Bifavooni kui uudse mööduva retseptori potentsiaali vanilloid-4-sõltuvate aterogeensete protsesside inhibiitori identifitseerimine ja funktsionaalne analüüs

Palun võtke ühendustoscar.xiao@wecistanche.comrohkem teada saada

Mazen O.Alharbi, Bidisha Dutta, RishovGoswami, Shweta Sharma, Kaye. Lei &Shaik O. Rahaman

Ateroskleroos, suurte arterite progresseeruv põletikuline haigus, on südame-veresoonkonna haigustega seotud suremuse ja haigestumuse suurenemise peamine põhjus kogu maailmas1. Peamine ateroskleroosi põhjustav sündmus hõlmab modifitseeritud madala tihedusega lipoproteiini (oxLDL) osakeste peetust subendoteliaalses aordis, peamiselt arterite harupunktides2. Varase aterogeneesi ajal, pärast endoteeli düsfunktsiooni, liiguvad tsirkuleerivad veremonotsüüdid intima piirkondadesse ja diferentseeruvad koe makrofaagideks3. Aordi siseruumides loob oxLDL-i seondumine ja omastamine makrofaagide poolt, mida toetavad püüdurretseptorid, nagu SRA ja CD36, edasisuunalise atero-põletikulise ahela, mille tulemuseks on lipiididega koormatud vahtrakkude teke, mis on ateroskleroosi kriitiline protsess 2–8. Vahtrakkude poolt esile kutsutud põletikuliste sündmuste kaskaadid põhjustavad varajase rasvkoe moodustumist ja lõpuks kaugelearenenud ateroskleroosi kahjustuste ilmnemist, mida iseloomustab kiulise korgi, lupjunud koe, immuunrakkude, maatriksvalkude ja lipiidide esinemine2–10. TRPV alamperekonna transientne retseptori potentsiaal vanilloid 4 (TRPV4), mitteselektiivne polümodaalne katioonikanal, mis on läbilaskev Ca2 plussile, ekspresseerub kõikjal erinevates rakutüüpides, sealhulgas makrofaagides 11–24. Varem osmosensorina tuntud TRPV4 reageerib nüüd teadaolevalt mitmesugustele biokeemilistele ja biomehaanilistele stiimulitele, sealhulgas kuumusele, maatriksi jäikusele, osmolaarsusele, kasvufaktoritele, pH-le ja 4 forboolestrit 11–24. Väidetavalt vahendab TRPV4 mitmeid füsioloogilisi funktsioone, nagu valutunne põletiku ja neuropaatiate korral 18, 22, 23, müofibroblastide diferentseerumine ja migratsioon 17, 25, 26 ning osteoklastide diferentseerumine luus27. TRPV4 mutatsioone on seostatud mitme kanalopaatiaga 28–31. Meie rühma ja teiste hiljutised uuringud on seostanud selle kanali võimalikku rolli paljudes patoloogilistes seisundites, nagu kopsuvigastused 22, 32, vahurakkude moodustumine 14, 16, kudede fbroos 17, 33, võõrkeha reaktsioon13 ja vähk34, 35. Varem näidati TRPV4 ateroprotektiivset rolli, milles keemiliste agonistide poolt indutseeritud TRPV4 funktsioon endoteelirakkudes oli seotud eNOS-i aktiveerimise ja monotsüütide adhesiooni pärssimisega endoteelirakkudega36. Seevastu TRPV4 funktsioonide puudujääke on seostatud paljude ateropõletikuliste vastustega, sealhulgas endoteeli düsfunktsiooniga, makrofaagide vahtrakkude tekke vähenemisega ja veresoonte haigustega 14, 16, 37–39. Meie labor on hiljuti tuvastanud TRPV4 proaterogeense rolli, mille abil see reguleerib oxLDL-indutseeritud makrofaagide vahtrakkude moodustumist. Mehhaaniliselt näitasime, et TRPV4 mõjutab oxLDL-i omastamist, kuid mitte seondumist makrofaagides CD{55}}sõltumatult14. Teises uuringus teatasime TRPV{57}}sõltuvast oxLDL-indutseeritud vahtrakkude moodustumise ägenemisest lipopolüsahhariidi juuresolekul ja maatriksi jäikuse suurenemisel, luues seega seose mehhaniseerimise ja ateroskleroosi riski vahel16. Kokkuvõttes näitavad need leiud, et TRPV4 on atraktiivne sihtmärk ateroskleroosi ja muude haiguste korral, stimuleerides seega TRPV4 väikeste molekulidega inhibiitorite avastamist, mida saab muuta kliiniliselt tõhusateks ravimiteks. Looduslike ühendite kasutamine terapeutilistes ravimites on muutunud olulisemaks, mis on peamiselt tingitud vajadusest kuluefektiivsete ja bioühilduvate ühendite järele, võrreldes praegu olemasolevate sünteetiliste ravimitega. Looduslikud ühendid naguflavonoidid, alkaloidid,polüfenoolid, ja kurkuminoidid, mõjutavad südame-veresoonkonna haigusi erinevate mehhanismide kaudu, nagu näiteks pärssiminepõletikku soodustavsignaalid, insuliini sensibiliseerimine ja vere lipiidide profiilide parandamine, suunates AMPK, COX1/2, eNOS ja Nrf2 radu 40–45. Hiljutised uuringud mitmete rühmade poolt on tuvastanud kaks flavonoidi, berberiini ja apigeniini, potentsiaalsete TRPV4 aktiivsuse modulaatoritena46,47. Oleme välja töötanud ja kasutanud poolkõrge läbilaskevõimega sõelumismeetodit TRPV4 potentsiaalsete antagonistide tuvastamiseks looduslike ühendite raamatukogust, kasutades fluoromeetrilise pildiplaadi lugeja (FLIPR) põhinevat Ca2 pluss sissevoolu analüüsi. Siin kirjeldame flavooni Linkedini kui TRPV4-sõltuvate aterogeensete protsesside uudse inhibiitori makrofaagides identifitseerimist ja funktsionaalset analüüsi, pannes sellega aluse edasistele uuringutele selle loodusliku ühendi kui loodusliku ateroskleroosivastase väikese aine kohta. molekuli ühend. Linkedinil on teadaolevalt neuroprotektiivne,kantserogeennejapõletikuvastanerollid48,49. Teatame Linkedini toimemehhanismist TRPV4 vastu makrofaagide vahtrakkude moodustumise taustal, kasutades arvukaid biokeemilisi ja rakulisi analüüse.

