Cistanche Herba tsistanosiid leevendab hüpoksiast põhjustatud meeste reproduktiivkahjustusi oksüdatiivse stressi pärssimise kaudu – Ⅱ

Cis-i mõju hüpoksiast põhjustatud GC-1-rakkude elujõulisusele in vitro.

Uurimaks, kas Cis suudab ära hoida hüpoksia inhibeerivat toimet GC{{0}} rakkude elujõulisusele, viidi läbi CCK-8 test. GC-1 rakke töödeldi erinevate alatüüpidega (Cis-A, B, C, H) ja kontsentratsioonivahemikega (0.02 μM, 0,2 μM, 2 µM) Cis 72 tundi. Mudelrühma võrdlus DMSO rühmaga näitas, et DMSO ei soodustanud otseselt GC{{10}} rakkude elujõulisust (joonis 2A). Rakkude elujõulisus taastus aga märkimisväärselt (P < 0.05) Cis-raviga. Võrreldes mudelirühmaga näitasid Cis-A, Cis-B, Cis-C ja Cis-H teatud kaitsvat toimet hüpoksiast põhjustatud kahjustuste suhtes GC-1 rakkude elujõulisusele ning Cis-B oli kõige olulisem. mõju (joonis 2A). Cis-i kaitsvad toimed 0,2 μM juures olid oluliselt suuremad kui Cis-i kaitsvad toimed kontsentratsioonil 0,02 μM, samas kui erinevus 2 μM ja 0,2 μM vahel ei olnud ilmne, mis näitab, et taastatud Cis-i poolt indutseeritud GC-1 rakkude elujõulisus näitas annusest sõltuvat kontsentratsioonivahemikus 0.02-0,2 μM suurenemist (joonis 2A). Seetõttu valiti järgmistes in vitro katsetes vastavalt eksperimentaalsetele vajadustele optimaalseks kontsentratsiooniks 0, 2 μM Cis. Et täiendavalt kinnitada, kas sugurakud olid tõepoolest Cis-i, FCM-i ja Ki-67-ga kaitstud, viidi läbi GC-1-rakkude proliferatsiooni muutumise hindamiseks pärast Cis-ga töötlemist. Cis-ga töötlemisel vähenes GC-1 rakkude osakaal G1 faasis. Seevastu S-faasi sisenes rohkem rakke, mis viitab sellele, et cis-ravi võib suurendada sugurakkude proliferatsiooniindeksit (P <0, 01; joonis 2B). GC-1 rakutsükli statistika on näidatud joonisel 2Bb. Ki-67 värvimise tulemused näitasid ka, et ravi Cis-A, Cis-B, Cis-C ja Cis-H parandas oluliselt hüpoksiast põhjustatud GC{{54} Ki{52}}positiivsete rakkude suhet. } rakud in vitro (joonis 2C).

LOODUSLIK TUBULOOS SUGUFUNKTSIOONI PARANDAMISEKS PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Cis-i mehhanism kaitseb sugurakke hüpoksia eest in vitro.

Et uurida, kas Cis-i kaitsev toime GC-1 rakkudele oli seotud liigse ROS-i eemaldamisega, kasutati igas rühmas ROS-i tasemete tuvastamiseks fluorestseeruvat värvi DCFH-DA. Nagu on näidatud joonistel 3A ja 3B, ei muutnud DMSO-ga töötlemine rakusisest ROS-i sisaldust ega LPO taset võrreldes mudelrühmaga. Kuid ROS-i tase GC-1 rakkudes vähenes Cis-ga töödeldud rühmades märkimisväärselt (joonis 3A). Lisaks täheldati LPO vähenemist ka Cis-le allutatud GC-1 rakkudes (joonis 3B).

