA ekspressioonile sõltus annusest vastavalt 7,12 μM ja 6,48 μM EK50-ga (joonis 7b). Lisaks viisime läbi samad katsed HK-2 rakkudes, mis on surematud proksimaalsed tubul epiteelirakud normaalselt täiskasvanud inimeselt.Neerudja leidis sarnase tulemuse, st COL1A1 ja αSMA inhibeerimise annusest sõltuval viisil vastusena ravile PGD2-ga (joonis 7c). Seetõttu suurenes PGD2 tase Alox15−/− CKD-sNeerudvõib aidata kaasa antifibrootilistele heitmetele CKD-s.
CISTANCHE PARANDAB NEERU- / NEERUVALU
15-PGDH, peamine PGD2-metaboliseeriv ensüüm, vähenes Alox15−/− CKD neerudesSelgitada PGD2 suurenemise mehhanismiNeerudAlox15−/− CKD mudelhiirtest mõõtsime PGD2 süntaasi mRNA taset. PGD2 süntaasil (PGDS) on kaks isovormi: lipokaliin PGDS (L-PGDS) ja vereloome PGDS (H-PGDS) [28]. Nii L-PGDS-i kui ka H-PGDS-i taset suurendati märkimisväärselt 5/6 Nx tingimustes võrreldes võltstingimustegaNeerudWT hiirtest (joonis 8a, mõlemad P<0.0001) indicating="" that="" increased="" pgd2="" in="" ckd="" is="" due="" to="" increased="" pgd2="" synthases.="" conversely,="" the="" increase="" in="" l-pgds="" and="" h-pgds="" under="" 5/6="" nx="" conditions="" was="" significantly="" inhibited="" in="" alox15−/−="" mice="" (fig. 8a)="" indicating="" that="" the="" increase="" in="" pgd2="" in="" alox15−/−="" ckd="" model="" mice="" was="" not="" due="" to="" increased="" production="" by="" pgds.="" then,="" we="" examined="" mrna="" levels="" of="" cox-1="" and="" cox-2="" as="" more="" upstream="" synthases="" of="" the="" prostaglandin-producing="" pathway.="" we="" also="" measured="" mrna="" levels="" of="" 15-pgdh="" and="">1C18, mis on teadaolevalt peamised PGD2-metaboliseerivad ensüümid [29, 30]. Kuigi COX-1, COX-2 ja AKR1C18 mRNA tase ei muutunud, vähenes CKD-s oluliselt mRNA tase 15-PGDHNeerudalox15−/− hiirtel võrreldes WT hiirtega (joonis 8b, P=0,0325), mis võib põhjustada PGD2 suurenemist CKD-sNeerudAlox15−/− hiirtest.
Arutelu
See uuring näitas, et CKD-sneerproovid, nii Alox15 transkriptsiooni- kui ka valgusisaldust suurendati, ningneertalitlushäired ja fibroos ammeliteeriti Alox15−/− hiirtel. Lisaks näitas LC-MS/MS-põhine vahendaja lipidoomika, et Alox15−/− CKD hiirNeerudPGD 2 tase oli WT hiirtega võrreldes oluliselt suurenenud. PGD2 inhibeeris NRK-52E ja HK-2 rakkude EMT-d; seega võib PGD2 suurenemine aidata kaasa Alox15−/− hiirte resistentsuseleneerukahjustusja fibroos. SeosNeeruhaigusja lipiidide profiile, mis kasutavad lipidoomikat inimese seerumil või plasmal, on põhjalikult uuritud [31–33], kuid mitteneerkude. Samamoodi, kuigi CKD loommudeleid kasutavate lipidoomika aruannete arv on vähe [34–36], teostasid kõik need uuringud lipidoomikat CKD loomamudeli plasmaproovidel; siiski ei ole terviklik lipidomics kohtaneerCKD mudeli kudesid on veel teatatud. Otsene lipidoomika kudedele on efektiivne ka funktsionaalsete metaboliitide tuvastamisel, samuti plasmaproovid. Lisaks on metaboliidi muutused kudedes ja vereproovides elunditi oluliselt erinevad [20]. Käesolevas uuringus analüüsisime põhjalikult PUFA-st saadud lipiidide vahendajate profiilineerCKD loomamudeli kuded.
See uuring keskendus ALOX15-le, mis on üks peamisi ensüüme, mis metaboliseerivad PUFA-sid. Selles uuringus tõsteti CKD-s selgelt nii ALOX15 valgu kui ka mRNA ekspressiooni tasetNeerud. Käsitlesime CKD-s ALOX15 avaldise eest vastutavaid rakutüüpeNeerudja in situ hübridisatsiooni teel leidsime ALOX15 mRNA suurenenud ekspressiooniNeerutorukujulised rakud 5/6 Nx mudelis.
