Cistanche Deserticola polüsahhariid pärsib OVX-indutseeritud luukadu hiirtel ja RANKL-i põhjustatud osteoklastogeneesi

Palun võtke ühendustoscar.xiao@wecistanche.comrohkem informatsiooni

ABSTRAKTNE

Osteoporoos on tõsine luuhaigus, mis mõjutab vananevat elanikkonda. Hiinas laialdaselt kasutatav toonik ja ravimtoit Cistanche deserticola (CD) on osutunud tõhusaks osteoporoosi raviks. CD-st ekstraheeritud Cistanche deserticola polüsahhariidil (CDP) on erinevad farmakoloogilised omadused, kuid selle rollosteoklastilineteket ja funktsiooni, samuti osteoporoosi, jääb teadmata. Selle uuringu eesmärk oli ekstraheerida ja puhastada CDP, et täiendavalt uurida selle võimalikku osteoporoosi toimemehhanismi. Tulemused näitasid, et CDP-ravi hoidis ära OVX-indutseeritud osteoporoosi ja leevendas luukadu, represseerides osteoklastide aktiivsust ja funktsiooni. Lisaks pärssis CDP-ravi oluliselt RANKL-i poolt indutseeritud osteoklastogeneesi, luu resorptsiooni ja osteoklastispetsiifilist geeniekspressiooni. Mehhaaniliselt inhibeeris CDP RANKL-i poolt indutseeritud NF-KB ja MAPK-de signaaliradade aktivatsiooni ja mõjutas järelikult allavoolu NFATc1 aktivatsiooni. Selle uuringu tulemused näitavad, et CDP on potentsiaalselt ohutu ravim osteoporoosi raviks. (10 eelist, mida Cistanche võib anda)

