Cistanche Deserticola polüsahhariid võib nõrgendada osteoklastogeneesi ja luu resorptsiooni

kontakt: emily.li@wecistanche.com

Dezhi Song jt

Osteoporoos on ainevahetushaigus, mida iseloomustab osteopeenia ja luude mikrostruktuuride halvenemine. Osteoklastid on peamised efektorrakud, mis lagundavad luumaatriksit ja nende ebanormaalne funktsioon põhjustab osteoporoosi arengut. Reaktiivsete hapnikuliikide (ROS) akumuleerumine raku metabolismi ajal soodustab osteoklastide proliferatsiooni ja diferentseerumist, mängides seetõttu olulist rolli osteoporoosis.Cistanche deserticolapolüsahhariid (CDP).kasvajavastane, anti‐põletikulinejaantioksüdant tegevust. CDPon osteoklastide mõju on aga ebaselge. Selles uuringus kasutati tartraadiresistentset happefosfataasi värvimist, immunofluorestsentsi, pöördtranskriptsiooni polümeraasi ahelreaktsiooni ja Western blot analüüsi, et näidata, et CDP inhibeeris osteoklastogeneesi ja hüdroksüapatiidi resorptsiooni. Lisaks pärssis CDP ka osteoklastide markergeenide, sealhulgas Ctsk, Mmp9 ja Acp5, ekspressiooni ega mõjutanud tuumafaktori κB (RANK) ekspressiooni retseptori aktivaatorit. Mehhaanilised analüüsid näitasid, et CDP suurendab antioksüdantsete ensüümide ekspressiooni, et nõrgendada RANKL-vahendatud ROS-i tootmist osteoklastides ja inhibeerida aktiveeritud T-rakkude tuumafaktorit ja mitogeen-aktiveeritud proteiinkinaasi aktivatsiooni. Need tulemused viitavad sellele, et CDP võib olla kandidaatravim osteoporoosi raviks, mis on põhjustatud liigsest osteoklastide aktiivsusest.

MÄRKSÕNAD:luu resorptsioon, Cistanchedeserticolapolüsahhariid, MAPK, osteoklast, reaktiivsed hapniku liigid

Cistanche kohta lisateabe saamiseks klõpsake siin

1. SISSEJUHATUS

Tasakaal osteoblastide poolt vahendatud luu moodustumise ja osteoklastide vahendatud luu resorptsiooni vahel mängib luu metaboolse homöostaasi säilitamisel üliolulist rolli (Manolagas, 2000; Zhu et al., 2018). Kui luu resorptsioon ületab luu moodustumist, tekib osteoporoos, mida iseloomustab luumassi vähenemine ja luude mikrostruktuuri kahjustused (Ikeda, 2008). Osteoporoos on eakate inimeste ja menopausijärgsete naiste tavaline haigus ning selle patogenees ei ole täielikult välja selgitatud (Cooper & Melton, 1992). Östrogeenipuudus on osteoporoosi peamine põhjus (Manolagas, O'Brien ja Almeida, 2013). Lisaks võib tuumafaktor κB ligandi (RANKL) retseptori aktivaator indutseerida reaktiivseid hapniku liike (ROS) ja neid seostatakse osteoklastide moodustumisega (Yip et al., 2005) ning seega võivad need aidata kaasa osteoporoosi tekkele (Manolagas, 2010). ). Mõned uuringud on leidnud, et nrf2-antioksüdantide puudus suurendab ROS-i taset ja soodustab auastmega indutseeritud osteoklastide diferentseerumist (Hyeon, Lee, Yang, &Jeong, 2013). Seetõttu tuleks ROS-i tootmise vähendamist osteoklastide diferentseerumise ajal hinnata osteoporoosi ravi terapeutilise strateegiana.

