Mikromullkontrastaine kombineerimine impulss-laserkiirgusega ravimi transdermaalseks manustamiseks, 1. osa

Abstraktne: Laserindutseeritud mikromullide (MB) kavitatsiooni optodünaamilist protsessi vedelikes kasutatakse mitmesugustes meditsiinilistes rakendustes. Kuid seda, kuidas langev laserkiirgus interakteerub MB-dega ultraheli kontrastainena, hinnatakse harva, kui vedelik sisaldab juba stabiilseid MB-sid. Käesolevas uuringus uuriti albumiiniga kaetud MB-de laser-vahendatud kavitatsiooni tõhusust transdermaalse ravimi kohaletoimetamise tõhustamisel. Esmalt hinnati MB-de laser-vahendatud inertsiaalse kavitatsiooni erinevaid tüüpe ja tingimusi. In vitro ja in vivo katsetes MB-dega kombineerimiseks valiti CO2 fraktsionaalne impulsslaser. In vitro -arbutiini läbitungimine nahka 2 tunni pärast oli 2 korda suurem rühmas, kus laser kombineeriti MB-dega, kui kontrollrühmas. Väikeloomadega tehtud katsetes suurenes valgendav toime C57BL/6J hiirte nahale rühmas, kus kombineeriti laserit nahal olevate MB-de ja läbitungiva arbutiiniga (oluliselt) 48.0 protsenti 11. ja 5. päeval. 0,0 protsenti 14. päeval ja seejärel stabiliseerumas ülejäänud 20-päevase katseperioodi jooksul. Käesolevad tulemused näitavad, et CO2 laseri kombineerimine albumiiniga kaetud MB-dega võib suurendada naha läbilaskvust, et suurendada -arbutiini kohaletoimetamist, et pärssida hiirtel melanogeneesi ilma nahka kahjustamata.

Asjakohaste uuringute kohaseltcistancheon tavaline ravimtaim, mida tuntakse kui "imerohi, mis pikendab eluiga". Selle põhikomponent ontsistanosiid, millel on erinevad mõjud naguantioksüdant, põletikuvastanejaimmuunfunktsiooni edendamine. Mehhanism cistanche janaha valgendaminepeitub antioksüdantses toimescistanche glükosiidid. Inimese nahas sisalduv melaniini toodetakse türosiini oksüdeerumisel, mida katalüüsibtürosinaas. Oksüdatsioonireaktsioon nõuab hapniku osalemist, mistõttu kehas olevad hapnikuvabad radikaalid muutuvad oluliseks melaniini tootmist mõjutavaks teguriks. Tistanche sisaldab tsistanosiidi, mis on antioksüdant ja võib vähendada vabade radikaalide teket organismis, seegamelaniini tootmise pärssimine.

Klõpsake valikul Cistanches Herba valgendamiseks

lisateabe saamiseks:

david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501

1. Sissejuhatus

Kavitatsioon viitab õõnsuste tekkele vedelikus ja tekib tavaliselt siis, kui vedelik on allutatud kiiretele rõhumuutustele. Selliseid rõhumuutusi saab esile kutsuda paljude erinevate meetodite abil, kusjuures akustiline kavitatsioon käivitatakse siis, kui rakendatava akustilise rõhu amplituud ületab teatud läve [1]. Akustiline kavitatsioon hõlmab mikromullide (MB) moodustumist, kasvu, pulseerimist ja kokkuvarisemist vedelikes ultraheliga töötlemisel kõrge intensiivsusega ultrahelilainetega (USA). Arvatakse, et need nähtused põhjustavad segunemist, killustumist, erosiooni, märgumist, sonokapillaaride teket ja muid mõjusid, millel on mitmesuguseid praktilisi tööstuslikke rakendusi [1].

USA-st põhjustatud MB kontrastainete kavitatsioon mängib samuti olulist rolli nii diagnostilistes kui ka terapeutilistes meditsiinilistes rakendustes. USA kontrastained on stabiliseeritud ja kaetud MB-d, mida süstitakse intravaskulaarselt, et parandada USA diagnostilise kujutise eraldusvõimet [2]. Paljud uuringud näitavad, et MB kontrastainete olemasolu veres võib vähendada erinevate USA-st põhjustatud bioloogiliste mõjude lävi nii in vitro kui ka in vivo, nagu hemolüüs, kapillaaride rebend ja sonoporatsioon [3]. Mõned uuringud on näidanud, et MB kontrastainete olemasolu veres vähendab oluliselt USA-st põhjustatud enneaegsete südame kontraktsioonide läve [4,5]. MB-de resonants (stabiilne kavitatsioon) põhjustab mittelineaarseid harmoonilisi emissioone, mida saab kasutada MB-spetsiifilises kontrastpildis. Inertsiaalne kavitatsioon ja MB-de hävitamine võivad põhjustada tugevaid mehaanilisi pingeid, mis suurendavad rakumembraanide ja hematoentsefaalbarjääri läbilaskvust, et parandada raviainete kohaletoimetamist. Varasemates uuringutes oleme rakendanud USA poolt indutseeritud MB-de inertsiaalset kavitatsiooni, et parandada ravimite transdermaalset kohaletoimetamist (TDD), kuna leiti, et inertsiaalne kavitatsioon suurendab sarvkihi palju suuremat läbilaskvust võrreldes stabiilse kavitatsiooniga [6–8] .

