Cistanche parandab süsteemse erütematoosluupuse tõttu neeruinfektsiooni
Mar 13, 2022
Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791
1. osa jaoks klõpsake siin.
ARUTELU
Tolerantsuse katkemine tuumaantigeenide suhtes on selle tunnusekssüsteemne luupuserütematoos, ja peale B-rakkude arvatakse, et autoreaktiivsed T-rakud mängivad selle patogeneesis keskset rolli. Kuna aga (auto)antigeenispetsiifilisteCD4pluss T-rakud on autoimmuunsuse uuringutes endiselt suureks väljakutseks, siiani on tuumaantigeeni suhtes reaktiivse CD4 kohta tegelikult vähe teadaplussT-rakud sissesüsteemneluupuserütematoos.
Hiljuti uudsed meetodid antigeenispetsiifilise CD4 tuvastamiseks ja loendamiseksplussT-rakud on välja töötatud. T-raku raamatukogu lähenemisviis kasutab ära T-rakkude eelnevat polüklonaalset laienemist, et võimaldada haruldaste antigeenispetsiifiliste T-raku kloonide tuvastamist. See strateegia pakub suurt tundlikkust ja võimaldab töötada piiratud hulga rakkudega. Seda tehnikat kasutades suutsime aktiivsetel patsientidel näidata reaktiivseid T-rakke 5 kanoonilise tuumaantigeeni vastusüsteemneluupuserütematoos. Raamatukogupõhise tuvastamise puudusteks on peale selle, et see on töömahukas, see, et teatud kloonide väljakasvamist või kadumist laienemise, faasi ajal ei saa välistada ning rakkude fenotüübilise analüüsi piiratud võimalused.
Standardset kaastsütomeetriat piirab tuvastatavate sündmuste arv, mis tavaliselt piirab proovide analüüsi populatsiooniga, mille sagedus on üle 0,01 protsenti. Meie vaatlus T-raku raamatukogu abil näitas, et tsirkuleeriva autoreaktiivse CD4 sagedusplussKonkreetse autoantigeeni T-rakud haiguse ägenemisega patsientidel olid w2{1}} rakud miljonis rakus, mis esindab sagedust 0,002 protsenti; seetõttu autoantigeenispetsiifilise CD4 tuvastamineplussT-rakkude kasutamine standardse, manipuleerimata kaastsütomeetria abil on peaaegu võimatu. Bacher et al. tutvustas CD4 eelrikastamistplussT-rakud, mis reageerivad teatud antigeenidele enne kaastsütomeetria omandamist, mida tuntakse ARTE-meetodina. Selle lähenemisviisi kasutuselevõtt tuumaantigeenispetsiifilise CD4 tuvastamiseksplussT-rakud, suutsime oma tulemusi kinnitada ja demonstreerida tuumaantigeeniga reaktiivse CD4 laienemistplussT-rakud on aktiivsedsüsteemneluupuserütematoos. Nimelt oli transtüretiini ja C. Albicansiga reageerivate T-rakkude sagedus tervete kontrollide ja haigete patsientide vahel ükskõikne.süsteemneluupuserütematooserineva haigusaktiivsusega. Seetõttu on täheldatud laienemistautoreaktiivneT rakudei ole tõenäoliselt üldise passiivse hüperreaktiivsuse tagajärgsüsteemneluupuserütematoosvaid antigeenispetsiifiliste T-rakkude laienemisest.
Thesüsteemne erütematoosluupusnakatabneerud, seega kasutatakse kaitseks tsistancheneerud.
