Vesipõhisest ensümaatilisest ekstraheerimisest saadud kõrvitsa (Cucurbita Moschata) seemneõli rasvhapete koostise, antioksüdantide ja farmakoloogilise toime hindamine, 1. osa

May 08, 2023

Abstraktne:Kõrvitsaseemneõli on kõrvalsaadus, mis sisaldab rohkelt toitaineid ja bioaktiivseid komponente, mis soodustavad mitmeid tervisele kasulikke omadusi. Selle uuringu eesmärk oli võrrelda Cucurbita moschata Duchist ekstraheeritud kõrvitsaseemneõlide keemilist koostist, antioksüdante ja farmakoloogilist toimet. Ex Poir. (PSO1) ja Cucurbita moschata (Jaapani kõrvits) (PSO2) ensümaatilise vesiekstraktsiooni teel. Ensümaatilise ekstraheerimise protsessis kasutati ensüümide segu, mis koosnes pektinaasist, tsellulaasist ja proteaasist (1:1:1). Õlide rasvhappeline koostis määrati rasvhappe metüülester/gaasikromatograafilise-massispektromeetria abil. Antioksüdandi aktiivsuse analüüsid mõõdeti stabiilse vabade radikaalide difenüülpikrüülhüdrasüüli, radikaalkatiooni 2, 20 -asinobis-(3- etüülbensotiasoliin-6-sulfonaati, raud(III) redutseeriva/antioksüdantse toime) ja raud(III)tiotsüanaadi inhibeerimise testiga. Uuriti naha vananemis- ja valgendamisprotsessiga seotud ensüüme. Linoolhape oli kõigi kõrvitsaseemneõlide põhikomponent. Lisaks tuvastati märkimisväärne kogus oleiinhapet, palmitiinhapet ja steariinhapet. PSO2-l oli kõrgeim antioksüdantne toime võrreldes kõrvitsaseemneõliga. PSO1 ja kaubanduslikud kõrvitsaseemneõlid (COM1 ja COM2). Nii PSO1 kui ka PSO2 inhibeerisid paremini hüaluronidaasi, kollagenaasi ja türosinaasi kui reklaamidel. Seetõttu võib vesipõhine ensümaatiline ekstraheerimine anda kõrvitsaseemneõlisid, millel on kõrgem antioksüdant, vananemisvastane ja See on kasulik edasistes farmakoloogilistes uuringutes ja seda saab kasutada funktsionaalse toiduna, mis parandab nahka.

Asjakohaste uuringute kohaseltcistancheon tavaline ravimtaim, mida tuntakse kui "imerohi, mis pikendab eluiga". Selle põhikomponent ontsistanosiid, millel on erinevad mõjud naguantioksüdant, põletikuvastanejaimmuunfunktsiooni edendamine. Mehhanism cistanche janahka valgendaminepeitub cistanche antioksüdantses toimesglükosiidid. Inimese nahas sisalduv melaniini toodetakse türosiini oksüdeerumisel, mida katalüüsibtürosinaas, ja oksüdatsioonireaktsioon nõuab hapniku osalemist, seega muutuvad keha hapnikuvabad radikaalid oluliseks melaniini tootmist mõjutavaks teguriks. Tistanche sisaldab tsistanosiidi, mis on antioksüdant ja võib vähendada vabade radikaalide teket organismis, seegamelaniini tootmise pärssimine.

cistanche para que serve

Klõpsake valikul Cistanche Tubulosa Supplement

Lisateabe saamiseks:

david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501

Märksõnad:Cucurbita moschata; Jaapani kõrvits; kõrvitsaseemneõli; vesipõhine ensümaatiline ekstraheerimine; rasvhapped; antioksüdant; Vananemisvastane

1. Sissejuhatus

Kõrvits kuulub perekonda Cucurbita ja perekonda Cucurbitaceae, tavaline ja kuulus taim, mida kasvatati Põhja-Mehhikos ning mis on levinud Euroopasse, Lääne-Ameerikasse ja Aasiasse [1]. Kõrvitsat peetakse funktsionaalseks toiduks, mis sisaldab rohkelt toitaineid, nagu valk, süsivesikud, lipiidid, kiudained jne, koos fütokeemiliste ühenditega, nagu tokoferoolid, karotenoidid ja -sitosterool [2]. On leitud, et kõrvitsa erinevatest osadest pärit fütotoitainetel on farmakoloogiline toime [2]. Kõrvitsakoore ekstrakt näitas loommudelites kasulikku põletushaavade toimet [3]. Kõrvitsa viljalihal oli antioksüdantne, põletikuvastane ja angiogeneesivastane toime [2], samuti väsimusevastane toime hiirtel [4]. Lisaks on kõrvitsaseemned hea looduslik asendamatute rasvhapete ja fütosteroolide allikas, mis vähendab kardiovaskulaarse suremuse riski [5,6]. Kõrvitsaseemneõli on kõrvitsaseemnete töötlemise kõrvalsaadus, mis sisaldab rohkesti erinevaid rasvhappeid ja bioaktiivseid ühendeid nagu karoteenid, tokoferool, B-vitamiin, luteiin, fütosteroolid ja muud mineraalid [7,8]. Õlil on antioksüdantne, põletikuvastane, antibakteriaalne ja haavu parandav toime [1,9]. Lisaks on sellel mitmeid tervisega seotud eeliseid haiguste, näiteks hüpertensiooni, diabeedi ja vähi vastu [8,10].

