Endoteeli eellasrakkude mikrovesikulite kaitsev toime Ang II poolt indutseeritud roti neerurakkude vigastusele
Mar 11, 2022
Abstraktne.Krooniline hüpertensioon võib põhjustadaneerukahjustused,Tuntud kui hüpertensiivne nefropaatia või hüpertensiivne nefroskleroos. Täiendav arusaam molekulaarsetest mehhanismidest, mille kaudu hüpertensiivne nefropaatia areneb, on tõhusa diagnoosimise ja ravi jaoks hädavajalik. Käesolevas uuringus uuriti mehhanisme, mille abil endoteeli eellasrakud (EPC) parandavad primaarset rottineerlahtrid (PRK-d). ELISA, rakkude loendamise komplekt-8 ja voolutsütomeetria analüüse kasutati selleks, et analüüsida EPC-de või EPC-MV-de mõju AngII poolt indutseeritud PRK-de oksüdatiivsele stressile, põletikule, rakkude vohamisele, apoptoosile ja tsüklile. PRK vigastusmudel loodi angiotensiin II (Ang II) abil. Pärast Ang II induktsiooni vähenes PRK vohamine, suurenes apoptoos ja rakutsükkel blokeeriti G1 faasis enne S-faasi sisenemist. Leiti, et reaktiivsete hapnikuliikide ja malondialdehüüdi sisaldust suurendati, samas kui glutatiooni peroksüdaasi ja superoksiidi dismutaasi tase vähenes. Lisaks suurenes oluliselt põletikuliste tsütokiinide IL-1β, IL-6 ja TNF-α tase. Seega kahjustas Ang II PRK-sid, stimuleerides oksüdatiivset stressi ja edendades põletikulist reaktsiooni. Kui aga PRK-d olid koos EPC-dega, vähenes Ang II põhjustatud kahju märkimisväärselt. Käesolevas uuringus koguti EFC-de poolt sekreteeritud mikrovesikuleid ja kasvatati neid Ang II indutseeritud PRK-dega ning tehti kindlaks, et EPC-MV-d säilitasid oma kaitsva mõju PRK-dele. Kokkuvõtteks võib öelda, et EFC-d kaitsevad PRK-sid Ang II põhjustatud kahjustuste eest sekreteeritud MV-de kaudu.
CISTANCHE PARANDAB NEERU-/NEERUHAIGUST
Sissejuhatus
Hüpertensioon on riskifaktor südame-veresoonkonna ja tserebrovaskulaarsete haiguste esinemissageduse ning nendega seotud suremuse tekkeks (1). Neerudvõib põhjustada hüpertensiooni ja on üks hüpertensioonikahjustuste sihtorganeid (2). Kroonilineneeruhaigus(CKD) on viimase kahe aastakümne jooksul (3,4) olnud üks peamisi suurenenud suremuse põhjuseid kõrge vererõhuga inimeste seas kogu maailmas (3,4). Seega on hädavajalik edendada hüpertensiivse nefropaatia ravi ja uurida selle patoloogilist mehhanismi. Varasemad uuringud on näidanud, et angiotensiin II (Ang II) indutseeris vaskulaarset kahjustust ja mängis olulist rolli vaskulaarsetes haigustes mitmete mehhanismide kaudu, nagu apoptoosi (5), rakutsükli seiskumine (6), reaktiivsete hapnikuliikide (ROS) taseme tõus (7), oksüdatiivse stressireaktsiooni soodustamine malondialdehüüdi (MDA) sekretsiooni suurendamise ja glutatiooni peroksüdaasi (GSH-Px) ja üleoksiidi dismutaasi (SOD) sekretsiooni vähendamine (8,9). Ang II soodustab ka põletikuga seotud tegurite, nagu IL-6, IL-1β ja TNF-α (10-12) tootmist. Seetõttu on hüpertensiooni modelleerimiseks kasutatud Ang II poolt põhjustatud kahjustusi in vitro, sealhulgas primaarsel rotil.neerrakud (PRK-d) (13,14).
