Danegaptiid hoiab ära TGF-i 1-indutseeritud kahjustuse inimese neeru proksimaalsete tuubulite epiteelirakkudes
Mar 12, 2022
Abstraktne:Kroonilineneeruhaigus(CKD) on ülemaailmne terviseprobleem, mis on seotud mitmete kaasuvate haigustega. Hiljutised tõendid viitavad adenosiintrifosfaadi (ATP) suurenenud poolkanali poolt vahendatud vabanemisele tubulointerstitsiaalse fibroosi progresseerumisel, mis on kroonilise neeruhaiguse peamine patoloogia. Siin hindame danegaptiidi mõju poolkanali poolt vahendatud muutuste blokeerimisele valkude ekspressioonis ja funktsioonis, mis on seotud haiguse progresseerumisega tubulaarses epiteelisneerudrakud. Inimese primaarseid proksimaalseid tuubuli epiteelirakke (hPTEC) töödeldi pro-fibrootilise tsütokiini transformeeriva kasvufaktori (TGF 1) ± danegaptiidi beeta1 isovormiga. qRT-PCR ja immunoblotanalüüs kinnitasid mRNA ja valgu ekspressiooni, samas kui tsütokiini antikehade massiiv hindas põletikueelsete ja profibrootiliste tsütokiinide ekspressiooni/sekretsiooni. Karboksüflfluorestseiini värvi omastamine ja ATP biosenseerimine mõõdeti poolkanali aktiivsust ja ATP vabanemist, samal ajal kui paratsellulaarse läbilaskvuse hindamiseks kasutati transepiteliaalset elektritakistust. Danegaptiid eitas karboksüfluorestseiini värvi omastamist ja ATP vabanemist ning kaitses torukujulise vigastusega seotud valgu muutuste eest. Cx43-vahendatud ATP vabanemise blokeerimisega kaasnes rakutsükli inhibiitorite, adherentide ja tihedate ühendusvalkude ekspressiooni osaline taastamine ning vähenenud paratsellulaarne läbilaskvus. Lisaks pärssis danegaptiid TGF-i 1-indutseeritud muutusi peamiste adipokiinide, tsütokiinide, kemokiinide, kasvufaktorite ja interleukiinide ekspressioonis ja sekretsioonis. Andmed viitavad sellele, et danegaptiidil on lünkühenduse modulaatori ja poolkanali blokaatorina potentsiaali kroonilise neeruhaiguse edaspidises ravis.
Märksõnad:danegaptiid; konneksiin; poolkanal; ATP; krooniline neeruhaigus; põletik; fibroos; hPTEC-id; TGF 1; neerud, neerud
CISTANCHE PARANDAB NEERU-/NEERUHAIGUST
Sissejuhatus
Kroonilineneeruhaigus(CKD) on kasvav terviseprobleem, mis on seotud suurenenud südame-veresoonkonna haiguste ja haigestumuse riskiga [1]. Arvatakse, et see mõjutab 10 protsenti maailma elanikkonnast [2], on riskitegurid vanus, diabeet, hüpertensioon, düslipideemia ja rasvumine [3]. Seda haigust iseloomustab glomerulaarfiltratsiooni kiiruse (GFR) langus, lisaks proteinuuriale, glomeruloskleroos, tubulaarne atroofia ja tubulointerstitsiaalne fibroos (TIF), mis on tavalised histopatoloogilised muutused [4]. Kulmineerudes epiteeli stabiilsuse kadumise, püsiva põletiku ja ekstratsellulaarse maatriksi suurenenud ladestumisega [5, 6], on TIF-i ja kaugelearenenud kroonilise neeruhaiguse ravi rahuldamata kliiniline vajadus [3]. Järelikult on vaja kiireid ravimeetodeid. Muutunud konneksiini (Cx) ekspressioon ja funktsioon on seotud haiguse erinevate vormide patoloogiaga (nagu on läbi vaadatud punktis [7]), sealhulgas kroonilise neeruhaigusega (vaadatud punktis [8, 9]). Konneksiinid on membraaniga seotud valkude perekond, mis oligomeriseerub heksameerseteks kooslusteks, mida nimetatakse konneksoniteks [10]. Kui naaberrakud joonduvad, ühenduvad konneksonid, et moodustada vaheühendused, pidevad poorid, mille kaudu saab sõnumimolekule vahetada, võimaldades otsest suhtlusteed [10]. Seondumata moodustavad konneksonid poolkanalid, mille kaudu molekule, nt adenosiintrifosfaati (ATP), saab lokaalsesse ekstratsellulaarsesse ruumi vabastada, et mõjutada naaberrakke purinoretseptorite aktiveerimise kaudu [11]. Purinergilise P2X7 retseptori (P2X7R) ekspressioon on organismis ülesreguleeritudneeru-diabeetikute tuubulidneeruhaigus[12] ja on olnud tugevalt seotud fibroosi progresseerumisega niineerud[13–17] ja teistes koetüüpides [18–21]. Pole üllatav, et purinergilise signaalimise sihtimine on pälvinud märkimisväärset tähelepanu. Kuid siiani ei ole kliinilised uuringud näidanud P2X7R antagonismi kasulikku toimet paljude põletikuliste seisundite korral, mis võib olla seotud retseptori geneetilise variatsiooniga [22]. ATP vabanemisest ülesvoolu suunamine aitaks nendest probleemidest mööda hiilida.
Tõendid seovad konneksiinide ebanormaalset ekspressiooni ja/või aktiivsust kroonilise neeruhaiguse erinevate vormidega [12, 23-26]. Abedi jt esialgsed uuringud. teatasid, et heterogeensetel (Cx43 pluss /-) hiirtel, kellel oli ühepoolne kusejuha obstruktsioon (UUO), vähenes ekstratsellulaarse maatriksi (ECM) ladestumine ja vähenes põletik [27], samas kui Cx43-spetsiifiline mimeetikum GAP{{6} }, suutis pärssida monotsüütide adhesiooni ja nüristada kollageeni I ekspressiooni reniinist sõltuva kroonilise neeruhaiguse reniini transgeeni (RenTG) hiiremudelis [25]. Hiljuti tuvastasime, et proksimaalses tuubulis ekspresseeritud domineeriv konneksiini isovorm Cx43 on diabeetilise nefropaatiaga inimestelt eraldatud biopsia materjalis kõrgem. See tähelepanek on paralleelne poolkanali poolt vahendatud ATP suurenenud vabanemisega TGFp{11}}ravitud esmases ravis. proksimaalsed tuubulirakud [12]. Hinnates rakuvälise ATP kontsentratsiooni lokaalse suurenemise mõju, tegime kindlaks, et aberrantne Cx43-vahendatud side käivitab P2X7R aktiveerimise kaudu adherentide (nt E-kadheriin) ja tihedate (nt Zona Occludens) ühenduskomplekside lahtiühendamise. Need mõjud, mis UUO heterogeenses Cx43 pluss/-hiire mudelis eitati [12], viitavad selgele seosele Cx43 ja torukujulise vigastuse vahel. Kuigi Cx43 osaline ablatsioon kinnitab konneksiinide rolli tubulaarse vigastuse fenotüüpiliste muutuste algatamisel, tuvastas farmakoloogiline sekkumine Cx43 poolkanali blokeerija peptiidiga5, et selle vähenenud Cx43 aktiivsuse kaitsev olemus tuleneb poolkanali poolt vahendatud ATP vabanemise pärssimisest. Mimeetiliste peptiidide kasutamist poolkanali aktiivsuse blokeerimise taga oleva kaitsva olemuse rõhutamiseks on edukalt kirjeldatud ka teiste haigusmudelite puhul, sealhulgas retinopaatia [28], neuropõletik [29], glioom [30, 31] ja vanusega seotud kollatähni degeneratsioon [32, 33]. Lõppkokkuvõttes seostavad uuringud muutunud konneksiini aktiivsust suurenenud põletikuga [34-36] ja fibroosiga [37-40] ning viitavad sellele, et stabiliseeriv poolkanali- ja/või vaheühenduse vahendatud side (GJIC) võib kahjustuse teket edasi lükata. täheldatud erinevate vigastusmudelite puhul. Järelikult on konneksiini poolkanalite inhibeerimine atraktiivne vahend põletiku vähendamiseks ja pakub märkimisväärset terapeutilist huvi.