Varasemad teated on selle olemasolu juba näidanudautoreaktiivneT-rakudsissesüsteemneluupuserütematoos, kasutades peamiselt proliferatsiooni, tsütokiinide tootmist või aktiveerimismarkerite ülesreguleerimist, ehkki ilma nende rakkude selge populatsiooni kvantifitseerimiseta. Tuuma antigeenispetsiifiliste T-rakkude esinemissageduse kohta on olemas parimad tõendid reaktiivsuse kohta U1 väikese ribonukleoproteiini suhtes, mis on iseloomulik autoantigeeni sihtmärk segatüüpi sidekoehaiguse korral ja mida leidub ainult osal patsientidestsüsteemneluupuserütematoos. U1 väike tuuma ribonukleoproteiin – reaktiivne CD4plussT-rakud määrati, kasutades piiravat lahjendust ja ensüümseotud immuunpunkti analüüsi (ELISPOT) ning teatati, et need esinevad vastavalt (40 kuni 250) 106 T-rakku ja (20 kuni 60) 106 PBMC-d, mis on sarnased. suurusjärk kui autoreaktiivsete rakkude sagedus meie uuringus. Oma töös uurisime reaktsioonivõimet mitme tunnuse suhtessüsteemneluupuserütematoos-seotud tuumaantigeenid. Huvitav on see, et kuigi kõigil aktiivse LN-ga patsientidel ilmnes tuumavastase antigeeni-reaktiivse CD4 suurenenud sagedusplussT-rakud, patsiendid erinesid oma sihtportfellis ja reaktsioonivõime oli suunatud laiema antigeenide komplekti vastu võrreldes mitteaktiivsete patsientidega.süsteemneluupuserütematoos. Selle bioloogiline tähtsus on praegu teadmata. Erinevad CD4plussT-rakkude reaktiivsus võib olla seotud erinevate reaktiivsuste teatud kliiniliste ilmingutega, mis võivad olla haiguse patogeneesi jaoks üleliigsed.
Sarnaselt teiste autoimmuunhaigustega suutsime ka näidata autoreaktiivse CD4 olemasoluplussT-rakud tervetel inimestel, kuigi palju madalama sagedusega võrreldes aktiivse süsteemse erütematoosluupusega patsientidega. Neid rakke ei olnud võimalik tuvastada, võrreldes aktiveeritud rakkude arvu koos antigeeni stimulatsiooniga või ilma, isegi selliste ülitundlike tehnikatega nagu T-raku raamatukogud või ARTE meetodid. Üherakulise kloonimisega suutsime aga näidata, et "taust" signaal sisaldas tõepoolest autoantigeenispetsiifilist CD4plussT-rakud. Millised konkreetsed sündmused toovad kaasa tolerantsuse katkemise ja sageduse suurenemiseautoreaktiivneT rakudjääb spekulatiivseks; sellegipoolest näitavad meie andmed, et autoreaktiivsete kloonide laienemine mängib osa süsteemse erütematoosluupuse patogeneesis.
Tsirkuleeriv tuumaantigeeniga reaktiivne CD4plussT-rakud tootsid peamiselt IFN-g ja vähemal määral IL-17 ja IL-10. See tsütokiini profiil koos nõrga / puuduva korrelatsiooniga autoantikehade tootmisega viitab sellele, et tuuma antigeeni suhtes reageeriva CD4 rollplussT-rakud ei pruugi olla ainus B-rakkude abi pakkuja. On näidatud, et IFN-g on LN-i patogeneesis asendamatu. On näidatud, et Th1 rakud on värvatudnakatunud neerudkude sissesüsteemne luupuserütematoos, muutes tuuma antigeeni suhtes reaktiivsed T-rakud peamisteks kandidaatideks tungimiseksneerud, kus nad kohtaksid oma üldlevinud sugulasautoantigeeni. Kuseteede T-rakke on varem kirjeldatud, et need peegeldavad haiguse aktiivsust ja peegeldavad intrarenaalsete rakkude fenotüüpi LN20,33; seega kasutasime puhverserverina uriini T-rakkeneerudT-rakud. Uriini T-rakud näitasid piiratud TCR-i varieeruvust, mis on kooskõlas vaatlusteganeerudbiopsiad, mis näitavad teatud T-raku kloonide rikastumistnakatunudneerudpabertaskurätik. Kuseteede T-rakkude hulgas suutsime tuvastada tuuma antigeeniga reaktiivseid T-rakke ja nende sagedus oli rikastatud võrreldes tsirkulatsiooni T-rakkudega. Järelikult tundub tõenäoline, et tuuma antigeeni suhtes reaktiivsed rakud osalevad otseselt kohalike elundikahjustuste levimises.
