Cistanche Herba tsistanosiid leevendab hüpoksiast põhjustatud meeste reproduktiivkahjustusi oksüdatiivse stressi pärssimise kaudu -Ⅰ

Sissejuhatus

Praegu mõjutab viljatus maailmas ligikaudu 48,5 miljonit (15%) reproduktiivses eas paari, millest 40-50% juhtudest on tingitud meeste viljatusest, mis on tugevalt seotud keskkonna- ja elustiili teguritega. Tõendid näitavad, et imetajate munandite tundlikkus madala hapnikurõhu suhtes on meeste viljatuse teatud vormide põhjuslik tegur. Nagu varasemates uuringutes on näidatud, on hüpobaarse hüpoksiaga kokkupuutel spermatogenees kahjustatud ja vähenenud.

LOODUSLIK TUBULOOS SUGUFUNKTSIOONI PARANDAMISEKS PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Selle aluseks oleva mehhanismi uurimiseks on uuringud näidanud, et kokkupuude hüpobaarse hüpoksiaga suurendab reaktiivsete hapnikuliikide (ROS) tootmist. ROS mängib olulist rolli meeste reproduktiivsüsteemis. Madalatel tasemetel on need vajalikud spermatosoidide mahtuvuse, akrosoomreaktsiooni ja spermatosoidide-ootsüütide liitmiseks [10]. Kuid liigne ROS võib põhjustada spermatosoidide tuuma/mitokondriaalse DNA kahjustusi ja plasmamembraani peroksüdatiivseid kahjustusi, mis omakorda on peamised etioloogilised teguridsuurenenud meeste viljatuse risk. Seega võib hüpoksiast põhjustatud ROS-i kuhjumine olla üks meeste viljatuse põhjuseid.

Cistanches Herba, mitmeaastane parasiitne ravimtaim, on laialt levinud kuivadel aladel ja seda kasutatakse laialdaselt selle farmakoloogilise toime tõttu. Kogu tõhusa sisu hulgasCistanches Herba, PhG-sid on peetud peamiseks aktiivseks komponendiks. Praeguseks on isoleeritud 34 PhG-dCistanches taimed. Tsistanosiid(Cis), aktiivne PhG, mis on eraldatudCistanches Herba, on pälvinud tähelepanu oma antioksüdantse toime tõttu.

Arvestades Cis-i antioksüdantset toimet ja ROS-i rolli hüpoksiast põhjustatud meeste viljatuses, peetakse cissi potentsiaalseks ravimikandidaadikshüpoksiast põhjustatud meeste viljatus. Kuid vähesed aruanded on käsitlenud Cistanches Herbast ekstraheeritud Cis'i antioksüdantset toimet hüpoksiast põhjustatud meeste viljatuse ravis või sellega seotud signaaliradu. Selles uuringus koostati in vitro ja in vivo hüpoksia eksperimentaalsed mudelid ning hinnati erinevate Cis-de mõjukomponente.

materjalid ja meetodid

Rakukultuur ja reaktiiv

Hiire spermatogoonia rakuliin GC-1spg (GC-1) osteti Ameerika tüüpkultuuride kollektsioonist (ATCC) ja kultiveeriti DMEM-is (Invitrogen, USA), millele oli lisatud 10% veise loote seerumit, 1%. L-glutamiin (100 mM), penitsilliin (100 U/ml) ja streptomütsiin (100 ug/ml) 37 kraadi juures 5% CO2-ga niisutatud inkubaatoris. Cis (Cis-A, B, C, H) osteti firmalt Chengdu Gelipu Biotechnology Co., Ltd. (Hiina).