Lisateabe saamiseks klõpsake siin

Materjalid ja meetodid Looma- ja rakukultuur

Ostsime kongeensed C57BL / 6 metsiktüüpi (WT) hiired ettevõttest Charles River Laboratories (Wilmington, Massachusetts, USA). Kõikide loomkatsete puhul järgiti Marylandi ülikooli loomade hooldamise ja kasutamise komitee juhiseid ja autorid järgisid ARRIVE juhiseid. Tioglükolaadist indutseeritud hiire residentmakrofaagide (MRM) eraldamiseks koguti pärast 4-päevast intraperitoneaalset tioglükolaadi süstimist kõhukelme loputus ja rakke hoiti 10-protsendilises veise loote seerumis (FBS), mis sisaldas DMEM7, 14, 16. Hiire makrofaagide rakuliin (RAW264.7) ja inimese dermaalsed fibroblastid (HDF) osteti ettevõttest ATCC (Manassas, VA) ja neid kultiveeriti vastavalt DMEM või MEM (Gibco, Waltham, MA). Hiire luuüdist pärinevad makrofaagid (BMDM-id) koguti 6- kuni 7-nädalastelt hiirtelt, nagu eelnevalt kirjeldatud14,50,51. Lühidalt, WT ja TRPV4 KO hiirte reieluud koguti ja reieluu luuüdi loputati täieliku DMEM söötmega, mis sisaldas 10 protsenti FBS-i. Suspendeeritud luuüdi rakud filtriti läbi 70 µm kurna (BD bioscience), tsentrifuugiti ja hoiti DMEM söötmes, millele oli lisatud M-CSF (25 ng/mL) 7–8 päeva temperatuuril 37 kraadi, et võimaldada diferentseerumist makrofaagideks.

Reaktiivid

Linkedin ja GSK1016790A (GSK101) osteti firmalt Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) ja FLIPR Calcium 6 testikomplekt saadi firmalt Molecular Device (Sunnyvale, CA). Inimese loomulik LDL (VLDL) osteti ettevõttest Stemcell Technologies (Vancouver, Kanada). Vase oksüdeeritud LDL (oxLDL)7, 14, 16 valmistamiseks inkubeerisime LDL-i 5 µM CuSO4-ga 12 tundi 37 kraadi juures. Fluorestsentsvärviga märgistatud DiI-oxLDL osteti ettevõttest Invitrogen (Carlsbad, CA) ja MCSF ettevõttest R&D (Minneapolis, MN). FACS-analüüsi antikehad olid: TRPV4 (Millipore; Burlington, MA), CD36 (R&D; Minneapolis, MN), TLR4 ja TLR6 (Novus Biologicals; Centennial, CO). PE-konjugeeritud sekundaarsed antikehad pärinesid teadus- ja arendustegevusest (Minneapolis, MN) ja PE-konjugeeritud isotüübi kontrollid BD-st (Franklin Lake, NJ). Kvantitatiivse polümeraasi ahelreaktsiooni (qRT-PCR) jaoks kasutasime QIAGENi (Redwood City, CA) RNeasy komplekti. Kõik praimerid osteti ettevõttest Bio-Rad (Hercules, CA). Rakukultuurisöötmed, rakukultuuriga seotud tooted ja Western blot reaktiivid saadi firmast Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA).