Et täiendavalt uurida mehhanismi, mille abil Cis kaitseb sugurakke hüpoksilise vigastuse eest, viidi apoptoosi hindamiseks läbi TUNELi värvimine ja Western blot analüüsid. TUNELi värvimine (joonis 3C) näitas mudeli- ja DMSO-rühmades olulist apoptoosi. Siiski täheldati Cis-ravi korral vähem apoptootilisi rakke, mis näitas, et Cis-ravi vähendas GC-1-rakkude apoptoosi. Lisaks mõõdeti molekulaarse mehhanismi kinnitamiseks PARP, Caspase-3, Baxi ja Bcl-2 ekspressiooni. Nagu on näidatud joonisel 3D, aktiveeriti kaspaas-3 ja PARP GC-1 rakkudes hüpoksia all ning seda aktivatsiooni pärssis ravi Cis-iga. Lisaks oli Bax/Bcl-2 suhe mudelrühmas kõrgem kui kontrollrühmas ning ravi Cis-ga vähendas Bax/Bcl-2 suhet (joonis 3D). Need andmed näitasid, et Cis-l oli potentsiaalne võime nõrgendada hüpoksiast põhjustatud oksüdeerivaid kahjustusi ja seda kaitsvat toimet võib saavutada ROS-i akumulatsiooni vähendamise ja kaspaasiga seotud apoptoosi raja aktiveerimise inhibeerimisega.

OS-i inhibeeriv ensümaatiline mehhanism hõlmab vabade radikaalide püüdjaid, nagu glutatioonreduktaas (GR), glutatioonperoksüdaas (GPx) ja superoksiiddismutaas (SOD) [23]. OS-i inhibeeriv ensümaatiline mehhanism mängib olulist rolli oksüdatiivsete kahjustuste ärahoidmisel rakkudes ja kudedes [23]. Hüpoksiast põhjustatud OS-i potentsiaalse Cis-i inhibeerimise mehhanismi edasiseks kinnitamiseks GC-1 rakkudes mõõdeti GR, GPx ja SOD aktiivsust. Tulemused näitasid, et GR, GPx ja SOD aktiivsused vähenesid hüpoksia korral märkimisväärselt (P < 0.01, joonis 3E) võrreldes kontrollrühmadega ja Cis-ravi taastas märgatavalt nende aktiivsuse GC-1 rakud puutuvad kokku hüpoksiaga (P < 0,05, joonis 3E), mis viitab sellele, et need ühendid võivad aktiveerida võimsa endogeense antioksüdantide süsteemi.

CISTANCHE TUBULOOS SPERMA TOOTMISE STIMULEERIMISEKS PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Cis-i mõju paljunemisele hüpobaarilisest hüpoksiast põhjustatud rottidel.

Hüpobaarse hüpoksia mõju määramiseks isastele rottidele testisime kõigepealt munandite morfoloogilisi muutusi hüpobaarilisest hüpoksiast põhjustatud rottidel. HE värvimise tulemused näitasid, et kontrollrühmas paiknesid normaalsed spermatogeensed rakud erinevates staadiumides korrapäraselt basaalmembraanist valendikuni ja küpsed spermatosoidid olid nähtavad tuubulite luumenis (joonis 4A). Võrreldes kontrollidega täheldati mudelrühmas munandikoe patoloogilisi muutusi, munandite epiteelirakkude alusmembraan oli lõdvalt paigutatud, spermatogeenne epiteel oli äärmiselt õhuke ning sugurakkude tase ja arv olid märgatavalt vähenenud (joonis 4A). . Kuid ravi Cis-iga parandas märkimisväärselt hüpobaarse hüpoksiast põhjustatud munandikahjustuse histoloogiat in vivo (joonis 4A). Mõõtsime ka kehakaalu, munandite kaalu, munandimanuse massi ja seemnepõiekeste massi, mille tulemusel arvutati reproduktiivorgani indeks (sigimisorgani ja kehamassi suhe). Nagu on näidatud joonistel 4B-D, oli paljunemisorganite indeks (munandid, munandimanuse ja seemnepõiekesed) mudelrühmas märgatavalt madalam (P < 0,01) kui kontrollrühmas. Kuid hüpobaarse hüpoksia mõju rottide reproduktiivorganite indeksile pöördus Cis-raviga (joonis 4B-D).