Lisateabe saamiseks klõpsake siin

Sissejuhatus

Osteoporoos – haigus, mida iseloomustavad luumassi vähenemine, luukoe ebanormaalne mikrostruktuur, suurenenud luude haprus ja luumurrud (De Martinis, Di Benedetto, Mengoli ja Ginaldi, 2006) – mõjutab praegu üle 200 miljoni inimese üle maailma ning on oluline meditsiiniline ja sotsiaalmajanduslik koormus kaasaegsele ühiskonnale (Strom et al., 2011). Osteoporoosi kliiniline ravi keskendub peamiselt hormoonasendusele,bisfosfonaatvõi denosumabravi. Need meetodid on tõhusad, kuid tekitavad pikaajalisi kõrvalmõjusid, nagu potentsiaalne risk rinnavähi ja reieluu ebatüüpiliste luumurdude tekkeks (Black, Bauer, Schwartz, Cummings ja Rosen, 2012; Rachner, Khosla ja Hof Bauer, 2011). Seetõttu on tungiv vajadus uurida ravimeid, mis mitte ainult ei pärsi osteoporoosi, vaid millel on ka vähem soovimatuid kõrvaltoimeid. Cistanche deserticola (CD), Hiinas laialdaselt kasutatav toonik ja ravimtoit, tuntud kui "kõrbeženšen", on C. deserticola YC Ma (Gu, Yang ja Huang, 2016) kuivatatud mahlane vars koos soomuslehtedega (Gu, Yang ja Huang, 2016) ja on mitmekesine. ja tõhusad farmakoloogilised tegevused, nagu immuunregulatsioon,antioksüdatsioonja osteoporoosivastased omadused (Hu et al., 2020; Li et al., 2012; Zhang et al., 2014). Varasemad uuringud CD aktiivsete ainete kohta osteoporoosi ravis keskendusid peamiselt fenüületanoidglükosiididele (Li, Jiang ja Gu, 2018; Xu, Zhang, Wang, Yao ja Ma, 2017). Kuid CD sisaldab ka teisi tõhusaid komponente, nagu iridoidid, lignaanid, polüsahhariidid (Wang, Zhang ja Xie, 2012). Traditsioonilise hiina meditsiini (TCM) kliiniline rakendus on peamiselt vee dekokteerimine. Polüsahhariidid on vees lahustuvad komponendid ja on tõenäoliselt TCM-i peamised farmakodünaamilised komponendid. TCM-st ekstraheeritud polüsahhariididel on metsikult teatatud, et neil on osteoporoosivastane toime ja mõned soovimatud kõrvaltoimed, mida on kliinikutes üldiselt kasutatud (nt polüsahhariidid, mis on ekstraheeritudEpimedium brevicornum(Zheng, He, Wu, Cai ja Wei, 2020), Achyranthes bidentata (Zhang, Zhang, Zhang, Wang ja Yan, 2018) ja Morinda officinalis (Yan et al., 2019)). Seetõttu püstitasime selle hüpoteesiCistanche deserticola polüsahhariidCD-st eraldatud (CDP) võib olla potentsiaalselt ohutu ravim osteoporoosi raviks. Tavaliselt säilitavad luu resorptsioon ja luu moodustumine dünaamilise tasakaalu luu remodelleerumise ajal koordineerituna mitut tüüpi rakkudega, sealhulgas osteoklastidega,osteoblastid, luuvoodri rakud ja osteotsüüdid (Kular, Tickner, Chim ja Xu, 2012). Selle tasakaalu katkemine võib põhjustada mitmesuguseid luu ainevahetushaigusi, nagu osteoporoos (Zhu et al., 2018) ja osteoskleroos (Ihde et al., 2011). Osteoklastid kui mononukleaarsest/makrofaagiliinist pärinevad diferentseerunud rakud on ainsad rakud, millel on luu resorptsiooni funktsioon (Teitelbaum, 20{{106}}0). Osteoklastide diferentseerumises ja küpsemises osalevad kaks peamist tsütokiini (Koga et al., 2004): makrofaagide kolooniaid stimuleeriv faktor (M-CSF) ja tuumafaktori κB (NF-κB) ligandi (RANKL) retseptori aktivaator. M-CSF vahendab vereloome tüvirakkude diferentseerumist osteoklastide eellasrakkudeks ja soodustab osteoklastide diferentseerumist, reguleerides RANK retseptori ekspressiooni (Takayanagi, 2007). RANKL-i ja RANK-i seondumine osteoklastide rakupinnal toob kaasa järgmised: (1) signaaliadaptermolekulide nagu TNF-i retseptoriga seotud faktor 6 (TRAF6) värbamine; (2) mitme allavoolu sihtmärgi, sealhulgas NF-κB ja mitogeen-aktiveeritud proteiinkinaaside (MAPK) aktiveerimine; ja (3) aktiveeritud T-rakkude, tsütoplasmaatilise 1 (NFATc1) tuumafaktori ekspressioonitasemete ülesreguleerimine (Liu et al., 2019; Yamashita et al., 2007). Nende signaaliradade aktiveerimine reguleerib otseselt osteoklastide geenide, sealhulgas happelise fosfataasi 5 (Acp5) [kodeerib tartraadiresistentset happelist fosfataasi (TRAcP)], maatriksi metalloproteinaasi 9 (MMP9) ja katepsiin K (CTSK) (Boyle, Simonet) ekspressiooni. ja Lacey, 2003). Seetõttu on RANKL-i indutseeritud osteoklastide diferentseerumisega seotud signaaliradade pärssimine osteoporoosi potentsiaalne ravimeetod. Selles uuringus püüdsime määrata CDP-ravi mõju munasarjade eemaldamise (OVX) poolt indutseeritud osteoporoosi hiiremudelile in vivo ja RANKL-i indutseeritud osteoklastide aktiivsusele in vitro, keskendudes osteoklastispetsiifiliste geenide ekspressioonile ja aktiveerimisele. NFATc1 ning NF-κB ja MAPK-de signaaliülekanderadu. Meie leiud võivad anda uusi teadmisi CDP kui ohutu ja tõhusa ravimi potentsiaalist osteoporoosi raviks. 2. Materjalid ja meetodid 2.1. Kemikaalide ja proovide kogumise CD (nr 180801) osteti ettevõttelt Anhui Jishun Traditional Chinese Medicine Co., Ltd. (Anhui, Hiina) ja selle tuvastas professor Haibo Huang Guangzhou Hiina Meditsiini Ülikooli Farmaatsiateaduste Koolist, Guangzhou, Hiina . Östradioolvaleraadi tabletid osteti firmalt Bayer (Leverkusen, Nordrhein-Westfalen, Saksamaa). Alfa-modifitseeritud minimaalne hädavajalik sööde (-MEM) ja veise loote seerum (FBS) saadi firmalt Gibco (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Penitsilliin / streptomütsiin ja TRAcP värvimiskomplekt saadi ettevõttest Solarbio (Peking, Hiina). Rekombinantse hiire M-CSF ja rekombinantse hiire RANKL hangiti ettevõttest R&D Systems (Minneapolis, MN, USA). Hüdroksüapatiidiga kaetud plaadid osteti ettevõttelt Corning Life Sciences (St. Lowell, MA, USA). NFATc1 ja CTSK primaarsed antikehad (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA); IκB-, p65, P-p65, p38, P-p38, ERK1/2, P-ERK1/2, JNK ja P-JNK (Cell Signaling Technology, Dan vers, MA, USA); ja -aktiini (CWBIO, Peking, Hiina) saadi ka. Teised selles uuringus kasutatud reaktiivid olid analüütilise kvaliteediga ja vesi puhastati Milli-Q veepuhastussüsteemiga (Millipore, Bedford, MA, USA). 2.2. CDP ekstraheerimine CD jahvatati peeneks pulbriks ja segati selle purustamiseks kolm korda petrooleetriga. Tahke jääk koguti filtrimisega ja seejärel kuivatati toatemperatuuril. Polüsahhariidid ekstraheeriti eeltöödeldud proovidest kolm korda veega 2 tundi, kontsentreeriti, sadestati veevaba etanooli lisamisega lõppkontsentratsioonini 80 (maht/maht) ja säilitati temperatuuril 4 °C 24 tundi. Sade koguti tsentrifuugimisega kiirusel 3000 p/min 20 minutit, lahustati destilleeritud vees ja puhastati (vabade valkude eemaldamine), kasutades Sevagi meetodit (Zhao et al., 2019). Eraldatud polüsahhariidid dialüüsiti, kuivatati ja säilitati kuni edasise kasutamiseni. Lisaks näitasid keemilise koostise tulemused, et CDP suhkru, uroonhappe, sulfaadi ja valgu üldsisaldus oli 67,63 ± 0,98%, 21,05 ± 0,49%, 1,90 ± 0,24% ja 8,81 ± 0,36%. CDP monosahhariidi koostis ja Fourier' teisenduse infrapunaanalüüs on näidatud täiendavatel joonistel 1 ja 2. 2.3. OVX-indutseeritud osteoporoosi hiiremudel Kõik loomkatsed kiitis heaks Guangzhou Hiina Meditsiini Ülikooli loomaeetikakomitee (kinnitatud SYXK 2019-0202). Kolmkümmend 6-nädalast emast C57BL/6 hiirt tarnisid Guangzhou Hiina meditsiini ülikooli katseloomade keskus. Pärast 1-nädalast aklimatiseerumist tehti ühele hiirte rühmale võltsoperatsioon (võltsrühm), ülejäänud hiirtele tehti munasarjaektoomia operatsioon (OVX rühm). Pärast operatsiooni lasti hiirtel 1-nädala jooksul taastuda. Seejärel jagati edukalt modelleeritud hiired juhuslikult 5 rühma, kus igas rühmas oli 6 hiirt: (1) võltsrühm: töödeldud destilleeritud veega, (2) OVX rühm: töödeldud destilleeritud veega, (3) OVX pluss E2 rühm (E2) : töödeldud 0,13 mg/kg östradioolvaleraadi tablettidega, (4) OVX pluss CDP madala doosi rühm (CDP-L): töödeldud 300 mg/kg CDP-ga, (5) OVX pluss CDP suure annuse rühm (CDP H): ravitud 600 mg/kg CDP-ga. Destilleeritud vett, E2 või CDP-d manustati sondiga üks kord päevas. Kõik hiired surmati pärast 12--nädalast raviperioodi (joonis 1A). Emakad koguti ja kaaluti ning vasak sääreluud koguti järgnevateks uuringuteks. Koguti täisvereproovid ja tsentrifuugiti kiirusel 5000 p/min 15 minutit temperatuuril 4 °C. Seerumi supernatandid aspireeriti ja säilitati kuni edasise analüüsini temperatuuril –80 ◦C. 2.4. Mikrokompuutertomograafia (mikro-CT) analüüs ja luu histomorfomeetria Vasak sääreluud fikseeriti 4-protsendilise paraformaldehüüdiga 48 tunniks ja asetati seejärel tavalist soolalahust sisaldavatesse tsentrifuugituubidesse. Fikseeritud proovid skaneeriti Skyscan 1172 mikro-CT instrumendiga (Bruker micro-CT, Skyscan, Kontich, Belgia), kasutades järgmisi seadistusi: pinge, 80 kV; lähtevool, 100 μA; Al, 0,5 mm filter; piksli suurus, 9,76 μm; ja pöörlemise samm, 0,6◦. Trabekulaarse luu mitmed parameetrid, sealhulgas luu mineraalne tihedus (BMD), luumahu fraktsioon (BV/TV), luu pind kogumahu kohta (BS/TV), trabekulaarne arv (Tb. N) ja trabekulaarne vahekaugus (Tb.Sp ) mõõdeti CT Analyser® tarkvaraga (Bruker micro-CT, Skyscan). Kolmemõõtmelised kujutised genereeriti tarkvara CTVol (Bruker micro-CT. Skyscan) abil. Pärast mikro-CT analüüsi eemaldati vasak sääreluu katlakivi 14-protsendilises EDTA lahuses ja sisestati lõikamiseks parafiini. Enne hematoksüliini ja eosiini (H&E) ja TRAcP värvimiskatseid lõigati proovid mikrotoomi abil 5 µm lõikudeks. Värvitud lõike uuriti ja dokumenteeriti Olympus CX 31 mikroskoobiga (Olympus Optical Co., Ltd, Tokyo, Jaapan). 2.5. Seerumi analüüs Kaltsiumi (Ca) ja fosfori (P) kontsentratsioonid määrati vastavalt komplekti juhistele, mille koostas Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute (Nanjing, Hiina). TRAcP-5b ja RANKL-i taset seerumis analüüsiti vastavalt TRAcP-5b ELISA komplekti (CUSABIO, Wuhan, Hiina) ja RANKL ELISA komplekti (Cloud-CloneCorp., Wuhan, Hiina) abil.