Osteoklastid pärinevad monotsüütide või makrofaagide vereloomeliinist ja on ainsad mitmetuumalised rakud, mis toimivadluu resorptsioon(Teitelbaum, 2000). Seetõttu on osteoklastide moodustumist käsitlevatel uuringutel suur tähtsus tõhusate ravimeetodite väljatöötamiselluuainevahetushaigused(Lorenzo, 2017). Osteoblastide ja aktiveeritud T-rakkude poolt toodetud makrofaagide kolooniaid stimuleeriv faktor (M-CSF) ja RANKL on olulised tsütokiinid, mis reguleerivad osteoklastogeneesi (Kim & Kim, 2016; Teitelbaum & Ross, 2003). RANKL indutseerib aktiveeritud T-rakkude tuumafaktori (NFATc1) ekspressiooni, mis on osteoklastide moodustumise ajal aktiivne kriitiline transkriptsioonifaktor (Ishidaet al., 2002). Aktiveeritud NFATc1 soodustab osteoklastide markergeenide, nagu tartraadiresistentne happeline fosfataas (TRAcP) ja katepsiin K (CTSK), ekspressiooni, mis reguleerivad osteoklastogeneesi ja osteoklastide funktsiooni (Balkan et al., 2009; Crottiet al., 2008). Need tulemused viitavad sellele, et CDP-d võib kasutada liigsest osteoklastilisest luu resorptsioonist põhjustatud osteoporoosi raviks.

2|MATERJALID JA MEETODID

2.1|Materjalid

CDP (puhtus > 98 protsenti) osteti ettevõttest Solarbio (Peking, Hiina) ja valmistati lähtekontsentratsiooniga 1 mM fosfaatpuhverdatud soolalahuses (PBS). Antikehad on spetsiifilised c‐Fos, CTSK, GSR, TRX1, NOS2, TRAF6, RANK, NFATc1, ERK, JNK, p38, fosforüülitud (p)‐ERK, p‐p38, p‐JNK ja ‐aktiini suhtes. Cruzi biotehnoloogia (San Jose, CA). V-ATPaasi d2 vastased antikehad toodeti nii, nagu eelnevalt kirjeldatud (H. Feng et al., 2009). 3-(4,5-dimetüültiasool-2-üül)-5-(3-karboksümetoksüfenüül)-2-(4-sulfofenüül)-2H-tetrasooliumi (MTS) ja lutsiferaasi analüüsisüsteem saadi ettevõttest Promega (Sydney, Austraalia) . Rekombinantne M-CSF osteti ettevõttelt R&D Systems (Minneapolis, MN). Rekombinantne GST-rRANKL valk ekspresseeriti ja puhastati, nagu eelnevalt kirjeldatud (Xu et al., 2000).

2.2|Rakukultuur

RAW264.7 rakud (hiire makrofaagirakud) saadi ettevõttest American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) ja neid kultiveeriti modifitseeritud minimaalses olulises söötmes (Thermo FisherScientific, Scoresby, Austraalia), millele oli lisatud 10 protsenti veise loote seerumit, 2 mM L-glutamiin, 100 U/ml penitsilliini ja 100 ug/ml streptomütsiini (täielik sööde). Luuüdist pärinevad monotsüüdid (BMM-id) eraldati 6-nädalastest C57BL/6J hiirtest, kes surmati Lääne-Austraalia ülikooli loomaeetika komitee (RA/3/100/1244) poolt heaks kiidetud protseduuride kohaselt. Pikad luud lõigati lahti pehmetest kudedest ja luuüdi loputati reieluust ja sääreluust, mida seejärel kultiveeriti täielikus söötmes M-CSF (50 ng/ml) juuresolekul.

2,3|Osteoklastogeneesi test

BMMs were plated into 96‐well culture plates at a density of 6 × 103cells per well and treated with a complete medium containing M‐CSF(50 ng/ml) and GST‐rRANKL (100 ng/ml), in the presence or absence of varying concentrations of CDP. The cell culture medium was changed every 2 days. After 5 days, cells were fixed with 4%paraformaldehyde for 10 min, washed three times with PBS, and then stained for TRAcP‐enzymatic activity using the leukocyte acid phosphatase staining kit (Sigma‐Aldrich, Sydney, Australia), following the manufacturer's procedures. TRAcP‐positive multinucleated cells(>kolm tuuma) tuvastati osteoklastidena.

2.4|Tsütotoksilisuse analüüsid

BMM-id külvati 96-augulistele plaatidele tihedusega 6 × 103 rakku süvendi kohta ja jäeti üleöö kleepuma. Järgmisel päeval inkubeeriti rakke CDP erineva kontsentratsiooniga. Veel 48 tunni pärast lisati MTS lahus (20 µl süvendi kohta) ja inkubeeriti rakkudega 2 tundi. Neelduvus 490 nm juures määrati mikroplaadilugejaga (MultiscanSpectrum; Thermo Labsystems, Chantilly, VA).