Seemneõli ekstraheerimiseks on välja töötatud erinevaid meetodeid, sealhulgas mehaanilisi meetodeid, nagu külmpressimine [11] ja kõrgsurve ekstraheerimine [12]. Samuti on dokumenteeritud seemneõli lahustiga ekstraheerimine, kasutades orgaanilisi lahusteid, nagu heksaan, etüülatsetaat, atsetoon ja metanool [13,14]. Ensüümi abil ekstraheerimine on alternatiivne meetod taimeõlitööstusele, kuna see on keskkonnasõbralik ja ohutu tehnoloogia. Vesipõhise ensümaatilise ekstraheerimise peamine mehhanism on taimse materjali rakuseinte hüdrolüüs ja purustamine, mis suurendab läbilaskvust ja vabastab bioaktiivseid komponente, sealhulgas õlifaasi [15]. Selles ekstraheerimises kasutatavad erinevad ensüümide segud koosnevad pektinaasidest, tsellulaasidest, hemitsellulaasidest, arabinoosist, -glükanaasist ja ksülanaasist [16,17]. Ensüümi segu optimeeritud tingimused, näiteks temperatuur, pH, reaktsiooniaeg, osakeste suurus ja ensüümi kontsentratsioon, suurendasid samuti ensüümi aktiivsust [16]. Tänapäeval on seda meetodit laialdaselt kasutatud paljudest puuviljadest ja taimede seemnetest õli eraldamiseks [18,19]. Mõned varasemad uuringud näitasid kõrvitsaseemneõli optimeeritud seisundit kõrge saagise ja tõhusa farmakoloogilise toime saavutamiseks [20,21].

Praegu tarbivad inimesed kõrvitsaseemneõli magustoitudes või salatikastmetes, samuti on see populaarne koostisosa kosmeetikas. Naha vananemine on keeruline bioloogiline protsess, mida iseloomustavad kortsud, elastsuse kadu, niiskuse kadu ja kare tekstuur, mis on põhjustatud oksüdatiivsest stressist, DNA kahjustustest ja glükoosi lõpp-produktide kuhjumisest [22]. Hüaluroonhape, kollageen ja elastiin, mis on naha olulised komponendid, võivad laguneda vastavalt hüaluronidaasi, kollagenaasi ja elastaasi ensüümide toimel, mille tulemuseks on naha vananemine. Mitmeid taimeõlisid, nagu oliiviõli, päevalilleseemneõli, viinamarjaseemneõli ja jojobaõli, on kasutatud naha kosmeetiliste omaduste jaoks, et säilitada niiskust, parandada naha barjäärifunktsiooni ja ennetada naha vananemist [23]. Lisaks on naha pigmentatsioon inimestel muutuv ja märgatav fenotüüp, mis hõlmab melanogeneesi ja mida reguleerib ensüüm türosinaas [24]. Praegu on erinevaid taimseid ekstrakte testitud kosmeetikatoodete ja ravimite jaoks, et vähendada melaniini tootmist, toimides valgendavate ainetena [25,26].

cistanche tubulosa supplement

Hiljuti C. moschata Duch. Ex Poir on üks Tais tavaliselt kasvatatud ja populaarne kõrvitsa kultivar, kuid selle funktsionaalseid väärtusi ja farmakoloogilisi omadusi käsitlevaid uuringuid on vähe. Veelgi enam, vesipõhine ensümaatiline ekstraheerimine on huvitav meetod kõrvitsaseemnetest õli ekstraheerimiseks, et saavutada kõrge saagis ja tõhusus. Seetõttu keskendus see uuring C. moschata Duch kõrvitsaseemneõli peamiste koostisosade, antioksüdantide ja farmakoloogilise toime määramisele. Ex Poir. (Tai kultivar) ja C. moschata (Jaapani kõrvits) vesipõhise ensümaatilise ekstraheerimise meetodil.

2. Materjalid ja meetodid

2.1. Taimsed materjalid

C. moschata Duch värsked viljad. Ex Poir ja C. moschata (Jaapani kõrvits) osteti Taist Chiang Mai kohalikult turult 2020. aasta detsembris. Seemned koguti ja kõik kiulised kiud eemaldati. Pärast seemnekesta eemaldamist pesti kooritud kõrvitsaseemned ja kuivatati toatemperatuuril. Seemneid hoiti kuni edasise katsetamiseni suletud kilekotis. Lisaks osteti Taist Chiang Mais asuvast supermarketist kaks kaubanduslikku kõrvitsaseemneõli proovi (COM1 ja COM2). Kõik katsed viidi läbi kaubanduslike õlide tarbimiseks sobivuse kuupäeva jooksul.