Kemikaalide ja proovide kogumise CD (nr 180801) osteti ettevõttelt Anhui Jishun Traditional Chinese Medicine Co., Ltd. (Anhui, Hiina) ja selle tuvastas professor Haibo Huang Ameerika Ühendriikide koolist. Farmaatsiateadused, Guangzhou Hiina Meditsiini Ülikool, Guangzhou, Hiina. Östradioolvaleraadi tabletid osteti firmalt Bayer (Leverkusen, Nordrhein-Westfalen, Saksamaa). Alfa-modifitseeritud minimaalne hädavajalik sööde (-MEM) ja veise loote seerum (FBS) saadi firmalt Gibco (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Penitsilliin / streptomütsiin ja TRAcP värvimiskomplekt saadi ettevõttest Solarbio (Peking, Hiina). Rekombinantse hiire M-CSF ja rekombinantse hiire RANKL hangiti ettevõttest R&D Systems (Minneapolis, MN, USA). Hüdroksüapatiidiga kaetud plaadid osteti ettevõttelt Corning Life Sciences (St. Lowell, MA, USA). NFATc1 ja CTSK primaarsed antikehad (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA); IκB-, p65, P-p65, p38, P-p38, ERK1/2, P-ERK1/2, JNK ja P-JNK (Cell Signaling Technology, Dan vers, MA, USA); ja -aktiini (CWBIO, Peking, Hiina) saadi ka. Teised selles uuringus kasutatud reaktiivid olid analüütilise kvaliteediga ja vesi puhastati Milli-Q veepuhastussüsteemiga (Millipore, Bedford, MA, USA). 2.2. CDP ekstraheerimine CD jahvatati peeneks pulbriks ja segati selle purustamiseks kolm korda petrooleetriga. Tahke jääk koguti filtrimisega ja seejärel kuivatati toatemperatuuril. Polüsahhariidid ekstraheeriti eeltöödeldud proovidest kolm korda veega 2 tundi, kontsentreeriti, sadestati veevaba etanooli lisamisega lõppkontsentratsioonini 8 0 mahuprotsenti ja säilitati temperatuuril 4 °C. 24 tunniks. Sade koguti tsentrifuugimisega kiirusel 3000 p/min 20 min, lahustati destilleeritud vees ja puhastati (vabade valkude eemaldamine), kasutades Sevag meetodit. (Zhao et al., 2019). Eraldatud polüsahhariidid dialüüsiti, kuivatati ja säilitati kuni edasise kasutamiseni. Lisaks näitasid keemilise koostise tulemused, et CDP suhkru, uroonhappe, sulfaadi ja valgu üldsisaldus oli 67,63 ± 0,98%, 21,05 ± 0,49%, 1,90 ± 0,24% ja 8,81 ± 0,36%. CDP monosahhariidi koostis ja Fourier' teisenduse infrapunaanalüüs on näidatud täiendavatel joonistel 1 ja 2. 2.3. OVX-indutseeritud osteoporoosi hiiremudel Kõik loomkatsed kiitis heaks Guangzhou Hiina Meditsiini Ülikooli loomaeetikakomitee (kinnitatud SYXK 2019-0202). Kolmkümmend 6-nädalast emast C57BL/6 hiirt tarnisid Guangzhou Hiina meditsiini ülikooli katseloomade keskus. Pärast 1-nädalast aklimatiseerumist tehti ühele hiirte rühmale võltsoperatsioon (võltsrühm), ülejäänud hiirtele tehti munasarjaektoomia operatsioon (OVX rühm). Pärast operatsiooni lasti hiirtel 1-nädala jooksul taastuda. Seejärel jagati edukalt modelleeritud hiired juhuslikult 5 rühma, kus igas rühmas oli 6 hiirt: (1) võltsrühm: töödeldud destilleeritud veega, (2) OVX rühm: töödeldud destilleeritud veega, (3) OVX pluss E2 rühm (E2) : töödeldud 0,13 mg/kg östradioolvaleraadi tablettidega, (4) OVX pluss CDP madala doosi rühm (CDP-L): töödeldud 300 mg/kg CDP-ga, (5) OVX pluss CDP suure annuse rühm (CDP H): ravitud 600 mg/kg CDP-ga. Destilleeritud vett, E2 või CDP-d manustati sondiga üks kord päevas. Kõik hiired surmati pärast 12--nädalast raviperioodi (joonis 1A). Emakad koguti ja kaaluti ning vasak sääreluud koguti järgnevateks uuringuteks. Koguti täisvereproovid ja tsentrifuugiti kiirusel 5000 p/min 15 minutit temperatuuril 4 °C. Seerumi supernatandid aspireeriti ja säilitati kuni edasise analüüsini temperatuuril –80 ◦C. 2.4. Mikrokompuutertomograafia (mikro-CT) analüüs ja luu histomorfomeetria Vasak sääreluud fikseeriti 4-protsendilise paraformaldehüüdiga 48 tunniks ja asetati seejärel tavalist soolalahust sisaldavatesse tsentrifuugituubidesse. Fikseeritud proovid skaneeriti Skyscan 1172 mikro-CT instrumendiga (Bruker micro-CT, Skyscan, Kontich, Belgia), kasutades järgmisi seadistusi: pinge, 80 kV; lähtevool, 100 μA; Al, 0,5 mm filter; piksli suurus, 9,76 μm; ja pöörlemise samm, 0,6◦. Trabekulaarse luu mitmed parameetrid, sealhulgas luu mineraalne tihedus (BMD), luumahu fraktsioon (BV/TV), luu pind kogumahu kohta (BS/TV), trabekulaarne arv (Tb. N) ja trabekulaarne vahekaugus (Tb. Sp. ) mõõdeti CT Analyser® tarkvaraga (Bruker micro-CT, Skyscan). Kolmemõõtmelised kujutised genereeriti tarkvara CTVol (Bruker micro-CT. Skyscan) abil. Pärast mikro-CT analüüsi eemaldati vasak sääreluu katlakivi 14-protsendilises EDTA lahuses ja sisestati lõikamiseks parafiini. Enne hematoksüliini ja eosiini (H&E) ja TRAcP värvimiskatseid lõigati proovid mikrotoomi abil 5 µm lõikudeks. Värvitud lõike uuriti ja dokumenteeriti Olympus CX 31 mikroskoobiga (Olympus Optical Co., Ltd, Tokyo, Jaapan). 2.5. Seerumi analüüs Kaltsiumi (Ca) ja fosfori (P) kontsentratsioonid määrati vastavalt Nanjingi koostatud komplekti juhistele.