2,5|Immunofluorestsentsvärvimine

BMM-id külvati M-CSF (50 ng/ml) juuresolekul öö läbi tihedusega 6 × 103 rakku süvendi kohta. Seejärel stimuleeriti rakke M-CSF ja GST-rRANKL-iga (100 ng/ml), kuni moodustusid küpsed osteoklastid. Seejärel töödeldi osteoklaste erineva kontsentratsiooniga CDP-ga 48 tundi enne fikseerimist 4% paraformaldehüüdiga, permeabiliseerimist 0,1% Triton X-100-PBS-ga ja blokeerimist 3% veise seerumi albumiiniga PBS-is. Valmistatud rakke inkubeeriti rodamiiniga konjugeeritud falloidiiniga 45 minutit pimedas, et värvida F-aktiini suhtes. Seejärel pesti rakke PBS-ga, tuumad värviti 4',6-diamidino-2-fenüülindooliga (DAPI) ja paigaldati konfokaalseks mikroskoopiaks katteklaasidega.

2,6|Hüdroksüapatiidi resorptsiooni test

Osteoklastide aktiivsuse mõõtmiseks stimuleeriti kuue süvendiga kollageeniga kaetud plaatidel (BD Biocoat; ThermoFisher Scientific) kasvatatud BMM-e (1 × 105 rakku süvendi kohta) GST-rRANKL-iga (100 ng/ml) ja M-CSF-iga (50 ng/ml). ) kuni küpsete osteoklastide tekkeni (Zhou et al., 2016). Seejärel eraldati rakud plaadilt õrnalt, kasutades rakkude dissotsiatsioonilahust (Sigma-Aldrich) ja võrdne arv küpseid osteoklaste külvati üksikutele süvenditele hüdroksüapatiidiga kaetud 96-augulistele plaatidele (Corning Osteoassay, Corning, NY). Küpsed osteoklaste inkubeeriti söötmes, mis sisaldas rRANKL-i ja M-CSF-i koos CDP-ga või ilma selleta näidatud kontsentratsioonides. 48 tunni pärast värviti pooled süvendid immunohistokeemiliselt TRAcP aktiivsuse suhtes, nagu ülalpool kirjeldatud, et hinnata mitmetuumaliste rakkude arvu süvendi kohta. Ülejäänud süvendeid pleegitati 10 minutit, et eemaldada rakud ja võimaldada resorbeerunud alade mõõtmist. Resorbeeritud alad pildistati standardse valgusmikroskoopiaga ja Ima geJ tarkvara (National Institutes of Health, Bethesda, MD) kasutati osteoklastide poolt resorbeeritud hüdroksüapatiidi pinna pindala protsendi määramiseks.

2,7|Lutsiferaasi reporteri testid

NFATc1 transkriptsioonilise aktivatsiooni uurimiseks transfekteeriti RAW264.7 rakud stabiilselt NFATc1-le reageeriva lutsiferaasi reporterkonstruktiga (Cheng et al., 2018; van der Kraan et al., 2013). Transfekteeritud rakke kultiveeriti 48-süvendilistel plaatidel tihedusega 1,5 × 105 rakku süvendi kohta ja eeltöödeldi erinevate kontsentratsioonidega CDP-ga 1 tund. Pärast eeltöötlust stimuleeriti rakke GST-rRANKL-iga (100 ng/ml) 24 tundi ja lutsiferaasi aktiivsust mõõdeti lutsiferaasi reporteranalüüsi süsteemiga vastavalt tootja protokollile (Promega).

2,8|Kvantitatiivne pöördtranskriptsiooni-polümeraasi ahelreaktsiooni (RT-PCR) analüüs

Kogu RNA eraldati rakkudest, kasutades Trizol reagenti vastavalt tootja protokollile (Thermo Fisher Scientific). Komplementaarne DNA sünteesiti, kasutades Moloney hiire leukeemiaviiruse pöördtranskriptaasi koos 1 ug RNA matriitsi ja oligo-dT praimeritega. Spetsiifiliste järjestuste polümeraasi ahelreaktsiooni amplifikatsioon viidi läbi järgmise programmi abil: 94 kraadi 5 minutit, millele järgnes 30 tsüklit 94 kraadi juures 40 sekundit, 60 kraadi 40 sekundit ja 72 kraadi 40 sekundit ning viimane pikendusetapp 5 min 72 kraadi juures. Üksikasjalik teave konkreetsete praimerite kohta on toodud tabelis 1. Suhtelised messenger-RNA tasemed arvutati normaliseerimise teel majapidamisgeeni Hmbs ekspressioonile.