Järgmisena mõõdeti ka isaste rottide sperma akrosoomi ensüümi aktiivsust ja elusate spermatosoidide arvu, et selgitada välja munandite funktsiooni kahjustus. Nagu on näidatud joonistel 4E, 4F, oli akrosoomi ensüümi aktiivsus ja spermatosoidide liikuvus mudelrühma rottidel madalam kui kontrollrühmas (P < 0.01). Võrreldes mudelrühma rottidega, taastus akrosoomi ensüümi aktiivsus rottidel, keda raviti 8 mg/kg/päevas Cis-ga (P < 0,05) (joonis 4D). Lisaks, nagu on näidatud joonisel fig 4F, ravi Cis-ga kasuurendas elusate spermatosoidide arvu; kõigil rottidel, keda raviti 8 mg/kg/päevas Cis-ga, oli elussperma määr oluliselt suurenenud (55,83 ± 6.03%, P < 0.05; 69.{101} {8}} ± 2,29%, P < 0,01; P < 0,05 ja 53,67 ± 2,25%, P < 0,05) võrreldes mudelrottidega (43,83 ± 4,01%); .

Kokkuvõttes näitasid need tulemused, et hüpobaarne hüpoksiline keskkond põhjustas isasrottidel munandite morfoloogilisi muutusi, reproduktiivorganite kaalukaotust ja munandite funktsiooni kahjustusi ning Cis võib tõhusalt kaitsta suguelundeid hüpoksiast põhjustatud kahjustuste eest.

Cis-i mõju OS-ile hüpobaarilisest hüpoksiast põhjustatud rottide munandites.

Mõõdeti ROS-i ja LPO tasemeid rottide munandites, et analüüsida Cis-i mõju hüpobaarilisest hüpoksiast põhjustatud OS-ile. ROS-analüüs näitas, et võrreldes kontrollrühmaga oli mudelrühma munandites ROS-i tase oluliselt suurenenud (P < 0.01 Joonis 5A). Seevastu LPO oli munandites hüppeliselt kõrgenenud (P < 0,01) hüpobaarse hüpoksia korral võrreldes normoksiliste tingimustega (joonis 5B). Kuid Cis-ravi muutis ülaltoodud muutusi (P <0, 05), milles Cis-B avaldas paremat mõju kui teised Cis-d (joonis 5A, 5B). Tundus, et Cis kaitseb munandeid, vähendades OS-i hüpobaarsetes hüpoksilistes tingimustes in vivo.

Lisaks viidi läbi apoptoosianalüüsid, et hinnata täiendavalt mehhanismi, mille abil Cis kaitses hüpobaarse hüpoksiast põhjustatud munandifunktsiooni kahjustuse eest. TUNELi värvimise tulemused (joonis 5C) näitasid, et mudelrühmas esines kontrollrühmaga võrreldes märkimisväärne apoptoos. Kuid pärast ravi Cis-ga (8 mg/kg/päevas) tekkis vähem apoptootilisi rakke (P < 0,05) (joonis 5C). Western blot'i andmed näitasid ka, et hüpoksia ja hüpobaariline ravi põhjustasid kaspaasi -3 ja PARP aktiveerumise ning Bax/Bcl-2 suhte suurenemise munandikoes, mis näitab apoptoosi suurenemist (joonis 5D). Lisaks erinevat tüüpiCis-ravivähendas oluliselt apoptoosi munandikoes (joonis 5D). Sarnaselt näitas munandikoe IHC analüüs sarnaseid tulemusi (täiendav joonis 1).

Hüpobaarilisest hüpoksiast põhjustatud Cis-vähendatud OS-i mehhanismi kontrollimiseks testisime täiendavalt GR, GPx ja SOD aktiivsust munandikoes. Nagu on näidatud joonisel 5E, vähendas hüpobaarse hüpoksia ravi kontrollrühmaga võrreldes oluliselt GR, GPx ja SOD aktiivsust (P < 0.01). Cis-ravi taastas aga hüpobaarse hüpoksiaga ravitud rottidel munandite koe ensüümi aktiivsused (GR, GPx ja SOD) (P <0,05). Kokkuvõtteks näis, et Cis kaitseb munandeid, aktiveerides hüpobaarse hüpoksia tingimustes võimsa endogeense antioksüdantse ensüümi kaitsemehhanismi.