Jianchengi bioinseneriinstituut (Nanjing, Hiina). TRAcP{{0}}b ja RANKL-i taset seerumis analüüsiti TRAcP-5b ELISA komplekti (CUSABIO, Wuhan, Hiina) ja RANKL ELISA komplekti (Cloud-CloneCorp., Wuhan, Hiina) abil. , vastavalt. 2.6. In vitro osteoklastogeneesi test BMM-id eraldati 6-nädala vanuste emaste C57BL/6 hiirte sääreluust ja reieluust. Eraldatud rakke kultiveeriti -MEM söötmes, mis sisaldas 25 ng/ml M-CSF-i, 10 protsenti FBS-i ja 1 protsenti penitsilliini/streptomütsiini. Konfluentsuse saavutamisel külvati BMM-id (1 × 104 rakku süvendi kohta) 96-süvendiga plaatidele ja töödeldi CDP-ga 50 ng/mL RANKL-i juuresolekul. Sööde ja CDP vahetati iga 2 päeva järel. 7 päeva pärast fikseeriti rakud 4% paraformaldehüüdiga ja värviti jälgede olemasolu tuvastamiseks. Osteoklastide arv, mis määratleti kolme või enama tuumaga TRAcP-positiivsete rakkudena, loendati ja dokumenteeriti valgusmikroskoobi abil. 2.7. Rakkude proliferatsiooni test BMM-id (1 × 104 rakku süvendi kohta) külvati 96-süvendiga plaadile ja inkubeeriti üleöö. Pärast seda töödeldi rakke 48 tundi CDP erinevate kontsentratsioonidega (0, 0,625, 1,25, 2,5, 5, 10, 20 ja 40 µg/ml). Rakkude liitumine tuvastati ja analüüsiti IncuCyte ZOOM® (Essen BioScience, Ann Arbor, MI, USA) abil, mis on pikaajaline reaalajas dünaamiline elusrakkude kuvamissüsteem. 2.8. Hüdroksüapatiidi resorptsiooni test BMM-id (1 × 104 rakku süvendi kohta) külvati hüdroksüapatiidiga kaetud plaadile, töödeldi CDP-ga näidatud kontsentratsioonides (0, 5 ja 10 µg/ml) ja kultiveeriti täielikus -MEM-is, mis sisaldas 25 ng/ml. ml M-CSF ja 50 ng/ml RANKL. 7 päeva pärast pesti rakke rakukomponentide eemaldamiseks 10% pleegituslahusega. Hüdroksüapatiidi resorptsioonipiirkondade kujutised jäädvustati IncuCyte ZOOM® abil ja analüüsiti ImageJ tarkvara abil (NIH, Bethesda, MD, USA) (Abramoff, Magelhaes ja Ram, 2003). 2.9. RNA eraldamine ja reaalajas pöördtranskriptsiooni-kvantitatiivne PCR (RT-qPCR) analüüs BMM-id (1 × 105 rakku süvendi kohta) külvati 6-süvendiga plaadile ja stimuleeriti RANKL-i ja M-CSF-iga CDP erinevates kontsentratsioonides (0, 5 ja 10 µg/ml) 5 päeva jooksul. Kogu RNA eraldati hiirte rakkudest või luukoest, kasutades TRIzol reagenti (Sigma Aldrich). Komplementaarne DNA sünteesiti 2 µg kogu RNA-st, kasutades pöördtranskriptaasi komplekti (TransGen Biotech, Peking, Hiina). RT-qPCR reaktsioonid valmistati, kasutades PerfectStart™ Green qPCR SuperMixi (TransGen Biotech) ja tuvastati ABI 7500 süsteemiga (Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA). PCR-i tsükliparameetrid määrati järgmiselt: 95 °C 5 minutiks, millele järgnes 40 tsüklit temperatuuril 95 °C 15 sekundit ja 60 °C 30 sekundit. Kasutatud spetsiifilised praimerid on näidatud tabelis 1 ja iga sihtgeeni kogus normaliseeriti GAPDH-le (sisekontroll).