Cistanche väsimuse vastu

Poolkõrge läbilaskevõimega sõelumine

Tegime Trpv4 antagonistide poolkõrge läbilaskevõimega sõelumise 2000 loodusliku ühendi raamatukogust (MSSP-2000, Johns Hopkins Chemcore), kasutades fluoromeetrilise kujutise plaadilugeja (FLIPR) põhinevat kaltsiumi sissevoolu analüüsi14,17. Me tuvastasime ginkgetiini (GGT) kui uudset TRPV4 antagonisti. Esmane ja sekundaarne sõeluuring viidi läbi RAW264.7, HDF ja BMDM-idega, et hinnata Linkedini ja teiste kandidaatide võimet inhibeerida TRPV{10}}inhibeeritud Ca2 pluss sissevoolu14,17. Kontrollidena kasutasime A23187, kaltsiumionofoori, TRPV4 null BMDM-e ja GSK219, selektiivset TRPV4 antagonisti17. Pärast sekundaarset sõeluuringut tuvastasime kuus ühendit, mis inhibeerivad enam kui kolmekordset TRPV{19}}vahendatud Ca2 pluss sissevoolu võrreldes vehiikuli kontrolliga. Linkediin tuvastati kui kõige tugevam TRPV4 aktiivsuse inhibiitor. BMDM-id (5 × 104 rakku süvendi kohta) külvati kollageeniga kaetud (10 µg/ml) 96-kaevu läbipaistva põhjaga mustadele plaatidele ja inkubeeriti 37 kraadi juures 5% CO2 atmosfääris. Katse päeval laaditi rakud kaltsium-6 värvainega HBSS-s, 20 mM HEPES-s, 2,5 mM probenetsiidis ja inkubeeriti 45 minutit 37 kraadi juures. Pärast inkubeerimist lisati igasse süvendisse raamatukogu ühendeid lõppkontsentratsioonini 2 uM. Plaate inkubeeriti veel 45 minutit 37 kraadi juures. Ca2 pluss sissevool kutsuti esile 10 nM TRPV4 agonisti GSK1016790A lisamisega vehiikuliga või ühendiga eeltöödeldud rakkudesse ja registreeriti ΔF / F (Max-Min) mõõtmisega, nagu eelnevalt kirjeldatud17. Andmed on näidatud suhteliste fluorestsentsühikutena (RFU).

Immunoblotid

Tioglükolaadiga esile kutsutud peritoneaalsed makrofaagid külvati 10% FBS-i, mis sisaldas DMEM-i, ja inkubeeriti üleöö. Kleepumata rakud pesti ja 1% veise seerumi albumiini (BSA), mis sisaldas DMEM-i, lisati plaadile ja inkubeeriti 3 tundi enne Linkedin-ravi. CD36, TRPV4, TLR2, TLR4, TLR6 ja GAPDH valkude ekspressiooni määramiseks valmistati täisrakulüsaadid rakkudest, mida töödeldi üle öö Linkediiniga (1 ja 5 uM) või vehiikuliga oxLDL (25 µg/ml) juuresolekul või puudumisel. ). LPS-ga vallandatud p-JNK ja JNK ekspressioonitasemete määramiseks töödeldi rakke 3 tundi Linkediiniga (5 ja 10 uM) ja seejärel stimuleeriti E. coli LPS-ga 30 minutit. Terve raku lüsaadid valmistati kaks korda pestud rakkudest (jääkülm PBS), kasutades RIPA puhvrit, millele oli lisatud proteaasi inhibiitori kokteili (Thermo Scientific, MA). Blotte sondeeriti küüliku anti-TRPV4 (Alomone Lab, Jeruusalemm, Iisrael), hiirevastase CD36 (R&D, Minneapolis, MN), küüliku anti-TLR4, küüliku anti-TLR6, küüliku anti-JNK ja küüliku anti-p-ga. JNK primaarsed antikehad (Cell Signaling, Danvers, MA), millele järgnesid küüliku- ja hiirevastased HRP-ga konjugeeritud sekundaarsed antikehad (R&D, Minneapolis, MN). Blotid eemaldati ja sondeeriti uuesti GAPDH-vastase IgG-ga (1:2000; Santa Cruz, Dallas, TX) laadimise kontrollimiseks.

Vahtrakkude moodustumine.Tioglükolaadiga vallandatud MRM külvati 12-augulisele plaadile DMEM-i, 10% FBS-iga klaasist katteklaasidele ja inkubeeriti 37 kraadi juures 5% CO2 juures 2 tundi. Rakkudele lisati GGT (1 või 10 uM) ja pärast 3-tunnist inkubeerimist lisati oxLDL (50 ug/ml) ja kultuure inkubeeriti üleöö temperatuuril 37 °C. Natiivne LDL (50 ug/ml) lisati kontrollrühma süvenditesse ja inkubeeriti üleöö. Rakud fikseeriti 4-protsendilises paraformaldehüüdis, millele järgnes Oil Red O värvimine, et kvantifitseerida vahtrakkude teket.

Adenoviiruse vektori transduktsioon.Kogusime Ad(RGD)-hiire TRPV4 (Ade-TRPV4; ~1010 pfu/ml) ja adenoviiruse tühja vektori Ad(RGD)-CMV-null (Ade-Vec; 1011 pfu/ml) ekspresseerimiseks adenoviiruse konstrukte. Vector Biolabs, Malvern, PA. Kõigi katsete jaoks kasutasime 1 × 108 pfu / ml. Vahtrakkude genereerimise uuringute jaoks inkubeeriti hiire kõhukelme makrofaage Ade-TRPV4 või Ade-Vec-iga DMEM-söötmes 72 tundi enne oxLDL-i lisamist, et tekitada makrofaagide vahtrakke.

Ox-LDL sidumine ja omastamine.Seondumise hindamiseks töödeldi kõhukelme makrofaage kahe annuse (1 või 10 uM) Linkedini või vehiikuliga 3 tundi ja inkubeeriti DiI-oxLDL-ga 4 kraadi juures üks tund. Pärast eeltöötlemist Linkedini või vehiikuliga inkubeeriti rakke omastamise hindamiseks DiI-oxLDL-ga 37 kraadi juures 30 minutit. Pildid jäädvustati fluorestsentsmikroskoopiaga (63x) ja tulemuste kvantifitseerimiseks kasutati kujutist J.