2.2. Kemikaalid ja reaktiivid 

Clostridium histolyticum'ist pärit kollagenaas (ChC-EC.3.4.23.3), sigade pankrease elastaas (PE-EC 3.4.21.36), N-suktsinüül-Ala-Ala-p-nitroaniliid, raudsulfaat (FeSO4), hüaluroonhappe naatriumsool Streptococcus equi, veiste testidest saadud hüaluronidaas, Aspergillus nigeri pektinaas (EC 3.2.1.15, suurem või võrdne 5 ühikut mg valgu kohta, optimaalne pH=4.{{20}}, optimaalne temperatuur=61 ◦C), Aspergillus nigeri tsellulaas (EC 3.2.1.4, suurem või võrdne 0,3 ühikut/mg tahke aine, optimaalne pH=6.5, optimaalne temperatuur {{ 30}}–55 ◦C), Aspergillus Saito proteaas (EC 3.4.21.112, 0,6 ühikut või suurem tahke aine mg kohta, optimaalne pH=5,1, optimaalne temperatuur=57,2 ◦) C), 2,20 -asinobis-3-etüülbensotiasoliin-6-sulfonaat (ABTS), 2,2-difenüül-1-pikrüülhüdrasüülhüdraat (DPPH), 2,4,6 tripüridüül-s-triasiin (TPTZ), 6-hüdroksü-2,5,7,8-tetrametüülkromaan-2-karboksüülhape (Trolox), veise seerumi albumiin, kojhape, L -türosiin, L-DOPA, linoolhape, ühealuseline naatriumfosfaat (NaH2PO4·2H2O), kahealuseline naatriumfosfaat ja türosinaas seentelt osteti firmalt Sigma-Aldrrich (St. Louis, MO, USA). Lisaks osteti 37% vesinikkloriidhapet, 95% etanooli, destilleeritud (DI) vett, dimetüülsulfoksiidi (DMSO) ja metanooli ettevõttelt RCI Labscan Co., Ltd. (Bangkok, Tai). Ammooniumtiotsüanaat (NH4SCN) ja raudkloriid (FeCl2) osteti ettevõttelt Loba Chemie Pvt. Ltd. (Mumbai, India). Tris(hüdroksümetüül)aminometaan osteti firmalt Merck (Darmstadt, Saksamaa).

2.3. Ensümaatiline veepõhine ekstraheerimine

Kõrvitsaseemneõlid nii C. moschata Duch. Ex Poir ja C. moschata (Jaapani kõrvits) ekstraheeriti vesipõhise ensümaatilise ekstraheerimise meetodil, kasutades ensümaatilise hüdrolüüsi parameetreid eelmisest Kanopka jt uuringust. (2016), sealhulgas ensüümi kontsentratsioon, ensüümi ja substraadi suhe, reaktsiooni temperatuur, pH ja reaktsiooniaeg [21]. Kolm erinevat tüüpi ensüümi, sealhulgas pektinaas, tsellulaas ja proteaas, ühendati massisuhtes 1:1:1, et saada kontsentreeritud ensüümide kokteil. Seejärel lahjendati saadud kontsentraadi kokteil 2 massiprotsendilise ensümaatilise vesilahuse saamiseks DI vees. Seejärel lisati saadud ensümaatilisele vesilahusele massisuhtes 1:1 koorimata kõrvitsaseemned. Seejärel jahvatati segu toatemperatuuril Moulinex DB81 segistiga peeneks kuni homogeensuseni. Saadud lobri pH reguleeriti seejärel 0,1 M HCl-ga 4,7-ni ja inkubeeriti 54 °C juures 15 tundi. Pärast suspensiooni jahutamist toatemperatuurini tsentrifuugiti seda 11 500 × g juures 10 minutit. Ülemine supernatantide kiht, mis oli õlifaas, koguti. Ekstraheerimise käigus tekkinud koort ei emulgeeritud, vaid see eemaldati sifooniga mikropipeti abil. Kõrvitsaseemnete jäägid eemaldati filtrimisega läbi Whatman No.1 filterpaberi vaakumis [21]. Kõrvitsaseemneõli C. moschata Duch. Ex Poir (PSO1) ja C. moschata (Jaapani kõrvits) (PSO2) hoiti kuni edasiste katseteni hästi suletud valguskindlates anumates toatemperatuuril.

2.4. Kõrvitsaseemneõli keemilise koostise määramine rasvhappe metüülestri/gaasikromatograafilise-massispektromeetrilise (FAME/GC/MS) meetodiga