2.10. Western blot analüüs BMM-id (5 × 105 rakku süvendi kohta) külvati 6-süvendiga plaadile. Lühiajaliste katsete jaoks eelinkubeeriti rakke 1 tund CDP erinevate kontsentratsioonidega (0, 5 ja 10 µg/mL) ning seejärel töödeldi neid 5{{ 58}} ng/mL RANKL 30 min. Pika aja jooksul stimuleeriti rakke 50 ng/ml RANKL-iga 3., 5. ja 7. päeval CDP juuresolekul (0, 5 ja 10 ug/ml). Kogu valgud ekstraheeriti RIPA lüüsipuhvriga (CWBIO). Valgud eraldati 10% SDS-PAGE abil ja kanti üle PVDF membraanidele. Membraanid blokeeriti 2 tundi toatemperatuuril 5% kooritud piimaga, inkubeeriti primaarsete antikehadega öö läbi temperatuuril 4 °C ja seejärel 1,5 tundi vastavate sekundaarsete antikehadega. Membraanid töötati välja ECL-reaktiividega (Millipore Corp., Billerica, MA, USA) ja pildid tehti Tanon 5200 Chemiluminescence Imaging Systemiga (Tanon Science and Technology, Shanghai, Hiina). 2.11. NFATc1 translokatsiooni tuvastamine immunofluorestsentstesti abil BMM-id külvati 12-kaevu katteklaasidele, stimuleeriti RANKL-i ja M-CSF-iga ning töödeldi 10 µg/ml CDP-ga 5 päeva. Rakud fikseeriti 4% paraformaldehüüdiga 15 minutit, pesti kolm korda PBS-iga ja permeabiliseeriti 0,1% Triton X-100-ga 10 minutit. Rakud segati 10% kitse seerumiga (CWBIO) ja inkubeeriti 2 tundi. Seejärel inkubeeriti rakke primaarse antikehaga üleöö temperatuuril 4 °C ja seejärel Alexa Fluor 488 kitse hiirevastase sekundaarse antikehaga (Abcam, Cambridge, MA, USA) pimedas 1 tund. Katteklaase pesti PBS-ga, paigaldati Prolong Gold Antifade Reagendisse koos 4′, 6-diamidino-2-fenüülindooliga (DAPI) (Solar) ja kontrolliti Zeiss LSM 800 abil Airyscani konfokaalse mikroskoobiga ( Carl Zeiss, Oberkochen, Saksamaa). 2.12. Statistiline analüüs Kõiki katseandmeid analüüsiti SPSS 25.0 statistilise tarkvara abil (IBM Corporation, Armonk, NY, USA). Loom- ja rakuuuringute andmed on väljendatud vastavalt keskmistena ± SEM ja keskmistena ± SD. Tulemused kasutavad ühesuunalist dispersioonanalüüsi või Studenti t-testi. Väärtused p < 0,05="" loeti="" statistiliselt="" oluliseks.="" 3.="" tulemused="" 3.1.="" cdp="" hoiab="" ära="" ovx-indutseeritud="" luukadu="" in="" vivo.="" kasutasime="" ovx-indutseeritud="" osteoporoosi="" hiiremudelit,="" et="" uurida="" cdp-ravi="" mõjusid="" osteoporoosile="" in="" vivo.="" võrreldes="" võltsrühmaga="" suurenes="" ovx="" hiirte="" kehakaal="" märkimisväärselt,="" samas="" kui="" emakaindeks="" vähenes,="" mis="" näitab,="" et="" osteoporoosi="" mudel="" oli="" edukalt="" konstrueeritud="" (joonised="" 1b="" ja="" d).="" sääreluu="" mikro-ct="" analüüs="" ovx="" rühmas="" näitas="" ulatuslikku="" luukadu.="" võrreldes="" ovx="" rühmaga="" suurenes="" luutrabeekulite="" arv="" cdp-l="" rühmas,="" samas="" kui="" cdp-h="" ja="" e2="" rühmas="" oli="" suurenemine="" olulisem="" ning="" kahes="" viimases="" rühmas="" muutusid="" trabeekulid="" jämedamaks="" ja="" vahe="" vähenes="" (="" joonis="" 1c).="" kvantitatiivne="" analüüs="" kinnitas,="" et="" mitmed="" luu="" histomorfomeetrilised="" parameetrid,="" sealhulgas="" bmd,="" bv/tv,="" bs/tv="" ja="" tb.="" n="" väärtused="" olid="" oluliselt="" suurenenud,="" samas="" kui="" tb.="" sp="" näitas="" cdp-h="" rühmas="" vähenenud="" väärtusi="" (joonis="" 1e="" ja="" f).="" tema="" patoloogiline="" uuring="" h&e="" värvimisega="" näitas,="" et="" luutrabeekulite="" arv="" cdp-h="" ja="" e2="" rühmades="" oli="" oluliselt="" suurem="" kui="" ovx="" rühmas,="" samas="" kui="" cdp-l="" rühmas="" ei="" toimunud="" olulist="" paranemist="" (joonis="" 1g).="" lisaks="" näitas="" tracp="" värvimine,="" et="" osteoklastide="" arv="" suurenes="" märgatavalt="" ovx="" rühmas,="" kuid="" vähenes="" cdp-h="" ja="" e2="" rühmades="" (joonis="" 1h).="" cdp-l,="" cdp-h="" ja="" e2="" rühmad="" inhibeerisid="" ovx-indutseeritud="" p="" sisalduse="" suurenemist,="" kuid="" suurendasid="" ca="" sisaldust="" vereseerumis.="" luu="" absorptsiooni="" markerid="" rankl="" ja="" tracp{84}}b="" näitasid="" cdp-l="">

