Uuring keemiliste profiilide ja metaboliitide kohta

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-post:audrey.hu@wecistanche.com

Zhe Li, Lkhaasuren Ryenchindorj, Bonan Liu, Ji Shi, Chao Zhang, Yue Hua, Pengpeng Liu, Guoshun Shan ja Tianzhu Jia

Abstraktne

Taust: Hiina materia medica töötlemine on traditsioonilises hiina meditsiinis (TCM) silmapaistev ja ainulaadne farmaatsiatehnika, mida kasutatakse kõrvaltoimete vähendamiseks ning toorürtide terapeutilise efektiivsuse suurendamiseks või isegi muutmiseks. Ravimtaimede efektiivsuse suurenemise eest vastutavad peamiselt optimeeritud töötlemisprotseduuri poolt esile kutsutud muutused olulistes komponentides. Riisiveiniga aurutatud Cistancha deserticola (C. deserticola) neeru-yangi turgutav toime oli tugevam kui toores C. deserticola (CD). Meetodid. Töötlemise mõju määramiseks viidi läbi võrdlusanalüüs UPLC-Q-TOF-MSE ja UNIFI informaatikaplatvormiga. Koostisosade iseloomustamiseks viidi läbi ka in vitro uuringudmetaboliididin vivo. Thekeemilinekomponendid määrati CD-s ja selle töödeldud toodetes. Mitme muutujaga statistilised analüüsid viidi läbi nende vaheliste erinevuste hindamiseks, samas kui paaripõhiseks võrdlemiseks kasutati OPLS-DA. Tulemused: Selle uuringu tulemused näitasid pärast töötlemist fenüületanoidglükosiidide (PhG) ja iridoidide märkimisväärseid erinevusi. CD ja selle töödeldud toote ekstraktides tuvastati kokku 97 ühendit. PhG-d, millel on 4'-O-kofeoüülrühm 8-O- -D-glükopüranosüüli osas, nagu akteosiid, tsistanosiid C, kampneosiid II, osmantusiid, vähenesid pärast töötlemist, samas kui PhG-d, millel on 6'-O- kofeoüülrühm 8-O- -D-glükopüranosüüli osas, nagu isoatsetosiid, isotsistanosiid C, isokampneosiid I, isomartynosiid, suurenes, eriti CD-NP rühmas. Suurenes ka ehhinakosiidi ja tsistanosiidi B intensiivsus, mille struktuur sisaldab 6'-O- -D-glükopüranosüülrühma. In vivo uuring, 10 prototüübi komponenti ja 44metaboliididtuvastati roti plasmas, väljaheites ja uriinis. Saadud tulemused näitasid, et töötlemine toob kaasa märkimisväärseid erinevusikeemilineCD koostisosad ja mõjutasid ühendite paiknemist in vivo ning II faasi metaboolsed protsessid on iga ühendi võtmekaskaadid ja enamikmetaboliididon seotud ehhinakosiidi või akteosiidiga. Järeldused: see on esimene ülemaailmne töötlemata ja töödeldud CD võrdlusuuring. Need leiud täiendavad meie arusaamist CD töötlemise mõjust ja annavad olulisi andmeid tulevaste tõhususe uuringute jaoks.

Uuring keemiliste profiilide ja metaboliitide tsitanche kohta

Sissejuhatus

Hiina materia medica (CMM) töötlemine on näidanud märkimisväärset rakendatavust traditsioonilise hiina meditsiini (TCM) kliinilises praktikas ja seda on peetud elujõuliseks raviks mitu sajandit. See on ainulaadne farmaatsiatehnoloogia, mis on tuletatud TCM-i teooriast. Pärast töötlemist ilmnesid olulised erinevused välimuses,keemilineIgat tüüpi TCM-ide koostisosad, omadused ja meditsiiniline tähtsus on tuvastatud, mistõttu võib eeldada, et töötlemine võib parandada TCM-i tõhusust või vähendada TCM-i toksilisi mõjusid.

Sadu aastaid,Cistanche deserticola(hiina keeles Roucongrong, CD) kasutatakse tavaliselt TCM-i kliinilises praktikas neerufunktsioonide täiendamiseks. See aitab ka soolestikku niisutada, mis viib soolte lõõgastamiseni [1].Cistanchesalvestati esmakordselt ShenNongBencaoJingis. Seda leidub tavaliselt kuivades ja poolkuivades elupaikades kogu Euraasias ja Põhja-Aafrikas, sealhulgas Iraanis, Hiinas, Indias ja Mongoolias [2]. CD töötlemine on läbi viidud riisi-veiniga aurutamisega normaalrõhul, mis on Hiina farmakopöas dokumenteeritud valmistamismeetod (hiina keeles Jiucongrong, edaspidi "CD-NP"). Ja CD-aurutamine riisi-veiniga kõrge rõhu all on tõhusam valmistamismeetod (edaspidi "CD-HP") [3, 4]. Mitmed uuringud on näidanud, et CD farmakoloogilised toimed erinevad selle töödeldud toodetest [5]. CD võib toniseerida neeru-yangi ja lõdvestada soolestikku, samas kui pärast riisi-veiniga aurutamist tugevneb neeru-yangi täiendav toime. Meie varasemas uuringus leiti, et CD-NP võib suurendada neerude toniseerimist ja toetada yangi ning leevendada soolte niisutamise ja roojamise mõju [6, 7, 8]. Kliinilises praktikas on töödeldud tooted kõige sagedamini kasutatav vorm.

Siiani on seda analüüsinud mitmed uuringudkeemilineCD komponendid, millele järgneb enam kui 100 ühendi [9, 10, 11], nagu fenüületanoidglükosiidid (PhG), iridoidid, lignaanid ja oligosahhariidid, eraldamine ja tuvastamine selle peamiste keemiliste koostisosadena. Samuti on teatatud, et PhG-del on palju farmakoloogilisi toimeid, sealhulgas immunomoduleeriv, neuroprotektiivne, hepatoprotektiivne, põletikuvastane, antioksüdatiivne jne.[12,13,14]. Iridoididel on põletikuvastane toime [15, 16]. Varasemad uuringud on samuti näidanud, et mõned keemilised komponendid varieerusid töötlemise ajal [17,18,19,20]. Nende aruannete põhjal võib eeldada, et järeltöötluse variatsioonid sissekeemilinekoostis põhjustab erinevaid farmakoloogilisi toimeid, mida tuleb täiendavalt uurida.