Kõrvitsaseemneõli rasvhapete koostis määrati rasvhappe metüülestri/gaasikromatograafilise-massispektromeetrilise (FAME/GC/MS) meetodiga. FAME on rasvhapete estri tüüp, mis saadakse rasvade happega katalüüsitud ümberesterdamisel metanooliga. Selles uuringus seebistati kõrvitsaseemneõlisid (PSO1, PSO2, COM1 ja COM2), lisades 15 minutiks 0,5 M NaOH lahust metanoolis temperatuuril 100 ◦C. . Pärast jahutamist derivatiseeriti õliproovid boortrifluoriidiga (BF3) metanoolilahuses temperatuuril 100 ◦C 1 minuti jooksul, et moodustada FAME tooteid. Pärast jahutamist ning küllastunud NaCl ja heksaani lisamist jaotati FAME heksaanifaasiks ja koguti süstimiseks viaalidesse. FAME ekstrakte analüüsiti GC/MS tehnikaga järgmistes tingimustes: kapillaarkolonni mõõtmed (TR-FAME, suurus 60 m × 0,25 mm, osakeste suurus 0,{18}}µm), töötemperatuuri programm 50 ◦C ; hoida 2 min kaldtee 1 kiirusega 10 ◦C/min kuni 180 ◦C, hoida 15 min; kaldtee 2 kiirus 4 ◦C/min, lõpptemperatuur 230 ◦C, hoidmine 22,50 min. Heeliumi kasutati kandegaasina voolukiirusel 1,0 ml/min. Õliproovid süstiti jaotuseta režiimis (jagamissuhe 1:20 ja poolitussuhe 20 ml/min) 235 ◦C juures automaatse proovivõtturiga. Elektropihustusionisatsiooni (ESI) allikaga varustatud MS-detektor, mis töötas 70 eV juures ning iooniallika ja ülekandeliini temperatuurid olid seatud vastavalt 200 ◦C ja 220 ◦C, registreeris massispektrid m/z vahemikus. 38–600. Analüüsitud ühendid määrati, võrreldes nende massispektreid avaldatud andmetega (National Institute of Standards and Technology, 2008). Protsentuaalne koostis arvutati, integreerides piigid koguioonkromatogrammidesse (TIC). Kõik mõõtmised viidi läbi uurimis- ja teeninduslaboratooriumis, Halal Science Centeris, Chulalongkorni ülikoolis, Bangkokis, Tais Halal GMP/HACCP ja Halal-QHS/ISO 22000 alusel.

cistanches herba

2.5. Antioksüdantide aktiivsuse määramine

2.5.1. 2,2-difenüül-1-pikrüülhüdrasüüli (DPPH) radikaali püüdmise test

DPPH radikaali (DPPH•) püüdmisaktiivsus määrati Chaiyana et al. (2017) [27]. Lühidalt, 20 µL õliproove (PSO1, PSO2, COM1, COM2) ja DMSO-s lahustatud linoolhapet segati 96-süvendiga plaadil 180 µL 167 µM DPPH etanoolilahusega ja inkubeeriti seejärel 30 minutit toatemperatuuril pimedas. Positiivse kontrollina kasutati askorbiinhapet (1 mg/ml). Optilist tihedust (OD) mõõdeti 520 nm juures, kasutades mikroplaadilugejat (Microplate readers EZ Read 2000, Biochrome, England). Katsed viidi läbi kolmes eksemplaris ja viidi läbi kolmes sõltumatus. DPPH inhibeerimise protsent arvutati võrrandi (1) abil:

DPPH inhibeerimine (protsent)={[(ODA − ODB) − (ODC − ODD)]/(ODA − ODB)} × 100, (1)

kus ODA on DI vett ja DPPH lahust sisaldava segu OD; B on DI vett ja DMSO-d sisaldava segu ODB; C on õliproove ja DPPH•lahust sisaldava segu ODC; ja ODD on õliproove ja DMSO-d sisaldava segu OD.

2.5.2. 2,20 -asino-bis-3-etüülbenstiasoliini-6-sulfoonhappe (ABTS) test

ABTS katioonsete radikaalide (ABTS• plus) püüdmisaktiivsust mõõdeti kolorimeetrilise meetodiga vastavalt Chaiyana et al. (2017) ja Paradee et al. (2019) [27,28] väikese muudatusega. ABTS• plus genereeriti, lisades 2 ml 7 mM ABTS-i koos 3 ml 2,45 mM kaaliumpersulfaadiga ja inkubeeriti 16–24 tundi toatemperatuuril pimedas. Saadud ABTS• plus lahjendati seejärel etanooliga, et saada OD 0,7 ± 0,1 750 nm juures. Lühidalt, 20 µL õliproove (PSO1, PSO2, COM1, COM2) ja DMSO-s lahustatud linoolhapet segati 96-süvendiga plaadil 180 µL ABTS• pluss etanoolilahusega ja inkubeeriti 5 minutit toatemperatuuril. . OD mõõdeti lainepikkusel 750 nm, kasutades mikroplaadilugejat (Microplate readers EZ Read 2000, Biochrome, England). Positiivse kontrollina kasutati askorbiinhapet (1 mg/ml). Standardkõver koostati neeldumise graafikul 750 nm juures versus Troloxi erinevate kontsentratsioonidega vahemikus 2,5–30 µg/ml. ABTS• pluss puhastusaktiivsus arvutati Troloxi standardkõveralt (R2=0.9922) ja väljendati Troloxi ekvivalentse antioksüdantide võimena (TEAC). Katsed viidi läbi kolmes eksemplaris ja viidi läbi kolmes sõltumatus.