Voolutsütomeetria analüüs.Tioglükolaadiga esile kutsutud kõhukelme makrofaage kultiveeriti DMEM-is, 10% FBS-is 24 tundi. Kleepumata rakud pesti maha, lisati seerumivaba sööde ja rakke inkubeeriti 2 tundi, millele järgnes 5 uM GGT või vehiikuli lisamine ning inkubeerimist jätkati 3 tundi. Töödeldud rakud kaabiti plaadilt maha ja resuspendeeriti 2% BSA-s PBS-s. Rakke inkubeeriti primaarsete antikehadega 45 minutit, millele järgnes 30-minutiline inkubeerimine PE-konjugeeritud sekundaarse antikehaga. Andmete kogumiseks kasutati FACSCantoII voolutsütomeetrit (BD Bioscience, Ontario, Kanada). Kõiki andmeid töödeldi FlowJo tarkvara abil.

qRT-PCR.Tioglükolaadiga indutseeritud makrofaage töödeldi 5 uM Linkedini või vehiikuliga 3 tundi; Vehiikulile või Linkediiniga töödeldud rakkudele lisati 25 µg/ml oxLDL-i ja inkubeerimist jätkati üleöö. Kogu RNA ekstraheerimiseks kasutati QIAGEN'i RNeasy Micro Kit (#74 004) ja RNA pöördtranskribeerimiseks kasutati Universal SYBR Green One-Step Kit firmalt Bio-Rad. Andmete hankimiseks kasutati C1000 Touch Thermal Cyclerit (Bio-Rad). Geeni ekspressioon määrati geenispetsiifilise mRNA kogusena GAPDH mRNA suhtes, kasutades võrdlevat CT meetodit, mida on kirjeldatud Bio-Rad qRT-PCR süsteemi kasutajabülletäänis.

Statistiline analüüs.Andmed on esitatud kui bioloogiliste kolmekordiste keskmine ± SEM. Kasutati GraphPad Prism 7.{1}} tarkvara ja arvutused viidi läbi Studenti t-testi abil kahe rühma jaoks või ühesuunalise ANOVA abil mitme rühma jaoks.

Eetiline heakskiit.Kõik katsed hiirtega viidi läbi vastavalt institutsionaalse loomade hooldamise ja kasutamise komitee (IACUC) juhistele ja need kiideti heaks Marylandi ülikooli kolledži pargi ülevaatekomitee poolt.

Tulemused in Semi high‑throughput screening for antagonists of TRPV4 from a library of natural compounds using a FLIPR‑based Ca2+ influx assay. A library containing a collection of structurally and functionally known natural compounds was screened using a semi high-throughput FLIPR-based Ca2+ influx assay (Fig. 1A) to investigate the modulatory effect of these compounds on TRPV4-elicited Ca2+ influx. Initial screening performed with 2000 compounds on primary human dermal fibroblasts and RAW264.7 cells identified 76 lead compounds that significantly (≥threefold) inhibited GSK101-induced (a TRPV4 specific agonist) Ca2+ influx. We performed a secondary screening of the lead compounds using the same assay on RAW 264.7 cells. We further verified and selected 6 compounds that produced reproducible and significant (>kolmekordne; lk<0.001) inhibition="" of="" trpv4-elicited="" ca2+="" influx="" in="" bmdms="" as="" compared="" to="" the="" vehicle="" control="" (fig.="" 1b).="" our="" screening="" assay="" proved="" to="" be="" a="" high="" confidence="" assay="" for="" detecting="" small="" molecule="" compounds="" with="" trpv4="" inhibitory="" effects="" as="" reflected="" by="" a="" good="" z="" factor="" value="" (0.703).="" we="" have="" used="" a23187="" (a23),="" a="" calcium="" ionophore,="" as="" the="" positive="" control,="" and="" gsk2193874="" (gsk219),="" a="" selective="" small-molecule="" chemical="" inhibitor="" of="" trpv4,="" as="" the="" negative="" control14–17.="" linkedin="" (ggt)="" was="" identified="" as="" one="" of="" the="" most="" potent="" inhibitors="" of="" trpv4="" in="" the="" screening.="" since="" previously="" published="" reports="" showed="" that="" ggt="" has="" an="" anti-inflammatory="" and="" anti-adipogenic="" effect,="" we="" selected="" ggt="" for="" further="" functional="" analysis="" on="" trpv4-dependent="" macrophage="" proatherogenic="">

Joonis 1. Poolkõrge läbilaskevõimega sõeluuringul põhinev Linkedini kui uudse TRPV4 inhibiitori tuvastamine looduslike ühendite raamatukogust. (A) Vooskeem, mis näitab töövoogu, mille tulemuseks on ginkgetiini kui potentsiaalse TRPV4 inhibiitori tuvastamine 2000 loodusliku ühendi raamatukogust. (B) Tüüpiline FlexStation 3 salvestis, mis näitab 6 loodusliku ühendi inhibeerivat toimet TRPV4 agonisti (GSK1016790A) poolt indutseeritud Ca2 pluss kaltsiumi 6 värviga laetud BMDM-ide sissevoolu sekundaarse skriinimise ajal. Eeltöötlemine kõigi kuue ühendiga näitas pärssivat toimet TRPV4-sõltuvale Ca2 pluss sissevoolule, võrreldes rakkudega, mida oli eelnevalt töödeldud vehiikuliga (negatiivne kontroll; kandja pluss GSK1016790A (10 nM)) või kaltsiumionofooriga (A23187, 2 µM). Negatiivse kontrollina kasutasime selektiivset TRPV4 antagonisti GSK2193874 (10 nM). Kõiki katseid korrati kolm korda neljas korduses. RFU: suhteline fluorestsentsühik.