LOODUSLIK TUBULOOS SUGUFUNKTSIOONI PARANDAMISEKS PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Rakkude elujõulisuse test

Rakkude elujõulisust testiti rakkude loenduskomplekti{{0}} testiga (CCK-8). Lühidalt öeldes külvati GC-1 rakud 96-süvendiplaatidele tihedusega 1,5 × 103 süvendi kohta ja kultiveeriti 37 kraadi juures 24 tundi. Seejärel töödeldi rakke erineva kontsentratsiooniga (20%, 15%, 10%, 5%) hapnikuga või erinevate kontsentratsioonidega (2 μM, 0,2 μM, 0,02 μM) Cis (Cis-A, Cis-B, Cis- C, Cis-H) vajaliku aja jooksul. Seejärel visati supernatant ära ja rakkude elujõulisus tuvastati CCK-8 komplekti (Dojindo Jaapan) abil. Iga süvendi neeldumist mõõdeti 450 nm juures, kasutades mikroplaadilugejat (BioRad USA). Lõpuks arvutati rakkude elujõulisus järgmise valemi järgi: Rakkude elujõulisus=(ODeksperimentaalne rühm - ODblank rühm)/ (OD kontrollrühm - ODblank rühm) × 100%.

Western blot analüüs

Kogutud rakud või koed homogeniseeriti valkude ekstraheerimiseks RIPA puhvris (RIPA Beyotime China; Cocktail Roche Switzerland). Supernatandid koguti ja valkude kontsentratsiooni testiti BCA meetodil (Beyotime). Ligikaudu 40 ug igast proovist ekstraheeritud valke eraldati SDS-PAGE abil ja kanti elektrotranspordiga nitrotselluloosi (NC) filtrimembraanile (Beyotime China). NC filtri membraane blokeeriti 5% rasvavaba piimaga 1,5 tundi ja inkubeeriti spetsiifiliste antikehadega (anti-PARP 1:1000, anti-Caspase-3 1:1000, anti-Bcl-2 1:1000, anti-Bax 1 :1000, anti-GAPDH 1:1000 kõik antikehad osteti ettevõttest Cell Signaling Technology, USA) üleöö temperatuuril 4 °C. Seejärel inkubeeriti kõiki NC membraane vastava mädarõika peroksidaasiga konjugeeritud sekundaarse antikehaga 1, 5 tundi toatemperatuuril ja pildistati pildistamissüsteemiga (Tannon, Hiina).

Rakutsükli tuvastamine

Rakutsükli analüüsimiseks viidi läbi voolutsütomeetriline test (FCM). Rakke töödeldi erinevates tingimustes 72 tundi ja koguti. Seejärel pesti rakke PBS-ga, fikseeriti 75% etanoolis ja värviti propiidiumjodiidiga (PI). Iga proovi jaoks koguti 1 × 104 rakku ja analüüsiti voolutsütomeetriaga (FACS Calibur, BD Biosciences). Seejärel arvutati G1/S/G2 faasi rakkude osakaal ja proliferatsiooniindeks [faas(S+G2)/faas(G1+S+G2) × 100%].

Ki-67 värvimine

Rakke kultiveeriti konfokaalses tassis ja töödeldi hüpoksiaga või erinevate Cis-i alatüüpidega 72 tundi. Pärast kõigi rakkude fikseerimist 4% paraformaldehüüdiga inkubeeriti neid anti-Ki-67 antikehaga (1:200, Cell Signaling Technology). Seejärel inkubeeriti kõiki rakke vastava CY{6}}konjugeeritud küülikuvastase IgG-vastase antikehaga (1:200, Boster, Hiina) ja DAPI lahusega (1,0 ug/ml, Beyotime). Fluorestsentsi jälgiti Fluoview FV1000 konfokaalse mikroskoobiga (Olympus, Jaapan).

KÕIGE CISTANHE TUBULOSA EXTRAKT TESTOSTEROONI TÕHENDAMISEKS PHGS75% ECH 30% ACT 12%

ROS-i tuvastamine

FCM võeti kasutusele rakusisese ROS taseme mõõtmiseks DCFH-DA abil. Suspendeeritud rakud külvati 6-süvendiplaatidele ja töödeldi erinevalt. Pärast 72-tunnist töötlemist suspendeeriti rakud seerumivabas DMEM-is 10 μM DCFH-DA-ga (Beyotime). Seejärel määrati ROS-i sisaldus fluorestsents-aktiveeritud rakkude sorteerimisega Beckman Coulter Flow Cytometry Systems ergastuslainepikkusega 488 nm ja emissiooni lainepikkusega 525 nm [18].