2.5.3. Raudmetalli redutseeriva antioksüdandi võimsuse (FRAP) test

Iga proovi raudhapet redutseeriva antioksüdandi võimsus (FRAP) määrati FRAP-testi abil, nagu on kirjeldatud Chaiyana jt eelmises uuringus. (2017), mida oli veidi muudetud Saeio et al. (2011) [27,29]. FRAP reaktiiv genereeriti värskelt, segades 300 mM atsetaatpuhvrit (pH 3,6), 10 mM 2,4,6-tripüridüül-s-triasiini (TPTZ) 40 mM HCl-s ja 20 mM FeCl3 vahekorras 10:1:1. Selles uuringus segati 20 µL õliproove (PSO1, PSO2, COM1, COM2) ja linoolhapet 180 µL FRAP reagendiga 96-süvendiga plaadil ja inkubeeriti 5 minutit toatemperatuuril pimedas. OD mõõdeti lainepikkusel 595 nm, kasutades mikroplaadilugejat (Microplate readers EZ Read 2000, Biochrome, England). Positiivse kontrollina kasutati askorbiinhapet (1 mg/ml). Standardkõver saadi neeldumise graafikul 595 nm juures versus raud(III)sulfaadi (FeSO4) erinevate kontsentratsioonidega vahemikus 0,003–0,5 mM. FRAP väärtus arvutati FeSO4 standardkõveralt (R2=0.9965) ja väljendati ekvivalentvõimsusena (EC1). Katsed viidi läbi kolmes eksemplaris ja viidi läbi kolmes sõltumatus.

2.5.4. Raudtiotsüanaadi (FTC) analüüs

Lipiidide peroksüdatsiooni pärssimist uuriti raudtiotsüanaadi (FTC) meetodil. See meetod viidi läbi vastavalt sammudele, mida on kirjeldanud Osawa et al. (1981) [30] väikeste muudatustega. Segu koosnes 50 µL õliproovidest (PSO1, PSO2, COM1, COM2) ja linoolhappest, 50 µL 50% linoolhappest DMSO-s, 50 µL 10% ammooniumtiotsüanaadi (NH4SCN) vesilahusest. ja 50 ui 2 mM raudkloriidi (FeCl2). Seejärel inkubeeriti segu temperatuuril 37 ± 2 °C 1 tund ja OD mõõdeti 500 nm juures, kasutades mikroplaadilugejat (Microplate readers EZ Read 2000, Biochrome, England). Positiivse kontrollina kasutati tokoferooli (0,025–0,1 mg/ml). Katsed viidi läbi kolmes eksemplaris ja viidi läbi kolmes sõltumatus. Lipiidide peroksüdatsiooni inhibeerimise aktiivsus arvutati võrrandi (2) abil:
Lipiidide peroksüdatsiooni inhibeerimine (protsent)={[(ODA − ODB) − (ODC − ODD)]/(ODA−ODB)} × 100, (2)
kus ODA on linoolhapet, NH4SCN ja FeCl2 sisaldava segu OD; ODB on DMSO OD; ODC on õliproove, linoolhapet, NH4SCN ja FeCl2 sisaldava segu OD; ja ODD on õliproove ja DMSO-d sisaldava segu OD.

2.6. Vananemisvastaste tegevuste määramine

2.6.1. Hüaluronidaasi vastane aktiivsus

Hüaluronidaasivastase aktiivsuse mõõtmine viidi läbi nii, nagu on eelnevalt kirjeldanud Chaiyana et al. (2020) [31]. Kõigepealt segati 20 µL õliproove (PSO1, PSO2, COM1, COM2) 100 µL 15 U/mL hüaluronidaasi lahusega ja inkubeeriti 37 ◦C juures 10 minutit. Pärast inkubeerimist lisati 100 µl 0,03 massiprotsenti hüaluroonhapet, mis lahustati 20 mM fosfaatpuhvris (pH 5,35), seejärel inkubeeriti temperatuuril 37 °C 45 minutit. Pärast seda lisati 1 ml 0,1% veise seerumi albumiini ja inkubeeriti toatemperatuuril 10 minutit. OD määrati 600 nm juures, kasutades mitmemoodilist detektorit (Beckman Coulter DTX880, Fullerton, CA, USA). Positiivse kontrollina kasutati oleanoolhapet (0,25 massiprotsenti). Katsed viidi läbi kolmes eksemplaris ja viidi läbi kolmes sõltumatus. Hüaluronidaasi inhibeerimise protsent arvutati võrrandi (3) abil:

Hüaluronidaasi inhibeerimine (protsent)={[(ODA − ODB) − (ODC − ODD)]/(ODA − ODB)} × 100, (3)
kus ODA on DI vett, hüaluronidaasi lahust ja hüaluroonhapet sisaldava segu OD; ODB on DI vett ja fosfaatpuhvrit (pH 5,35) sisaldava segu OD; ODC on õliproove, hüaluronidaasi lahust ja hüaluroonhapet sisaldava segu OD; ja ODD on õliproove ja fosfaatpuhvrit (pH 5,35) sisaldava segu OD.