Käesolevas uuringus viidi võrdlevaks analüüsiks läbi tundlik ja tõhus meetod, st ülikõrgefektiivse vedelikkromatograafia koos TOF-MSE-ga (UPLC-Q-TOF-MSE) ning ekstraktide kvalitatiivseks analüüsimiseks viidi läbi in vitro uuringud. CD, CD-NP ja CD-HP, et selgitada nende keemilisi profiile. Üldiselt eksogeennekemikaalidsuure kokkupuutega sihtorganites peeti tõhusateks komponentideks. Seetõttu manustati rottidele suukaudselt CD-d ja selle töödeldud tooteid, millele järgnes nende iseloomustus. Olemasolev uuring näitab esimest korda toor- ja töödeldud CD võrdlevat uuringut (nii in vitro kui ka in vivo). Saadud tulemused laiendaksid meie arusaama CD töötlemise mõjust, mis võib olla abiks edasistes uuringutes.

keemiliste profiilide ja metaboliitide tsitanche

materjalid ja meetodid

Materjalid

Ajugooli (180120) ja 2'-aktüülatsetosiidi (M0601AS) standardühendid tarnis Chendu Pure Chem-Standard Co., Ltd (Chengdu, Hiina). Tsistanosiidi F (MUST-17022620), ehhinakosiidi (D1105AS), tsistanosiidi A (M0906AS) ja isoakteosiidi (M0106AS) tarnis Must (Hiina Sichuan); akteosiid (O0618AS), salidrosiid (J0526AS), katalpol (S0728AS), geniposiid (A0407AS) ja geniposiidhape (MB6001-S) osteti ettevõttelt Dalian Meilun Bio.Co., Ltd (Dalian, Hiina). 8-epideoksülogaanhape (B31123) saadi ettevõttelt Shanghai Yuanye Biological Technology Co., Ltd, Hiina. Metanool ja atsetonitriil olid MS-klassi ja saadi Merck KGaA-st, Darmstadt, Saksamaa. HPLC puhtusega metaanhapet (CH2O2) tarnis Merck KGaA (Darmstadt, Saksamaa). Olemasolevas uuringus kasutatud vett töödeldi Milli-Q süsteemi kaudu (18, 2 MΩ, Millipore, Ma, USA). Riisiveini tarnis Brand Tower Shaoxing Wine Co., Ltd. (Zhejiang, Hiina).

Cistanch deserticola koguti Neimenggu wangyediltcistancheCo. Ltd. Proovid tuvastas prof Yanjun Zhai (farmaatsiakool, Liaoningi TCM-i ülikool). Proovid esitati Liaoningi traditsioonilise hiina meditsiini ülikoolile.

Loomad

Sprague–Dawley isasrotid (SPF-klass) kogukehamassiga 180–220 g hankis Liaoning Changsheng biotechnology Co. Ltd. (Liaoningi provintsi laboratoorsete loomaressursside keskus, litsentsi number: SCXK-2015–0001). Neid rotte peeti ühe nädala jooksul hästi hoitud temperatuuri ja niiskusega kasvatusruumis, st 20–26 kraadi, 50–70 protsenti. Enne katsetamist toideti rotte tavapärase laboratoorse toidu ja veega. Loomad paastusid üleöö, kuid vett anti ad libitum enne katset. Rotid hukati 10-protsendilise kloraalhüdraadi anesteetikumiga. Hiina meditsiini Liaoningi provintsihaigla loomaeetika institutsionaalne komitee kiitis heaks kõik katseprotokollid (2019.03.25, 2019015).

CD, CD-NP ja CD-HP ekstrakti valmistamine

CD-NP, CD-HP töödeldi samast Cistanch deserticola partiist. CD-NP valmistamiseks niisutati kuivad CD-tükid (5 mm paksused, 100 g) riisi-veiniga (30 ml) ja aurutati 100 kraadi juures 16 tundi, millele järgnes kuivatamine 55 kraadi juures kuivatusahjus. Samal ajal kui CD-HP valmistati kuivade CD tükkide (5 mm paksused, 100 g) infiltratsiooni teel riisi-veiniga (30 ml), millele järgnes aurutamine 1,25 atmosfäärirõhul 4 tundi. ja seejärel kuivatati kuivatuskapis 55 kraadi juures.

100 ml mõõtekolvis sõeluti üks gramm pulbrit läbi sõela nr 4, seejärel lisati 50 protsenti metanooli (50 ml) ning seejärel kaeti tihedalt ja segati. Seda segu kaaluti ja sellele järgnes pool tundi. leotamine. Pärast leotamist töödeldi segu ultraheliga (võimsus 250 W, sagedus 35 kHz) 40 minutit, millele järgnes jahutamine ja uuesti kaalumine. Kaalukadu täiendati 50% metanooliga, segati korralikult ja lasti seista, seejärel filtreeriti supernatant ja saadud filtraati kasutati testlahusena.

Aktiivsete komponentide MSE analüüs

Standardainete valmistamine: tubulosiid-A (3.02 mg), ehhinakosiid (3.00 mg), 2'-atsetüüllakteosiid (2,34 mg), akteosiid (2,45 mg), isoakteosiid (0,61). mg), tsistanosiid-F (2,14 mg), salidrosiid (3,39 mg), geniposiid (2,84 mg), ajugool (1,58 mg), katalpool (2,39 mg), geniposiidhape (2,56 mg) ja 8-epideoksülogaanhape (2,34 mg) lisati 10 ml mõõtekolbi, lisati konstantse mahuga metanooli skaala järgi, mis oli konfigureeritud vastava kontsentratsiooniga võrdluslahuseks. Iga 100 μL konfigureeriti segatud võrdluslahuseks.

MS analüüsi tingimus: massi väärtust korrigeeriti enne katset ja kasutati negatiivsete ioonide režiimi. Massivahemik oli 50–1200 Da ja proov süstiti läbi voolusüstepumba. Koonuse kiirus oli 100 l/h, lahusti voolukiiruseks määrati 800 l/h. Kapillaar- ja koonuspinge fikseeriti vastavalt 2500 ja 40 V. Iooniallika ja lahustava gaasi temperatuur oli vastavalt 100 kraadi ja 400 kraadi ning signaali vastuvõtusagedus oli 0,5 S−1.

keemiliste profiilide ja metaboliitide tsitanche

CD ekstrakti UPLC-Q-TOF-MSE analüüs

Kromatograafilised hindamised viidi läbi Waters ACQUITY I-CLASS UPLC süsteemis (Waters Corporation, Milford, MA, USA). Sealhulgas kolonn ACQUITY UPLC® BEH C18 (50 × 2,1 mm, 1,7 μm, Waters). Liikuv faas koosnes veest, milles oli 0,1 protsenti sipelghapet (A) ja atsetonitriil sisaldab 0,1 protsenti sipelghapet (B), elueerimistingimused olid järgmised: 97 protsenti kuni 85 protsenti A (0–5 min), 85 protsenti kuni 75 protsenti A (5–15 min), 75 protsenti kuni 65 protsenti A (15–16 min), 65 protsenti kuni 55 protsenti A (16–18 min) . Voolukiirus oli 0,3 ml min-1, samas kui automaatse proovivõtu ruumi ja kolonni temperatuur oli eraldi 30 kraadi ja 8 kraadi. Süstimismaht oli 1,0 μL.