Lipiidide peroksüdatsiooni (LPO) määramine

LPO tuvastamiseks viidi läbi tiobarbituurhappe reaktiivsete ainete (TBARS) test. Kõik tööetapid viidi läbi vastavalt juhistele (Sigma USA). Kontsentratsioonid arvutati, kasutades molaarset ekstinktsioonikoefitsienti 1,56 × 105/(M·cm), mis saadi kasutades standardina malondialdehüüdi. Tulemused on väljendatud MDA ekvivalentidena nmol/mg valgu kohta.

Ensüümide aktiivsuse määramine

Ensüümi aktiivsust testiti testikomplektide abil, mis hõlmasid glutatioonreduktaasi (GR), glutatioonperoksüdaasi (GPx) ja superoksiidi dismutaasi (SOD). Kõik tööetapid viidi läbi vastavalt kaasasolevatele juhistele (Nan Jing Jian Cheng Bioengineering Institute Hiina).

Loomad ja katseprotokoll

Küpsed isased Wistari rotid (180-220 g, 8 w vanad) saadi Hiinast Xi'anis asuvast neljanda sõjaväemeditsiini ülikooli loomakeskusest. Loomade kasutamiseks saadi ülikooli eetikakomiteelt luba (viitenumber: 20190506). Loomkatse viidi läbi vastavalt ülikooli laboriloomade hooldamise ja kasutamise juhistele.

Kõigil rottidel lasti enne katse algust umbes 1 nädal kohaneda. Pärast aklimatiseerumist jaotati rotid juhuslikult 6 rühma, igas rühmas oli 5 looma. Kontrollrühma rotte kasvatati normaalrõhu all (PO2: 20%; õhurõhk: 101,3 kPa), samal ajal kui mudel- ja Cis-ga töödeldud rühmade rotte kasvatati madala rõhuga hapnikukambris (siserõhk 61,6 kPa). , mis vastab 4000 meetri kõrgusele merepinnast, PO2: 14,55%), et simuleerida kõrgmäestiku hüpoksilist keskkonda. Kõikidel rottidel oli automaatse 12-h valguse/pimeduse tsükliga plastpuurides vaba juurdepääs toidule ja veele 22 ± 2 kraadi ja niiskuse tingimustes. Mudel- ja Cis-ga töödeldud rühmade rotid jäid hüpobaarsetesse tingimustesse, kuid viidi iga 96 tunni järel normobaaridesse, sel ajal anti neile toitu ja vett ning puurid puhastati. Hüpobaarselt hüpobaariliseks ülemineku kestus oli ligikaudu 2 tundi. Kõiki ravirühmi töödeldi vastava Cis-ga (8 mg/kg/päevas) suukaudse sondiga 8 nädala jooksul, samas kui kontroll- ja mudelrotte töödeldi võrdse koguse veega.

8 nädala pärast surmati rotid anesteesia all. Munandid, munandimanused ja seemnepõiekesed eraldati ja kaaluti ning elundiindeks arvutati järgmise valemi järgi: (elundi/looma kaal) × 100%. Seejärel koguti munandimanuse spermatosoidid ning testiti nende liikuvust ja akrosoomi ensüümi aktiivsust. Samamoodi koguti munandikuded histopatoloogiliste uuringute ning ROS, LPO ja antioksüdantsete ensüümide aktiivsuse tuvastamiseks.

CISTANHE TUBULOSA EXTRACT CISTANHE HERB SUURENDAB SEKSUÕIMU PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Elussperma määra hindamine

Epididüüs lõigati kirurgiliste kääridega ja sperma suspensioon valmistati tavalises soolalahuses. Elussperma määra hindamiseks segati 5 μl sperma suspensiooni ettevaatlikult võrdse koguse eosiin-Y peitsiga. Seejärel loendati seemnerakud valgusmikroskoobi all. Elussperma määra hinnati nii värvitud (surnud spermatosoidid) kui ka värvimata spermatosoidide (elusseemnerakud) arvutamise teel.