Danegaptiid ((2S, 4R)-1-(2-aminoatsüül)-4-bensamidopürrolidiin2-karboksüülhape), tuntud ka kui ZP1609 või GAP-134, on väike rotigaptiidist tuletatud dipeptiid (AAP10, ZP123). Algselt välja töötatud arütmiavastase ainena [41], see interakteerub Cx43-ga [42] ja toimib tugeva vaheühenduse modifikaatorina [43]. Ühend on näidanud kaitsvaid ja antiarütmilisi omadusi ning on varem näidanud märkimisväärset toimet südame isheemiliste-reperfusioonikahjustuste väljakujunenud prekliinilistes mudelites [44, 45]. Kuigi 2. faasi kliinilised uuringud inimestega ei vastanud kahjuks oma lõpp-punktile [46], on teiste rühmade uuringud uurinud danegaptiidi terapeutilist potentsiaali teiste koetüüpide ja haigusmudelite puhul [41, 47–49]. Veelgi enam, kuigi selle rollist poolkanali aktiivsuse moduleerimisel on vähe teada, on näidatud, et danegaptiid vähendab poolkanali poolt vahendatud värvi omastamist C6 glioomirakkudes [43]. Sellele vaatamata tuleb veel kinnitada selle ühendi roll poolkanali poolt vahendatud ATP vabanemise blokeerimisel teistes koetüüpides.
CISTANCHE PARANDAB neeru-/NEerupuudulikkust
Käesolevas uuringus uuriti danegaptiidi efektiivsust konneksiini poolt vahendatud poolkanali ATP vabanemise eitamisel primaarsetes TGF-i 1-töödeldud inimese proksimaalsetes tuubulite epiteelirakkudes (hPTEC), enne kui piiritleti selle kaitsvat rolli ekspressiooni ja funktsionaalsete muutuste vastu, mida tavaliselt seostatakse progresseerumisega. tubulointerstitsiaalne fibroos. Kasutades meetodeid ekspressioonimuutuste (qRT-PCR, immunotsütokeemia, immunoblotanalüüs, antikehade massiivid) ja funktsioonide (ATP biosenseerimine, värvi omastamine, transepiteliaalne elektritakistus, antikehade massiivid) määramiseks, näitavad meie leiud, et danegaptiidi nanomolaarsed kontsentratsioonid blokeerivad Cx poolkanali vahendatud ATP. vabastavad ja osaliselt nõrgendavad TGF-i 1-indutseeritud muutusi rakutsükli valkude (nt p16, p21, tsükliin D1) ja renoprotektiivsete tegurite (nt Klotho) ekspressioonis. Lisaks vähendab danegaptiid torukujuliste vigastuste korral sageli täheldatud muutusi, sealhulgas adhereeni ühenduste lahtiühendamist (sealhulgas E-kadheriini kadu) ja tihedaid ühendusi (sealhulgas zona occludens 1 (ZO{10}}) ja claudin 2 kadu). Oluline on see, et proteoomiprofiili massiiv näitas danegaptiidi võimet taastada TGF 1 poolt indutseeritud rakuvälise maatriksi võtmevalkude, adipokiinide, kemokiinide ja kasvufaktorite ekspressiooni ja sekretsiooni muutusi. Järelikult näitavad meie in vitro andmed, et danegaptiidi (50–100 nM) ) suudab edukalt blokeerida poolkanali vahendatud ATP vabanemist primaarsetes hPTEC-des ja kaitsta osaliselt põletiku ja fibroosiga seotud muutuste eest, nagu on täheldatud kroonilise neeruhaiguse hilises staadiumis.
2. Tulemused
2.1. Danegaptiid ei mõjuta tubulaarsete epiteelirakkude elujõulisustInimeneneerud2 (HK2) rakke kultiveeriti madala glükoosisisaldusega (5 mM) 48 tundi, enne kui neid nälgiti üle öö ja seejärel töödeldi TGF 1 optimaalse kontsentratsiooniga (10 ng/mL) [12,24] ± danegaptiidiga (50). nM–1 µM) 48 tunni jooksul (joonis 1A, n=3). 3-(4,5-dimetüültiasool-2-üül)-2,5-difenüültetrasooliumbromiidi (MTT) analüüs kinnitas, et kumbki TGF 1 (101,9 ± 11,7 protsenti) ega danegaptiid üksi ei muutnud rakkude elujõulisust (95,2 ± 7 protsenti (50 nM), 103 ± 5,7 protsenti (100 nM) ja 96,6 ± 5,3 protsenti (1 uM)) võrreldes kontrollidega. Toime ei täheldatud, kui TGF-ga 1--ga töödeldud rakke inkubeeriti koos danegaptiidiga (104,1 ± 2,2 protsenti (50 nM), 93,4 ± 1,6 protsenti (100 nM) ja 89,3 ± 3,7 protsenti (1 µM)). Nende andmete kinnitamiseks viidi läbi kristallvioleti (CV) ja laktaatdehüdrogenaasi (LDH) test. LDH vabanemine TGF-i 1-töödeldud rakkudes oli võrreldav kontrollidega (109,3 ± 11,3 protsenti) ja koosinkubeerimisel danegaptiidiga ei olnud täiendavat mõju (106,4 ± 11,6 protsenti (50 nM), 113,9 ± 15,6 protsenti (10) ja 113,2 ± 4,3 protsenti (1 uM)). Ootuspäraselt ei muutnud danegaptiid üksi LDH vabanemist oluliselt võrreldes kontrollidega (104,4 ± 4,3 protsenti (50 nM), 95,3 ± 4,7 protsenti (100 nM) ja 92,6 ± 3,3 protsenti (1 uM)). Rakkude värvimine kristallvioletiga võttis need leiud kokku, kusjuures andmed TGF 1 (10 ng/ml; 96,9 ± 7,3 protsenti) ja TGF 1 pluss danegaptiidi (50 nM–1 µM) kohta olid võrreldavad kontrollidega (98,2 ± 1,9 protsenti) (50 nM) 97,5 ± 1,8 protsenti (100 nM) ja 85,8 ± 5,3 protsenti (1 µM) Lõpuks ei muutnud danegaptiid üksi kristallvioletset värvumist (98,3 ± 2,5 protsenti (50 nM), 99,6 ± 2,7 protsenti (100 nM) ja 100,8 nM. 2,2 protsenti (1 µM) kontrollidest.) Nende andmete valguses valiti järgnevateks uuringuteks kontsentratsioon 50–100 nM.