Massispektromeetriline hindamine viidi läbi Waters XEVO G{{0}}XS QTOF MS (Waters Corporation, Milford, MA, USA) kaudu, mis sisaldas ESI allikat. Lämmastikgaasi voolukiiruseks määrati 800 L·hrs−1 temperatuuriga 400 kraadi, lähtetemperatuur fikseeriti 100 kraadi ja koonusegaasi kiiruseks 50 L h−1. Koonuse ja kapillaari pinge reguleeriti vastavalt 40 ja 2000 V peale. Kaldtee kokkupõrkeenergiat kasutati vahemikus 20–30 V. Kõikide proovide tsentreeritud andmed saadi vahemikus 50–1200 Da, 5-skaneerimisaeg 0,5 s analüüsiaja 10 minuti jooksul. . Massi täpsuse kinnitamiseks kasutati LockSpray TM-i. Luku massina kasutati leutsiini enkefaliini [M-H]− iooni (200 pg·μL−1 infusiooni voolukiirus 10 μL min−1) m/z 554,2615 juures. Täpse massi, prekursorioonide koostise ja fragmendi ioonide arvutamiseks kasutati tarkvara MassLynx V4.1 (Waters Co., Milford, USA).

Andmete analüüs Masslynxi platvormil

Lisaks loodi kirjanduse põhjal ettevõttesisene raamatukogu, mis sisaldab ühendi nimetust, selle struktuuri ja molekulaarset valemit (moolides). Kõik ühendid märgiti spetsiaalsesse Excelis tehtud mallisse. Lisaks salvestati kohalikku arvutisse ka mol-failid (Chemdraw Ultra 8.0, Cambridge soft, USA) ja kõigi üksikute liitstruktuuride Exceli failid. Loodud oluliste andmetega Exceli leht imporditi otse UNIFI teadusraamatukogusse.

Struktuuriomaduste, eriti iseloomulike fragmentide ja MS killustumise hindamiseks kasutati UNIFI 1.8.2, Waters, Manchester, UK. 2D piigi tuvastamiseks määrati minimaalseks piigi pindalaks 500. 3D-piikide paljastamise ajal valiti madal energia piigi intensiivsus üle 300 loenduse ja kõrgendatud energia piigi intensiivsus üle 80 loenduse. Tuntud ühendite massiviga leiti olevat kuni ± 10 ppm ja retentsiooniaja tolerants määrati vahemikku ± 0,1 min. Valisime negatiivsed aduktid, mis sisaldavad -H ja HCOOH. MS-ist saadud algandmete töötlemine viidi läbi sujuva UNIFI-tarkvara abil, et kiiresti tuvastadakeemilinekomponendid, mis vastasid iseehitatud andmebaasi ja ettevõttesisese traditsioonilise meditsiini raamatukogu standarditele.

Järgmiseks kontrolligekeemilineIga sihtühendi struktuuri põhjal eristati isomeere neile iseloomulike MS fragmentatsioonimustrite järgi, mis ilmnesid teatatud uuringutes, ja võrdlusstandardite retentsiooniaegu võrreldes.

Mitmemõõtmelisel statistilisel analüüsil põhinev metaboolne analüüs

Enne algandmete töötlemist määrati parameetrid, nagu mass vahemikus 150 kuni 1200 Da, retentsiooniaja vahemik (0 kuni 20 min), lävi intensiivsus ( 2000 loendust), massi taluvus, st 5 mDa, samas kui massi ja retentsiooniaja aken olid vastavalt 0,20 min ja 0,05 Da. Järgmises andmebaasi loendis oli ioonide identifikaator RT-m/z paarid nende elueerimisaegade järgi. Erinevate proovipartiide samu RT ja m/z väärtusi käsitleti sama ühendina.

Tõhusate biomarkerite hindamiseks viidi läbi mitme muutujaga statistiline analüüs, mis aitasid oluliselt kaasa erinevate rühmade erinevustele. Analüüsi käigus kasutati põhikomponentanalüüsi (PCA), et näidata maksimaalsed erinevused ja mustrituvastus ülevaate ja klassifikatsiooni saamiseks. OPLS-DA on modelleerimistööriist, mis pakub OPLS-DA ennustava komponendi laadimise visualiseerimist, et aidata mudelit hinnata. Erinevate komponentide hindamisel kasutati projektsiooni muutuvat tähtsust (VIP) jametaboliididwith VIP values >1.{1}} ja P-väärtus< 0.05 were="" regarded="" as="" effective="" markers.="" furthermore,="" a="" permutation="" test="" was="" conducted="" for="" providing="" reference="" distributions="" for="" the="" r2/q2="" values="" that="" could="" show="" the="" statistical="">

keemiliste profiilide ja metaboliitide tsitanche

Loomkatsed

Rotid jaotati juhuslikult nelja rühma (iga rühma jaoks n = 6), millele järgnes erinevate ekstraktide suukaudne manustamine: (1) Tühi kontrollrühm: rottidele anti tavalist soolalahust (2 ml/100 g); (2) CD rühm: rottidele anti CD ekstrakti (2 ml/100 g); (3) CD-NP rühm: rottidele anti CD-NP ekstrakti (2 ml/100 g); (4) CD-HP rühm: rottidele anti CD-HP ekstrakti (2 ml/100 g). Kõigi rühmade edasine kategoriseerimine viidi läbi vastavalt plasma, uriini ja väljaheidete kolme alarühma. Kaks tundi hiljem manustati igale rotile suukaudselt sama ja võrdne kogus ekstrakte.

Pärast manustamist võeti vereproovid 1.0 h, 20 h ja 40 h hepariniseeritud 1,5 ml polüetüleentorudes (orbitaalveenidest) , millele järgnes kõigi proovide tsentrifuugimine (kiirusel 4500 pööret minutis) 15 minutit.

Uriini- ja väljaheiteproovide jaoks hoiti rotte ainevahetuspuurides ning seejärel võeti uriini- ja väljaheiteproove 24 tundi pärast manustamist. Uriiniproove tsentrifuugiti kiirusel 4500 pööret minutis 15 minutit, samal ajal kui väljaheiteproovid kuivatati varjus, jahvatati pulbriks, seejärel võeti 0,2 g ja lisati 0,5 ml soolalahusesse. lahusega, ultraheliga 5 minutit ja tsentrifuugiti kiirusel 12,000 pööret minutis 15 minutit. Kõiki bioproove hoiti kuni analüüsimiseni temperatuuril –80 kraadi.