2.6.2. Kollagenaasivastane aktiivsus

Kollagenaasivastase aktiivsuse mõõtmine viidi läbi Chaiyana et al. (2019) ja Thring et al. (2009) väikeste muudatustega [32,33]. Lühidalt, 20 µL õliproove (PSO1, PSO2, COM1, COM2) segati 20 µL 0,1 U/mL kollagenaasi lahusega Clostridium histolyticum'ist ja inkubeeriti 37 °C juures 15 minutit. Pärast inkubeerimist 80 µL 50 mM tritsiinipuhvrit (400 mM NaCl ja 10 mM CaCl2, pH 7,5) ja 40 µL N-[3-(2-furüül)akrüloüül]-Leu-Gly- Lisati Pro-Ala (FALGPA) substraadi lahus. OD tuvastati kohe 340 nm juures ja seejärel mõõdeti pidevalt 20 minutit, kasutades mikroplaadilugejat (Microplate readers EZ Read 2000, Biochrome, Inglismaa). Positiivse kontrollina kasutati oleanoolhapet (1% w/v). Katsed viidi läbi kolmes eksemplaris ja viidi läbi kolmes sõltumatus. Kollagenaasi inhibeerimise protsent arvutati võrrandi (4) abil:

Kollagenaasi inhibeerimine (protsent)=[(ODA − ODB)/ODA] × 100, (4)
kus ODA on õliproove, kollagenaasi lahust, tritsiini puhvrit ja FALGPA substraati sisaldava segu OD; ja ODB on DMSO-d, kollagenaasi lahust, tritsiini puhvrit ja FALGPA substraati sisaldava segu OD.

2.6.3. Elastaasivastane aktiivsus

Elastaasivastase aktiivsuse mõõtmine viidi läbi Chaiyana et al. (2019) ja Thring et al. (2009) väikeste muudatustega [32,33]. Lühidalt, 10 µL õliproove (PSO1, PSO2, COM1, COM2) segati 40 µL 0,03 U/mL sea pankrease elastaasi lahusega, seejärel 50 µL 200 mM Tris-HCL puhvriga (pH 8,0) ja 10 µL 0,0 Lisati 0,8 mM N-suktsinüül-Ala-Ala-Ala-p-nitroaniliidi (AAAPVN) substraadi lahus. OD tuvastati kohe lainepikkusel 410 nm ja seejärel mõõdeti pidevalt 20 minutit, kasutades mikroplaadilugejat (Microplate readers EZ Read 2000, Biochrome, Inglismaa). Positiivse kontrollina kasutati oleanoolhapet (1% w/v). Katsed viidi läbi kolmes eksemplaris ja viidi läbi kolmes sõltumatus. Elastaasi inhibeerimise protsent arvutati võrrandi (5) abil:

Elastaasi inhibeerimine (protsent)=[(ODA − ODB)/ODA] × 100, (5)
kus ODA on õliproove, elastaasi lahust, Tris-HCl puhvrit ja AAAPVN substraati sisaldava segu OD; ja ODB on DMSO-d, elastaasi lahust, Tris-HCl puhvrit ja AAAPVN substraati sisaldava segu OD.

2.7. Türosinaasivastaste aktiivsuste määramine

Loodusliku ekstrakti valgendav toime tehti kindlaks türosinaasivastase aktiivsuse mõõtmisega, mis viidi läbi vastavalt Saeio et al. (2011) ja Laosirisathian et al. (2020) [29,34]. Selles uuringus olid türosinaasi ensüümi substraadid L-türosiin ja L-DOPA. Lühidalt, 10 µL õliproove (PSO1, PSO2, COM1, COM2) segati 96-süvendiga plaadil 30 µL türosinaasiga, seejärel inkubeeriti toatemperatuuril 10 minutit. Pärast inkubeerimist lisati 100 µl substraati, mis on 2,5 mM L-türosiini või L-DOPA, ja inkubeeriti 30 minutit. OD määrati 450 nm juures, kasutades mikroplaadilugejat (Microplate readers EZ Read 2000, Biochrome, England). Positiivse kontrollina kasutati kojihapet (20 ug/ml). Katsed viidi läbi kolmes eksemplaris ja viidi läbi kolmes sõltumatus. Türosinaasi inhibeerimise protsent arvutati võrrandi (6) abil:

Türosinaasi inhibeerimine (protsent)={[(ODA − ODB) − (ODC − ODD)]/(ODA − ODB)} × 100, (6)
kus ODA on DMSO-d, türosinaasi ensüümi ja L-türosiini sisaldava segu OD; ODB on türosinaasi ensüümi ja PBS-i sisaldava segu OD, mille pH on 6,8; ODC on õliproove, türosinaasi ensüümi ja L-türosiini sisaldava segu OD; ja ODD on õliproove, türosinaasi ensüümi ja PBS-i sisaldava segu OD, mille pH on 6,8.

2.8. Statistiline analüüs

Kõiki andmeid demonstreeriti kui keskmine ± standardhälve (SD). Statistilist olulisust analüüsiti ühesuunalise dispersioonanalüüsi (ANOVA) abil, millele järgnes Tukey post-hoc test, kasutades GraphPad Prism (versioon 8.0, GraphPad Software) ja p < 0.05 võeti arvesse. statistiliselt oluline.