Joonis 1. Danegaptiid hoiab ära TGF-i 1-indutseeritud poolkanali poolt vahendatud värvaine omastamise suurenemise. Paneelil (A) inimeneneerud2 (HK2) rakku kultiveeriti madala glükoosisisaldusega (5 mM) ± TGF 1 (10 ng/mL) ± danegaptiidis (50, 100 ja 1000 nM) 48 tundi ja rakkude elujõulisus oli hinnatud. Tulemused on esitatud keskmisena ± SEM (n=3). Inkubeerimine TGF 1-ga (10 ng/mL ± danegaptiid (50–1000 nM)) ei muutnud 3-(4,5-dimetüültiasool-2-üül)-2,{{ 19}}difenüültetrasooliumbromiidi (MTT) omastamine, laktaatdehüdrogenaasi (LDH) vabanemine või kristallvioletne (CV) värvimine. Paneelidel (B) ja (C) kasutati karboksüfluorestseiini värvi omastamist, et hinnata poolkanali aktiivsust HK2 rakkudes ja inimese proksimaalsetes tuubulite epiteelirakkudes (hPTEC), kusjuures värvi koormuse määr oli otseselt võrdeline avanemisega. Rakke kultiveeriti madala glükoosisisaldusega (5 mM) ± TGF1 (10 ng/ml) ± danegaptiidis (50 või 100 nM) 48 tundi. Danegaptiid takistas TGF-i 1-kutsutas esile karboksüflfluorestseiini värvaine omastamise suurenemise HK2 rakkudes (paneel (B)) ja hPTEC-des (paneel (C)). Kontrollrakkudes esines minimaalne värvikoormus, samal ajal kui TGF 1-ga töödeldud rakkudes suurenes värvikoormus märkimisväärselt. Danegaptiidi (50 või 100 nM) lisamine vähendas värvi omastamist, viies FL fluorestsentsi intensiivsuse tagasi kontrolltasemetele. Intensiivsust väljendatakse protsentides võrreldes madala glükoosisisaldusega kontrollidega ja see esindab kolme erinevat katset. Andmed on esitatud kui keskmine ± SEM (n=3) koos võtmetähtsusega (** p < 0,01,="" ***="" p="">< 0,001;="" ühesuunaline="" anova="" ja="" tukey="">
2.2. Danegaptiid blokeerib TGF-i 1-tekitanud muutused poolkanali poolt vahendatud värvaine omastamises toruepiteelirakkudesOleme varem näidanud, et TGF 1 suurendab Cx43-vahendatud poolkanali aktiivsust ja ATP vabanemist proksimaalsetest tuubulite epiteelirakkudest [24]. Karboksüflfluorestseiini värvi omastamise testi kasutati selleks, et teha kindlaks, kas danegaptiid võib eitada TGF-i 1-indutseeritud värvi omastamist HK2 rakkude ja primaarsete hPTEC-de poolkanalite kaudu. Ootuspäraselt suurendas TGF 1 (10 ng/mL) värvaine omastamist HK2 rakkudes 354,9 ± 32,6 protsendini kontrollidest, samal ajal kui koosinkubeerimine danegaptiidiga (50 nM ja 100 nM) nõrgenes oluliselt. vastus vastavalt 165,5 ± 17,9 protsendile ja 147,6 ± 18,1 protsendile (joonis 1B; p väiksem või võrdne 0,001, n=4). Danegaptiid üksi ei muutnud värvaine omastamist. Karboksüflfluorestseiini värvaine omastamist suurendas TGF 1 (10 ng/ml) primaarsetes hPTEC-des (310,8 ± 38,6 protsenti kontrollidest), mis on osaliselt ümber lükatud danegaptiidi (100 nM; 145 ± 19,7 protsendiga võrreldes) koosinkubeerimisega kontrollrühmaga. (Joonis 1C; p väiksem või võrdne 0,01, n=4).
2.3. Danegaptiid eitab TGF-i 1-indutseeritud poolkanali poolt vahendatud ATP vabanemist HK2 rakkudesEt teha kindlaks, kas danegaptiid (5{{10}}–100 nM) võib takistada TGF 1 (10 ng/mL) poolt indutseeritud ATP vabanemist HK2 rakkude poolkanalitest kasutasime ATP biosenseerimist [24,50]. TGF 1 (10 ng/mL) suurendas ATP vabanemist 0,33 ± 0,11 µM väärtuseni 3,60 ± {{40} },29 µM (joonis 2A, B, E; p väiksem või võrdne 0,001), efekt, mille danegaptiid osaliselt eitab mõlema 50 nM juures (1,90 ± 0,26 µM; p väiksem või võrdne 0,01 ) ja 100 nM (0,79 ± 0,19 uM; p väiksem või võrdne 0,001) (joonis 2D, E, n=3, kuus kordust proovinumbri kohta). Danegaptiid üksi ei mõjutanud ATP vabanemist (joonis 2C, E), ATP tasemed registreeriti 0,35 ± 0,10 uM (50 nM) ja 0,31 ± 0,09 uM (100 nM) võrreldes kontrollidega (joonis 2E).
2.4. Danegaptiid muudab TGF-i 1-indutseeritud muutused rakutsükli valkudes ja Reno-kaitse marker hPTEC-desEt teha kindlaks, kas danegaptiid võib tühistada tavalise rakutsükli ja renoprotektiivsete markerite poolkanali poolt vahendatud regulatsiooni, inkubeeriti hPTEC-sid TGF 1-ga (10 ng/mL) ± danegaptiidiga (100 nM) 12 tundi ja kandidaatgeeni mRNA ekspressiooni hinnati qPCR analüüsi abil. Danegaptiidi lisamine TGF 1--ga töödeldud hPTEC-dele tagastas p16 ekspressiooni 358,8 ± 21,1 protsendilt 193 ± 18,5 protsendile kontrollidest, p21 ekspressiooni 221,8 ± 12,9 protsendilt 142,2 ± 6,2 tsükliini D ekspressioonile 7 ± 2,2 protsenti. protsendist 132,9 ± 15,0 protsendini (joonis 3; p väiksem või võrdne 0,001, n=3). Lisaks pööras danegaptiid osaliselt tagasi Klotho languse 43,3 ± 3,8 protsendilt 59,9 ± 11,7 protsendini kontrollrühmadest (joonis 3, n=3).
2.5. Danegaptiid taastab TGF-i 1-vahendatud muutused adhereenides ja tiheda ühendusega valkudes ning paratsellulaarses läbilaskvuses hPTEC-desAastalneerudvähenenud E-kadheriini (ECAD) vahendatud rakuadhesioon algatab sündmuste jada, mis kulmineeruvad vahelduva fenotüübiga, mis on seotud epiteeli osalise-mesenhümaalse transformatsiooniga. Initsieerimine hõlbustab nii adherentide kui ka tihedate ühenduskomplekside lahtivõtmist, mis kulmineerub adhesiooni kadumise, rakkudevahelise suhtluse vähenemise ja lekkiva epiteeliga [12, 24, 51]. Et teha kindlaks, kas danegaptiid võib eitada TGF-i 1-vahendatud muutusi adherentsus ja tihedas ühendusvalkudes, inkubeeriti hPTEC-sid TGF 1-ga (10 ng/mL) ± danegaptiidiga (10{{41). }} nM) 48 tunni jooksul ja hinnati kandidaatvalkude ekspressiooni. Danegaptiid taastas osaliselt E-kadheriini ekspressiooni 33,3 ± 3,3 protsendilt 89 ± 7,6 protsendile kontrollidest, N-kadheriini (NCAD) ekspressiooni 224,4 ± 29,6 protsendilt 161,9 ± 27,4 protsendile ja vimentiini ekspressiooni 212,9 ± 8,9 protsendilt 1 ± 8,9 protsendile . Joonis 4A; p väiksem või võrdne 0.001, p väiksem või võrdne 0,01 ja p väiksem või võrdne 0,001; n {{43} }). -kateniini ekspressioon jäi poolkanali blokaatori poolt muutmata 149,2 ± 11,2 protsendilt (ainult TGF 1) 151,6 ± 16,8 protsendini (TGF 1 pluss danegaptiid, joonis 4B; p=NS, n=3). Danegaptiidi mõju hindamine tiheda ristmiku valkudele kinnitas, et vaheühenduse modulaator taastas osaliselt claudiini -2 ekspressiooni 44,5 ± 5 protsendilt 74,6 ± 5 protsendile kontrollidest ja ZO-1 ekspressiooni 27,8 ± 11,3 protsendilt. protsendist 52,8 ± 5,4 protsendini võrreldes kontrollidega (joonis 4B; p väiksem või võrdne 0,05, n=3). Transepiteliaalset elektritakistust uurivad uuringud kinnitasid, et TGF 1-ga (10 ng/mL) täheldatud tihedate ühendusvalkude ekspressiooni vähenemine on paralleelne transepiteliaalse resistentsuse vähenemisega 57,33 ± 1.86 Ω·cm2 väärtusele 10 ± 1,53 Ω· cm2 (p Väiksem või võrdne 0,001, n=3). Seda suurenenud lekkimist korrigeeriti osaliselt kaasinkubeerimisega danegaptiidiga (36 ± 2,08 Ω·cm2) (joonis 4C; p väiksem või võrdne 0,001, n=3).