Bioloogiliste proovide ettevalmistamine

Plasma-, uriini- ja väljaheiteproovide lisamine viidi läbi 3 mahu metanooliga, millele järgnes 3-minutise keerisega segamine. Järgmisena tsentrifuugiti segusid (kiirusel 12, 000 pööret minutis) 10 minutit, seejärel kanti supernatant EP katseklaasi ja kuivatati seejärel lämmastikuga 37 kraadi juures. Lisaks lisati 200 µl HCN-H2O (50 protsenti) lahust. Seejärel kasutati keerist segamiseks (1 min), millele järgnes tsentrifuugimine (12, 000 pööret minutis) 5 minutit. Töödeldud proovide supernatant (5 μL) süstiti UPLC-Q-TOF-MSE süsteemi.

Vedelikkromatograafiline ja massispektromeetriline seisund

Analüüs jaoksmetaboliididteostas ka Watersi UPLC instrument ESI liidese kaudu. Eraldamised viidi läbi Acquity UPLC HSS T3 kolonniga (100 mm × 2,1 mm, 1,8 µm), liikuv faas oli 0,1 protsenti sipelghapet (A): Atsetonitriil (B), gradiendi elueerimise tingimus oli 0–3 min (99,8 protsenti → 98 protsenti A), 3–5 minutit (98 protsenti → 95 protsenti A), 5–8 minutit (95 protsenti → 90 protsenti A), 8 –12 minutit (90 protsenti → 85 protsenti A), 12–17 minutit (85 protsenti → 70 protsenti A), 17–22 minutit (70 protsenti → 60 protsenti A), 22–23 minutit (60 protsenti → 58 protsenti A) , 23–25 min (58 protsenti A), 25–32 min (58 protsenti → 45 protsenti A) ja 32–37 min (45 protsenti → 35 protsenti A), voolukiirus oli 0,4 ml min-1. Kolonni ja prooviruumi temperatuuriks seati vastavalt 40 kraadi ja 8 kraadi. Kasutati ülalmainitud massispektromeetria tingimusi.

Bioproovides leiduvate metaboliitide süstemaatilise analüüsi strateegia

Andmetöötluseks kasutati UNIFI (1.8.2) tarkvara. Tõhusate metaboliitide tuvastamiseks kasutati funktsiooni Binary Compare. Hinnatud metaboliite samaväärses kontrollproovis ei esinenud või need esinevad madala iooniintensiivsusega. Suhtelise intensiivsuse läveks määrati 3 või 5 jametaboliididallakriipsutatud kriteeriumidele vastavaid materjale saab hinnata. Üldine ja etteaimatavmetaboliididmääras seejärel KIK. Kahefaasiliste metaboliitide otsimiseks kasutati NLF funktsiooni. Näiteks UNIFI tarkvaras saab parameetriteks määrata 176.0321 võimalike glükuroonhappe konjugaatide otsimiseks. Järeltöötlusel saab meetodis määrata või tuvastada neutraalse kadu. MassFragmenti kasutati tuvastatud määramiseks või iseloomustamiseksmetaboliididstruktuuride puhul on UNIFI spektraaltõlgendusfunktsioon peamine funktsioon, mida kasutatakse lähtekomponentide sekundaarse killustumise analüüsimiseks. Seda funktsiooni saab kasutada killustatuse tee kiireks kontrollimiseks, kas see on mõistlik.

keemiliste profiilide ja metaboliitide tsitanche

Tulemused

Fenüületanoidglükosiidide ja iridoidide massi killustumise reegel

Peamised on fenüületanoidglükosiididkeemilineCD koostisosad. Võeti isoakteosiidi, tsistanosiidi F, tubulosiidi A, ehhinakosiidi, akteosiidi ja 2'-aktüülakteosiidi standardlahused, millele järgnes kokkupõrkeenergia erineva taseme andmine (tabel 1) ja seejärel saadi vastavad MS2 kaardid (joonis 1). .

Joonis 1 Fenüületanoidglükosiidide massispektrogramm ja lõhustamisrada. A Isoakteosiid; B-tsitanosiidF; C tubulosiidA; D ehinakteosiid; E akteosiid; F2'-aktüülakteosiid

Tabel 1 Standardainete kokkupõrkeenergia

Massispektromeetriline analüüs näitas, et fenüületanoidglükosiididel on sarnased massispektri fragmentatsioonimustrid, lõhustamisrajad negatiivsete ioonide režiimis hõlmavad peamiselt järgmist: (1) Estrisideme lõhustumine: neutraalse kofeoüülrühma (C9H3O6, 162.03) ja neutraalse atsetüülrühma (C2H2O) kadu. , 42.{10}}); (2) Glükosiidne lõhustamine: neutraalsete ramnoosijääkide (C6H10O4, 146,05) ja neutraalsete glükoosijääkide (C6H10O5, 162,05) kadu. Kõrge eraldusvõimega massispektromeetriast võis eristada kofeoüüli (162,03) ja glükoosijääki (162,05).

Võeti iridoidide ajugooli, katalpoli, geniposiidhappe, geniposiidi ja 8-epideoksülogaanhappe standardlahused, millele järgnes erinevate kokkupõrkeenergiate andmine ning saadi vastavad MS2 kaardid (joonis 2).

Joonis 2 Iridoidglükosiidide massispektrogramm ja lõhustamisrada. A Ajugol, B katalpol, C geniposidhape, D geniposiid, E 8-epideoksülogaanhape

Iridoidglükosiididel on sarnased massispektri fragmentatsioonimustrid, negatiivsete ioonide režiimis hõlmavad lõhustamisrajad peamiselt (1) glükosiidne lõhustamine: neutraalse glükoosijäägi kadu (C6H10O5, 162,05); (2) Neutraalse CO2 (43,99) ja H2O (18,01) kadu.

Ühendite identifitseerimine CD, CD-NP ja CD-HP ekstraktides

UPLC-QTOF-MS E analüüs

Viidi läbi kromatograafiliste tingimuste optimeerimine. Järgmiseks ühendidCistancheHerbat hinnati nii negatiivsete kui ka positiivsete ioonide režiimis kõrge ja madala CE-ga. Saadud tulemused näitasid, et nende ühendite puhul oli negatiivse režiimi ühilduvus suurem kui positiivse režiimiga. Joonisel fig 3 on kujutatud MS-i aluselise piigi iooni (BPI) kromatogrammi, mis on jälgitud nummerdatud piikidega. Iga tuvastatud iooni intensiivsus UPLC-Q-TOF-MSE analüüsis normaliseeriti kogu ioonide arvu suhtes, et luua andmemaatriks, mis koosnes m/z väärtusest, normaliseeritud piigi pindalast ja retentsiooniajast.

Joonis 3 Proovide baaspiigi intensiivsus (BPI). 1.CD, 2. CD-NP, 3. CD-HP

CD ja selle töödeldud toodete komponentide hindamine UNIFI platvormil

CD-st ja selle töödeldud tootest (tabel 2) tuvastati -SEM (n = 6) režiimiga kokku 97 ühendit, sealhulgas fenüületanoidglükosiidid (PhG), iridoidid, lignaanid ja oligosahhariidid. 95, 91 ja 94 komponendid tuvastati vastavalt CD-s, CD-NP-s ja CD-HP-s. Nende hulgas oli 64 fenüületanoide, 13 iridoide ja 20 muud tüüpi ühendit. Selles oli sarnasuskeemilineCD ja selle töödeldud toote koostis, kuid komponentide kogus CD ja selle töödeldud toote lõikes oli erinev.