Patsientidele, kellelneerufunktsioonkahjustus, endoteelirakkude kahjustused ning regenereerimise ja remondi vähenemine on peritubulaarsete mikrovesikulite kadumise peamised põhjused (MV-d) (15). Luuüdist saadud endoteeli eellasrakud (EPCd) võivad soodustada endoteeli parandamist (16,17). Varasemad uuringud on näidanud, et EFC-d võivad parandada südame-veresoonkonna taastumist (18) ja reguleerida angiogeneesi (19) ning avaldada terapeutilist toimet ägedaleNeeruisheemia-reperfusiooni vigastus (20) ja patsientidel, kellelneerusiirdamine(21). Kuid meie teada ei ole EFC-de mõju hüpertensiivsele nefropaatiale varem teatatud. Me oletasime, et EPC-del võib olla kaitsev toime hüpertensiivse nefropaatia vastuNeeruLahtrid. MV-sid sekreteerivad pidevalt mitmesugused rakud kehas, nagu epiteelirakud, kasvajarakud ja tüvirakud, ning need eksisteerivad mitmes kehavedelikus, näiteks veres, uriinis ja piimas, kus nad vahendavad bioloogilisi funktsioone (22). Tõendite kogumine on näidanud, et EPC-de kaitsev toime on tihedalt seotud MV-de vabanemisega (23,24) Käesolevas uuringus uuriti EPC-MV-de võimalikku kasutamist hüpertensiivse nefropaatia raviks, uurides kaitsvaid mõjusid ja mehhanisme, mille kaudu EPC-MV-d kaitsevad Ang II poolt indutseeritud PRK vigastuse eest, et anda bioloogiline teoreetiline alus hüpertensiivse nefropaatia raviks.
Märksõnad:EPC-MV-d, hüpertensiivne nefropaatia, Ang II, ROS, MV-d, põletik, neerud, neerud
Materjalid ja meetodid
Loomade.Kokku saadi Pekingi Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.-lt (litsentsi nr. SCXK, Guangdong, 2015-0063). Rotid paigutati püsiva temperatuuri ja niiskusega ruumi (temperatuur, 23±2 °C; niiskus, 50±10%) 12-h heleda/tumeda tsükli all, kus ad libitum pääses standardsele rotitoidule ja veele polüstüreeni puuris. Kõik loomkatsed kiitis heaks Hainani meditsiiniülikooli loomahoolduse ja -kasutuse komitee (Haikou, Hiina; heakskiidu nr. HYLL-2021-053) ja viidi läbi vastavalt riiklikele tervishoiuinstituutide suunistele (25).
CISTANCHE PARANDAB NEERU/NEERU FUNKTSIOONI
PRK-de isoleeritus ja kultuur.WKY rotid, kellel on vaba juurdepääs veele, on enne katset paastunud 12 tundi. WKY hiired eutaniseeriti pentobarbitaalse naatriumi (200 mg/kg kehakaalu) intraperitoneaalse süstimise teel, seejärelNeerudeemaldati aseptiliselt ja kortikaalne osaneervõeti maha ja siirdati väikesesse keeduklaasi. Neeruajukoor lõigati ~1 mm3 koefragmentideks , pesti kolm korda PBS-iga (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc.), tsentrifuugitud 1000 x g juures 25 °C juures 5 minutit ja supernatant visati ära. Koe fragmendid lisati I tüüpi kollageenaasile (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc.) lõppkontsentratsioonis 1 g/l ning koefragmendid võnguti ja seediti 37 °C juures 30 minutit. Pärast filtreerimist läbi 200-võrgusilma (0,075 mm) roostevabast terasest ekraani eraldati rakud Ficolliga (Sigma-Aldrich; Merck KGaA) tiheduse gradient tsentrifuugimine (26). Pärast tsentrifuugimist 1000 x g juures 25 °C juures 2 minutit koguti vahevedrustus ja segati MEM/F12 söötmega (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc.), inokuleeritud 6-kaevulises plaadis ja kultiveeritud temperatuuril 37 °C alla 5% CO2. 24 tunni pärast eemaldati ja asendati söötme värske söötmega ning kinnitamataNeerurakud ja kude visati ära. 48 tunni pärast eemaldati sööt uuesti, rakke pesti kaks korda PBS-iga ja neid tähistati PRK-dena (27,28); peamine koosseis oli roti glomerulaarsed mesangiaalsed rakud. PRK-sid kasvatati kolm põlvkonda ja neid töödeldi Ang II-ga (1 μM; Sigma-Aldrich; Merck KGaA) 37 °C juures 24 tunni jooksul PRK loomiseksneerukahjustusedMudel. Ang II poolt indutseeritud põletik rotisNeerutorukujulised epiteelirakud viidi läbi nii, nagu varem kirjeldas Nair et al (29).