2.6. Danegaptiid hoiab ära TGF-i 1-tsellulaarse maatriksi valkude esilekutsutud ülesreguleerimise hPTEC-desmis on põhjustatud moodustumise ja lagunemise vahelisest tasakaalustamatusest, on ECM-i kogunemine kroonilise neeruhaiguse peamine tunnus. TGF 1 roll selles protsessis on hästi välja kujunenud [52] ja mõistmine, kuidas neid muutusi eitada, mõjutab selgelt haiguse progresseerumist. Et uurida danegaptiidi mõju TGF-ile 1-kutsutud esile muutused ECM-valkude ekspressioonis, kultiveeriti hPTEC-e madala glükoosisisaldusega (5 mM) 48 tundi, näljutati üleöö ja töödeldi TGF 1-ga (1{{ 28}} ng/mL) ± danegaptiid (100 nM) 48 tundi. Võrreldes kontrollidega suurendas TGF 1 ECM valkude kollageeni I (334,6 ± 30,14 protsenti), kollageeni IV (354,5 ± 16,9 protsenti), fibronektiini (301,7 ± 50,4 protsenti) ja laminiini (324,8 ± 30,14 protsenti) A (Figure 36, 324,8 ± 36 protsenti). B; p väiksem või võrdne 0,001, n=3). Kaasinkubeerimine danegaptiidiga nõrgendas neid muutusi märkimisväärselt, taastades ekspressiooni 180,7 ± 27,3 protsendini (kollageen I), 164 ± 6,9 protsendini (kollageen IV), 161,3 ± 4 protsendini (fibronektiin) ja 149 ± 20,4 protsendini (lemiin) 0,001 või sellega võrdne; n=3 igal juhul). Danegaptiid (100 nM) vähendas ka TGF 1 (10 ng/mL) poolt esile kutsutud muutusi integriiniga seotud kinaasi 1-s (ILK1) 378,9 ± 16,8 protsendilt 251,8 ± 33 protsendini (p 0,001 või väiksem), kuid mõju oli minimaalne. maatriksi metalloproteinaasil 3 (MMP3), vähendades ekspressiooni 185,3 ± 19,6 protsendilt ainult tsütokiiniga 147,1 ± 12,2 protsendini, kui seda inkubeeritakse koos danegaptiidiga (joonis 5B)
2.7. Danegaptiid vähendab TGF-i 1-hPTEC-de poolt esile kutsutud muutusi adipokiinide, kemokiinide, kasvufaktorite ja interleukiinide ekspressioonis
Põletikuline reaktsioon proksimaalsetes tuubulites ja nende ümbruses hõlmab nii mitmete rakutüüpide aktiveerimist kui ka paljude põletikuliste markerite sekretsiooni. Täpsemalt, lahustuvad kemokiinid, tsütokiinid ja kasvufaktorid värbavad ja aktiveerivad infiltreeruvaid immuunrakke ning stimuleerivad püsivaid fibroblaste. Nende rakkude püsiv aktiveerimine vahendab tubulointerstitsiaalset fibroosi. Kasutasime proteoomiprofiili massiivi, et teha kindlaks, kas danegaptiid eitab TGF-i 1-indutseeritud muutusi peamiste proinflammatoorsete vahendajate ekspressioonis ja sekretsioonis. Primaarseid hotelle kultiveeriti ülalkirjeldatud viisil ja töödeldi TGF 1-ga (10 ng/ml) ± danegaptiidiga (100 nM) 48 tundi. Lüsaadi (joonis 6) ja supernatandi (joonis 7) muutuste loend on esitatud 31 kandidaatvalgu jaoks, mis on rühmitatud esmase funktsiooni järgi.
3. Arutelu
2017. aastal oli kroonilise neeruhaiguse ülemaailmne esinemissagedus 697,5 miljonit juhtu, kusjuures haigusseisund on maailmas 12. peamine surmapõhjus [53]. Praeguseks ei ole lõppstaadiumis ravivaid ravivõimalusineeruhaigus(ESRD). Lisaks madala dialüüsi ellujäämismäära ja ülemaailmse puuduseganeerudDoonoritele on tungiv vajadus töötada välja ravimeetodid, mis võiksid takistada kroonilise neeruhaiguse progresseerumist ja parandada patsiendi elukvaliteeti. Kroonilise neeruhaiguse korral määrab proksimaalse tuubuli põletiku raskusaste, kui kiiresti aneerudebaõnnestub. Mitme rakutüübi aktiveerimise tõttu näib see osaliselt hõlmavat konneksiini vahendatud rakkudevahelist suhtlust [9]. Konneksiinid hõlbustavad otsest ja lokaalset parakriinse vahendatud rakusuhtlust tänu nende võimele oligomeriseeruda heksameerseteks konneksoniteks. Kui naaberrakud joonduvad, ühenduvad konneksonid, moodustades vaheühendused [10]. Need pidevad kanalid pakuvad otsest teed teabe edastamiseks, võimaldades rakkudel lukustada teatud sagedust ja sünkroonida tegevust. Erinevalt lünkühendustest, mis tavaliselt avanevad füsioloogilistes tingimustes, on dokkimata ühenduskohtadel, mida nimetatakse ka poolkanaliteks, avanemise tõenäosus väike ja need avanevad vastusena vigastusele [10]. Muutunud poolkanali aktiivsus on seotud mitme haigusseisundi patofüsioloogiaga, kusjuures tõendid seovad muutunud rakkudevahelise suhtluse suurenenud vananemise [54], põletiku [34, 55, 56] ja fibroosiga [18–21]. Meie enda labori andmed näitavad, et proksimaalses tuubulis (Cx43) domineeriv konneksiini isovorm on kaugelearenenud kroonilise neeruhaiguse korral ülesreguleeritud ja korreleerub TGF 1 kõrgenenud tasemega ning fibroosi ja põletiku raskusastmega [24]. Veelgi enam, see muutunud ekspressioon tähendab rakkudevahelise suhtluse katkemist, millega kaasneb suurenenud poolkanali poolt vahendatud ATP vabanemine ja muutused, mis viitavad varasele torukujulisele vigastusele. Järelikult võib Cx{20}}vahendatud poolkanali ATP vabanemise blokeerimine olla elujõuline sihtmärk kroonilise neeruhaigusega inimestel tekkiva hilise staadiumi kahjustuse ravimisel.