Tabel 2 CD-st ja selle töödeldud toodetest saadud ühendite hindamine UPLC-Q-TOF-MSE abil

Variatsioonid sissekeemilinetöödeldud toodete komponendid

Mitme muutujaga andmemaatriksi analüüsimiseks kasutati Simca-P 13.{2}} tarkvara. Enne PCA-d olid kõik muutujad keskmise kesksed ja pareto-skaalaga, millele järgnes potentsiaalsete diskrimineerivate muutujate tuvastamine. PCA skoori graafikul näitas iga punkt individuaalset proovi. Proovid, mis näitasid oma sarnasustkeemilinekomponendid olid hajutatud üksteise kõrval, samas kui need, mis näitasid nende komponentide erinevusi, jagati. Nagu näha PCA-st (joonis 4), eraldati CD-HP rühm CD ja CD-NP rühmadest.

Joonis 4 CD ja selle erinevate töödeldud toodete PCA

To distinguish CD from CD-HP and CD-NP, OPLS-DA, permutation test, S-plot, and VIP value were developed. (Figs. 5, 6, 7) The obtained results revealed that many components were key characteristic components of each product. The screening condition was the VIP >1 ja P< 0.05. from="" the="" date="" of="" the="" s-plot,="" the="" characteristic="" components="" were="" evaluated,="" which="" were="" commonly="" existing="" in="" the="" three="">

Joonis 5 OPLS-DA/permutatsiooni test/S-diagramm/soojuskaart, mis näitab potentsiaalsete biomarkerite intensiivsust CD-NP ja CD-HP ühendite 9, 10, 14, 32, 59, 60, 68, 70, 74 vahel, 75, 80, 81, 82 ja 84 on CD-NP diferentsiaalkomponendid, samas kui ühendid 11, 15, 16, 45, 48, 66 ja 72 on CD-HP diferentsiaalkomponendid.

Joonis 6 OPLS-DA /permutatsioonitest/S-plot/soojuskaardid, mis näitavad efektiivsete biomarkerite intensiivsust CD ja CD-NP ühendite 13, 15, 16, 37, 49, 63, 66, 72, 74, 75 ja vahel. 85 on CD diferentsiaalkomponendid, samas kui ühendid 10, 11, 32, 59, 60, 68, 70, 71, 80, 81 ja 82 on CD-NP diferentsiaalkomponendid.

Joonis 7 OPLS-DA/permutatsioonitest/S-diagramm/soojuskaardid, mis näitavad efektiivsete biomarkerite intensiivsust CD ja CD-HP ühendite 9, 14, 16, 59, 63, 66, 72, 74, 75, 80, 82 vahel , 84, 85 ja 94 on CD diferentsiaalkomponendid ning 11, 15, 45, 49, 50, 60 ja 71 on CD-HP diferentsiaalkomponendid.

Jooniselt 8 leidsime 4'-O-kofeoüülrühma sisaldava akteosiidi (54), tsistanosiidi C (74), kampneosiidi II (43), osmantusiidi (75) ja 2'-aktüülakteosiidi (80) intensiivsuse. 8-O- -D-glükopüranosüüli osa (vt joonis 9) vähenes pärast töötlemist riisi-veiniga, samas kui isoatsetosiidi (60), isotsistanosiidi (71), isokampneosiidi I (69) intensiivsus , isomartynosiidi (86) sisaldus, millel on 6'-O-kofeoüülrühm (vt joonis 9), suurenes, eriti CD-NP rühma puhul. Kuigi tubulosiid B (72), millel on 6'-O-kofeoüülrühm, sama mis isoakteosiid, vähenes intensiivsus selle 2'-aktüülrühma tõttu. 6'-O- -D-glükopüranosüülrühma sisaldava ehhinakosiidi (38) ja tsistanosiidi B intensiivsus suurenes, kuid tubulosiidi A (55) intensiivsus vähenes ka selle 2'-aktüülrühma tõttu.

Joonis 8 Peamiselt PhG-de intensiivsus CD-s ja selle töödeldud toodetes

Joonis 9KeemilinePeamiselt PhG-de struktuurid CD-s ja selle töödeldud toodetes.

Meie uurimisrühm uuris ka akteosiidi ja isoakteosiidi termilist stabiilsust ning leidis, et akteosiid oli vees, metanoolis ja kollase riisiveini lahuses ebastabiilne ning seda saab kuumutamisel osaliselt isoakteosiidiks muuta. Kuid isoakteosiidi termostabiilsus oli parem, eriti kollase riisiveini lahuses. Joonisel 10 on näidatud PhG-de võimalikud muutused CD-s töötlemise ajal:

Joonis 10 PhG-de võimalik reaktsioon töötlemise ajal

Metaboliitide tuvastamine rottidel

Kõrge eraldusvõimega massispektromeetria andmetest leiate täpse molekulmassi ja elementide koostisemetaboliididja protomolekuli ühendeid analüüsiti ja võrreldi. Kuna sama tüüpi ühendid TCM-is näitasid metaboolsete modifikatsioonide sarnasust, võivad fütokeemiliste koostisosade korrelatsioonid in vitro laieneda nende metaboliitidele in vivo . Vahepeal järeldati tavapäraste biotransformatsiooni radade põhjal mõistliku molekulmassi muutuse kohta. Lõpuks,metaboliididtuvastati, analüüsides metaboliitide ja protoühendite fragmentatsiooniraja MSE massispektreid massispektris [21, 22]. Võrreldes pimeprooviga tuvastati selle komponendid in vivo kromatogrammi-massispektri teabe, metaboolse reaktsiooni võimalikkuse, ühendi struktuuri omaduste ja selle massispektri killustumise reegli põhjal. Vt tabel 3.

Tabel 3 TuvastatudMetaboliididCD-s ja selle töödeldud toodetes sisalduva vesiekstrakti plasmas, uriinis ja väljaheites

Fenüületanoolglükosiididega seotud metaboliitide tuvastamine

Töötlemiseks kasutati UNIFI platvormi. Joonisel 11 on näidatud uriini, väljaheidete ja plasma TIC-kromatograaf CD ja selle töödeldud toodete jaoks. Võrreldes tühiproovidega tuvastati rottidel kokku 54 metaboliiti, sealhulgas 10 prototüübi komponenti ja 44metaboliidid, milles 24, 49 ja 6 olid vastavalt väljaheites, uriinis ja plasmas.