Laserkiirgus on alternatiivne lähenemisviis ravimite läbitungimise suurendamiseks ja seega ravimite naha sisse- või läbiviimise hõlbustamiseks. Kui teatud läve ületava intensiivsusega laserimpulss fokusseeritakse vedelikule, võib vedeliku plahvatuslik aurustumine samuti esile kutsuda MB kavitatsiooni [9,10]. Laser-indutseeritud kavitatsiooni agressiivne olemus on viinud selle kasutamiseni paljudes rakendustes, sealhulgas rakkude lüüsis, rakumembraani poratsioonis ja silmakirurgias [11]. Operatsioonijärgsete, atroofiliste ja aknearmide väljanägemise ohutu parandamise strateegiaid on hiljuti demonstreeritud fraktsioneerivate ablatiivsete ja mittenablatiivsete laserite abil [12]. Ablatiivne laseriga naha taastamine tagab suurima kliinilise paranemise, kuid operatsioonijärgne taastumine võtab mitu nädalat [13]. Mittenablatiivsed laserprotseduurid võivad olla sobivamad patsientidele, kes ei suuda või ei taha taluda pikaajalist operatsioonijärgset paranemist. Kuid varasem herpes simplex-nakkus võib laseri või muu valgusallika tekitatud intensiivse kuumuse tõttu pärast naha mittenablatiivset laserremodelleerimist uuesti aktiveeruda [13].

Laserkiirguse tekitatud soojuse vähendamiseks on välja töötatud mõned meetodid, näiteks kontaktjahutusega käsiinstrumentide või dünaamiliste krüogeensete seadmete kasutamine, mis on võimelised edastama erineva kestusega jahutuspihustusi [14]. Siiski pole siiani üksmeelt, milline jahutamisviis on ravi ajal kõige tõhusam. Veelgi enam, erinevalt USA-st jääb vedelikes stabiliseeritud kaetud MB-dega laser-indutseeritud kavitatsiooni mõju aluseks olev mehhanism ebaselgeks.

2. Materjalid ja meetodid

2.1. Albumiiniga kooritud MB-de tootmine

Albumiiniga koorega MB-d valmistati vastavalt meie varasemates uuringutes kasutatud protseduurile [7, 15]. Lühidalt, albumiiniga koorega MB-d genereeriti ultraheliga töötlemisel 10 ml lahuses, mis sisaldas 140 mg albumiini (Octapharma, Viin, Austria) ja perfluorosüsivesinikgaasi füsioloogilises soolalahuses (pH 7,4, { {21}},9 protsenti naatriumkloriidi), kasutades sonikaatorit (Branson Ultrasonics, Danbury, CT, USA) 2 minuti jooksul. Perflfluorosüsinikuga täidetud albumiini MB-de arv lahuses mõõdeti MultiSizer III seadmega (Beckman Coulter, Fullerton, CA, USA) 30-µm avaga sondiga ja mõõtmispiiridega 0,6–20 µm. Suuruse jaotust suspensioonis mõõdeti dünaamilise valguse hajumise põhjal (Zetasizer Nano, ZS90, Malvern, UK), mis näitas, et albumiiniga koorega MB-de läbimõõt oli 1,02 ± 0,11 µm (keskmine ± SD) ja kontsentratsioon 1,40 × 108 MBs/ml.

2.2. Laser-indutseeritud MB häire 

Varasemad uuringud on näidanud, et tõhusa TDD jaoks on vaja USA-vahendatud MB katkestust (st inertsiaalset kavitatsiooni) [8, 16, 17]. Käesolevas uuringus mõõdeti MB katkestuse efektiivsust erinevat tüüpi laserite kasutamisel erinevates tingimustes. MB-de kontsentratsioon reguleeriti Eppendorfi torus väärtusele 2,8 × 107 MBs/mL (viiekordne lahjendus) ja 1,4 × 107 MBs/mL (kümnekordne lahjendus) ning kiiritamist võimaldas nelja tüüpi laser: õhkjahutusega argoonioonlaser. (515 nm, pidev laine), superkontiinumkiudlaser (1064 nm, impulsslaine), Nd: YAG laser (532 nm, impulsslaine) ja CO2 fraktsionaalne laser (10 600 nm, impulsslaine). Erinevat tüüpi laserite üksikasjalikud tingimused on loetletud tabelis 1.