PRK-d tuvastati immunofluorestsentsanalüüsi (IF) abil.Pärast loputamist kolm korda PBS-iga ja kinnitamist 4% paraformaldehüüdiga 25 °C juures 1 h jooksul inkubeeriti rakud (25 °C) triton X-100-ga 2 tunni jooksul, millele järgnes 5% BSA (Beijing Solar Science & Technology Co., Ltd.) 25 °C juures 30 minutiks. Seejärel inkubeeriti PRK-d üleöö pimeduses α-silelihase aktiiniga (α-SMA; 1 μg/ml; kass. ab7817; Abcam) ja vimentin (1:250; kass nr. ab92547; Abcam) temperatuuril 4 °C. Pärast loputamist kolm korda PBS-iga inkubeeriti rakud Alexa Fluoriga® 488- (1:100; kass nr. ab150077; Abcam) või 647-märgistusega (1:200; kass. Ei. ab150075; Abcam) sekundaarsed antikehad temperatuuril 37 °C 1 h. Seejärel värviti rakud DAPI-ga (0,5 μg/ml; Beyotime'i biotehnoloogia instituut) 25 °C juures 5 minutit. Lõpuks jäädvustati pildid fluorestsentsmikroskoobi abil (suurendus, x400; Leica Microsystems GmbH).
Euroopa majanduspartnerluste kultuur ja identifitseerimine.Rottide reieluu ja sääreluu tükeldati ja iga luuüdi toru loputati steriilse PBS-iga. Saadud segu tsentrifuugis (1000 x g; 25 °C; 15 min) ja osakesed peatati uuesti MEM/F12 keskkonnas. Rakud isoleeris Ficoll (Sigma-Aldrich; Merck KGaA) tihedusega gradienttsentrifuugimine (1000 x g; 25°C; 20 min) ja asetatakse fibronektiiniga (BD Biosciences) kaetud 25 cm2 kultuurikolbi. Rakke hoiti standardtingimustes (37 °C; 5% CO2) täielikus keskkonnas. Kultuurimeediumi muudeti 4 päeva pärast ja kleepuvaid rakke kasvatati veel 3 päeva (30). EPCde tuvastamiseks kasutati dilkompleksi atsetüülitud madala tihedusega lipoproteiini (Dil-Ac-LDL) värvimist (Beijing Solar Science & Technology Co., Ltd.). Kaaskultuurisüsteemi puhul lisati PRK-d (1x104 ) kooskasvatusplaadi alumisele kambrile (Corning, Inc.) 24 h ja seejärel lisati ülemisse kambrisse PRK-d (1x104) ja seejärel Ang II (1 μM) või 200 μl PBS ja EPC (3x104) ning inkubeeriti 37 °C juures 24 tunni jooksul enne täiendava rakufunktsiooni analüüsi tegemist. PRK-de ja EPC-de parima osa sõelumisel olid lahtrinumbri proportsioonid 2:1, 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6 ja 1:7.