Danegaptiid on väike terapeutiline peptiid, mida kuni viimase ajani on kasutatud lõheühenduse taastamiseks mitmes vigastusmudelis, sealhulgas isheemia [43, 44] ja retinopaatia [49]. On näidatud, et danegaptiid blokeerib hemikanali aktiivsust ja värvi omastamist C6 glioomirakkudes [43]; Ühendi roll poolkanali poolt vahendatud ATP vabanemise blokeerimisel tuleb siiski veel kinnitada ja üheski uuringus ei ole veel hinnatud danegaptiidi mõju vigastatutele.neerudtorukesed. Käesolevas uuringus esitasime veenvaid tõendeid selle kohta, et danegaptiid blokeerib TGF 1-indutseeritud poolkanali poolt vahendatud ATP vabanemise inimese primaarsetes proksimaalsetes tuubulite epiteelirakkudes. Veelgi enam, ühend taastas TGF-i 1-kutsutas esile muutused põletiku ja fibroosiga seotud valkude ekspressioonis ja sekretsioonis. Kroonilise neeruhaiguse korral areneb tubulointerstitsiaalne fibroos vastusena erinevatele morfoloogilistele ja fenotüüpilistele muutustele, sealhulgas epiteeli-mesenhümaalsele üleminekule (EMT), põletikurakkude infiltratsioonile, fibroblastide aktivatsioonile ja rakuvälise maatriksi (ECM) ümberkujunemisele [57]. Hiljutised tõendid näitavad, et rakkude vananemine võib mängida võtmerolli kroonilise haiguse progresseerumiselneeruhaigus[58], mille vananemine on seotud EMT-ga, põletikku soodustava sekretoomiga ja rakuvälise maatriksi ladestumisega [59–62]. Vananemine tähistab pöördumatut proliferatiivse kasvu peatumist koos sellega seotud muutustega kromatiini organisatsioonis, geenide transkriptsioonis ja valgu sekretsioonis [63, 64]. Järelikult on vananevatel rakkudel teadaolevalt suurenenud tsükliin-sõltuvate kinaasi (CDK) inhibiitorite (CKI), sealhulgas p21Cip1 (p21) ja p16Ink4a (p16) ekspressioon ning muutunud renoprotektiivse Klotho ekspressioon [65–68]. Käesolevas uuringus oli CDK inhibiitorite p16, p21 ja tsükliin D1 mRNA ekspressioon TGF-iga töödeldud tubulaarsetes epiteelirakkudes märkimisväärselt kõrgem, samas kui renoprotektiivse vananemisvastase valgu Klotho ekspressioon oli kontrollrühmaga võrreldes vähenenud. Huvitaval kombel paranes p16, p21 ja tsükliin D1 ekspressioon, kui rakke inkubeeriti koos danegaptiidiga. Selle tähelepaneku tähtsust toetavad arvukad in vivo uuringud [69, 70], sealhulgas hiljutine töö p16 INK4a topelt-knockout hiiremudeliga. Kui UUO-ga indutseeriti kaugelearenenud interstitsiaalne põletik ja fibroos, ilmnes nendel hiirtel vähenenud apoptoos, vananemine, vähenenud TGF 1/Smad signaaliülekande tase ja põletikuliste rakkude infiltratsiooni vähenemine võrreldes metsiktüüpi loomadega [70]. Veelgi enam, UUO mudelist eraldatud proksimaalsete tuubulite rakkudel oli suurenenud p21 tase, mille pärssimine on paralleelne EMT-ga tavaliselt seotud markerite vähenemisega [71, 72]. Otsene seos rakkude vananemise ja EMT indutseerimisega on juba loodud [73].
E-kadheriini poolt vahendatud raku adhesiooni kadumine on EMT käivitav vallandaja, millega kaasneb N-kadheriini (kadheriini lüliti) suurenemine, millega kaasneb adhereeni ristmiku lahtivõtmine ja valkude omandamine, mida tavaliselt seostatakse fibroblastide fenotüübiga, nt. , vimentiin ja fibroblastispetsiifiline valk [74]. Aastalneerud, on hästi teada, et torukujuline vigastus kutsub esile mitmeid morfoloogilisi ja fenotüüpseid muutusi, mis on iseloomulikud osalisele, kui mitte täielikule EMT-le. Meie hiljutised uuringud näitasid, et glükoosi poolt esile kutsutud muutused TGF 1-s vahendavad adherentide ja tiheda ühenduskompleksi lahtiühendamist, reguleerides muutusi adherentsis (ECAD, NCAD, -kateniin) ja tiheda ühenduse (ZO-1) valgu ekspressioonis. Veelgi enam, mittehüdrolüüsitava ATP in vitro manustamine vähendas E-kadheriini ekspressiooni proksimaalses piirkonnasneerudrakud, mille kadumisega kaasnes rakkudevaheliste ligeerimisjõudude vähenemine, sideme rebenemise vähenemine ja tsütoskeleti ümberkujunemine [51]. P2X7R vahendatud mõjud pöördusid heterogeenses Cx43 pluss /-UUO mudelis [12]. Nendele leidudele tuginedes rõhutab danegaptiidi tõhusus kaitsvat rolli poolkanali poolt vahendatud ATP vabanemise blokeerimisel võtmeepiteeli (ECAD, -kateniin, ZO-1, claudiin 2) ja mesenhümaalse (NCAD, vimentiin) ekspressiooni muutumise ärahoidmisel. valgud, mille tagajärjed pakuvad terapeutilist huvi.
CISTANCHE PARANDAB NEERU/NEERU VALU
Adhereeni ristmik koguneb, kui E-kadheriini tsütoplasmaatiline saba seondub -kateniiniga, vahendades kinnitumist tsütoskeleti võrguga ja tagades raku polaarsuse ja arhitektuuri säilimise [75]. Vaatamata oma rollile raku polaarsuse säilitamisel võimaldab nende ühenduste lahtivõtmine -kateniini vabastamist tsütosooli, mis aktiveerimisel Wnt valkude või muude ülesvoolu regulaatorite, nt integriiniga seotud kinaasi (ILK) poolt, võib siirduda tuuma. ja reguleerida rakuspetsiifilisi toimeid. Integriiniga seotud kinaas on rakusisene seriini/treoniini valgu kinaas, mis mängib olulist rolli rakkude adhesiooni, ellujäämise, proliferatsiooni ja ekstratsellulaarse maatriksi (ECM) ladestumise reguleerimisel [76]. Oluline on see, et ILK inhibeerimine nõrgenebneeru-fibroos mitmes kroonilise neeruhaiguse mudelis [77]. Käesolevas uuringus taastati TGF 1-indutseeritud ILK1 ekspressiooni suurenemine osaliselt, kui rakke inkubeeriti koos danegaptiidiga, mis oli paralleelne -kateniini ekspressiooni ja ECM-iga seotud valkude vähenemisega. Huvitav on see, et kuigi danegaptiid ei suutnud oluliselt muuta TGF 1--indutseeritud kateniini ekspressiooni suurenemist, on oluline märkida, et ekspressioonimuutuse puudumine ei kajasta selle funktsiooni puudumist rakus. Kanooniline Wnt-rada hõlmab kateniini tuuma translokatsiooni ja sihtgeenide aktiveerimist transkriptsioonifaktorite rühma kaudu, mida nimetatakse T-rakufaktoriks / lümfoidsete võimendajateks (TCF/LEF) [78]. Tavaliselt on Wnt/-kateniini signaalimine vaikne, kuid see aktiveeritakse pärast vigastust mitmes erinevas kroonilise haiguse mudelis.neeruhaigus[79,80]. Veelgi enam, hälbiv Wnt/-kateniini