LOODUSLIK TUBULOOS SUGUFUNKTSIOONI PARANDAMISEKS PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Arutelu

Kõrgmäestikualadel mõjutab hüpobaarne hüpoksia teadaolevalt paljusid inimeste süsteeme, sealhulgas meeste reproduktiivsüsteemi [4, 20]. Hiljutised eksperimentaalsed uuringud on suunatud mehhanismide mõistmisele, kuidas hüpobaarne hüpoksia kahjustab meeste reproduktiivsüsteemi. Selles uuringus uuriti Cistanches Herba Cis ekstrakti terapeutilist toimet hüpoksiast põhjustatud reproduktiivkahjustustele. Tulemused näitasid, et Cis võib kaitsta meeste reproduktiivsüsteemi hüpoksiliste kahjustuste eest, vähendades hüpoksiast põhjustatud ROS-i akumulatsiooni ja OS-i, suurendades endogeensete antioksüdantsete ensüümide aktiivsust.

ROS on hapnikust pärinevad vabad radikaalid, mis mängivad inimese füsioloogias ja patoloogias üliolulist rolli. ROS-i väikesed annused on hädavajalikudsperma mahtuvus, akrosoomireaktsioon ja spermatosoidide ja munarakkude liitmine [24, 25]. Kuid ROS-i liigne kogunemine põhjustab sageli sugurakkude ja stroomarakkude kahjustusi, mille tulemuseks on meeste viljatus [26]. ROS võib peroksüdatsiooni kaudu kergesti kahjustada rakumembraane, nukleiinhappeid, valke, ensüüme ja muid bioloogilisi makromolekule. Lisaks põhjustavad need potentsiaalset raku- ja DNA-kahjustust, kui nad ületavad antioksüdantide kandevõimet. Kogunenud tõendid toetavad ROS-i keskset rolli meeste viljakuse patogeneesis [27, 28]. ROS-i tootmist reguleerib hapniku pinge. Hüpoksilistes tingimustes väheneb saadav hapnik keskkonnas ja suureneb vere viskoossus, mõjutades seeläbi paljusid hapnikust sõltuvaid ainevahetusprotsesse organismis [29, 30]. Madalam atmosfäärirõhk kõrgel aga põhjustab kehva venoosse tagasivoolu ja vereringega transporditava hapniku koguse vähenemise kõigisse organismi rakkudesse, mis suurendab veelgi elundite ja rakkude hüpoksiat [29, 30]. Seega põhjustab kokkupuude suurel kõrgusel mitmeid hüpoksilisi füsioloogilisi reaktsioone, sealhulgas ROS-i teket ja akumuleerumist, kui hapnikuvajadus ületab veresoonte tarnimist. Nagu varem mainitud, põhjustab ROS-i akumuleerumine mitmesuguseid rakusisest mõju, millest kõige kriitilisem on OS-i tekitamine rakkudes.

OS viitab oksüdatsiooni- ja redutseerimisreaktsioonide vahelisele tasakaalustamatusele, mis põhjustab liigsete oksüdantide või molekulide teket, mis võtavad vastu elektrone teisest reagendist, mis omakorda toodab ROS-i [31, 32]. OS on hästi teada, et seda saab käivitada mitmed endogeensed ja eksogeensed tegurid, sealhulgas kokkupuude suurel kõrgusel. Spermatosoidid on rakud, mis on OS-i suhtes eriti vastuvõtlikud, arvestades nende ebapiisavaid rakuparandussüsteeme ja suurt polüküllastumata rasvhapete plasmamembraanisisaldust [33]. Munandite ja munandimanuse kuded ei ole erand, kuna hüpoksiaga allutatud rottide ümarate spermatiidide puhul on täheldatud raske OS-i esinemist [4]. OS mõjutab DNA stabiilsust, ohustades sellega sugurakkude geneetilise materjali terviklikkust [34-36]. Siiski on kinnitatud, et meessugurakkude DNA kahjustuste kõrge tase põhjustab apoptoosi signaali aktiveerimise, mille tulemuseks on munandimanuse spermatosoidide arvu vähenemine ja defektsete rakkude protsendi suurenemine [28, 37]. Käesolevas uuringus vähendas hüpoksia oluliselt GC-1 rakkude elujõulisust apoptoosi indutseerimise ja rakutsükli peatamise kaudu. Veelgi olulisem on see, et FCM-i analüüs näitas pärast hüpoksia stimuleerimist oluliselt suurenenud ROS-i taset koos suurenenud apoptoosi kiirusega ja suurema kaspaasi -3, PARP ja Bax/Bcl-2 suhtega, mis näitab, et ROS võib aktiveeruda. apoptoosi, aktiveerides kaspaasi signaaliraja hüpoksiast põhjustatud viljakuskahjustuse ajal. Käesolevad leiud näitasid, et hüpoksia põhjustas ROS-i liigset akumuleerumist, põhjustades reproduktiivrakkude oksüdatiivset kahjustust. Seega on mõttekas välja selgitada uued antioksüdandid, mis võivad olla tõhusaks lähenemisviisiks hüpoksiast põhjustatud viljakuskahjustuste leevendamiseks.