EPC-MV-de ettevalmistamine. EPC-sid kasvatati 7 päeva, nagu varem kirjeldatud (30), pesti kaks korda PBS-iga ja seerumit 12 tundi. Seejärel koguti ja tsentrifuugiti kultiveeritud EPC-sid sisaldav MEM/F12 sööt 4 °C juures (1000 x g; 15 min) ja supernatant ekstraheeriti 4 °C juures (100 000 x g; 60 min) sekreteeritud EPC-MV-de kogumiseks. Pärast Pon 812 epoksüvaigu (Structure Probe, Inc.) manustamist paigutati see üleöö 37 °C peale. Seejärel lisati 4 tunniks elektronmikroskoobi fikseerimislahus (Wuhan Service Technology Co., Ltd.) ja uraanatsetaat (2%; Wuhan Service Technology Co., Ltd.) ja pliitsitraat (Wuhan Service Technology Co., Ltd.) värviti 15 minutiks 25 °C juures. Kaaskultuurisüsteemis lisati Transwelli analüüsiplaadi ülemisse kambrisse 50 μg/ml EPC-MV-d (31) ning alumisele kambrile lisati pargid, nagu eelnevalt kirjeldatud, ja inkubeeriti 24 h.
Rakkude vohamise analüüs.PRK-d lagundati trüpsiiniga, inokuleeriti 96-kaevulistes plaatides tihedusega 3x103 rakke / kaevu ja kasvatati 24 tundi. Optilist tihedust 450 nm juures mõõdeti 10 μl rakkude loendamise Kit-8 reaktiiviga (CCK-8; Pekingi päikeseenergia teadus ja tehnoloogia Co., Ltd.) 37 °C juures 60 min vastavalt tootja juhistele, et hinnata rakkude vohamise kiirust.
CISTANCHE PARANDAB NEERU- / NEERUVALU
Raku apoptoosi analüüs.Raku apoptoosi analüüs viidi läbi lisa V-FITC apoptoosi tuvastamise komplekti (BD Biosciences) abil vastavalt tootja juhistele. PRK-d koristati, pesti kaks korda jääkülma PBS-iga (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc.) ja taaselustatud 500 μl sidumispuhvris. Seejärel inkubeeriti resuspendeeritud PRK-d 5 μl lisandiga V-FITC ja 5 μl PI-ga pimedas 15 minutit temperatuuril 23±2 °C. Raku apoptoosi hinnati voolutsütomeetria (FCM; FACSCanto II; BD FACSChorus™ tarkvara, versioon: 1.0; BD Biosciences).
EPC-MV ja PRK termotuumasüntees.Et jälgida, kas EPC-MV-d sulatati PRK-dega, märgistati EPC-MV-d enne kaasinkubeerimist lipiidide membraaniga sisseehitatud fluorestsentsvärviga (PKH26). Lühidalt kombineeriti 50 μg/ml EPC-MV-d 2 ml PKH26-ga (2x10-6 M; Sigma-Aldrich; Merck KGaA) ja segatud temperatuuril 23±2 °C 5 minutit. Märgistatud segu lisati 2 ml 1% BSA-le (v) ja tsentrifuugeeriti 100 000 x g juures 4 °C juures 60 minutit, seejärel loputati külma PBS-iga. Sade peatati 1 ml MEM/F12 keskkonnas, lisati PRK-dele ja inkubeeriti 37 °C juures 24 tunniks. Lõpuks lisati 1 μg/ml DAPI tuuma värvimiseks 25 °C juures 15 minutiks. Rakupildid omandati fluorestsentsmikroskoobi abil (suurendus, x400; Leica Microsystems GmbH).