Optilise seadistuse näide on näidatud joonisel 1. Temperatuuri muutust laserkiirguse ajal mõõdeti termomeetriga (Optris LS, Optris, Berliin, Saksamaa). Seejärel lisati pärast laseriga kokkupuudet mikroskoobi slaidile vaatlemiseks 100 µl MB lahust. MB-de arv valgusmikroskoopilistel piltidel enne ja pärast laserkiirgust teisendati 8-bitiste halltoonide kujutisteks, kasutades MATLAB-i (The MathWorks, Natick, MA, USA), et hõlbustada MB katkestuste jälgimist. MB-de hävimiskiirus kvantifitseeriti vastavalt kahjustatud aladele, kasutades järgmist võrrandit:

2.3. Läbitungimissügavus seanahka

2.4. In vitro naha tungimine -arbutiini lahusega

{{0}} mm paksune seanaha proov koguti Humby noaga, puhastati hoolikalt PBS-iga ja lõigati ruudukujulisteks tükkideks (2 cm × 2 cm). Nahaproovide ringikujulised alad raadiusega 1,5 cm ja kõrgusega 5 mm ümbritseti geeliga, et vältida leket, kui proovi laaditi 5{{30}}0 µl MB-ga. Pärast proovi seitsmekordset kiiritamist (tingimused on loetletud tabelis 1) CO2 fraktsioneeriva laseriga testiti naha läbitungimist, kasutades staatilisi Franzi difusioonirakke 2, 14 cm2 suurusel alal vastavalt eelnevalt kirjeldatud katseplaanile [7]. Difusioonisõlme temperatuuri hoiti 37 ◦C juures. -arbutiin (30 mg/ml, 500 µL, 4-hüdroksüfenüül- -D-glükopüranosiid, molekulmass=272,25 Da; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) oli kantakse naha epidermaalsele küljele ja suletakse parafilmiga (Pechiney Laboratory Safety Products and Apparel, Chicago, IL, USA). Naha poole suunatud retseptori difusioonikamber täideti 12 ml PBS-ga (pH 7,4), mida segati 600 pööret minutis pöörleva magnetvarda abil. Testlahused, mis ei sisaldanud MB-sid, filtreeriti läbi 02-µm mikropoorfiltri (Nalgene, Rochester, NY, USA) või 022-µm mikropoorfiltri (Millex, Darmstadt, Saksamaa). Retseptorlahuse alikvoodid (200 µL) võeti 0, 1, 2, 3, 4, 6, 8, 10, 12 ja 24 tunni järel ning asendati sama koguse värske retseptori lahusega.

2.5. -arbutiini HPLC analüüs

Arbutiini kontsentratsioonide mõõtmiseks kasutati Inspire™ C18 kolonni (250 mm × 4,6 mm, osakeste suurus 5 µm; Dikma Technologies, Lake Forest, CA, USA). HPLC-süsteem oli varustatud kahendpumbaga (PU-2089, Jasco, Tokyo, Jaapan) ja ultraviolettkiirguse (UV) detektori (UV-2075, Jasco) lainepikkuseks määrati 280 nm. Liikuv faas koosnes metanoolist: destilleeritud veest (pH 5,5, 70:30 maht/maht) [18] kiirusega 0,6 ml/min. Kõik analüüsitavad proovid süstiti mahuga 20 µL. -arbutiini retentsiooniaeg oli umbes 4,3 minutit.

2.6. Loomade ravi

Organoidide melaniinisisaldust uuriti hiiremudelis C57BL/6J [19]. Viie nädala vanused hiired kaaluga 20–25 g saadi ettevõttest Bio Lasco (Taipei, Taiwan). Katseprotokolli kiitis heaks Taiwani Taipei riigikaitse meditsiinikeskuse institutsionaalne loomade hooldamise ja kasutamise komitee. Loomade hooldamise protseduurid vastasid institutsionaalsetele juhistele ja määrustele (kinnitus nr IACUC-17-092). Kogu katsete ajal hoiti loomi roostevabast terasest puurides konditsioneeritud ruumis, mille temperatuur hoiti 25–28 ◦C ning valguse ja pimeduse vaheldumisi 12 tundi.