2,9|Western blot analüüs

BMM-e kultiveeriti täielikus söötmes M-CSF-iga kuue süvendiga plaatidel ja stimuleeriti GST-rRANKL-iga (100 ng/ml) märgitud aegadel. Rakud lüüsiti radioimmunosadestamise lüüsipuhvris ja valgud lahutati naatriumdodetsüülsulfaat-polüakrüülamiidi geelelektroforeesiga ja kanti üle polü(vinülideenfluoriid)membraanidele (GE Healthcare, Silverwater, Austraalia). Membraanid blokeeriti 5% lõssis 1 tund ja seejärel sondeeriti erinevate spetsiifiliste primaarsete antikehadega, raputades õrnalt öö läbi temperatuuril 4 kraadi. Membraane pesti ja seejärel inkubeeriti mädarõika peroksidaasiga konjugeeritud sekundaarsete antikehadega. Seejärel tuvastati antikehade reaktiivsus täiustatud kemoluminestsentsreagendiga (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) ja visualiseeriti Image-quant LAS 4000 (GE Healthcare) abil.

2.10|Intratsellulaarne ROS-i tuvastamine

Intratsellulaarsed ROS-i tasemed tuvastati 2',7'-diklorofluorestseiindiatsetaadi rakulise ROS-i tuvastamise testikomplekti abil (Abcam, Melbourne, Austraalia). BMM-e (5 × 103 rakku süvendi kohta) kultiveeriti 96-süvendilistel plaatidel ja töödeldi RANKL-iga (100 ng/ml), M-CSF-iga (50 ng/ml) ja CDP-ga 72 tundi. Intratsellulaarset ROS-i taset mõõdeti, kasutades 2', 7'-diklorofluorestseiindiatsetaati, mis oksüdeerub ROS-i juuresolekul fluorestseeruvaks CSF-ks. Rakke pesti Hanki puhvris ja inkubeeriti pimedas 30 minutit 10 uM DCFH-DA-ga. Pildid saadi konfokaalse mikroskoopia abil.

2.11|Statistilised analüüsid

Kõik andmed esindavad vähemalt kolme katset, mis viidi läbi kolmes korduses, kui pole märgitud teisiti. Andmed on väljendatud keskmisena ± SD. Tulemuste vaheliste erinevuste olulisuse määramiseks kasutati ühesuunalist dispersioonanalüüsi, millele järgnes Student-Newman-Keulspost hoc test, kusjuures oluliseks peeti p <>

3|TULEMUSED

3.1|CDP inhibeerib RANKL-i poolt indutseeritud osteoklastogeneesi ja osteoklastide sulandumist

Et teha kindlaks, kas CDP suudab pärssida RANKL-i poolt indutseeritud osteoklastide moodustumist, viisime esmalt läbi osteoklastogeneesi testi, kasutades hiire BMM-e (Liu et al., 2013; Song et al., 2016). BMM-e töödeldi RANKL-i ja M-CSF-iga 5 päeva, suurendades CDP kontsentratsioone. CDP vähendas TRAcP-positiivsete mitmetuumaliste rakkude arvu, kui CDPreedi kontsentratsioon oli 5 µM või suurem (joonis 1a, b). CDP toksilisuse hindamiseks ja kinnitamiseks, et need tulemused ei peegeldanud rakusurma ega arvu, viisime läbi MTS-testi. BMM-e töödeldi RANKL-i ja M-CSF-iga 48 tundi CDP erinevate annustega. CDP ei mõjutanud BMM-i proliferatsiooni kontsentratsioonil 15 µMor vähem (joonis 1c).