TRPV4 inhibeerimine GGT poolt tühistab oxLDL-i indutseeritud makrofaagide vahtrakkude moodustumise.Meie varasemad uuringud näitasid, et TRPV{0}}kutsutud Ca2 pluss sissevool on seotud oxLDL-vahendatud vahtrakkude moodustumisega 14,16. Seetõttu hindasime võimalust, et vahurakkude moodustumist pärssis GGT-vahendatud TRPV4 aktiivsuse antagoniseerimine. Metsiktüüpi hiire kõhukelme makrofaage inkubeeriti oxLDL-ga, et indutseerida vahtrakkude moodustumist GGT juuresolekul või puudumisel, ja analüüsiti Oil Red O värvimisega. Nagu oodatud, leidsime, et vahtrakkude teke suurenes oxLDL-ga töödeldud makrofaagides natiivse LDL-ga võrreldes viis korda (joonis 2A, B). Kuid makrofaagide töötlemine GGT-ga (1 või 10 uM) enne oxLDL-ga stimuleerimist vähendas oluliselt vahtrakkude protsenti (joonis 2A, B). Kokkuvõttes viitavad need leiud GGT inhibeerivale toimele makrofaagide vahtrakkude moodustumisele, mis võib olla suunatud TRPV{12}} esile kutsutud Ca2 pluss sissevoolule. Lisaks ekspresseerisime TRPV4 üle TRPV4 nullmakrofaagides, kasutades adenoviiruse konstruktsiooni, ja seejärel indutseerisime vahtrakkude moodustumist, kasutades oxLDL-i GGT juuresolekul. Leidsime, et TRPV4 üleekspressioon suurendas vahurakkude moodustumist, mis blokeeriti raku eeltöötlemisel GGT-ga, mis viitab sellele, et proaterogeense vahtrakkude moodustumise pärssimine GGT poolt sõltub TRPV4-st (joonis 2C, D).

GGT ei blokeeri TRPV4 ja põletikuliste retseptorite ekspressiooni baastaset.Scavenger retseptor CD36 mängib olulist rolli oxLDL-i omastamisel ja seondumisel ning vahtrakkude moodustumisel, mis on ateroskleroosi kriitilised protsessid 4–7, 54, 55. Hiljuti on üha rohkem tõendeid, mis viitavad teemaksutaoliste retseptorite osalemisele ateroskleroosis 2, 4, 56. Et uurida, kas GGT blokeeris vahtrakkude moodustumist, mõjutades CD36, TLR4, TLR6 ja TRPV4 ekspressiooni, teostasime immunoblotanalüüsi kahel GGT kontsentratsioonil (1 või 5 uM). Leidsime sarnased CD36, TRPV4, TLR6 ja TLR4 ekspressioonitasemed võrreldes töötlemata kontrolliga (joonis 3-D). Voolutsütomeetriline analüüs ei näidanud ka olulist erinevust valkude rakupinna ekspressioonis GGT-raviga või ilma (joonis 3E-H, I-L). Kõiki kokku võttes viitavad need tulemused sellele, et GGT blokeerib makrofaagide vahtrakkude moodustumist, inhibeerimata TRPV4, CD36, TLR4 ja TLR6 pinnaekspressiooni baastasemeid.

Joonis 2. TRPV4 inhibeerimine Linkedini poolt katkestab oxLDL-indutseeritud makrofaagide vahtrakkude moodustumise. (A) Tioglükolaadiga indutseeritud hiire kõhukelme makrofaage töödeldi üleöö 50 µg/ml oxLDL-ga, millele järgnes 3-tunnine eelinkubeerimine vehiikuliga või 1 või 10 µM Linkediniga. Rakke töödeldi kontrollina 50 ug/ml natiivse LDL-iga (VLDL). Algne suurendus: 40x. (B) Tulemuste kvantifitseerimine on näidatud punktis (A). n=500 lahtrit/tingimus. õpilase t-test; ***lk<0.001. data="" represent±sem.="" (c)="" trpv4="" ko="" rpms="" were="" transduced="" with="" either="" ade-vec="" or="" ade-trpv4="" and="" were="" untreated="" or="" treated="" with="" ggt="" in="" the="" presence="" of="" oxldl="" for="" 16="" h="" on="" day="" 5="" of="" transduction="" for="" macrophage="" foam="" cell="" formation.="" (d)="" quantification="" of="" the="" results="" shown="" in="" c.="" n="100" cells/condition.="" student's="" t-test;=""><>