Rakutsükli analüüs.Rakutsükli analüüs viidi läbi rakutsükli tuvastamise komplekti (BD Biosciences) abil. EPC-d või PRK-d (1x106) koristati, pesti kaks korda PBS-iga ja kinnitati seejärel 500 μl 70% jääkülma etanooli 2 h-le 25 °C juures. Seejärel pesti rakke kaks korda külma PBS-iga ja inkubeeriti PI-s (400 μl) ja RNase'is (100 μl) 30 minutit pimedas 37 °C juures. PI-signaal tuvastati FCM-i (FACSCanto II) abil. G1, S ja G2 faasi lahtrite protsente loendati ja võrreldi FlowJo tarkvara abil (versioon 10.0.6; FlowJo OÜ).
ROS-i mõõtmine FCM-i järgi.PRK-d kasvatati 60-70% -ni ja koristati trüpsiinimise teel. Kõiki rakke inkubeeriti 1,0 μM 2',7'-diklorodihüdrfluorestseiini diatsetaadiga 15 minutit 37 °C juures. Seejärel pesti rakke kaks korda PBS-iga ja analüüsiti FCM-i kaudu, et tuvastada ROS,488 nm laserit ergastamiseks ja 535 nm laserit avastamiseks.
ELISA.Pärast tsentrifuugimist (1000 x g; 25 °C; 5 min) koguti iga alarühma raku supernatant, et analüüsida MDA, GSH-Px, SOD ja põletikuliste tegurite IL-6, IL-1β ja TNF-α taset. Vastavalt tootja juhistele kasutati järgmisi komplekte: Micro MDA analüüsikomplekt (kass. Ei. BC0020; Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.), GSH-Px analüüsikomplekt (kass nr. BC1195; Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.), SOD aktiivsuse tuvastamise komplekt (kass nr. BC0170; Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.), rott IL-1β ELISA komplekt (kass nr. RLB00; R&D Systems, Inc.), rott IL-6 Quantikine ELISA komplekt (kass nr. R6000B; R&D Systems, Inc.) ja rott TNFα Quantikine ELISA komplekt (kass. Ei. RTA00; R&D Systems, Inc.).
Statistiline analüüs.Kõiki katseid korrati kolm korda ja kõiki andmeid väljendatakse keskmise ± SD. Andmeid analüüsiti SPSS-tarkvara versiooni 21.0 (IBM Corp.) abil. Mitme rühma vahelisi erinevusi hinnati ühesuunalise ANOVA ja Dunnetti post hoc testi abil. P<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">
Tulemused
Isoleeritud epc-de ja PRK-de tuvastamine. Isoleeritud EPC-d tuvastati Dil-Ac-LDL-i värvimise abil (joonis 1A). Mikroskoopiline loendamine näitas, et punase (Dil-Ac-LDL värvimine) ja sinise (tuumavärvimine DAPI-ga) fluorestsentsi kokkusattumise aste oli >90%, kinnitades, et EPC-d olid edukalt isoleeritud. Isoleeritud PRK-sid analüüsiti IF-i (vimentin / α-SMA) kaudu. Tulemused näitasid, et vimentin/α-SMA ekspressioonitase PRK-des oli kõrge ja positiivne, mis viitab PRK-de edukale isoleerimisele (joonis 1B).
EFC-de optimaalne suhe PRK-desse.Uuriti PRK-de/EPCde erinevate proportsioonide kombineerimise mõju kaaskultuurisüsteemis ning leiti, et suhtega 1:3 PRK-de/EPC-de suhtega kasvatatud PRK-d ei suurendanud levikumäära võrreldes PRK-de suhtega 2:1, 1:1 või 1:2 (joonis 1C). Lisaks suurendas EFC-de osakaalu suurenemine (1:4, 1:5, 1:6 ja 1:7) prk-de vohamist märkimisväärselt võrreldes euroopa tehnoloogiapõhiste majanduspartnerluslepingutega (1:3). Seetõttu valiti edasisteks uuringuteks suhe 1:3 PRK-d/EPC-d, et vältida ülemääraste epc-de võimalikku sekkumist järgnevates katsetes.