Sperma akrosoomi ensüümi aktiivsuse määramine

Sperma akrosoomi ensüümi aktiivsuse testi kasutati sperma akrosoomi ensüümide hindamiseks [19]. Iga rühma tulemused arvutati järgmise valemi abil: Akrosoomi ensüümi aktiivsus (μIU)=(ODExperiment group – ODBlank group)/(247,5×10) × 106.

Tulemused

Hüpoksia mõju GC{0}} rakkudele

Et teha kindlaks hüpoksia mõju sugurakkudele, uurisime esmalt muutusi rakkude elujõulisuses pärast hüpoksiaravi erinevate hapnikukontsentratsioonidega (20%, 15%, 10% ja 5%) 1, 3, 5 ja vastavalt 7 päeva. CCK-8 analüüsi tulemused näitasid, et võrreldes kontrollrühmaga (hapniku kontsentratsioon 20%) vähenes hüpoksiaga kokku puutunud rakkude elujõulisus (P < 0,01; joonis 1A). Veelgi enam, nende ellujäämise määr oli pöördvõrdeline hapniku kontsentratsiooniga ja vähenes induktsiooniajaga veelgi. Ülemäärase tsütotoksilise toime vältimiseks valiti järgnevate in vitro katsete jaoks hüpoksilise mudeli kriteeriumiteks 10% hapniku kontsentratsioon ja 3-päevane induktsiooniaeg.

Seejärel viidi läbi FCM ja immunofluorestsentsvärvimine, et täiendavalt hinnata hüpoksiaga ravitud GC{{0}} rakkude proliferatsiooni muutusi. Tulemused näitasid, et hüpoksia võib indutseerida GC-1 rakkude seiskumist G1 faasis, vähendades seeläbi rakkude sisenemist S-faasi ja pärssides DNA replikatsiooni. Seega vähendas hüpoksia oluliselt GC-1 rakkude proliferatsiooniindeksit (P < 0,01; joonis 1B). Positiivne Ki-67 värvumine on veel üks spetsiifiline prolifereeruvate rakkude biomarker. Seetõttu uurisime ka Ki-67-positiivsete rakkude suhet hüpoksiaraviga või ilma. Võrreldes kontrollrühmaga vähendas hüpoksiaravi märkimisväärselt Ki-67-positiivseid rakke, nagu on näidatud joonisel 1C.

Järgmisena püüdsime uurida hüpoksiast põhjustatud GC{{0}} rakkude elujõulisuse pärssimise viisi. Nagu kirjanduses on kirjeldatud, tõusis ROS-i tase, kui rotid puutusid kokku hüpobaarse hüpoksilise keskkonnaga [8, 20]. Seetõttu mõõdeti endogeense ROS tasemed GC-1 rakkudes FCM-testi abil. Tulemused näitasid hüpoksia korral kõrgemat ROS-i taset võrreldes normaalse hapnikurühmaga (P <0, 01; joonis 1D). Kogunenud ROS põhjustab märkimisväärset DNA kahjustust, mis omakorda põhjustab raku apoptoosi raja aktivatsiooni ja võib olla peamine etioloogiline tegur meeste viljatuse riski suurenemisel [21, 22]. Järgmisena tuvastasime TUNEL-värvimise abil hüpoksia apoptootilise aktiveeriva toime GC-1 rakkudele. Nagu on näidatud joonisel fig 1E, põhjustas hüpoksiaga ravi TUNELi fluorestsentsi suurenemise võrreldes kontrollrühmaga, mis näitab apoptoosi suurenemist mudelrühmas.

Kuna ROS-indutseeritud rakukahjustusi põhjustab tavaliselt OS, testisime täiendavalt GC-1 rakkude operatsioonisüsteemi. Nagu on näidatud joonisel 1F, olid GC-1 rakkude LPO tasemed mudelrühmas märkimisväärselt tõusnud võrreldes GC-1 rakkude LPO tasemetega kontrollrühmas. Need leiud viitasid sellele, et hüpoksiast põhjustatud GC{6}} rakkude kahjustus võib olla seotud OS-iga, mis on indutseeritud ROS-i akumuleerumisest.