oxLDL-i omastamine, kuid GGT pärsib seda, et see ei seondu makrofaagide poolt. Kuna varem on näidatud, et TRPV4 omab rolli oxLDL-i omastamisel ja vahtrakkude moodustumisel 14, 16, hindasime, kas ravi GGT-ga põhjustas oksLDL-i seondumise halvenemist makrofaagide pinnal. WT peritoneaalseid makrofaage töödeldi GGT-ga enne inkubeerimist DiI-oxLDL-ga 4 kraadi juures ja hinnati seondumist. Tulemused näitavad, et GGT (1 või 10 µM) töötlemine ei takistanud oluliselt oxLDL-i seondumist makrofaagide pinnal, võrreldes vehiikuli kontrolliga (joonis 5A–C). Olles kindlaks teinud, et GGT ei inhibeeri oxLDL-i seondumist, püüdsime järgmisena kindlaks teha, kas GGT-ravi kahjustas oxLDL-i omastamist makrofaagides. Huvitaval kombel näitasid meie tulemused, et GGT-ga eeltöödeldud rakkudes oli makrofaagides oxLDL-i omastamine märkimisväärselt pärsitud, võrreldes kandjaga töödeldud rühmaga (joonis 6A, B). Kõiki kokku võttes viitavad need tulemused sellele, et GGT blokeerib oxLDL-i omastamist, kuid ei seondu makrofaagides.

GGT blokeerib TRPV4 oxLDL-indutseeritud ekspressiooni makrofaagides.

Kuna meie varem avaldatud uuringud näitasid, et TRPV{0}}indutseeritud Ca2 pluss mängib rolli oxLDL-vahendatud makrofaagide vahtrakkude moodustumisel14,16, püüdsime kindlaks teha, kas GGT blokeerib vahtrakkude moodustumist oxLDL-i poolt indutseeritud CD36 ekspressiooni pärssimise kaudu. TLR2, TLR4, TLR6 või TRPV4. Leidsime, et makrofaagide üleöö stimuleerimine oxLDL-ga põhjustas TRPV4 valkude ekspressiooni olulise ülesreguleerimise võrreldes LDL-ga, samas kui teiste retseptorite (CD36, TLR2, TLR4 ja TLR6) ekspressioon jäi muutumatuks (joonised 4A–F). Rakkude eeltöötlemine GGT-ga enne oxLDL-ga stimuleerimist vähendas selektiivselt TRPV4 valkude ekspressioonitaset võrreldes vehiikuliga töötlemisega (joonis 4A-F). Need leiud viitavad ühiselt GGT inhibeerivale toimele TRPV4 valgu ekspressioonile, mis võib osaliselt olla seotud vahurakkude moodustumise pärssimisega GGT poolt.

Joonis 3. Linkediiniga töötlemine ei muuda makrofaagides TRPV4, CD36 ja TLR-ide koguvalgu või pinna ekspressiooni. (A–D) Makrofaagide täisrakulüsaatide immunoblotid pärast üleöö töötlemist 1 või 5 µM Linkediini või vehiikuliga. Tüüpilised immunoblotid näitavad CD36 (A), TRPV4 (B), TLR6 (C) ja TLR4 (D) valgu koguekspressiooni Linkediiniga töödeldud ja töötlemata rakkudes. Iga katsekomplekti jaoks viidi läbi kolm sõltumatut bioloogilist kordust ja 3 katsekordust. (E-H) Üleöö 5 µM Linkediiniga töödeldud või töötlemata makrofaagide voolutsütomeetriline analüüs, mis näitab TRPV4 (E), CD36 (F), TLR4 (G) ja TLR6 (G) pinnaekspressiooni töötlemata ja Linkediiniga töödeldud rakkudes. Analüüsiti kolme sõltumatut bioloogilist replikatsiooni ja 30,{18}} rakku seisundi kohta. (I–L) (E–H) tulemuste kvantitatiivne analüüs. Analüüsitud kahepoolse t-testiga 99-protsendilise usaldusvahemikuga. Katse kohta loendatud rakud, 30,000; kaks katsekordust.