cistanche herb

3. Tulemused ja arutelu

3.1. Kõrvitsaseemneõli karakter

Selles uuringus kasutasime C. moschata Duchi kõrvitsaseemneõli ekstraheerimiseks orgaanilise lahustiga ekstraheerimise asemel vesipõhist ensümaatilist ekstraheerimist. Ex Poir (PSO1) ja C. moschata (PSO2), sest see on lihtne, tõhus ja produktiivne protsess [15,21]. PSO1 oli madala viskoossusega tumepruun vedelik, samas kui PSO2 oli madala viskoossusega rohekaspruun vedelik. Mõlemal kõrvitsaseemneõlil oli oma iseloomulik lõhn. PSO1 ja PSO2 saagised olid vastavalt 17,7 mahuprotsenti ja 15,6 mahuprotsenti. Lisaks õlile sisaldab kõrvitsaseemneid ka mitmesuguseid toitaineid. C. moschata lähedased koostised olid peamiselt süsivesikud (39,51 protsenti), millele järgnesid vastavalt rasv (28,49 protsenti), valk (19,23 protsenti), vesi (7,67 protsenti) ja tuhk (5,18 protsenti) [35]. Võrreldes varasemate uuringutega, milles kasutati lahustit ja mehaanilist pressimist, näitas käesolev uuring siiski väiksemat C. moschata õli saagist. Kuigi lahustiga ekstraheerimist on kirjeldatud kui kõige tõhusamat õli ekstraheerimismeetodit, millega ekstraheeritakse seemnetest kuni 98 protsenti õlidest, on probleeme lahustijääkide ja toodetava õli puhtusega [36]. Lisaks mõjutas ekstraheerimisprotsessis kasutatud lahusti tekkiva õli saagist. Ekstraheerimine heksaani, petrooleetri, petrooleetri benseeni, tsükloheksaani, isopropüüleetri, etüülatsetaadi, tetrahüdrofuraani, propaan-2-ooli ja atsetooniga andis 43,4–64,4 protsenti [37,38]. Seetõttu eelistati külmpressimist lahustiga ekstraheerimisele. Külmpressimine võib aga kruvipressi kasutamise algfaasis tekitada mõningaid keerukusi [39]. Seetõttu võiks ensümaatiline vesiekstraktsioon olla alternatiivne ekstraheerimismeetod, kuna see andis kõrgema kõrvitsaseemneõli sisalduse (36.0 protsenti) võrreldes külmpressitud õliga (33,5 protsenti) [21]. Kuigi vesipõhise ensümaatilise ekstraheerimise protsess oli keerulisem kui külmpressimine, sisaldab see suhteliselt odavamat investeerimiskulu, kaubanduslike ensüümpreparaatide kulude jätkuvat langust, võimalust eraldada üheaegselt ainulaadseid ja väärtuslikke fütokeemilisi komponente ning laialt levinud soov rakendada rohelisi tehnoloogiaid [21]. Esialgsed uuringud kirjeldasid, et taime rakuseina struktuuri hävitamiseks on sageli kasutatud mitmeid ensüüme, nagu tsellulaasid, pektinaasid, hemitsellulaasid ja proteaasid, et tõhustada taimedest bioaktiivset ekstraheerimist [16,17]. Seetõttu kavandasime selle uuringu seemneõli ekstraheerimiseks, kasutades pektinaasi, tsellulaasi ja proteaasi (1:1:1) sisaldavat ensüümide segu, nagu on eelnevalt kirjeldanud Kanopka et al. (2016), kes optimeeris ensümaatilise hüdrolüüsi tingimusi, et saada kõrvitsaseemneõli kõrgeim saagis [21]. Lisaks näitab see meetod ohutumaid ja keskkonnasäästlikumaid alternatiive lahustiga ekstraheerimisele, mida siin nimetatakse "roheliseks ekstraheerimiseks".

3.2. Kõrvitsaseemneõli keemiline koostis

Rasvhapete koostise analüüsiks võrreldi kõrvitsaseemneõli, milles kasutati ensümaatilist vesiekstraktsiooni (PSO1 ja PSO2), ja analüüsiti seda koos kaubandusliku kõrvitsaseemneõliga (COM1 ja COM2), mis on toodetud külmpressimise teel. PSO1, PSO2, COM1 ja COM2 rasvhapete koostised on näidatud tabelis 1. Kõik kõrvitsaseemneõli proovid koosnesid polüküllastumata (PUFA), monoküllastumata (MUFA) ja küllastunud rasvhapetest. Tsis-linoolhape (C18:2) oli kõigi õliproovide põhikomponent. Kõige rohkem rasvhappeid sisaldas COM2 (51,74 protsenti), millele järgnesid vastavalt COM1 (48.00 protsenti), PSO1 (39.09 protsenti) ja PSO2 (37,63 protsenti). Samamoodi oli cis-oleiinhapet (C18:1) suur protsent, eriti PSO2-s (37,45 protsenti), millele järgnesid COM1 (33,39 protsenti), PSO1 (31,22 protsenti) ja COM2 (28,64 protsenti). Küllastunud rasvhappeid, nagu palmitiinhape (C16:0) ja steariinhape (C18:0), leiti igas õliproovis vaid väikestes kogustes. Täheldati ja tuvastati ka teiste PUFA, MUFA ja küllastunud rasvhapete jälgi.