rühmas ilma statistilise erinevuseta, samas kui need olid oluliselt vähenenud CDP-H rühmas (joonis 1I). Lisaks uurisime RT-qPCR abil CDP mõju osteoklastide markergeenide ekspressioonile luukudedes. NFATc1, Acp5, Mmp9 ja CTSK mRNA tasemed OVX rühmas olid oluliselt kõrgemad kui Sham rühmas. CDP-H rühmad vähendasid NFATc1, Acp5 ja CTSK mRNA taset OVX rühmaga võrreldes 1.{10}}, 1.70- ja 200- korda. (Joon. 1J). 3.2. CDP pärsib RANKL-i indutseeritud osteoklastogeneesi in vitro. Jälgime CDP-ga töödeldud BMM-ide rakkude proliferatsiooni, kasutades pikaajalist reaalajas dünaamilist elusrakkude pildianalüsaatorit. Võrreldes kontrollrühmaga, ei muutunud rakkude liitumine CDP-ga ravitud rühmades annusega<10 µg/ml,="" but="" was="" significantly="" reduced="" at="" the="" 20="" and="" 40="" µg/ml="" dosages="" (fig.="" 2a).="" to="" investigate="" the="" effect="" of="" cdp="" on="" ranklinduced="" osteoclastogenesis,="" bmms="" were="" stimulated="" with="" rankl="" and="" mcsf="" in="" the="" presence="" of="" cdp="" for="" 7="" days.="" tracp,="" a="" characteristic="" enzyme="" of="" osteoclasts,="" is="" considered="" as="" an="" indicator="" of="" osteoclast="" function="" (minkin,="" 1982).="" tracp="" staining="" showed="" that="" the="" osteoclasts="" treated="" with="">1,25 µg/ml CDP näitas oluliselt vähenenud suurust ja arvu (joonised 2B ja C). Need tulemused näitasid, et CDP inhibeeris tõhusalt eeldatavat RANKL-i poolt indutseeritud osteoklastogeneesi, mõjutamata rakkude elujõulisust. 3.3. CDP inhibeerib RANKL-i indutseeritud osteoklastilise resorptsiooni aktiivsust ja osteoklastide spetsiifilist geeniekspressiooni. Lisaks määrasime hüdroksüapatiidiga kaetud plaatide abil CDP-ravi mõju osteoklastide luu resorptsiooni aktiivsusele. Luu resorptsioon on osteoklastide aktiivsuse ja võime mõõtmise põhifunktsioon ja standard (Novack & Faccio, 2011). Tulemused näitasid, et CDP võib annusest sõltuval viisil oluliselt vähendada osteoklastide luu resorptsiooniala, mis näitab, et CDP inhibeeris RANKL-i poolt indutseeritud luu resorptsiooni aktiivsust (joonised 3A ja B). Täpsemalt vähenes osteoklastiliste luude resorptiivne ala pärast ravi 10 µg/ml CDP-ga ligikaudu 6,3 protsendini. CDP osteoklastogeneesi takistuse paremaks väljaselgitamiseks mõõtsime osteoklastidega seotud geenide transkriptsioonitasemeid. Ilma CDP-ga töötlemiseta soodustas induktsioon RANKL-iga NFATc1, CTSK, Acp5, Atp6v0d2 ja Mmp9 geenide ekspressiooni. Vastupidi, CDP ja RANKL-i samaaegne kasutamine vähendas nende viie geeni märkimisväärselt (joonis 3C ja D).

3.4. CDP pärsib RANKL-i indutseeritud NFATc1 aktivatsiooni TRAcP värvimine näitas, et CDP-ravi vähendas oluliselt küpsete osteoklastide arvu eeldatavat suurenemist pärast RANKL-i stimuleerimist 3–7 päeva jooksul (joonis 4A ja B). Lisaks uurisime, kas CDP-ravi võib tõhusalt kahjustada osteoklastide diferentseerumist, inhibeerides NFATc1 ekspressiooni. Tulemused näitasid, et NFATc1 ekspresseeriti kõrgelt pärast RANKL-i stimuleerimist 5 päeva jooksul, mis inhibeeriti oluliselt pärast CDP-ravi (joonised 4C ja D). Lisaks pärssis CDP-ravi CTSK ekspressioonitasemeid, mis on normaalseks osteoklastide moodustumiseks ja funktsioneerimiseks vajalik valk (Bossard et al., 1996) (joonised 4E ja F). Valisime RANKL-i stimulatsiooni ajakohase esituse 5 päeva jooksul, et täiendavalt uurida 10 µg / ml CDP-ravi mõju NFATc1 translokatsioonile. Nagu oodatud, inhibeeris CDP-ravi märkimisväärselt RANKL-i indutseeritud NFATc1 tuuma translokatsiooni (joonised 4G ja H).