ALOX15 osaleb kroonilistes haigustes, nagu ateroskleroos, ja selle kustutamine loomahaiguste mudelites parandab neid haigusi [5]. Seoses ALOX15 seostamisegaNeeruhaigus, valgurikas väheneb Alox15−/− hiirtel, kes on glomerulaarse vigastuse all streptozototsiini poolt indutseeritud diabeetilise nefropaatia mudeliga [37]. Kuid see suhkurtõve hiire mudel ei näita mingit langustneerufunktsioon; seega mehhanism selle kohta, kuidas ALOX15 on seotud kahjustatudneerufunktsioonCKD mudelites on jäänud ebaselgeks. Käesolevas uuringus, kasutades 5/6 Nx hiire mudelit, leidsime, et ALOX15 kustutamine on amelioreeritudneerdüsfunktsioon jaNeerufibroos CKD mudelis. Praeguseks on teadaolevalt ainult IL-4 ja IL-13 monotsüütides regulatiivsed tegurid, mis otseselt suurendavad ALOX15 ekspressiooni [5]. Siiski jääb selgusetuks, mis suurendab ALOX15Neerutorukujulised rakud. On teada, et mitmesugused tsütokiinid ja ureemilised toksiinid suurenevad plasmas ja neerudes CKD-s [38, 39]. Nende hulgas võib olla ALOX15 uudseid regulaatoreid. On vaja täiendavaid uuringuid, et selgitada CKD-s ALOX15 peamisi regulatiivseid tegureid. Oma uuringutes, et teha kindlaks spetsiifilised vahepealsed oksülipiinid, mis seovad Alox15 kustutamist selle renoprotektiivse toimega 5/6 Nx mudelis, leidsime, et PGD2 võib olla seotud resistentsuseganeerukahjustusedpõhjustatud ALOX15 kustutamisest. Üldise arusaamana luua PGD2, COX-1 ja
CCOX-2 toodab PGG2 arahhidoonhapetest, mis seejärel muundatakse PGH2-ks. Kui PGH2 metaboliseeritakse PGD2 süntaasiga (PGDS), toodetakse PGD2 [28]. PGDS-il on kaks geneetiliselt erinevat isovormi, nimelt lipokaliintüüp PGDS (L-PGDS) ja vereloome tüüpi PGDS (H-PGDS) [28]. Kuigi PGD2 suurenes Alox15−/− CKD hiirelNeerud, ei suurenenud Alox15−/− CKD hiirel ei L-PGDS ega H-PGDSNeerud, hoolimata PGDS-i suurest kasvust WT CKD hiirelNeerud(Joonis 8a). Lisaks paljastasime, et Ei COX-1 ega COX-2 ei suurenenud Alox15−/− CKD hiire neerudes (joonis 8b). Need tulemused näitavad, et PGD 2 suurenemine Alox15−/− CKD hiire neerudes ei olnud tingitud süntaaside suurenemisest, vaid substraadi kättesaadavuse suurenemisest või lagunemise pärssimisest, ning tegelikult oleme näidanud 15-PGDH vähenemist, mis on üks peamisi PGD2 metaboliseerivaid ensüüme [29], Alox15−/− CKD hiire neerudes (joonis 8b). On vaja täiendavat uurimist, et selgitada välja põhjus, miks Alox15 kustutamine toob kaasa 15-PGDH vähenemise.
Nagu eespool mainitud, võib PGD2 olla seotud vastupanuganeerukahjustusalox15 kaotusest põhjustatud. Selles uuringus inhibeeris PGD2 EMT-d TGF-β1 poolt NRK-52E ja HK-2 rakkudes, esindades proksimaalseid torukujulisi rakke. PGD2 seondub kahe erineva G-valguga seotud retseptoriga, nimelt DP1 ja DP2-ga, mille funktsioonid on erinevad [28]. Kuid meie in vitro katsetes oli PGD2 efektiivne kontsentratsioonides vahemikus 4 kuni 32 μM, mis on suhteliselt kõrged, arvestades, et DP1 ja DP2 Ki väärtused on vastavalt 1,7 nM ja 2,4 nM [28]. See tulemus näitab, et PGD2 võib avaldada antifibrootilisi heitmeid mitte G-valguga seotud retseptorite kaudu, vaid teiste radade kaudu, nagu PPARγ, mille kaudu on teada, et 15-d-PGJ2, allavoolu PGD2 metaboliit, avaldab oma efects [28]. Selles uuringus, mis keskendub lipiidide metaboolsetele ensüümidele ja nende metaboliitidele, võib ALOX15 inhibeerimine ja / või PGD2 manustamine olla CKD paljutõotav terapeutiline sihtmärk. Kahjuks ei ole välja töötatud ALOX15 spetsiifilist inhibiitorit, mida saab kliinilises praktikas kasutada [40, 41]. Allavoolu funktsionaalsete metaboliitide, näiteks PGD2 terapeutiline sihtimine, mitte rasvhapete metaboliseerivate ensüümide pärssimine, mis mõjutavad erinevaid metaboliite, võib olla uudne ideaalne CKD-ravi.
CISTANCHE PARANDAB NEERU/NEERU DIALÜÜSI