signaaliülekanne on tugevalt seotud vananemise algusega, mis on paralleelne Klotho, vananemisvastase valgu, mis toimib kanoonilise Wnt raja negatiivse regulaatorina [81], ekspressiooni kadumisega. käesolev uuring oli TGF-ga 1-töödeldud rakkudes allareguleeritud (joonis 3). Järelikult on Wnt/-kateniini signaaliülekande püsiv aktiveerimine seotud fibroosi progresseerumisega mõlemasneerudja muud koetüübid [79,82,83]. Pärast tuuma translokatsiooni seostatakse -kateniin transkriptsioonifaktori SNAIL ja maatriksi metalloproteinaasi MMP7 suurenenud ekspressiooniga. Huvitav on see, et need sündmused on seotud E-kadheriini transkriptsiooni repressioonide ja rakuvälise domeeni membraani eraldumisega, millest viimane näeb vaba kateniini tsütoplasmaatilise kogumi suurenemist [84]. Seega on Wnt-signaalimine vigastuse korral EMT võtmeaktivaator [85]. Veelgi enam, kuna on tõendeid selle kohta, et Wnt / -kateniini signaalimine soodustab paljude geenide, sealhulgas fibronektiini, FSP1, Snail1, MMP7 ja tsükliin D1 ekspressiooni, pole üllatav, et selle signaalikaskaadi nõrgenemine on seotud paranenud geenidega.neerufunktsioon, vähendas EMT [86] ja vähendas põletikku [87] ja fibroosi [80, 88]. Järelikult võib see osaliselt põhjustada TGF 1-indutseeritud ekstratsellulaarse maatriksi valkude (joonis 5), põletikueelsete tsütokiinide ja kemokiinide suurenenud ekspressiooni ja sekretsiooni, mida täheldati selles uuringus (joonised 6 ja 7). Suurenenud ECM-i ladestumine ja põletikueelsete molekulide sekretsioon on tubulointerstitsiaalse fibroosi tunnused erinevate rakutüüpidega, sealhulgasneeru-torukujulised epiteelirakud, mis teadaolevalt sekreteerivad suurt hulka tegureid, mida ühiselt määratletakse kui CKD-ga seotud sekretoorset fenotüüpi (CASP). Seda CASP-i iseloomustavad arvukad molekulid, sealhulgas interleukiinid, ekstratsellulaarsed maatriksvalgud ja kemokiinid, on see CASP silmatorkav sarnasus vananemisega seotud sekretoorse fenotüübiga (SASP), kusjuures CASP komponendid on tugevalt seotud tubulointerstitsiaalse fibroosi patoloogiaga [89]. Vabanemisel toimivad need põletikueelsed tegurid parakriinselt naabruses asuvatele tervetele rakkudele, soodustades seeläbi kroonilise neeruhaiguse fibroosi progresseerumist. Kuna on teada, et paljud CASP-ga seotud tegurid kutsuvad esile fibroosineerud(nt TGF, interleukiin (IL)-1 ja interleukiin (IL)-6), võib nende põletikuliste signaalide vaheühendite sihtimine ülesvoolu osutuda tõhusaks alternatiivseks strateegiaks kroonilise neeruhaiguse raviks. Proteoomiprofiili massiivi kasutades inkubeeriti TGF 1 ± danegaptiidiga töödeldud rakkude supernatanti rakumembraanil, mis oli eelnevalt imendunud peamiste põletikuliste valkude vastu tekitatud antikehadega. Nagu on näidatud joonistel 6 ja 7, taastas rakkude koosinkubeerimine TGF 1 ja danegaptiidiga mitmete kandidaatvalkude ekspressiooni ja sekretsiooni, mille rollneeruhaiguson hästi tõestatud kui kahjulik (kasvajanekroosifaktor alfa, interleukiin 1-alfa, interferoon-gamma) või kaitsev (hepatotsüütide kasvufaktor). Veelgi enam, kroonilise neeruhaiguse korral värbavad ja aktiveerivad lahustuvad kemokiinid, adhesioonimolekulid ja kasvufaktorid infiltreeruvaid immuunrakke ja püsivaid fibroblaste, et vahendada vigastatute põletikku ja fibroosi.neerud. Meie massiivi andmed kinnitavad, et Cx43 moduleerimine ja poolkanali poolt vahendatud ATP vabanemise blokeerimine tubulaarsetes epiteelirakkudes eitab kas osaliselt või täielikult paljude põletikuliste vahendajate, sealhulgas kemokiinide, monotsüütide kemoatraktiivse valgu (MCP1) ja aktiveerimisel reguleeritud, normaalse T sekretsiooni. Cell Expressed and Secreted (RANTES), mis mõlemad on seotud monotsüütide värbamisega. Kõrgendatud nii inim- kui ka eksperimentaalseltneeruhaigused, MCP1 sekretsiooni käivitavad interleukiin-1, tuumori nekroosifaktor-alfa [90] ja interferoon-gamma [91], mis kõik indutseeriti meie mudelis TGF 1 poolt, kuid blokeeritakse, kui neid kasutatakse koos danegaptiidiga. Lisaks täheldati, et danegaptiid takistas TGF-i 1-indutseeritud rakkudevahelise adhesioonimolekuli (ICAM1) [92], granulotsüütide-makrofaagide kolooniaid stimuleeriva faktori (GM-CSF) [93] ja epiteeli-neutrofiile aktiveeriva peptiidi sekretsiooni. (ENA78) [94]. Kokkuvõttes on neid seostatud kroonilise neeruhaiguse progresseerumisega ja teiste peamiste patogeensete valkudega, sealhulgas dipeptidüülpeptidaas 4 (DPPIV) [95] ja veresoonte endoteeli kasvufaktor (VEGF) [96], ning need on tuvastatud potentsiaalsete terapeutiliste sihtmärkidena. Vaatamata nendele tähelepanekutele tuvastas massiivianalüüs 48 tunni pärast mitmeid valke, kus TGF 1- indutseeritud regulatsioon näis olevat sõltumatu poolkanali poolt vahendatud ATP vabanemisest. Nagu näitab FLT3 ligandi ekspressioon rakulüsaadis, ei suutnud danegaptiid oluliselt muuta TGF 1-indutseeritud muutusi kogu raku ekspressioonis. FLT3 ligand sünteesitakse algselt membraaniga seotud valguna, mis tuleb lahustuvaks kasvufaktoriks saamiseks lõhustada. TGF 1--ga töödeldud rakkudes täheldati membraaniga seotud FLT3L suurenemist võrreldes rakulüsaadi kontrollidega. See reaktsioon ei muutunud, kui rakke inkubeeriti koos danegaptiidiga. Kuigi FLT3L proteolüütilise lõhustamise ja vabanemisega seotud ensüümi kohta on vähe teada, on Horiuchi et al. näitasid, et FLT3L eritumine ja vabanemine membraanist sõltuvad metalloproteaasist ja see toime fibroblastides sõltub TNF-i konverteerivast ensüümist (TACE) [97]. Kuigi saame ainult oletada, on võimalik, et Cx{38}}vahendatud ATP vabanemise blokeerimine võib nõrgendada FLT3 membraani eemaldamiseks vajaliku valgu aktiivsust ja seega FLT3L vabanemise puudumisel FLT3L taset supernatandis. on TGF 1 pluss danegaptiidiga töödeldud rakkudes oluliselt vähem kui TGF 1--ga töödeldud kontrollidega. Huvitav on see, et kuigi danegaptiid ei paistnud muutvat TGF-i 1-indutseeritud FLT3L rakulüsaadi suurenemist, avaldas see siiski mõju valgu sekreteeritud vormile.