Joonis 4. CDP pärsib RANKL-indutseeritud NFATc1 aktivatsiooni. (A) BMM-id külvati 6-süvendiga plaadile ja stimuleeriti RANKL-i ja M-CSF-iga CDP (0, 5 ja 10 µg/mL) juuresolekul. märgitud päevad. Tüüpilised pildid, mis näitavad TRAcP-positiivseid mitmetuumalisi rakke. Suurendus, ×100. Skaalaribad {{10}} μm. (B) TRAcP-positiivsete mitmetuumaliste rakkude kvantifitseerimine (tuumad 3 või suuremad). (CF) NFATc1 ja CTSK valgu ekspressioonide Western blot analüüs BMM-ides, mida stimuleeriti M CSF ja RANKL-iga 3–7 päeva CDP juuresolekul. (G) BMM-e töödeldi 10 ug/ml CDP-ga ja stimuleeriti M-CSF-i ja RANKL-iga 5 päeva, seejärel immunovärviti NFATc1 (roheline) ja DAPI-ga (sinine) ning jälgiti konfokaalse mikroskoobiga. Suurendus, ×200. Skaalaribad=20 μm. (H) Fluorestsentsi intensiivsust analüüsiti Image-Pro Plus abil. Väärtused on väljendatud keskmistena ± SD (n=3). *p < 0,05,="" **p="">< 0,01,="" ***p="">< 0,001="" vs="" kontrollrühm;="" #p="">< 0,05,="" ##p="">< 0,01,="" ###p="">< 0,001="" vs="" rankl="" grupp.="" 3.5.="" cdp="" inhibeerib="" rankl-i="" poolt="" indutseeritud="" nf-κb="" ja="" mapk-de="" signaaliradade="" aktivatsiooni="" cdp-indutseeritud="" osteoklastide="" diferentseerumise="" inhibeerimisega="" seotud="" mehhanismide="" selgitamiseks="" uurisime="" cdp-ravi="" mõju="" nf-κb="" ja="" mapk-de="" radadele.="" tulemused="" näitasid,="" et="" cdp-ravil="" oli="" annusest="" sõltuval="" viisil="" pärssiv="" toime="" ikb="" degradatsioonile="" ja="" p65="" fosforüülimisele="" (joonised="" 5a="" ja="" b).="" kolme="" mapk="" pereliikme,="" täpsemalt="" rakuvälise="" signaaliga="" reguleeritud="" kinaasi="" (erk),="" c-jun="" n-terminaalse="" kinaasi="" (jnk)="" ja="" p38="" fosforüülimine="" oli="">