Et testida CDP mõju osteoklastide fusioonile, indutseeriti osteoklastid RANKL-i ja M-CSF-raviga koos CDP erinevate annustega või ilma. Osteoklastid värviti rodamiin-falloidiini ja DAPI-ga, et hinnata tuumade arvu osteoklasti kohta (joonis 2a). Nii osteoklastide arv kui ka keskmine tuumade arv osteoklasti kohta vähenesid pärast CDP-ravi (5–10 µM; joonis 2b, c). Seetõttu oli CDP-l annusest sõltuval viisil pärssiv toime RANKL-i indutseeritud osteoklastogeneesile ja osteoklastide fusioonile.

3.2|CDP nõrgendab RANKL-i poolt indutseeritud osteoklastilise hüdroksüapatiidi resorptsiooni aktiivsust

CDP mõju tuvastamiseks osteoklastide funktsioonile viidi läbi hüdroksüapatiidi resorptsiooni test (joonis 3a). Pärast 24-tunnist inkubeerimist ei muutunud osteoklastide arv süvendi kohta, samas kui hüdroksüapatiidi resorptsiooniala vähenes märkimisväärselt 5 ja 10 µM CDP-ga töötlemisel võrreldes kontrollrühmadega (joonis 3b, c). Need tulemused näitavad, et CDP-l on tugev inhibeeriv toime nii osteoklastide moodustumisele kui ka osteoklastide resorptsiooni aktiivsusele ilma tsütotoksiliste mõjudeta.

3,3|CDP inhibeerib osteoklastide markergeeni ekspressiooni

CDP inhibeeriva toime edasiseks uurimiseks osteoklastogeneesile ja osteoklastilise luu resorptsioonile töödeldi BMM-e RANKL-i ja M-CSF-iga 5 päeva erineva CDP kontsentratsiooniga. Seejärel viidi läbi RT-PCR, et tuvastada osteoklastide markergeenide ekspressiooni. Nfatc1, osteoklastogeneesi ajal olulise transkriptsioonifaktori, ekspressiooni inhibeeris CDP annusest sõltuval viisil (joonis 4a). Lisaks vähendas CDP (5 ja 10 µM) luu resorptsiooniga seotud geenide, sealhulgas Mmp9, Ctsk ja Acp5 ekspressiooni (joonis 4bd).

3,4|CDP pärsib NFATc1 aktiivsust ja allavoolu valgu ekspressiooni

Et uurida CDP mõju RANKL-i poolt indutseeritud NFATc1 aktiivsusele, viidi läbi lutsiferaasi reporteranalüüs. Ravi CDP-ga kontsentratsioonidel 5 µM ja kõrgemal inhibeeris oluliselt RANKL-i poolt indutseeritud NFATc1 aktiivsust (joonis 5a). Lisaks näitas Western blot analüüs, et CDP pärssis oluliselt NFATc1 ja c-Fos valgu ekspressiooni RANKL-i ja M-CSF-iga töödeldud BMM-ides 3 ja 5 päeva jooksul (joonis 5b). Lisaks oli osteoklastide funktsiooniga seotud valkude, nagu V-ATPaas-d2 ja CTSK, ekspressioon CDP juuresolekul kontrollrühmadega võrreldes allareguleeritud. Kuid CDP ei mõjutanud RANK-i ekspressiooni (joonis 5b).

3,5|CDP soodustab antioksüdantsete ensüümide ekspressiooni, et kõrvaldada ROS-i tootmine RANKL-i indutseeritud osteoklastogeneesi ajal

CDP-sõltuva osteoklastogeneesi inhibeerimise mehhanismi uurimiseks töödeldi BMM-e RANKL-i (100 ng/ml) ja M-CSF-iga (50 ng/ml) koos PBS-i või CDP-ga 72 tundi. Uurisime CDP mõju RANKL-i poolt stimuleeritud rakusisesele ROS-i tootmisele. Intratsellulaarset ROS-i taset suurendas RANKL-ravi, mida nõrgendas CDP (5 ja 10 uM; joonis 6a). CDP-ravi vähendas annusest sõltuval viisil nii ROS-positiivsete rakkude arvu kui ka ROS-i värvimise intensiivsust (joonis 6b, c). Western blot analüüs näitas, et CDP soodustas tioredoksiini (TRX1) ja glutatioonreduktaasi (GSR) ekspressiooni, pärssides samal ajal indutseeritava lämmastikoksiidi süntaasi (NOS2) ekspressiooni BMM-ides, mida töödeldi RANKL-i ja CSF-iga 3 päeva (joonis 6d).