EPC kaaskultuuri mõju Ang II poolt põhjustatud kahjustustele.PRK-d (1x104) nakatati 24 tundi ette Transwelli plaadi alumisse kambrisse. Ülemine kamber sisaldas kontrollrühmas 200 μl PBS-i ja katserühmas 200 μl EPC-d (3x104). Modelleerimiseksneerukahjustused,Alumisele sektsioonile lisati 1 μM Ang II. Pärast 24 tunni möödumist tehti CCK-8 ja FCM analüüsid, et mõõta PRK-de massihävitusrelvade leviku määra.<0.05) proliferation="" rate="" (fig.="" 1d),="" and="" increased="" apoptosis="" rate="" (fig.="" 1e)="" and="" cell="" cycle="" arrest="" in="" the="" g1="" phase="" (fig.="" 1f)="" compared="" with="" the="" control="" group,="" while="" prks="" co‑cultured="" with="" epcs="" receiving="" ang="" ii="" showed="" the="" reverse="" effects.="" these="" results="" indicated="" that="" co‑culture="" with="" epcs="" can="" reduce="" the="" damage="" induced="" by="" ang="" ii="" in="" a="" rat="">neerlahtri mudel.
EPC-d kaitsevad PRK-sid Ang II poolt põhjustatud kahjustuste eest, uuriti Ang II poolt indutseeritud oksüdatiivse stressi taset EPC-dega koos kasvatatud PRK-des. FCM-i analüüsi tulemused näitasid, et Ang II suurenes oluliselt (P<0.05) the="" levels="" of="" ros="" in="" prks="" in="" the="" absence="" of="" epcs,="" while="" prks="" co‑cultured="" with="" epcs="" had="" comparatively="" lower="" ros="" levels="" (fig.="" 2a).="" similarly,="" the="" elisa="" results="" indicated="" that="" the="" levels="" of="" secreted="" mda="" (fig.="" 2b)="" were="" increased="" and="" gsh="" and="" sod="" (fig.="" 2c="" and="" d)="" levels="" were="" decreased="" in="" prks="" receiving="" ang="" ii,="" while="" prks="" receiving="" ang="" ii="" and="" co‑cultured="" with="" epcs="">
Joonis 1. PrK-de taastumine kooskultuuri ja EFC-dega pärast Ang II põhjustatud vigastusi. a) EFC-de isoleerimise kinnitamine Dil-Ac-LDL-i värvimise teel. Suurendus, x100. b) PRK-de isoleerituse kinnitamine immunofluorestsentsanalüüsi abil. Suurendus, x400. C) CCK-8 analüüs ühise kultiveeritud epc-de eri proportsioonide mõju kohta PRK>-de levikule. * P<0.05 vs.="" prks:epcs,="" 2:1="" group.="" (d)="" cck‑8="" analysis="" of="" the="" effects="" of="" co‑cultured="" epcs="" on="" the="" proliferation="" rate="" of="" ang="" ii‑treated="" prks.="" fcm="" analysis="" of="" the="" effects="" of="" co‑cultured="" epcs="" on="" the="" (e)="" apoptosis="" and="" (f)="" cell="" cycle="" of="" ang="" ii‑treated="" prks.="" *=""><0.05 vs.="" control;="" #=""><0.05 vs.="" ang="" ii.="" ang="" ii,="" angiotensin="" ii;="" epcs,="" endothelial="" progenitor="" cells;="" prks,="" primary="" rat="">neerrakud; FCM, voolutsütomeetria; CCK-8, rakkude loendamise komplekt-8; Dil-Ac-LDL, Dil kompleks atsetüülitud madala tihedusega lipoproteiin; OD, optiline tihedus; α-SMA, α-silelihasaktiin; NS, ei ole oluline. vastupidised tulemused seoses nende ensüümide sekretsiooniga. Ros-i genereerimine võib seega olla seotud Ang II poolt indutseeritud rakukahjustusega ja seda saab leevendada kooskultuuriga EFC-dega.