Kokkuvõttes näitame siin, et tuumaantigeeni suhtes reaktiivne CD4plussT-rakud on inaktiivsedsüsteemneluupuserütematoos; need on fenotüüpiliselt peamiselt IFN-g tootvad Th1 T-rakud ja tungivad sissenakatunudsihtorganid naguneerud.
Cistanche võib vältida nakatumistneerudtõttusüsteemneluupuserütematoos.
MEETODID
Üksikasjalikud meetodid on toodud lisamaterjalis.
Katsealused ning vere- ja uriiniproovid
Vereproovid võeti 17 tervelt isikult, 12 mitteaktiivselt patsiendiltsüsteemneluupus erütematoos(süsteemneluupuserütematoosDAI skoor<10), and="" 20="" patients="" with="" active="">süsteemneluupuserütematoos(süsteemneluupuserütematoosDAI score >10). Lisaks võeti uriiniproovid 12 patsiendilt, kellel oli aktiivnesüsteemneluupuserütematoosja LN. Kõik katsealused olid andnud oma teadliku nõusoleku Charité – Universitätsmedizin Berlini institutsionaalselt järelevalvenõukogult ja eetikaasutustelt saadud eetilise nõusoleku alusel (EA 1/342/12, EA 1/098/07 ja EA 1/036/16). ). PBMC-d ja uriinirakud valmistati FicollHypaque'i tihedusgradienti abil.
Antikehad ja järgige tsütomeetriat
Sõltuvalt katsetest värviti antigeeniga stimuleeritud rakkudel mitmeid pinnamolekule järgmiste monoklonaalsete antikehade erinevates kombinatsioonides: anti-CD3, -CD4, -CD8, -CD14, -CD20, -CD69 ja -CD154; elusate ja surnud rakkude eristamiseks LIVE/DEAD Aqua komplekt (Life Technologies Ltd.,Paisüsteemneluupuserütematoos, UK) kasutati.
Intratsellulaarse raku sektsiooni värvimiseks fikseeriti rakud 2% (maht/maht) paraformaldehüüdiga 15 minutit toatemperatuuril ja permeabiliseeriti BD FACS permeabiliseeriva lahusega 2 (BD Biosciences, San Jose, CA); järgmised antigeenid värviti intratsellulaarselt, kasutades standardset protokolli: CD154, IFN-g, IL-2, IL-4, IL-10 ja IL-17.
Proovid saadi BD FACSCanto II ja BD LSRFortessa (BD Biosciences) ja voolutsütomeetria põhiseadme Deutsches Rheuma-Forschungszentrum Berlini tsütomeetritega, kasutades BD FACSDiva tarkvara (BD Biosciences). Voolutsütomeetria andmeid analüüsiti FlowJo tarkvara abil (FlowJo v10, Three Star, Ashland, VA).
Antigeeni ja antigeenide kogumi ettevalmistamine
CD4 stimuleerimiseks kasutasime järgmisi antigeeneplussT-rakud T-raku raamatukogu analüüsis: {{0}},5 mg/ml inimese SNRPD1 (SmD1) rekombinantset valku (Biorbyt Ltd., Cambridge, UK), 50 ng/ml inimese SNRP70 (RNP70) rekombinantset valku (Abcam Plc., Cambridge, UK), 0,5 mg/ml inimese looduslikku histooni valku (Abcam Plc.), 0,5 mg/ml inimese SS-i -A/Ro rekombinantne valk (soovitab Euroimmun AG, Lübeck, Saksamaa), 0,5 mg/ml inimese SS-B/La rekombinantset valku (tarvitab Orgentec Diagnostika GmbH, Mainz, Saksamaa), 1 mg/ml SEB (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, Saksamaa), 1 mg/ml PepTivator Candida albicans MP65 (Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach, Saksamaa) ja 0,5 mg/ml inimese transtüretiini rekombinantset valku (ATGen, Seongnam, Lõuna-Korea ).