Loomi aklimatiseerus 7 päeva enne katset. Pärast nende karvade eemaldamist 2 cm × 2 cm suuruselt alalt mõõdeti nahavärvi kromomeetriga (CR-400, Konica Minolta Sensing, Tokyo, Jaapan). Seejärel eksponeeriti loomi ultraviolett-B (UVB) kiirgusega (G8T5E, Sankyo, Tokyo, Jaapan), et kutsuda esile hüperpigmentatsioon (kogu energiadoos kokkupuute kohta=1 J/cm2, lainepikkus=306 nm, kolm korda per nädalal 2 nädala jooksul) ja seejärel mõõdeti uuesti nahavärvi.

Loomad jagati järgmisse viide rühma (n {0}} rühma kohta, ravi korrati iga 3 päeva järel 20 päeva jooksul): (1) ravita (rühm C); (2) ainult läbitungiva -arbutiini (300 µg/mL, 0,2 ml/cm2) pealekandmine (rühm A); (3) naha kiiritamine laseriga otse läbitungiva -arbutiini (300 ug/mL, 0,2 ml/cm2) pealekandmisega (rühm L pluss A); (4) soolalahusega kaetud naha kiiritamine laseriga läbitungiva -arbutiini (300 ug/mL, 0,2 ml/cm2) pealekandmisega (rühm L pluss S pluss A); ja (5) naha kiiritamine laseriga kombineerituna nahale MB-dega ja läbistava -arbutiini (300 ug/mL, 0,2 ml/cm2) pealekandmine (rühm L pluss MB-d pluss A). Iga raviga indutseeritud nahavärvi muutust hinnati eelnevalt kindlaksmääratud aegadel kromameetri abil. Heleduse indeks L [20] arvutati igal mõõtmispäeval enne ja pärast ravi.

2.7. Histoloogiline uuring

Nahakoeproovid (ligikaudu 8 mm × 8 mm) võeti ravipiirkonnast vahetult pärast katseid ja säilitati 10-protsendilises formaliinilahuses. Kasutati hematoksüliini ja eosiini (HE; Sigma-Aldrich) värvimist ning proove analüüsis ekspert dermatopatoloog (HWG). Mõned teised proovid värviti Fontana-Massoni hõbenitraadiga (Kojima Chemical, Kashiwabara, Jaapan) 30 minutit temperatuuril 60 °C, seejärel pesti destilleeritud veega ja fikseeriti 5% naatriumtiosulfaadi lahuses (Duksan, Seoul, Korea) 2 tundi. min, enne uuesti destilleeritud veega pesemist. Seejärel värviti proove 5 minutit tuumakiire punase lahusega (Fluka, Buchs, Šveits) ja pesti kaks korda destilleeritud veega. Lõpuks dehüdreeriti proove 95-protsendilises, seejärel 100-protsendilises etanoolis ja pesti kaks korda ksüleeniga (Duksan) [21].

2.8. Statistiline analüüs

Saadud andmeid analüüsiti statistiliselt Studenti t-testi abil. Tõenäosusväärtust p < 0,05 peeti olulise erinevuse märgiks.

3. Tulemused

3.1. Laser-indutseeritud MB häire

Viiekordselt lahjendatud MB-de mikroskoopiakujutised ilma kiiritamata ja kiiritamata 10,8 mW pideva (õhkjahutusega argoonioon) laseriga ja 10,8 mW impulsslaseriga (supercontiinuum fiiber) laseriga 60, 120 ja 180 s on näidatud joonisel 2. impulsslaseri hävimismäär suurenes 17,66%, 20,52% ja 39,05% võrreldes pidevlaseriga vastavalt 60, 120 ja 180 s. Joonis 3 näitab viie- ja kümnekordselt lahjendatud MB-de hävitamise efektiivsust Nd:YAG-impulsslaseri kasutamisel 60, 120 ja 180 s juures. Viie- ja kümnekordselt lahjendatud MB-de hävimismäärad olid vastavalt 72,46 protsenti ja 78,59 protsenti 60 sekundi jooksul, 88,06 protsenti, 96,10 protsenti 120 sekundi juures, 85,22 protsenti ja 98,80 protsenti 180 sekundi pärast. Joonisel 4 on näidatud kümnekordselt lahjendatud MB-de hävitamise efektiivsus kliinilise CO2 fraktsioneeriva impulsslaseriga kiiritamisel üks, kolm ja seitse korda. Hävituskiirus suurenes koos kiiritamise ajaga, olles seitsmekordse kiiritamise korral ligi 100 protsenti, mistõttu kasutati seda tingimust järgmistes in vitro ja in vivo katsetes.

lisateabe saamiseks: david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501