OS-i eest kaitsmiseks eksisteerib kehas keeruline antioksüdantide süsteem, mis koosneb peamiselt ensümaatilistest teguritest. Füsioloogilistes tingimustes säilitavad ROS-i sisaldus ja antioksüdantide süsteem teatud tasakaalu. Kuid ROS-i ületootmine kurnab sperma antioksüdantide süsteemi, põhjustades OS-i, mis põhjustab sperma DNA kahjustusi ning vähendab viljakust ja rasedust [23]. Seega on ROS-i ületootmise ja sellega seotud kahjulike mõjude käsitlemiseks rakutasandil meeste reproduktiivsüsteemis testitud erinevaid antioksüdantide strateegiaid [23]. Praegu on kirjanduses antioksüdantse toimega ühendite kasutamine jasperma funktsiooni paranemineon ulatuslik. Oluline on see, et enamik aruandeid kirjeldab sperma parameetrite paranemist pärast suukaudset antioksüdantide manustamist, sealhulgassperma kontsentratsiooni paranemineja motoorika või DNA kahjustuse vähenemine [38]. Seega kirjutab üha suurem arv urolooge OS-iga seotud probleemide tõttu välja suukaudseid antioksüdante viljatuse raviks [39]. Need antioksüdandid hõlmavad peamiselt karnitiine, vitamiine, tsinki, melatoniini ja looduslikke ühendeid [23, 40]. Praegu kaalutakse ravimite ekstraheerimise tehnoloogia arenedes üha suuremat arvu TCM-i ekstrakte, mis leevendavad meeste viljatust, kuna need antioksüdandid võivad vähendada OS-i hävitavat mõju [41]. Yüce A. et al. teatas 2013. aastal, et kaneelil on kasulik mõju oksüdatiivsele ja antioksüdantsele tasakaalule munandites ning sperma kvaliteedile [42]. Zhang L et al. näitas, et kurkumiin parandab märkimisväärselt patsientide spermatosoidide liikuvust ja vähendab H2O2 [43]. Lisaks on näidatud, et mitmed teised taimeekstraktid, nagu mustikas, crocus sativus, granaatõunaseemned ja roheline tee, kaitsevad reproduktiivsüsteemi antioksüdantsete mehhanismide kaudu [27, 44-47]. Cistanches Herba on oluline TCM, millel on soodne ohutusprofiil ja laiad meditsiinilised funktsioonid viljatuse raviks, muu hulgas [13]. Kaasaegsed farmakoloogilised uuringud on näidanud, et Cistanches Herbal on mitmesuguseid toimeid, nagu antioksüdatiivne, põletikuvastane, hepatoprotektiivne ja neurodegeneratiivsete haiguste vastane toime [13, 48]. Seetõttu võivad Cistanches Herba ekstraktidel, fraktsioonidel või ühenditel olla potentsiaalseid antioksüdantseid omadusi viljatuse raviks.