Lahustuv täiustatud glükatsiooni lõpp-produktide retseptor (RAGE) on põletiku ja oksüdatiivse stressi potentsiaalne biomarker [98]. See toimib peibutusretseptorina, mis takistab arenenud glükatsiooni lõpptoodete seondumist membraaniga seotud RAGE ja RAGE-ga seotud kahjulike mõjudega. Käesolevas uuringus täheldasime TGF 1-ga sRAGE sekretsiooni 70-protsendilist suurenemist, mis on danegaptiidiga taastatud. sRAGE on funktsionaalne ja eritumisel võimeline esile kutsuma efekti. Danegaptiidi potentsiaal seda sekretsiooni oluliselt tühistada on selgelt terapeutiliselt huvipakkuv. Huvitaval kombel ei täheldanud me RAGE lüsaadi suurenemist 48 tunni pärast TGF 1 ± danegaptiidiga. Kuigi need katsed on tehtud inimese primaarsetes proksimaalsetes tuubulite rakkudes, võivad meie mudeli piirangud avaldada rakust, ajast ja kontsentratsioonist sõltuvat mõju. Järelikult, kuigi on vaja paremini mõista danegaptiidi toimemehhanismi, annavad selle uuringu tulemused olulisi esialgseid tõendeid selle kohta, et danegaptiidi kasutamine on kasulik TGF-i 1-indutseeritud põletiku ja tubulaarsete vigastuste markerite muutuste blokeerimise teel. poolkanali vahendatud ATP vabanemine. Mööname, et meie in vitro andmed annavad minimalistliku mudeli multifaktoriaalsetest sündmustest, mis põhjustavad tubulointerstitsiaalset fibroosi, ja soovitame olla ettevaatlik nende uudsete leidude ülekandmisel in vivo olukorda, eriti kui teiste liikide ja vigastuste mudelite uuringud on näidanud varieeruvat mõju. [41,44,46–49]. Nüüd on vaja täiendavaid uuringuid, et määrata kindlaks nende poolkanalite selektiivsus ja ravimi võimekus kroonilise kahjustuse prekliinilistes mudelites, enne kui tõhusust inimeste kliinilistes uuringutes testitakse.
4. Materjalid ja meetodid
4.1. Materjalid
Klooniline inimeneneerud2 (HK2) epiteelirakku ja primaarseid inimese proksimaalse tuubuli epiteelirakke (hPTEC) osteti Ameerika tüübikultuuride kollektsioonist (ATCC) (LGC standardid). Koekultuuri tarvikud osteti ettevõttest Invitrogen (Paisley, UK). Immobilon-FL PVDF membraan pärines ettevõttest Millipore (Watford, UK) ning Odyssey blokeerimispuhver ja sekundaarsed FL fluorestseeruvad antikehad osteti ettevõttelt LI-COR (Cambridge, UK). Antikehad E-kadheriini, N-kadheriini, ILK1, MMP-3, -kateniini, vimentiini ja ZO-1 jaoks saadi ettevõttest Cell Signaling Technologies (Hertfordshire, UK), samas kui claudin-2, laminiini, kollageeni I ja kollageen IV antikehad saadi ettevõttest ABCAM (Cambridge, UK). Fibronektiini antikeha osteti Santa Cruzist (Santa Cruz, CA, USA). Rekombinantne hTGF 1 saadi firmast Sigma (Poole, UK), nagu ka kõik muud üldkemikaalid. Danegaptiidi tarnis Zealand Pharmaceuticals. ATP biosensorid olid firmalt Sarissa Biomedical Ltd. (Coventry, UK) ja jahunõud firmalt WPI (Hertfordshire, UK). Transwelli filtrid osteti ettevõttest Corning (Nottinghamshire, Ühendkuningriik). Proteome Profiler Human Cytokine Array Kit pärines ettevõttelt R&D Systems (Oxfordshire, Ühendkuningriik).
4.2. Koekultuur
Inimese primaarseid proksimaalseid tuubuli epiteelirakke (hPTEC-sid) hoiti aneeru-ATCC epiteelirakkude basaalsööde, millele on lisatud 0,5 protsenti vasika loote seerumit (FCS massi järgi, trijodotüroniin (10 nM), rhEGF (10 ng/mL), hüdrokortisooni hemisuktsinaat (100 ng/mL), rhInsuliin (5 µg/mL), epinefriin (1 µM), transferriin (5 µg/mL) ja L-alanüülglutamiin (2,4 mM) niisutatud atmosfääris temperatuuril 37 ◦C 5% CO2-ga. Rakke hoiti üleöö seerumi nälgimine enne ravineerud2 (HK2) rakku (lõigud 18–30) kasvatati Dulbecco modifitseeritud Eagle'i söötmes (DMEM)/Hams F12 söötmes, millele oli lisatud 10 massiprotsenti FCS-i, glutamiini (2 mmol/L) ja epiteeli kasvufaktorit (EGF). 5 ng/mL), niisutatud atmosfääris temperatuuril 37 ◦C 5% CO2-ga. HK2 rakud immortaliseeriti inimese papilloomiviiruse 16 (HPV-16) E6/E7 geenide transduktsiooniga ja need olid mükoplasmavabad. Kõigis katsetes külvati rakud madala glükoosisisaldusega DMEM/F12 (5 mmol/L) 48 tunniks ja seejärel näljutati seerumit üleöö enne ravi.
4.3. MTT test 3-(4,5-dimetüültiasool-2-üül)-2,5-difenüültetrasooliumbromiidi (MTT) analüüs viidi läbi nagu eelnevalt kirjeldatud, et hinnata danegaptiidi tsütotoksiline toime rakkude proliferatsioonile [99]. HK2 rakud külvati 96-süvendiga plaatidele ja kultiveeriti madala glükoosisisaldusega DMEM/F12-s (5 mM) 48 tundi enne üleöö seerumi nälgimist ning seejärel stimuleeriti 48 tundi TGF 1-ga (10 ng/ml). ) ± danegaptiid (50–1000 nM). Formazaani tootmise kolorimeetriline mõõtmine vastas elujõuliste rakkude arvule.
4.4. Laktaatdehüdrogenaasi testLaktaatdehüdrogenaasi (LDH) vabanemist söötmesse plasmamembraani kahjustuse tagajärjel kasutatakse tavaliselt rakusurma või tsütotoksilisuse hindamiseks. HK2 rakud külvati 96-süvendiga plaatidele ja kultiveeriti madala glükoosisisaldusega DMEM/F12-s (5 mM) 48 tundi enne üleöö seerumi nälgimist. Seejärel stimuleeriti rakke 48 tundi TGF 1-ga (10 ng/ml) ± danegaptiidiga (50–1000 nM). LDH tsütotoksilisuse analüüsi komplekti II (Abcam) kasutati LDH kvantifitseerimiseks vastavalt tootja juhistele.
4.5. Kristalllilla analüüsSeda lihtsat testi kasutatakse kleepunud rakkude suhtelise tiheduse mõõtmiseks mitme süvendiga taldrikutele. Kristallviolett värvib DNA-d ja pärast solubiliseerimist saab selle kvantifitseerida kolorimeetriliselt. HK2 rakud külvati 12-süvendiga plaatidele ja kultiveeriti madala glükoosisisaldusega DMEM/F12-s (5 mM) 48 tundi enne üleöö seerumi nälgimist ning seejärel stimuleeriti 48 tundi TGF 1-ga (1{{16). }} ng/mL) ± danegaptiid (50-1000 nM). Seda analüüsi on varem kirjeldatud [99]. Lühidalt, rakud fikseeriti paraformaldehüüdiga 10 minutit, pesti fosfaatpuhverdatud soolalahusega (PBS) ja inkubeeriti 10 minutit toatemperatuuril (RT) 0,1-protsendilises kristallvioletses lahuses. Pärast veel mitut pesu lahustati plekk 1% SDS-iga ja neeldumist mõõdeti plaadilugejaga.