Perifeersed ja kuseteede T-rakkude raamatukogud Protokoll amplifitseeritud perifeersete ja uriini T-rakkude raamatukogude loomiseks võeti vastu ja kohandati nii, nagu eelnevalt kirjeldatud.14 Brieflfly, 200, 000 perifeerne CD4plussT-rakud või 500 kuni 2000 uriini CD4plussT-rakud eraldati anti-inimese CD4 abilplussMicroBeads (Miltenyi Biotec GmbH) vastavalt tootja juhistele. CD4 puhtusplussT-rakkude fraktsiooni kontrolliti rutiinselt, kasutades CD3 alusel jälgitavat tsütomeetriatplussCD4pluss expression, where the purity always reached >99 protsenti ja 70 protsenti kuni 75 protsenti perifeerse vere ja uriiniproovide puhul. Paralleelselt valmistati antigeeni esitlevad rakud, kogudes CD3 rakud PBMC-dest pärast ammendamist anti-inimese CD3 MicroBeadsiga (Miltenyi Biotec GmbH) ja külmsäilitati. Pärast 1–2-nädalast kultiveerimist amplifitseeritud CD4 fraktsioonidplussSõltuvalt analüüsitavate antigeenide arvust jaotati T-rakud 96-süvendiplaatidele. Enne antigeenidega stimuleerimist puhati rakke vähemalt 4 päeva. Stimuleerimise päeval antigeeni esitlevad rakud sulatati ja jaotati T-rakukultuuri vahekorras vähemalt 1 antigeeni esitlev rakk 100 CD4 kohta.plussT-rakud. CD4plussKatsetesse kaasati alati negatiivse kontrolli (stimuleerimata rakud) ja positiivse kontrolli (SEB-ga stimuleeritud rakud) T-raku raamatukogud. CD4pluss T-rakke stimuleeriti antigeeniga 4 päeva ja proliferatsioon määrati standardse [3H]-tümidiini protokolli abil.
Amplifitseeritud T-raku blastid reageerisid erinevalt antigeenidele, mida kuvas väga heterogeenne stsintillatsiooni CPM; seega oli doonorispetsiifilise z-skoorina määratud proliferatsiooniläve normaliseerimine vajalik. z-skoor arvutati 75. ja 25. protsentiili 5 erinevusena, mis ületab stimuleerimata mikrokultuuride CPM-i mediaan. SEB-ga stimuleeritud mikrokultuuride rakud toimisid positiivse kontrollina. Pange tähele, et mikrokultuurid, mille SEB stimulatsiooni indeks on<5 for="" peripheral="" blood="" samples,="" or="" 4="" for="" urinary="" samples,="" were="" excluded="" because="" it="" indicated="" poor="" cell="" viability.="" enumeration="" of="" the="" precursor="" frequency="" of="" antigen-specific="">plussT-rakud arvutati, kasutades negatiivsete mikrokultuuride arvu vastavalt Poissoni jaotusele ja väljendati 1 miljoni raku kohta, nagu eelnevalt kirjeldatud. Poissoni jaotuse kasutamine põhineb tõenäosusel, et vähemalt 1CD4plussKui radioaktiivne signaal tuvastati pärast antigeenispetsiifilist stimulatsiooni, on T-rakk olemas ühes T-raku raamatukogude mikrokultuuris.