Joonis 11 TIC kromatograaf. Uriiniproov BC rühmas; B Uriiniproov CD rühmas; C Uriiniproov CD-NP rühmas; D Uriiniproov CD-HP rühmas; E Väljaheidete proov BC rühmas; F Väljaheiteproov CD rühmas; G Väljaheiteproov CD-NP rühmas; H Väljaheiteproov CD-HP rühmas; I Plasmaproov BC rühmas; J Plasmaproov CD rühmas; K Plasmaproov CD-NP rühmas; M Plasmaproov CD-HP rühmas

Täpse massi, killustumise kaskaadi ja prognoositavate neutraalsete biotransformatsiooni kadude põhjal on kokku 35 fenüületanoidglükosiidi.metaboliididolid esialgselt hinnatud. Fenüületanoidglükosiidide sarnastel metaboliitidel on sarnased massispektri fragmentatsioonimustrid, nagu tüüpiline dekofeoüülfragment m/z 461,1605, seejärel hüdrolüüsitakse glükosiid- ja estersidemetega in vivo ning metaboliseeritakse hüdroksütürosooliks (HT) (m/). z 153,0504, C8H10O3, 4,73 min) ja kohvhape (CA) (m/z 179,0389, C9H7O4, 0,77 min), vaata joonist 12A.

M11 näitas [M-H]− m/z 153,0504 juures valemiga st C8H10O3 ja identifitseeriti kui HT. M16 esitles [M-H]− m/z juures 329,0851, mis oli 176 Da kõrgem kui HT oma, mis näitab, et see võib olla HT glükuroniseeritud metaboliit. M26 [M–H]− oli m/z juures 343,1037, 14 Da kõrgem kui HT-glükuroniidil. Seetõttu tuvastati M26 HT-metüülitud glükuroniidina. M17 tuvastati HT-sulfaadina selle [M-H]− juures m/z 233,0112, 80 Da HT-ga võrreldes, mida sai edasi metüülida, seejärel saadi M22, mille m/z oli 247,0278, mis näitab, et see oli HT-metüülitud sulfaaditudmetaboliit. M7 (m/z 167,0335) ja M5 (m/z 167,0762) loeti vastavalt oksüdatsiooniproduktiks ja metüülitud HT-ks (joonis 12B).

M1 tähistas [M-H]− m/z 179,0389 juures, selgitatud molekulvalem oli C9H7O4 ja identifitseeriti kui kohvhape (CA). M25 näitas [M–H]− m/z 355,0704 juures, mis oli 176 Da kõrgem kui CA oma, näitab, et see võib olla glükuroniseeritudmetaboliitCA. M27 m/z oli 258,994, mis oli 80 Da kõrgem kui CA oma, seega selgitasime selle CA-sulfaadina ja see võis toota M35 (m/z 273,0064). Kuna M4 annab [M–H]− m/z juures 193,0524, mis on 14 Da kõrgem kui CA, tuvastati see CA metüülitud metaboliidina. M39 oli CA dehüdroksüüliminemetaboliit, mille m/z on 163,04, ja seda saab sulfaadida M32-ks (m/z 242,9951).

M33 (m/z 181.{16}}491, C9H10O4, 9,06 min) oli CA ehk 3,4-dihüdroksübenseenpropioonhappe redutseerimisprodukt, mida sai metüülida M19-ks (m/z 195,0623, C10H12O4, 0,93 min). M33 saab dehüdroksüdada M43-ks, see on 3-HPP (m/z 165,0558, C9H10O3, 11,29 min) ja M31 (m/z 341,0942, C15H17O9, 8,90 min) ja M29, C9,0,1025, m/z 8,52 min) olid glükuronideeritud ja sulfaaditud tooted (joonis 12C).

Fenüületanoidglükosiididega seotudmetaboliidid, olid peamised metaboolsed kaskaadid II faasi metaboolsed reaktsioonid, st glükuronisatsioon, metüülimine ja sulfatsioon. Kavandatavad fenüületanoidide metaboolsed kaskaadid on kujutatud joonisel 13.

Joonis 12 Mõne massispektermetaboliididCD-del

Joonis 13. Fenüületanoidide võimalik metaboolne rada

Iridoididega seotud metaboliitide tuvastamine

Analüüsides elementaarset koostistmetaboliidid, MSE fragmentatsiooni ja sellega seotud kirjanduse põhjal hinnati esialgselt kokku 19 iridoidiga seotud metaboliiti. Iridoidglükosiidid hüdrolüüsiti glükosiidsidemetega, moodustades neile vastavad aglükoonid. M/z 185,117 oli M8 puhul, 162 Da väiksem kui ajugoolil, mis saadi glükoosijäägi kadumise tõttu.

M40 (m/z 199,0641, Rt 10,91 min) oli katalpoli deglükosüülitud produkt. M45 m/z 169,0487, Rt 12,15 min) oli vähem kui 30 Da deglükosüülitud katalpooli omastmetaboliit, ja tuvastati CH2O metaboliidi molekuli eemaldamisena. M34 (m/z 151,0352, Rt 9,08 min) oli H2O edasine kadumetaboliit.

M44 (m/z 211,0665, Rt 11,31 min) oli geniposiidi deglükosüülitud metaboliit ja M37 (m/z 197,0833, Rt 15,03 min) oli 8-epideoksülogaanhappe deglükosüülimine. Iridoidide metaboolsed reaktsioonid võivad ilmneda deglükosüülimise I faasi metabolismina (joonis 12D).

Plasma, uriini ja väljaheidete metaboolse profiili võrdlus CD ja selle töödeldud toodete vahel

Võrreldi 2 prototüüpi plasmas, 7 uriinis ja 3 väljaheites. CD-s oli 7 prototüüpi, CD-NP-s 7 prototüüpi ja CD-HP-s 8 prototüüpi. M21 tuvastati ainult CD-NP väljaheidete rühmas ja M38 ja M51 tuvastati ainult CD-HP uriinirühmades. Metaboliitidega võrreldes identsedmetaboliididplasmas, uriinis ja väljaheites olid vastavalt 4, 42 ja 21. CD-rühmas imendus 34 metaboliiti, CD-NP-s 39 ja CD-HP-rühmas 40 metaboliiti. M5, M7, M40 ja M52 tuvastati ainult CD-NP rühmades, samas kui M24, M41 ja M48 tuvastati just CD-HP rühmades.

Erinevates CD töödeldud toodetes täheldati toimeainete imendumise ja metabolismi erinevusi. Jooniselt 14 leidsime, et HT-sulfaadi konjugatsiooni (M17) intensiivsus oli kõrgeim uriinis, millele järgnes 3-HPP sulfaadi konjugatsioon (M29), metüülitud HT sulfaadi konjugatsioon (M22), dehüdroksüülitud CA sulfaadiga konjugatsioon (M32) ja 3,4-dihüdroksübenseenpropioonhappe sulfaatkonjugatsioon (M19). Töödeldud rühmas oli ainevahetusproduktide sisaldus kõrgem kui CD rühmas, eriti M22, M29, M27, M16, M19, M1, M2 puhul. Nende prekursorühenditel, nagu hüdroksütürosool, on kasvajavastased, põletikuvastased, antibakteriaalsed, viirusevastased ja seenevastased omadused [23]. Kofeiinhappel on põletiku-, vähi- ja viirusevastane toime [24]. See oli kooskõlas CD ja selle töödeldud toodete kliinilise kasutamisega.