4.6. Western BlottingVarem on kirjeldatud tsütosoolse valgu valmistamist HK2 rakkudest ja hPTEC-dest, nende eraldamist SDS-geelelektroforeesiga ja ülekandmist Immobilon-FL PVDF membraanidele [12]. Membraanid blokeeriti Odyssey blokeerimispuhvriga (LI-COR) ja seejärel sondeeriti öö läbi E-kadheriini (1:1000), N-kadheriini (1:1000), claudiini-2 (1:500), ZO vastaste antikehadega. -1 (1:1000), kollageen I (1:1000), kollageen IV (1:2000), fibronektiin (1:2000), laminiin (1:500), ILK1 (1:500), -kateniin (1:2000), vimentiin (1:500) ja MMP3 (1:500). Ribad visualiseeriti OdysseyFC abil ja poolkvantifitseeriti ImageStudio abil (v5.2, LI-COR, Lincoln, NE, USA).
4.7. Transepiteliaalne resistentsusHK2 rakud külvati (6 × 104 rakku/ml) Transwelli filtritele (läbimõõt 12 mm, pooride suurus 0,4 µM; Corning, NY, USA) ja kultiveeriti madala glükoosisisaldusega DMEM/F12-s (5 mM) 48 tundi, seerumi nälga üleöö ja seejärel stimuleeriti TGF 1 (10 ng/ml) ± danegaptiidiga (100 nM) 48 tundi. Transepiteliaalset elektritakistust (TER) mõõdeti EVOM-seadmega (World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA). Igast takistuse näidust lahutati tühitakistus, mida mõõdeti ainult söötmega süvendist.
4.8. Värvaine omastamise uuringudHK2 rakud ja hPTEC-d külvati fluorodiistritele (läbimõõt 22 mm) ja kultiveeriti madala glükoosisisaldusega DMEM/F12-s (5 mmol/L) 48 tundi. Pärast üleöö seerumi nälgimist inkubeeriti rakke 48 tundi TGF 1-ga (10 ng/mL) ± danegaptiidiga (50-100 nM). Järgmiste etappide jaoks tasakaalustatud soolalahus (BSS, pH 7,0), mis sisaldab NaCl (137 mM), KCl (5,4 mM), MgSO4 (0,8 mM), Na2HPO4 (0,3 mM), KH2PO4 (0,4 mM), NaHCO3 (4,2 mM) ), kasutati HEPES-i (10 mM) ja glükoosi (5 mM). Värvaine omastamise esilekutsumiseks eksponeeriti rakke 10 minutiks Ca2 pluss-vaba BSS-iga (null CaCl2 pluss EGTA (1 mM)) ja karboksüflfluorestseiiniga (200 uM), millele järgnes 5-minutiline periood Ca2 pluss-sisaldusega BSS-is (1,3 mM). pluss karboksüflfluorestseiin (200 uM). Seejärel pesti nõusid Ca2 pluss-i sisaldava BSS-ga (12 ml). Pildid saadi Cool Snap HQ CCD-kaameraga (Roper Scientific, Gottingen, Saksamaa) ja Metamorph tarkvaraga (Universal Imaging Corp., Marlow, Bucks, Ühendkuningriik). Värvaine omastamise kvantifitseerimiseks kasutati ImageJ-d, kus iga raku ümber joonistati huvipakkuv piirkond (ROI) (umbes 10–15 rakku tassi kohta) ja mõõdeti pikslite keskmine intensiivsus. Igast ROI-st lahutati taustfluorestsentsi väärtus.
CISTANCHE PARANDAB neeru-/NEEREDIALÜÜSI
4.9. ATP biosenseerimineATP biosensoreid (Sarissa Biomedical, Coventry, UK) kasutati samaaegses kahekordse salvestamise amperomeetrilises seadistuses, nagu eelnevalt kirjeldatud [12]. Mittespetsiifiliste elektroaktiivsete artefaktide arvestamiseks kasutati null-biosensorit ja lahutati ATP jäljest. Glütserool (2 mM) lisati kõikidesse salvestuslahustesse, et võimaldada ATP tuvastamist. HK2 rakud külvati klaasist katteklaasidele (läbimõõt 10 mm) madala glükoosisisaldusega DMEM/F12-s (5 mmol/L) 48 tundi enne üleöö seerumi nälgimist. Seejärel inkubeeriti rakke TGF 1-ga (10 ng/ml) ± danegaptiidiga (100 nM) 48 tundi. Katteklaasid viidi kambrisse, mis sisaldas Ca2 pluss-sisaldavat BSS-i, mida oli perfuseeritud kiirusega 6 ml/min (37 ◦C) ja jäeti 10 minutiks aklimatiseeruma. ATP- ja null-biosensorid painutati ja langetati nii, et elektrood asus paralleelselt raku monokihiga. Kui algtase oli stabiilne, stimuleeris Ca2 pluss-vaba BSS-i perfusioon poolkanali avanemist. Pärast ATP vabanemist kasutati poolkanalite sulgemiseks Ca2 pluss sisaldavat BSS-i, millele järgnes ATP kalibreerimislahus (10 mM). Salvestised saadi sagedusel 4 Hz Micro CED (Mark2) liidesega, kasutades Spike (v8.03) tarkvara.
4.10. Põletikuvastaste antikehade massiiv,Põletiku antikehade massiiv (RnD Systems) hindas TGF-i 1-indutseeritud 31 põletikumarkeri regulatsiooni. Massiiv viidi läbi tootja juhiseid järgides. Lühidalt, hPTEC-sid kultiveeriti madala glükoosisisaldusega DMEM/F12-s (5 mM) 48 tundi enne üleöö seerumi nälgimist ja seejärel stimuleeriti neid 48 tundi TGF 1 (10 ng/ml) ± danegaptiidiga (100 nM). Rakulüsaadid ja supernatant koguti ja inkubeeriti üleöö eelnevalt blokeeritud membraanidega, mis olid kahes korduses kinni püüdvate antikehadega. Ekspressioonivalgu/antikeha komplekside visualiseerimiseks Odyssey FC abil kasutati 800 CW FL fluorestseeruvat streptavidiini/biotinüülitud kokteilisegu ja poolkvantifitseeriti ImageStudio abil (v5.2, LI-COR).
4.11. Kvantitatiivne reaalajas PCRRNA ekstraheeriti RNeasy minikomplekti (QIAGEN) abil ja pöördtranskribeeriti (Invitrogen). Reaalajas PCR (SYBR GreenER, Invitrogen) viidi läbi StepOne Plus instrumendiga (Applied Biosystems Inc, Foster City, CA, USA). cDNA ekspressioon saadi, võrreldes seeriaviisiliselt lahjendatud cDNA standardkõveraga. The following primers were used: p16 (forward: CTCGTGCTGATGCTACTGAGGA, reverse: GGTCG GCGCAGTTGGGCTCC), p21 (forward: AGGTGGACCTGGAGACTCTCAG, reverse: TCCTCTTGGAGAAGATCAGCCG), cyclin D1 (forward: TCTACACCGACAACTCCATCCG, reverse: TCTGGCATTTTGGAGAGGAAGTG), Klotho (forward: CCTCCTTTACCTGAAAATCAGCC, reverse CAGGTCGGTAAACTGAGACAGAG) ja GAPDH (edasi: GTCTC CTCTGACTTCAACAGCG, tagurpidi: ACCACCCCTGTTGCTGTAGCCAA). Sulamiskõvera analüüs kinnitas praimeri spetsiifilisust ja kontrollis võimalikku saastumist.
4.12. AnalüüsKõigi katsete puhul normaliseeriti madala glükoosisisaldusega kontroll (5 mM) 100 protsendile ja kõiki muid tingimusi võrreldi nende vastavate kontrollidega. Statistiline analüüs viidi läbi, kasutades ühesuunalist ANOVA testi Tukey mitmekordse võrdluse järeltestiga. Andmed on väljendatud keskmisena ± SEM, kusjuures n tähistab proovi numbrit. P-väärtus Väiksem või võrdne 0,05 tähistas statistilist olulisust.