Ang II võib kahjustada ka rakke, soodustades põletikuliste tsütokiinide sekretsiooni, samas kui EPC-d võivad ennetada põletikku (32). Seejärel uuriti, kas Ang II soodustab põletikuliste tsütokiinide sekretsiooni PRK-des ja kas EPC-d võivad avaldada oma kaitsvat rolli, pärssides põletikuliste tsütokiinide sekretsiooni. IL-1β, IL-6 ja TNF-α sekretsiooni reguleeriti PRK-des märkimisväärselt Ang II lisamisega. Seevastu ELK-dega koosviidavates PRK-des olid IL-1β, IL-6 ja TNF-α (joonis 2E-G) tasemed suhteliselt madalamad (P.<0.05) than="" those="" in="" prks="" cultured="" alone.="" therefore,="" the="" damage="" induced="" by="" ang="" ii="" in="" prks="" was="" also="" associated="" with="" pro‑inflammatory="" cytokines,="" and="" co‑culture="" with="" epcs="" exerted="" protective="" effects="" by="" reducing="" the="" secretion="" of="" these="">
EFC-de kaitsev toime avaldub MV-de kaudu.Mehhanismid, mille kaudu EFC-d avaldavad kaitsvat mõju Ang II indutseeritudneerrakke analüüsiti edasi, eraldades MV-d EPC-dest (joonis 3A). EPC-MV-d märgistati PKH26-ga ja lisati PRK-dele koos Ang II-ga Transwelli plaadil, nagu eelnevalt kirjeldatud. PKH26 fluorestsents tuvastati PRK-de tsütoplasmas (joonis 3B), mis näitab, et EPC-MV-d olid kokku sulanud PRK-dega. Seejärel leiti, et EPC-MV-d (joonis 3C-E) pärssisid Ang II poolt indutseeritud vohamismäära vähenemist, soodustatud apoptoosi ja tsükli seiskumist G1 faasis. Sarnaselt EPC-dega koos kasvatatud PRK-dele vähendasid EPC-MV-de juuresolekul kasvatatud ja Ang II-ga kokkupuutuvad PRK-d võrreldes Ang II rühmaga ros- ja MDA-d (joonised 4A ja B), GSH ja SOD taseme tõusu (joonised 4C ja D) ning põletikuliste tsütokiinide IL-1β, IL-6 ja TNF-α (joonis 4E-G) sekretsiooni vähenemist võrreldes Ang II rühmaga.
Arutelu
Meile teadaolevalt näitas käesolev uuring esimest korda, et EPC-d võivad kaitsta PRK-sid Ang II poolt põhjustatud rakukahjustuste eest. Seda kaitsvat toimet vahendavad vähemalt osaliselt MV-d, mida eritavad EPC-d ja mis sulanduvad prk-dega kaaskultuuri ajal. Lisades rikastatud MV-sid Ang II-ga kokkupuutuvatele PRK-dele, leiti, et ainuüksi EPC-MV-d võivad kaitsta PRK-sid Ang II poolt põhjustatud kahjustuste eest, pärssides oksüdatiivset stressi ja põletikku. MV-d on määratletud kui membraani nanodebris (0,05-1 μm) (33) ja need heidetakse raku pinnalt pärast aktiveerimist, stressi või apoptoosi. Lisaks võib MV-sid tuletada erinevatest rakutüüpidest, nagu trombotsüüdid, endoteelirakud, EPC-d ja valged verelibled (34,35). MV-d ekspresseerivad spetsiifilisi rakupinna markereid, mis varieeruvad lähteraku ja nende moodustumise poolest ning võivad avaldada põletikuvastast, antikoagulantset ja angiogeenset toimet (36). EPC-dest vabanevad MV-d võivad kanda oma emaraku bioloogilist teavet ja seega avaldada sihtrakkudele sarnast funktsiooni (33). Näiteks EPC-MV-d kaitsevad kardiomüotsüüte Ang II indutseeritud hüpertroofia ja apoptoosi eest (28), parandavad endoteeli funktsiooni ja võimet reguleerida angiogeneesi (37) ning leevendavad oksüdatiivse stressi põhjustatud endoteeli häireid (38). Kuid meie teadmiste kohaselt ei ole EPC-MV-de mõju hüpertensiivsele nefropaatiale varem teatatud. Seetõttu oli käesoleva uuringu eesmärk uurida Epc-ide ja EPC-MV-de võimalikku kaitsvat mõjuneerurakkude vigastus.