Perifeersed ja kuseteede ARTE meetodid järgisime protokolli, mis kasutab CD154 MicroBead Kit (Miltenyi Biotec GmbH). Lühidalt öeldes stimuleeriti rakke 7 tundi antigeenidega ja märgistati seejärel inimese CD154-vastaste biotiini antikehade ja biotiinivastaste mikrohelmestega vastavalt tootja juhistele. Märgistatud rakud laaditi kalibreeritud MS kolonnidesse (Miltenyi Biotec GmbH), et rikastada CD{5}}ekspresseerivaid rakke. Rakkude märgistamine karboksüfluorestseiindiatsetaadi N-suktsiinimidüülestriga (Sigma-Aldrich Chemie GmbH) viidi läbi standardprotokolli järgi.
Cistanche paranebneerudfunktsioonid.
Üherakuliste kloonide genereerimine
Antigeeniga reaktiivsetest rakkudest genereeriti üherakulised kloonid, mida rikastati CD154 ekspressiooniga ARTE protokolli järgi. CD154-ekspresseerivad rakud filtreeriti 30-mm ettevalmistusfiltriga (Miltenyi Biotec GmbH) ja resuspendeeriti 1 ml 20 (maht/maht) protsendilises (maht/maht) külmas fosfaatpuhverdatud soolalahuses, 0,5 ui. protsenti veise seerumi albumiini ja 2 mM etüleendiamiintetraäädikhapet. Rakud olid üksikud rakud, mis olid sorteeritud CD154 jaoksplussCD69plussfenotüüpi ja üksikult sorteeritud rakke kultiveeriti 96-süvendi plaatide üksikutes süvendites toiterakkude juuresolekul. Rakukultuure hoiti 3 kuni 4 päeva, kuni mitmed kloonid olid nähtavad. Üks päev enne taasstimuleerimist sulatati antigeeni esitlevad rakud ja jaotati T-rakukultuuri vahekorras
vähemalt 1 antigeeni esitlev rakk 100 CD4 kohtaplussT-rakud. Rakke stimuleeriti 1 mg/ml antigeeniga ja stimuleerimata kloonid toimisid negatiivse kontrollina.
Järgmise põlvkonna sekveneerimisel põhinev TCR-i repertuaarianalüüs
Genoomne DNA eraldati perifeersest CD4-stplussT-rakud ja uriinirakud, kasutades AllPrep DNA/RNA Micro Kit (Qiagen, Venlo, Holland). Rekombineeritud TCR-b lookust amplifitseeriti vastavalt eelnevalt kirjeldatud protokollile. Lugemisi töödeldi IMSEQ abil ning võrdsed klonotüübid koondati ja analüüsiti edasi.
Statistika
Statistilised testid viidi läbi GraphPad Prism tarkvaraga (Prism 8, GraphPad Software Inc., La Jolla, CA). Mitme võrdluse jaoks rakendati Bonferroni korrigeerimist. Sõltumatu ja sõltuva andmekogumiga katsetes kasutati Mann-Whitney U testi ja Wilcoxoni märgistatud auaste testi. Pärast Bonferroni korrigeerimist mitme võrdluse jaoks korrigeeriti kriitiliste P väärtuste arvutamist, kuna see põhineb kavandatud võrdluste arvul. P väärtused<0.01 were="" considered="" statistically="" significant="" with="" the="" following="" indication:="" *p="" <="" 0.01,="" **p="" <="" 0.005,="" and="" ***p="" <="" 0.0005.="" correlation="" analyses="" were="" performed="" using="" spearman="" rank="" correlations="" by="" showing="" the="" absolute="">süsteemneluupuserütematoosDAI väärtused järjestatud väärtuste asemel, et paremini mõista rakkude arvu ja haiguse aktiivsuse vahelist seost. Korrelatsioonianalüüsi jaoks P väärtused<0.5 were="" considered="" statistically="" significant="" with="" the="" following="" indication:="" *p="" <="" 0.05,="" **p="" <="" 0.01,="" and="" ***p="" <="" 0.001.="" when="" background="" frequencies="" were="" higher="" than="" the="" frequencies="" of="" nuclear="" antigen–reactive="">plussT-rakkude puhul määrati ilma taustata sagedused nulliks. Andmekogumile rakendati teisendust log(x þ 1), kui see sisaldas nullväärtusi. Täiendavad patsiendiandmed ja statistilised andmed on saadaval täiendavates tabelites S1 ja S2.