Edasiseks uurimiseks, kas CDP pärssis osteoklastide diferentseerumist, vähendades ROS-i tootmist, töödeldi seejärel BMM-e peroksiidiga (10 µM), et jäljendada rakkude kõrget ROS-i staatust. BMM-e indutseeriti RANKL ja M-CSF abil 3 päeva ning Western blot analüüsi ja RT-PCR tulemused näitasid, et peroksiid soodustas NFATc1 ja c-Fos ekspressiooni võrreldes kontrollrühmadega. Kooskõlas joonisel 5 toodud tulemustega pärssis CDP NFATc1 ja c-Fos ekspressiooni, samas kui peroksiid päästis CDP inhibeeriva toime (joonis 6e, f). Need andmed näitasid, et CDP surus alla NFATc1 ja c-Fos ekspressiooni, vähendades ROS-i tootmist.

3,6|CDP represseerib MAPK radu RANKL-i indutseeritud osteoklastogeneesi ajal

Järgmisena uurisime CDP-ravi mõju RANKL-vahendatud TRAF6 ekspressioonile ja MAPK raja aktiveerimisele. Pärast 2-tunnist seerumivabas söötmes inkubeerimist stimuleeriti BMM-e RANKL-iga koos CDP-ga või ilma selleta 60 minutit. Stimuleerimine CDP-ga (10 uM) ei mõjutanud TRAF6 ekspressiooni ning nõrgendas JNK2 ja ERK1/2 fosforüülimist 10. ja 20. minutil (joonis 7). Lisaks pärssis 60-minutiline CDP-ravi märkimisväärselt p38 fosforüülimist võrreldes kontrollrühmadega (joonis 7). Need andmed näitavad, et CDP pärsib RANKL-i indutseeritud MAPK signaaliülekande radu, mis on kooskõlas selle inhibeeriva toimega osteoklastide moodustumist ja aktiivsust.

4|ARUTELU

Cistanche, tuntud kui "kõrbe ženšen", on viimasel ajal pälvinud palju tähelepanu oma võimega moduleerida immuunsust ja toimida kaitsvalt vananemise ja oksüdatiivse stressi ajal (Jia et al., 2012; Snytnikovaet al., 2012). On näidatud, et fenüülpropanoid-asendatud diglükosiidid, Cistanche peamised aktiivsed komponendid, pärsivad aktiivsust makrofaagides (Ahn, Chae, Chin ja Kim, 2017). Lisaks vähendas Cistanche ekstrakt oksüdatiivset stressi reperfuseeritud müokardis pärast isheemiat ja mängis olulist rolli kardioprotektsiooni viivate apoptootiliste radade pärssimisel (Yu, Li ja Cao, 2016). Cistanche olulise komponendina täidab CDP mitmesuguseid farmakoloogilisi funktsioone. Meie praegune uuring näitas, et CDP surus alla RANKL-i aktiveeritud osteoklastide diferentseerumise ja aktivatsiooni, nõrgendades ROS-i tootmist, samuti NFAT- ja MAPK-aktivatsiooni.

Happelise fosfataasina eksisteerib TRAcP paljudes rakkudes ja seda leidub rohkesti osteoklastides ja alveolaarsetes makrofaagides (Snipes, Lam, Dodd, Gray ja Cohen, 1986). TRAcP on osteoklastidele iseloomulik ensüüm ja selle ekspressioon on tihedalt seotud osteoklastide funktsiooniga, mida peetakse osteoklastide aktiivsuse ja luu resorptsiooni näitajaks (Minkin, 1982). Meie uuringus inhibeeris CDP TRAcP-positiivsete rakkude arvu, mis näitab, et CDP blokeeris RANKL-i poolt indutseeritud osteoklastogeneesi. Luumaatriksi lagunemine osteoklastide poolt sõltub katepsiin K-st (CTSK) ja MP-dest (Gruber, 2015). Siin vähendas CDP oluliselt osteoklastide funktsionaalsete geenide, nagu Mmp9, Ctsk ja Acp5, ekspressiooni.