Käesolevas uuringus loodi PRK vigastusmudel, tekitades kahju Ang II-ga. Kooskõlas varasemate aruannetega (26,39) vähendas Ang II PRK vohamist, suurendas apoptoosi ja peatas rakutsükli G1 faasis enne S-faasi sisenemist. Nende hüpertensiooniga seotud markerite põhjal jõuti järeldusele, et Ang II poolt indutseeritud PRK hüperpinge mudel loodi edukalt. Lisaks tehti kindlaks, et kooseksisteerimisega EFC-dega kaitses PRK-sid Ang II põhjustatud kahju eest. Pärast EPCde koosinkubeerimist PRK-dega + Ang II-ga vähenesid oksüdatiivse stressiensüümide ja põletikuliste tegurite tase PRK-des. Seega võivad võimalikud mehhanismid, mille kaudu epc-d rakendavad oma kaitsvat mõju PRK-dele, hõlmata oksüdatiivse stressi ja põletiku reguleerimist. Meie teadmiste kohaselt näitas praegune uuring esimest korda, et EPC-d võivad leevendada Ang II poolt indutseeritud oksüdatiivset stressireaktsiooni ja põletikku PRK-des.
Epc-d kaitsevad tõhusaltneerufunktsioonCKD-s (40) ja neil on oluline roll vaskulaarse terviklikkuse säilitamisel ja endoteelikahjustuste parandamisel (15), samuti veresoonte lekke vähendamisel, elundifunktsiooni parandamisel ja sepsise elulemuse suurendamisel (41). Tõendite kogumine viitab sellele, et euroopa majandus- ja elektroonikaseadmetel võib olla kaitsev roll MV-de sekretsiooni kaudu (37,42,43). EPC-MV-de kaitsva toime testimiseks PRK-des isoleeriti EPC-MV-d ja märgistati PKH26-ga ning seejärel inkubeeriti märgistatud MV-d PRK-dega + Ang II-dega. EPC-MV-d sulandusid PRK-dega ja pärssisid oluliselt Ang II poolt indutseeritud oksüdatiivset stressivastust ja põletikku ning need tulemused on sarnased Fu jt (44) tulemustega. EPC-MV-de inhibeeriv toime oksüdatiivse stressiensüümide tasemele oli suurem kui ainult EPC-del; selle põhjuseks võib olla asjaolu, et MV-d on EPC-MV-dega ravitud PRK-des suuremas kontsentratsioonis kui epc-dega koosviidavates sagedustes. Need leiud viitavad sellele, et EPC-de kaitsev mõju PRK-dele Ang II poolt indutseeritud rakukahjustuste vastu võib sõltuda sekreteeritud MV-dest. Käesoleva uuringu piirang on see, et võimalikke mehhanisme, mille kaudu EPC-MV-d reguleerivad mikroRNA-/mRNA-sid/signaaliläbilasketelge, ei uuritud täielikult. Roll ja mehhanismid, mille kaudu EPC-MV-d kaitsevadneerukahjustusedtuleks hinnata hüpertensiivse nefropaatia loommudelis, mis on paljutõotav suund tulevasteks uuringuteks. Kokkuvõtteks võib öelda, et käesolev uuring näitas, et EPC-d võivad kaitsta PRK-sid Ang II poolt indutseeritud oksüdatiivse stressi ja suurenenud põletiku eest MVde sekretsiooni kaudu. See annab uudse suuna hüpertensiivse nefropaatia raviks ja kehtestab in vitro mudeli õppimiseks.neerukahjustus.