Kirjanduses tuntakse linoolhapet ka kui oomega{0}}, asendamatut rasvhapet, mida inimkeha ei saa sünteesida, vaid saab seda ainult toiduga. Linoolhape on inimeste tervisefunktsioonide jaoks oluline toitaine, hõlmates keramiidide eelkäijat, mis on rakumembraanide, D-vitamiini ja mitmesuguste hormoonide põhikomponent [40,41]. Loomkatsed on näidanud, et linoolhappe puudus võib põhjustada naha ketendamist ja sügelust [23]. Lisaks on taimeõlist saadav linoolhape toetanud nahahaavade paranemist ning ennetanud nahapõletikku ja aknet [23]. Lisaks on oleiinhape ehk oomega{5}} olnud kasulik vähi, autoimmuunsete ja põletikuliste haiguste ennetamisel [42]. Tõepoolest, oleiinhape vähendas oluliselt lämmastikoksiidi tootmist haava kohas, mille tulemuseks oli haava kiirem sulgumine [43]. Need andmed kinnitavad, et kõrvitsaseemneõli, mis rikastab linoolhapet (oomega-6) ​​ja oleiinhapet (oomega-9), avaldab potentsiaalset kasu tervisele.

cistanche tubulosa

Meie leidude põhjal koosnes kõrvitsaseemneõli (PSO1, PSO2, COM1 ja COM2) paljudest rasvhapetest, sealhulgas linoolhappest (C18:2), oleiinhappest (C18:2), palmitiinhappest (C16:0). ja steariinhape (C18:0), mis on kõrvitsaseemneõlis levinud komponendid [44]. Linoolhape (oomega-6) ja oleiinhape (oomega-9) olid kõigis õliproovides domineerivad. Suurim kogus linoolhapet oli COM2, millele järgnesid vastavalt COM1, PSO1 ja PSO2. Samuti oli suurim kogus oleiinhapet PSO2, millele järgnesid COM1, PSO1 ja COM2. Need tulemused selgitavad, et kõrvitsaseemneõli vesipõhisel ensümaatilisel ekstraheerimisel oli linoolhapet veidi madalam, kuid mitte oleiinhapet kui külmpressimisel. Ensümaatilise vesiekstraktsiooni kõrvitsaseemnete väiksema linoolhappe sisalduse põhjus kui kaubanduslikes õliproovides oli tingitud ekstraheerimisprotsessi erinevusest. Varasemad uuringud on leidnud ebakõlasid küllastumata rasvhapete, eriti oleiinhappe ja linoolhappe koguses erinevatest ekstraktidest saadud kõrvitsaseemneõlides [39]. Oleiinhappe sisaldus oli 28,19 protsendist külmpressitud kõrvitsaseemneõlis kuni 30,56 protsendini pentaaniga ekstraheeritud kõrvitsaseemneõlis, samas kui linoolhappe sisaldus ulatus 4386 protsendini pentaaniga ekstraheeritud kõrvitsaseemneõlis. 46,67 protsendini külmpressitud kõrvitsaseemneõlis [39]. Peale erinevate ekstraheerimismeetodite mõjutasid seemnete linoolhappe sisaldust ka ekstraheerimisel kasutatud lahustid ja seemnete küpsemise temperatuur. Eelmine uuring tõi esile, et petrooleeter andis madala linoolhappesisaldusega (26,2 protsenti) linaseemneõli, samas kui n-heksaan andis vastuolulisi tulemusi, kui linoolhappe sisaldus oli 46,5 protsenti [45]. Lisaks on linoolhape päevalilleseemnete küpsemise ajal pöördvõrdeline temperatuuriga [46].

Lisaks avastas suhteline uuring, et rasvhapete koostise keemiline koostis näitas, et dietüüleetriga ekstraheeritud kõrvitsaseemneõlis (C. maxima) olid linool- ja oleiinhapped vastavalt 47,45% ja 35% [47]. . Vastavalt Akin et al. (2018), linoolhappe sisaldus oli vahemikus 53,19 protsenti kuni 53,27 protsenti, millele järgnes oleiinhape, mida oli samuti suurtes kogustes 27,52–27,59 protsenti külmpressitud C. pepo L. seemneõli ekstraheerimisel [48 ]. Seetõttu andis selles uuringus ensümaatiline vesiekstraktsioon ka väiksema rasvhapete saagise kui varasemates uuringutes mainitud lahustiga ekstraheerimine ja külmpressi ekstraheerimine. Kultivaride võrdluses leidsime, et PSO1 (C. moschata Duch. Ex Poir) näitas suuremat linoolhappe kogust kui PSO2 (C. moschata või Jaapani kõrvits). PSO2 sisaldas erinevalt suuremas koguses oleiinhapet kui PSO1. Oluline on see, et rasvhapete profiilide ja kõrvitsaseemneõli koguste erinevused sõltusid konkreetsete kultivaride päritolust, kliimatingimustest ja koristusjärgsest majandamisest [49]. Lisaks erinevatel ekstraheerimismeetoditel saadud kõrvitsaseemneõlide rasvhapete profiilide erinevustele on vesipõhise ensümaatilise tehnoloogia abil saadud õlid fütosterooli ja tokoferooli rikkad [50]. Seetõttu soovitatakse edasiseks kasutamiseks alternatiivsete kõrvitsaseemneõlidena PSO1 ja PSO2, mis on toodetud rohelise ekstraheerimise meetodil.


Lisateabe saamiseks: david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501

Ju gjithashtu mund të pëlqeni