GGT blokeerib proaterogeenset JNK2 aktivatsiooni ja põletikku makrofaagides. Meie labori ja teiste avaldatud aruanded on näidanud, et JNK2 aktiveerimine mängib kriitilist rolli vahtrakkude moodustumisel ja ateroskleroosil 7, 57. Et teha kindlaks, kas GGT võib pärssida JNK1 / 2 aktiveerimist, töödeldi makrofaage GGT-ga, millele järgnes stimuleerimine LPS või oxLDL-ga. Immunoblotanalüüsi tulemused näitasid, et ravi GGT-ga pärssis oluliselt oxLDL- või LPS-indutseeritud JNK1/2 fosforüülimist võrreldes töötlemata või natiivse LDL-ga töödeldud kontrolliga (joonis 7A–D). On näidatud, et JNK aktiveerimine makrofaagides kutsub esile ateroskleroosiga seotud põletikueelsete vahendajate transkriptsiooni 58–60. Et teha kindlaks, kas GGT võib potentsiaalselt blokeerida nende põletikueelsete regulaatorite ekspressiooni makrofaagides, stimuleeriti GGT-ga eeltöödeldud rakke oxLDL-ga ja TNF, IL6, IL12, IL1 ja MCP1 mRNA ekspressioonitasemed kvantifitseeriti qRT-PCR analüüsiga. Me tuvastasime GGT-ga töödeldud rakkudes TNF-i, IL12-, IL1- ja MCP1-mRNA oxLDL-indutseeritud ekspressioonitasemete olulise allareguleerimise võrreldes vehiikuliga töödeldud kontrollidega (joonis 7E-I). Kokkuvõttes näitavad need tulemused, et GGT blokeerib proaterogeense JNK2 aktivatsiooni ja põletikulise geeni ekspressiooni vastuseks oxLDL-i stimulatsioonile makrofaagides. Arutelu Looduslikud ühendid, nagu flavonoidid ja polüfenoolid, moduleerivad teadaolevalt kardiovaskulaarseid reaktsioone erinevate mehhanismide kaudu, nagu põletikueelsete signaalide pärssimine, insuliini sensibiliseerimine, oksüdatiivne seisund ja vere lipiidide profiile parandamine40–45. Siin kirjeldame poolkõrge läbilaskevõimega sõeluuringul põhinevat flavooni Linkedini identifitseerimist ja funktsionaalset iseloomustamist kui makrofaagides toimuva TRPV4-sõltuvate proterogeensete/põletikuliste protsesside uudset inhibiitorit. Näitasime konkreetselt, et i) ginkgetiin blokeerib TRPV4-vahendatud Ca2 pluss sissevoolu makrofaagidesse, ii) TRPV4 funktsiooni ginkgetiini blokaad vähendas märgatavalt oxLDL-i indutseeritud vahtrakkude moodustumist, pärssides oxLDL-i omastamist makrofaagides, ja iii) ginkgetiin blokeerib. LPS- ja oxLDL-indutseeritud JNK1 / 2 fosforüülimine, TRPV4 valkude ekspressioon ja põletikulise geeni ekspressioon. Kokkuvõttes näitasid meie uuringu tulemused, et ginkgetiin pärsib proaterogeensete/põletikuliste makrofaagide funktsiooni TRPV{42}}sõltuval viisil. Ateroskleroosi, aordihaigust, soodustab algselt põletik ja makrofaagide kuhjumine oxLDL-iga, põhjustades makrofaagide vahtrakkude moodustumist, mis seejärel arenevad ateroomiks 2–10. Kuna vahtrakkude moodustumine on aterogeneesis kriitiline protsess, võib vahtrakkude moodustumise mõistmisel ja manipuleerimisel olla terapeutiline potentsiaal. Teadaolevalt ekspresseerivad makrofaagid hulgaliselt membraani läbivaid ioonikanaleid ja pumpasid, sealhulgas TRPV4, mehhaanitundlikku polümodaalset Ca2 pluss läbilaskvat ioonikanalit, mida aktiveerivad nii füüsikalised kui ka biokeemilised stiimulid11–24. Meie labori ja teiste avaldatud uuringud on tuvastanud TRPV4 rolli makrofaagide põletikus ja oxLDL-indutseeritud vahtrakkude moodustumisel 14–16, 26. TRPV4 võib seega olla elujõuline sihtmärk proaterogeensete protsesside nõrgendamiseks.