Arutelu

CD on TCM ja selle peamised bioaktiivsed komponendid, sealhulgas PhG-d, iridoidid, polüsahhariidid, on dokumenteeritud erinevate uuringute abil. TCM-i kliinilises praktikas on CD töödeldud tooteid laialdaselt kasutatud võrreldes toorproduktidega. ThekeemilineTöötlemise käigus muudetakse koostist, mis võib viia ravimite toime muutumiseni (joonis 14).

Joonis 14 Põhivoolu intensiivsusmetaboliididuriinis

PhG-d on teatud tüüpi fenoolsed ühendid, mida iseloomustab -glükopüranosiidi struktuur, mis kannab aglükoonina hüdroksüfenüületüülrühma. Need ühendid sisaldavad sageli kofeiinhapet ja ramnoosi, mis on seotud glükoosijäägiga vastavalt estri- või glükosiidsidemete kaudu. Käesolevas uuringus viidi läbi CD, CD-NP ja CD-HP kvalitatiivsed analüüsid ning tuvastati kokku 97 ühendit, sealhulgas fenüületanoidglükosiidid (PhG), iridoidid jne. Saadud tulemused näitasid erinevusikeemilinekoostis enne ja pärast töötlemist. PhG-de, mis sisaldavad 4'-O-kofeoüülrühma 8-O- -D-glükopüranosüüli osas, nagu akteosiid, tsistanosiid C, kampneosiid II, osmantusiid, intensiivsus vähenes pärast töötlemist, samas kui PhG-de 6-ga. '-O-kofeoüülrühm 8-O- -D-glükopüranosüüli osas, nagu isoatsetosiid, isotsistanosiid, isokampneosiid I, isomartynosiid, suurenes, eriti CD-NP rühmas. Suurenes ka ehhinakosiidi ja tsistanosiidi B intensiivsus, mille struktuur sisaldab 6'-O- -D-glükopüranosüülrühma. PhG-d, millel on 2'-aktüülrühm, vähenesid sageli protsessi käigus tekkinud hüdroosreaktsiooni tõttu, nagu tubulosiid B, 2-atsetüüllakteosiid.

Uuriminemetaboliididin vivo imendumine viidi läbi pärast CD ja selle töödeldud toodete suukaudset manustamist. II faasi metaboolsed protsessid olid võtmekaskaadid ja enamik metaboliite olid sulfaat, glükuroniid ja metüülitud konjugaadid. Fenüületanoolglükosiidide suukaudne imendumine ja kasutamine on madal. Neid on raske verre imenduda ja nad toimivad eellastena, et täita oma rolli pärast metaboolset aktiveerimist in vivo. Fenüületanoolglükooniks toodetud fenüületanoidid, nagu hüdroksütürosiin (HT) ja kohvhape (CA) ning selle derivaat 3-hüdroksüfenüülpropioonhape (3-HPP), võivad need metaboliidid plasmas kergemini imenduda ja neil on parem ravim. mõju.

Enamikmetaboliididleiti nende madalamates kontsentratsioonides või neid ei tuvastatud roti plasmas, kuid uriinis täheldati kõrgemat kontsentratsiooni, mis näitab, et metaboliidid erituvad kergesti uriiniga. Nagu on näidatud tabelis 3, määrati samad ühendid erinevates rühmades, samas kui nende kontsentratsioonides leiti olulisi erinevusi.metaboliididmida võib seostada CD ja selle töödeldud toodete ebavõrdse tõhususega. Suurim intensiivsus uriinis on HT-sulfaadi konjugatsioonil (M17), millele järgneb 3-HPP sulfaadi konjugatsioon (M29), metüülitud HT sulfaadi konjugatsioon (M22), dehüdroksüülitud CA sulfaadi konjugatsioon (M32) ja 3,{{ 7}}dihüdroksübenseenpropioonhappe sulfaadi konjugatsioon (M19). Töödeldud rühmas oli ainevahetusproduktide sisaldus kõrgem kui CD rühmas, eriti M22, M29, M27, M16, M19, M1, M2 puhul.

Üldiselt võivad komponendid, millel on suur kokkupuude sihtorganitega, olla tõhusad. In vitro on hinnatud ja määratud piisav kogus fenüületanoide ja nende derivaate. Iseloomulikud ühendid on akteosiid, mille sisaldus pärast riisi-veiniga töötlemist vähenes ning vastavalt suurenes isoakteosiidi, isotsistanosiidi C, isokampneosiidi I sisaldus. PhG-de, nagu CA ja HT derivaadid, lagunemissaadusi saab hinnata bioproovides ning riisi-veini töötlemine võib suurendada nende imendumist.metaboliididin vivo.

Järeldus

Selles uuringus tuvastati CD ja selle töödeldud toote ekstraktides 97 ühendit. Mõnede glükosiidide lagunemine toimus kõrgendatud temperatuuril ja selle tulemusena sünteesiti mõned uued isomeerid ja kompleksid. In vivo uuring, prototüübi komponendid (10) jametaboliidid(44) määrati või hinnati esialgselt roti plasmas, väljaheites ja uriinis. II faasi metaboolsed protsessid olid peamised kaskaadid, enamikmetaboliididseostati ehhinakosiidi või akteosiidiga, nagu HT, CA ja nende derivaadid 3-hüdroksüfenüülpropioonhape 3-HPP. Need metaboliidid võivad plasmas kergemini imenduda ja neil on parem ravitoime. Saadud tulemused näitasid, etkeemilineCD koostis oli erinev ja mõjutas ühendi dispositsiooni in vitro ja in vivo.

Andmete ja materjalide kättesaadavus

Käesoleva uuringu käigus kasutatud ja/või analüüsitud andmestikud on mõistliku taotluse korral kättesaadavad vastavalt autorilt.

Lühendid

PhG-d: fenüületanoidglükosiidid

CD:Cistanche deserticola

CMM: Hiina Materia Medica

TCM: traditsiooniline hiina meditsiin

CD-NP:Cistanche deserticolaTöödeldud aurutades koos riisi-veiniga normaalrõhul

CD-HP:Cistanche deserticolaTöödeldud aurutades kõrge rõhu all koos riisi-veiniga

UPLC-Q-TOF-MSE: ülikõrge jõudlusega vedelikkromatograafia koos TOF-MSE-ga

PCA: põhikomponentide analüüs

VIP: projektsiooni jaoks muutuv tähtsus

CA: kofeiinhape

HA: Hüdroksütürosool

Uuring keemiliste profiilide ja metaboliitide tsitanche kohta

Viited

1. Hiina farmakopöa komisjon. Pharmacopeia of The People's Republic of China, vol. I. Peking: China Medical Science Press; 2020. Lk. 140.