Tuuma antigeeniga reaktiivne CD4plussrakud laienevad aktiivseltsüsteemneluupuserütematoos, toodavad efektortsütokiine ja nakatavadneerud,Cistanche saab kaitstaneerud.
AVALIKUSTAMINE
Kõik autorid ei deklareerinud konkureerivaid huve.
TUNNUSTUS
Täname Toralf Kaiserit ja Jenny Kirschi (voolutsütomeetria ja rakkude sorteerimisüksus, Deutsches Rheuma-Forschungszentrum Berlin) abi eest voolutsütomeetria ja rakkude sorteerimisel. Neid uuringuid toetasid Deutsche Forschungsgemeinschaft Sonderforschungsbereich 650 raames GR-le ning Deutsche Gesellschaft für Nephrologie ja Charité-Universitätsmedizin Berlin kliiniliste teadlaste programmi ja Berliini Terviseinstituudi toetused PE-le.
TÄIENDAV MATERJAL Täiendav fail (PDF)
Joonis S1. Autoreaktiivne tuumaantigeenispetsiifiline CD4plussT-rakud tuvastati T-raku raamatukogu meetodil. Joonis S2. CD154plussCD69plussCD4plussTervetelt isikutelt pärast tuumaantigeenidega stimuleerimist eraldatud T-rakud on bona-fife antigeenispetsiifilised CD4plussT-rakud.
Joonis S3. Tsütokiine tootva autoreaktiivse CD4 sagedusedplussT-rakke võrreldi tuumavastaste antikehade (anti-ANA) tiitriga (A) ja kaheahelaliste DNA antikehade (anti-dsDNA) (B) kontsentratsiooniga.
Joonis S4. Tuuma antigeeniga reaktiivne CD4plussT-rakud tuvastati aktiivsete uriinissüsteemneluupuserütematoosLN-ga patsiendid.
Tabel S1. Kliinilised andmed.
Tabel S2. Mediaanväärtuste kokkuvõte.
Täiendavad meetodid.
Kordneerudon nakatunud tuuma antigeeni suhtes reaktiivse CD4 tõttuplussrakud laienevad aktiivseltsüsteemneluupuserütematoos,neerudfunktsioon hävib, parandamiseks kasutatakse cistanche'ineerudfunktsiooni.
VIITED
1. Casciola-Rosen LA, Anhalt G, Rosen A. Sihitud autoantigeenidsüsteemne luupuserütematooson koondunud apoptootiliste keratinotsüütide kahte pinnastruktuuride populatsiooni. J Exp Med. 1994;179: 1317–1330.
2. Arbuckle MR, McClain MT, Rubertone MV jt. Autoantikehade tekkimine enne haiguse kliinilist algustsüsteemneluupuserütematoos. N Engl J Med. 2003;349:1526–1533.
3. Suarez-Fueyo A, Bradley SJ, Tsokos GC. T-rakud sissesüsteemneluupuserütematoos. Curr Opin Immunol. 2016;43:32–38.
4. Crow MK, DelGiudice-Asch G, Zehetbauer JB jt. Ribosomaalse P2 valgu poolt indutseeritud autoantigeenispetsiifiline T-rakkude proliferatsioon patsientidel, kellel onsüsteemneluupuserütematoos. J Clin Invest. 1994;94:345–352.
5. Engler JB, Undeutsch R, Kloke L jt. Autoreaktiivse CD4 paljastamineplussT-rakud CD25 regulatoorsete T-rakkude kahanemise teelsüsteemneluupuserütematoos. Ann Rheum Dis. 2011;70:2176–2183.
ja jne.