Joonis 5. Linkediin ei pärsi DiI-oxLDL seondumist makrofaagidega. Makrofaage töödeldi vehiikuliga või Linkediniga (1 või 10 uM) 3 tundi, millele järgnes inkubeerimine DiI-märgistatud oxLDL-ga (2,5 µg/ml) 1 tund 4 kraadi juures. (A) Tüüpilised fluorestsentsmikroskoopilised kujutised (algne suurendus, 63×) DiI-oxLDL-i seondumisest makrofaagide membraani pinnal (n =20 rakku/seisund). (B) Eksperimendi A tulemused on näidatud graafiku profiilina, kasutades NIH ImageJ tarkvara. (C) A. n=20 rakkude tulemuste kvantitatiivne analüüs seisundi kohta. ateroskleroosi parandamisel, vähendades MMP{14}} ja MMP-9 ning suurendades NO ja NOS taset roti rindkere aordis52. Käesolevas uuringus näitasime, et ginkgetiin blokeerib TRPV{17}}, mis kutsus esile Ca2 pluss sissevoolu makrofaagidesse. Mehhaaniliselt näitasime, et ginkgetiin blokeerib oxLDL-i omastamist, kuid ei seondu makrofaagides. In vivo ja in vitro tehtud uuringud viitasid CD36 kriitilisele rollile peamise püüduri retseptorina oxLDL-i ja makrofaagide vahtrakkude moodustumisel 2–7. Näidati, et CD36 nullhiired, kellel puudub ApoE või LDLR, on vähem altid aterosklerootiliste kahjustuste tekkele5, 6. Meie rühma varasemad uuringud tuvastasid CD36-JNK signaaliülekandekaskaadi olulise rolli makrofaagide vahtrakkude moodustumisel7. Toll-sarnased retseptorid TLR2, TLR4 ja TLR6 toimivad koreretseptoritena, interakteerudes CD36-ga, ja on näidatud, et nad osalevad aterogeneesis2, 56, 63. Uurisime võimalust, et Linkediiniga töödeldud makrofaagides täheldatud vahtrakkude moodustumise puudumine oli tingitud CD36, TRPV4, TLR2, TLR4 või TLR6 valkude ekspressiooni vähenemisest. Huvitav on see, et Linkedin-ravi ei vähendanud oluliselt CD36, TLR2, TLR4 või TLR6 valkude ekspressiooni põhitasemel ega oxLDL-i stimuleeritud tingimustes. Kuid Linkedin blokeeris spetsiifiliselt TRPV4 valkude ekspressiooni oxLDL-indutseeritud ülesreguleerimise, samas kui selle ekspressioon baastasemel jäi muutumatuks. Kõiki kokku võttes viitavad need tulemused sellele, et ginkgetiin blokeerib oxLDL-i indutseeritud vahtrakkude moodustumist mehhanismi kaudu, mis ei sõltu CD36 ja TLR ekspressioonist, kuid sõltub TRPV4-st. Meie rühma ja teiste varasemad uuringud näitasid, et JNK2 aktiveerimine on seotud vahtrakkude moodustumisega ja aterosklerootiliste kahjustuste arenguga 7, 57. Samuti teatati, et JNK on seotud MMP-9 ja MMP-13 moduleerimisega, mis on aterosklerootiliste kahjustuste korral üleekspresseeritud64–68. Arvestades JNK tunnustatud seost aterogeensetes protsessides, tahtsime kindlaks teha, kas ginkgetiin võib pärssida JNK aktiveerimist. Vastavalt varasematele aruannetele näitasid meie tulemused ka seda, et ginkgetiin blokeerib JNK2 põletikulise stiimuli poolt põhjustatud fosforüülimist makrofaagides. See tulemus viitab võimalikule mehhanismile, mille abil Linkedin blokeerib vahtrakkude moodustumist. Lisaks avastasime ginkgetiiniga töödeldud rakkudes oxLDL-i poolt indutseeritud TNF, IL12, IL1 ja MCP1 mRNA ekspressiooni olulise allareguleerimise võrreldes vehiikli kontrolliga, tuues esile ginkgetiini potentsiaalsed põletikuvastased rollid vastuseks oxLDL-le. Kokkuvõttes näitasid meie tulemused, et ginkgetiin pärsib proaterogeenset ja põletikulist makrofaagi funktsiooni TRPV{65}}sõltuval viisil. Need leiud tugevdavad seega looduslike ühendite kasutamise põhjust potentsiaalsete ravimite ja/või kemopreventiivsete reaktiivide väljatöötamisel.

Viited
1. Barquera, S. et al. Ülemaailmne ülevaade aterosklerootilise kardiovaskulaarse haiguse epidemioloogiast. Arch. Med. Res. 46, 328–338 (2015).
2. Moore, KJ & Tabas, I. Makrofaagide rakubioloogia ateroskleroosis. Cell, 145, 341–355 (2011).
3. Libby, P. Ateroskleroosi põletik. Nature 407, 233–241 (2002).
4. McLaren, JE, Michae, DR, Ashlin, TG & Ramji, DP Tsütokiinid, makrofaagide lipiidide metabolism ja vahtrakud: mõju südame-veresoonkonna haiguste ravile. Prog. Lipid Res. 50, 331–347 (2011).
5. Febbraio, M. et al. Klassi B püüduri retseptori CD36 sihipärane katkestamine kaitseb hiirtel aterosklerootiliste kahjustuste tekke eest. J. Clin. Investeeri. 105, 1049–1056 (2000).
6. Kunjathoor, VV jt. Scavenger retseptorid klass AI/II ja CD36 on peamised retseptorid, mis vastutavad modifitseeritud madala tihedusega lipoproteiinide omastamise eest, mis põhjustab makrofaagides lipiidide laadimist. J. Biol. Chem. 277, 49982–49988 (2002).
7. Rahaman, SO jt. Makrofaagide vahtrakkude moodustamiseks on vajalik CD36-sõltuv signaalikaskaad. Lahtri metab. 4, 211–221 (2006).
8. Ross, R. Ateroskleroos – põletikuline haigus. N Engl J Med. 340(2), 115–126 (1999).
9. Libby P. Ateroskleroosi trombootiliste tüsistuste molekulaarsed mehhanismid. J. intern. Med. 517–527, 2008.
10. Lusis, AJ Ateroskleroos. Nature 407, 233–241 (2000).
11. Matthews, BD et al. TRPV4 ioonikanalite ülikiire aktiveerimine rakupinna beeta1 integriinidele rakendatud mehaaniliste jõududega. Täisarv. Biol. (Kamb). 2(9), 435–442 (2010).
12. Sharma, S., Goswami, R. & Rahaman, SO Te TRPV4-TAZ-i mehhaanilise transduktsiooni signaalitelg maatriksi jäikuse ja TGF-i 1-indutseeritud epiteeli-mesenhümaalse ülemineku korral. Cell Mol. Bioeng.12, 139–152 (2019).
13. Goswami, R., Arya, RK, Biswas, D., Zhu, X. & Rahaman, SO Võõrkeha vastuseks ja hiiglaslike rakkude moodustumiseks on vaja mööduvat retseptori potentsiaali vanilloidi 4. Olen. J. Pathol. 189(8), 1505–1512 (2019).
14. Goswami, R. et al. TRPV4 kaltsiumi läbilaskev kanal on oksüdeeritud LDL-indutseeritud makrofaagide vahtrakkude moodustumise uus regulaator. Vaba Radik. Biol. Med. 110, 142–150 (2017).