2. Li Z, Lin H, Gu L, Gao J, Tzeng CM. HerbaCistanche(Rou Cong-Rong): traditsioonilise hiina meditsiini üks parimaid farmaatsia kingitusi. Front Pharmacol. 2016;7:41.

3. Liu BN, Shi J, Zhang C, Li Z, Hua Y, Liu PP, Jia TZ. Erinevate kuivatamismeetodite mõju FreshileCistanche deserticolaselle komponentide sisu kohta. J Chin Med Mater. 2020;10:2414–8.

4. Liu BN, Shi J, Jia TZ, Lv TT, Li Z. Cistanches Herba kõrgsurveaurutamisprotsessi optimeerimine. Chin Trad Patent Med. 2019;11:2576–80.

5. Fan YN, Huang YQ, Jia TZ, Wang J, La-Sika, Shi J.Cistanchesherba enne ja pärast töötlemist D-galaktoosist põhjustatud vananevate rottide vananemisvastase funktsiooni ja immuunfunktsiooni kohta. Chin Arch Trad Chin Med, 2017; 11:2882–2885.

6. Gao YJ, Jiang Y, Dai F, Han ZL, Liu HY, Bao Z, Zhang TM, Tu PF. Cistanche deserticola YC Ma lahtistavate koostisosade uuring. Kaasaegne Chin Med. 2015;17(4):307–10.

7. Liu BN, Shi J, Li Z, Zhang C, Liu P, Yao W, Jia T. Uuring neuroendokriin-immuunfunktsiooni kohtaCistanche deserticolaja selle riisiveini aurutamistooted glükokortikoidide indutseeritud rotimudelis. Evid Based Complement Alternatiivne Med. 2020;22:5321976.

8. Guo Y, Wang L, Li Q, Zhao C, He P, Ma X. Enhancement of neeru turgutav funktsioon hiiremudelis Cistanches herba kuivatatud kiiresti keskmisel kõrgel temperatuuril. J Med Food. 2019;22(12):1246–53.

9. Wang T, Zhang X, Xie W.Cistanche deserticolaYC Ma, "Kõrbe ženšenn": ülevaade. Am J Chin Med. 2012;40(6):1123–41.

10. Fu Z, Fan X, Wang X, Gao X. Cistanches Herba: ülevaade selle keemilistest, farmakoloogilistest ja farmakokineetikalistest omadustest. J Etnopharmacol. 2018;219:233–47.

11. Lei H, Wang X, Zhang Y, Cheng T, Mi R, Xu X, Zu X, Zhang W. HerbaCistanche(Rou Cong Rong): ülevaade selle fütokeemiast ja farmakoloogiast. Chem Pharm Bull. 2020;68(8):694–712.

12. Geng X, Tian X, Tu P, Pu X. Ehhinakosiidi neuroprotektiivne toime Parkinsoni tõve hiire MPTP mudelis. Eur J Pharmacol. 2007;564:66–74.

13. Deng M, Zhao JY, Ju XD, Tu PF, Jiang Y, Li ZB. Tubulosiidi B kaitsev toime TNF-alfa-indutseeritud apoptoosile neuronaalsetes rakkudes. Acta Pharmacol Sin. 2004;25(10):1276–84.

14. Nan ZD, Zhao MB, Zeng KW, Tian SH, Wang WN, Jiang Y, Tu PF. Põletikuvastased iridoidid varredestCistanche deserticolakasvatatakse Tarimi kõrbes. Chin J Nat Med. 2016;14(1):61–5.

15. Nan ZD, Zeng KW, Shi SP, Zhao MB, Jiang Y, Tu PF. Põletikuvastase toimega fenüületanoidglükosiidid Tarimi kõrbes kasvatatud Cistanche deserticola vartest. Fitoteraapia. 2013;89:167–74.

16. Morikawa T, Pan Y, Ninomiya K, Imura K, Yuan D, Yoshikawa M, Hayakawa T, Muraoka O. Iridoid ja atsüklilised monoterpeenglükosiidid, kankanosiidid L, M, N, O ja P alatesCistanchetubulosa. Chem Pharm Bull. 2010;58(10):1403–7.

17. Li SL, Song JZ, Qiao CF jt. Uudne strateegia potentsiaali kiireks uurimisekskeemilinemarkerid töötlemata ja töödeldud Radix Rehmanniae eristamiseks UHPLC-TOF-MS abil mitme muutujaga statistilise analüüsiga. J Pharm Biomed Anal. 2010;51(4):812–23.

18. Peng F, Chen J, Wang X, Xu CQ, Liu TN, Xu R. Muutused fenüületanoidglükosiidide tasemes, antioksüdantide aktiivsus ja muud kvaliteediomadusedCistanche deserticolaviilud auruga töötlemisel. Chem Pharm Bull. 2016;64:1024–30.

19. Ma ZG, Tan YX. Kuue fenüületanoidglükosiidi sisu muutub aurutamise ajal veiniga Desertliving Cistanche'is. Chin Trad Patent Med. 2011;33(11):1951–4.

20. Peng F, Xu R, Wang X, Xu C, Liu T, Chen J. Aurutamisprotsessi mõju koristusjärgsele kvaliteedilecistanche deserticolameditsiiniliseks kasutamiseks päikesekuivatamise ajal. Biol Pharm Bull. 2016;39(12):2066–70.

21. Cui Q, Pan Y, Zhang W, Zhang Y, Ren S, Wang D, Wang Z, Liu X, Xiao W.MetaboliididToidu akteosiidi: profiilid, isoleerimine, identifitseerimine ja hepatoprotektiivne võime. J Agric Food Chem. 2018;66(11):2660–8.

22. Cui Q, Pan Y, Bai X, Zhang W, Chen L, Liu X. Süstemaatiline iseloomustusmetaboliididehhinakosiidist ja akteosiidistCistanchetubulosa roti plasmas, sapis, uriinis ja väljaheites UPLC-ESI-Q-TOF-MS põhjal. Biomed Chromatogr. 2016;30(9):1406–15.

23. Bertelli M, Kiani AK, Paolacci S, Manara E, Kurti D, Dhuli K, Bushati V, Miertus J, Pangallo D, Baglivo M, Beccari T, Michelini S. Hüdroksütürosool: paljulubava farmakoloogilise toimega looduslik ühend. J Biotechnol. 2020;309:29–33.

24. Touaibia M, Jean-François J, Doiron J. Kohvhape, mitmekülgne farmakofoor: ülevaade. Mini Rev Med Chem. 2011;11(8):695–713.