Taimede viljakust parandavate toimeainete hulka kuuluvad erinevad keemilised rühmad, nagu PhG-d, saponiinid, hapnikuga rikastatud lenduvad ühendid ja alkaloidid [41]. PhG-de farmakoloogilise aktiivsuse uuringud on näidanud, et PhG-del on lai valik bioaktiivsust, nagu antioksüdatsioon, kiirgusvastane neuroprotektsioon ja seksuaalfunktsiooni parandamine [49, 50]. Nende tegevuste hulgas tõmbab järk-järgult tähelepanu antioksüdatsioon. On teatatud, et mõned PhG-de üksikud komponendid või fraktsioonid inhibeerivad erinevate kemikaalide poolt indutseeritud sugurakkude apoptoosi ning nende antioksüdatsioonivõimet in vitro on demonstreeritud ka in vivo mitmetes loommudelites [51, 52]. Need tulemused näitavad, et PhG-d võivad olla atraktiivsed kandidaadidmeeste viljatuse ravi. Cis on aktiivne PhG, mida saab eraldada Cistanches Herbast. Käesolevas uuringus uurisime Cis'i mõju hüpoksiaga töödeldud rakkudele või rotimudelile ja uurisime selle aluseks olevaid molekulaarseid mehhanisme. Cis avaldas kaitsvat toimet hüpoksiast põhjustatud elujõulisuse vähenemise ja apoptoosi suurenemise suhtes GC-1 rakkudes ning see näitas ka kaitsvat toimet hüpoksiast põhjustatud kahjustustele rottide reproduktiivsüsteemis in vivo. Võrreldes normoksiliste rühmadega täheldati hüpoksia korral GR, GPx ja SOD aktiivsuste olulist vähenemist, samal ajal kui GR, GPx ja SOD spetsiifilised aktiivsused suurenesid oluliselt Cis-ga töödeldud munandites või GC-1 rakkudes. Cis näis kaitsvat munandeid ja GC{5}} rakke hüpoksilistes tingimustes, suurendades antioksüdantsete ensüümide aktiivsust.

Ensüümi antioksüdandid toimivad peamiselt superoksiidi anioone püüdes, vältides seeläbi lipiidide peroksüdatsiooni ja DNA kahjustusi, et vältida viljatust. Ensümaatilised antioksüdantsed mehhanismid mängivad oksüdatiivsete kahjustuste ärahoidmisel otsustavat rolli [23]. OS-i vastane ensümaatiline mehhanism hõlmab vabade radikaalide püüdjaid ja glutatioonist sõltuvaid ensüüme, sealhulgas GR, GPx ja SOD [12]. Antioksüdantsed ensüümid on hästi teada kui olulised meeste reproduktiivsüsteemi jaoks. Käesolevas uuringus kaasnes antioksüdantsete ensüümide aktiivsuse vähenemisega hüpobaarse hüpoksia korral mudelirühmas suurenenud ROS ja LPO, mis on kooskõlas varasemate aruannetega [12]. Cis-i manustamine viis aga antioksüdantsete ensüümide aktiivsuse taastumiseni GC-1 rakkudes ja rottide munandites, mis võimaldas luua strateegiaid Cistanches Herba manustamiseks, et vältida hüpobaarilisest hüpoksiast põhjustatud kahjustusi, nagu eelnevalt soovitati. Kuigi praegused tulemused näitasid, et ravi Cis-iga vähendas osaliselt hüpoksiast põhjustatud sugurakkude kahjustusi rottidel, on selle reproduktiivkaitse mõju täieliku pildi lahti mõtestamiseks vaja täiendavaid uuringuid. Näiteks mõjutab cis-i spetsiifiline mehhanism antioksüdantsete ensüümide aktiivsust. Lisaks on küsimus, kas muud mehhanismid võivad samuti olla asjakohased, kuna Cis taastus hüpoksiast põhjustatud reproduktiivkahjustusest ainult osaliselt. Lõpuks tuleks kaaluda ka seda, kas Cis-l on otsene kasvu soodustav toime sugurakkudele.

LOODUSLIK TUBULOOS SPERMA AKTIIVSUSE SÄILITAMISEKS PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Järeldused

Üldiselt rõhutavad selle uuringu tulemused Cis-i potentsiaali antioksüdandina hüpoksiast põhjustatud meeste reproduktiivkahjustuste ravis. Cis võib kaitsta hüpoksiast põhjustatud meeste reproduktiivkahjustuste eest, taastades antioksüdantsete ensüümide aktiivsuse, vähendades ROS-i indutseeritud OS-i, suurendades samaaegselt rakkude elujõulisust ja vähendades apoptoosi. Oluline on see, et selles uuringus uuritud Cis-alatüübid (Cis-A, Cis-B, Cis-C ja Cis-H) näitasid kõik teatud kaitsvat toimet reproduktiivsüsteemile ja Cis-B näitas kõige olulisemat toimet. Seetõttu oletame, et Cis võib olla hea kandidaat antioksüdanthüpoksiast põhjustatud meeste reproduktiivkahjustuste ravi, kuigi täpne alusmehhanism nõuab täiendavat uurimist.