Arutelu

Osteoporoos on tavaline ja degeneratiivne luuhaigus. Praegu kasutatakse osteoporoosi kliinilises ravis palju keemilise sünteesi ravimeid, näiteks östrogeene ja bisfosfonaate. Kuid nende ravimite pikaajaline kasutamine nõrgestab järk-järgult kliinilist efektiivsust ja põhjustab isegi palju tõsiseid kõrvaltoimeid, sealhulgas suurenenud risk haigestuda munasarja-, rinna- ja endomeetriumivähki ning lõualuu osteonekroosi (Beral, 2003 Khan et al., 2009; Lacey jt, 2002). Selles uuringus valisime raviaineks CDP, mis on CD-st ekstraheeritud tõhus komponent, ja näitasime, et CDP-l oli OVX hiirtel luukoe hõrenemise vastu kaitsev toime ja see inhibeeris RANKL-i poolt indutseeritud osteoklastide moodustumist ja funktsiooni. Samal ajal on traditsioonilise hiina meditsiini teooria "neeru reguleeriv luu" kohaselt luukadu seostatud neerupuudulikkusega. Neere toniseeriva ravitoiduna on CD osutunud tõhusaks osteoporoosi raviks (Fan et al., 2019; Jiang, Wang, Li ja Zhang, 2016). Seega on sellest looduslikust ürdist ekstraheeritud CDP parem ja ohutum ravim. Praegu on OVX hiiremudel naiste menopausijärgse luuhõrenemise klassikaline mudel, mis uurib luuhõrenemise põhjuseid ja viib läbi sekkumist (Wehrle et al., 2015). Sellest lähtuvalt teostasime C57BL / 6J emastel hiirtel kahepoolse ooforektoomia, et luua osteoporoosi mudel. Varasemates uuringutes olid loomadele antud CDP annused 50–200 mg/kg (madal annus) ja 1800 mg/kg (suur annus) (Guo et al., 2016; Zhang et al., 2018). Siin oli CDP suur annus hiirtel 600 mg/kg, mis põhines suurel kliinilisel annusel 30 g CD keetmises; seega on see sarnane praeguse kliinilise praktikaga. Selles uuringus pärssis ravi CDP-ga märkimisväärselt OVX-i indutseeritud kehakaalu tõusu, mis on OVX-hiirtel tavaline nähtus (Davis et al., 2019). Kasutades mikro-CT-skaneerimist ja 3D-rekonstrueerimist, leidsime, et OVX tõi kaasa BMD, BV/TV, BS/TV ja Tb.N märgatava vähenemise ning Tb.Sp suurenemise, samas kui CDP-ravi muutis kõik need muutused tagasi. . Eelkõige võib CDP võrreldes positiivse ravimiga oluliselt parandada OVX hiirte BMD-d, mis on oluline luu kvaliteedi marker ja mida kasutatakse osteoporoosi astme kajastamiseks (Fuggle et al., 2019), mis näitab, et CDP-l on eelis võrreldes positiivse ravimiga LMT parandamisel. Lisaks näitasid histoloogilised tulemused, et CDP-ravi võib vähendada OVX-i poolt indutseeritud TRAcP-positiivsete osteoklastide suurenenud hulka. Need tulemused viitavad sellele, et CDP manustamine leevendas tõhusalt luukadu OVX-indutseeritud osteoporoosi korral, võib-olla inhibeerides osteoklastide moodustumist. Kooskõlas ülaltoodud tulemustega leidsime, et CDP inhibeeris annusest sõltuvalt RANKL-i indutseeritud osteoklastide moodustumist ja funktsiooni, samas kui CDP-l oli meie in vitro katsetes vähe mõju M-CSF-i poolt indutseeritud osteoklastide prekursorrakkude proliferatsioonile. RANKL-i ja RANK-i sidumine võib viia TRAF6 värbamiseni ja sellele järgneva mitme allavoolu signaaliradade, näiteks NF-κB ja MAPK-de aktiveerimiseni (Boyle et al., 2003; Huang et al., 2006). NF-κB signaalirada mängib olulist rolli osteoklastide diferentseerumise reguleerimisel ja selles rajas olulisi valke kodeerivate geenide vaigistamine võib viia ebanormaalse luu arenguni (Leibbrandt & Penninger, 2008). On hästi teada, et NF-κB esineb stimuleerimata rakkude tsütoplasmas kompleksis IκB-ga, kuid siseneb kiiresti tuumasse pärast RANKL-i stimuleerimist (Boyle et al., 2003). Vabanenud IκB laguneb seejärel kiiresti, samas kui NF-κB aktiveerib spetsiifilise geeni transkriptsiooni, soodustades järelikult osteoklastide diferentseerumist, küpsemist ja apoptoosi (Abdelmagid et al., 2015). Selles uuringus näitasid tulemused, et CDP-ravi pärssis RANKL-i indutseeritud NF-KB signaaliraja aktivatsiooni, mida näitas IKB lagunemise ja p65 fosforüülimise pärssimine annusest sõltuval viisil, mis võib hõlmata selle osteoklastogeenset toimet. . Lisaks on MAPK-de signaalirada, sealhulgas ERK, JNK ja p38, tihedalt seotud RANKL-i indutseeritud osteoklastogeneesiga (Li et al., 2002). Lisaks võivad p38 ja JNK domineerivad inhibiitorid takistada RANKL-i indutseeritud osteoklastogeneesi (Chang et al., 2008; Kim et al., 2019), samas kui ERK-l on oluline roll osteoklastide ellujäämises (Miyazaki et al., 2000). On hästi teada, et RANKL aktiveerib MAPK signaaliülekanderaja, suurendades ERK, JNK ja p38 fosforüülimist (Mizukami et al., 2002). Oma uuringus näitasime, et CDP pärssis MAPK-de signaaliraja võtmevalkude RANKL-i poolt indutseeritud fosforüülimist. Kokkuvõttes näitavad need tulemused, et NF-κB ja MAPK signaaliradade aktiveerimise inhibeerimine aitab kaasa CDP inhibeerivale toimele osteoklastogeneesi vastu. NF-κB ja MAPK-de signaaliradade aktiveerimine soodustab mitme peamise transkriptsioonifaktori, nagu raku onkogeeni fos, aktivaatorvalk 1 ja NFATc1, ekspressiooni (Huang et al., 2006; Wagner & Matsuo, 2003). NFATc1, NFAT perekonna oluline liige, osaleb terminaalses osteoklastide diferentseerumises transkriptsiooni pearegulaatorina (Asagiri et al., 2005). On teatatud, et NFATc1- puudulikkusega embrüonaalsed tüvirakud ei saa RANKL-i stimuleerimisel diferentseeruda osteoklastideks ja NFATc1 ektoopiline ekspressioon põhjustab prekursorrakkude diferentseerumist, möödudes RANKL-i signaalimisest, mis viitab sellele, et NFATc1-l on oluline roll osteoklastide diferentseerumine (Takayanagi et al., 2002). Meie uuringu tulemused näitasid CDP pärssivat toimet NFATc1 ekspressioonile ja sellele järgnevale valgule CTSK. Huvitaval kombel täheldasime, et NFATc1 valgu ekspressioonitase esmalt tõusis ja seejärel langes, saavutades kõrgeima taseme 5. päeval pärast RANKL-i stimuleerimist. See oli kooskõlas Baeki jt tulemustega. (2014), kes täheldas, et M-CSF indutseeris NFATc1 lagunemist hilises staadiumis osteoklastogeneesis Cbl-indutseeritud NFATc1 ubikvitineerimise kaudu Src kinaasist sõltuval viisil. Immunofluorestsentsanalüüsi tulemused toetasid järjekindlalt CDP inhibeerivat toimet NFATc1 transkriptsioonilisele aktiveerimisele. Peale selle, osteoklastispetsiifilisi geene, sealhulgas CTSK, Acp5, Mmp9 ja Atp6v0d2, reguleerib NFATc1 otse (Y. Kim et al., 2005), CDP surus alla. Need leiud näitavad, et NFATc1 on CDP inhibeeriva toime sihtmärk NF-KB ja MAPK signaaliradadele.

Järeldus

Kokkuvõttes ekstraheerisime ja puhastasime CD-st aktiivse polüsahhariidi ning näitasime, et CDP-l oli kaitsev toime OVX-i poolt indutseeritud osteoporoosile ja leevendas luukadu, represseerides osteoklastide aktiivsust ja funktsiooni. Lisaks võib CDP pärssida RANKL-i indutseeritud osteoklastide diferentseerumist ja funktsiooni, häirides NF-KB ja MAPK signaaliülekande radu ning mõjutades järelikult allavoolu NFATc1 aktivatsiooni. Kokkuvõtteks võib öelda, et meie leiud loovad aluse CDP laiendamiseks ja rakendamiseks osteoporoosi ravis.

See artikkel pärineb sisuloenditest, mis on saadaval ajakirja ScienceDirect Journal of Functional Foods kodulehel: www.elsevier.com/locate/jff