Osteoklastide diferentseerumist ja funktsiooni reguleerivad mitmed signaalirajad (Boyle, Simonet ja Lacey, 2003). Pärast RANK-iga seondumist värbab RANKL adaptervalgu TRAF6, et aktiveerida NFATc1 ekspressioon, mis on osteoklastide moodustumise oluline transkriptsioonifaktor, mis mõjutab osteoklastide spetsiifilist geeniekspressiooni, sealhulgas TRAcP ja CTSK (X. Feng, 2005; Takayanagi et al., 2002). Selles uuringus leidsime, et CDP ei mõjuta RANK-i ja TRAF6 ekspressiooni osteoklastides. Kuid CDP inhibeeris RANKL-i poolt indutseeritud NFATc1 aktivatsiooni BMM-ide osteoklastogeneesi ajal. Lisaks näidati, et mitokondrite poolt elektronide kohaletoimetamise protsessis toodetud ROS soodustas osteoklastide proliferatsiooni ja diferentseerumist ning reguleeris luumaatriksi lagunemist (Ha et al., 2004). Hiljutine uuring näitas, et RANKL indutseeris Bach1 tuumaimporti ja nõrgendas Nrf2-vahendatud antioksüdantsete ensüümide tootmist, suurendades seeläbi rakusisest ROS-i ekspressiooni ja osteoklastogeneesi hiirtel (Kanzaki et al., 2017). Lisaks suurendas homotsüsteiini poolt rakusisene ROS-i teke osteoklastide moodustumist ja aktiivsust (Koh et al., 2006). Meie uuring näitas, et CDP vähendas ROS-i akumuleerumist osteoklastides, inhibeerides NOS2 ekspressiooni ja soodustades antioksüdantsete ensüümide, nagu TRX1 ja glutatioonreduktaasi, ekspressiooni. Kui ravisime BMM-e peroksiidiga, et suurendada rakusisese ROS-i akumulatsiooni, näitasid tulemused, et suurenenud ROS võis parandada NFATc1 ekspressiooni, et ROS oli NFATc1-st ülesvoolu. Samuti leidsime, et peroksiid päästis CDPon NFATc1 ekspressiooni inhibeeriva toime. Niisiis näitavad meie andmed, et CDP pärsib ROS-i akumulatsiooni, et inhibeerida NFATc1 ekspressiooni, seejärel represseerib osteoklastide moodustumist ja funktsiooni.

ERK, JNK ja p38 kuuluvad MAPK perekonda, mis on samuti seotud osteoklastide diferentseerumise reguleerimisega (Seger & Krebs, 1995). RANKL aktiveerib MAPK raja, suurendades ERK, JNK ja p38 fosforüülimist (Mizukami et al. ., 2002). Näitasime, et CDP surus maha MAPK raja võtmevalkude RANKL-vahendatud fosforüülimise, aidates sellega kaasa CDPon inhibeerivale toimele osteoklastide markergeenide ekspressioonile. Meile teadaolevalt on see esimene uuring, mis näitab CDP inhibeerivat mõju ROS-i tootmisele, NFAT-i ja MAPK aktivatsioonile, mis esindab CDP uudseid toimemehhanisme in vitro.

Kokkuvõttes näitasime, et CDP nõrgendab osteoklastogeneesi ja hüdroksüapatiidi resorptsiooni ning osteoklastide markergeenide, sealhulgas Ctsk, Mmp9 ja Acp5, ekspressiooni. CDP suutis alla suruda RANKL-i vahendatud ROS-i tootmist, samuti NFAT-i ja MAPK aktiveerimist (joonis 8). Kokkuvõttes näitavad meie tulemused, et CDP võib olla kandidaatravim osteoklastidega seotud seisundite raviks, millega kaasneb ROS-i ületootmine.

TUNNUSTUS

Seda uuringut toetasid Hiina loodusteaduste sihtasutus (81572164), Hiina riiklik võtmetehnoloogia uurimis- ja arendusprogramm (2017YFC1103300), Guangxi provintsi loodusteaduste sihtasutus (2016GXNSFAA380295) ning Guangxi provintsi ülikooli teaduse ja tehnoloogia uurimisprojekt ( KY2015YB054). Seda toetavad osaliselt ka Guangxi teadusuuringute ja tehnoloogia arengukava projekt (GKG13349003, 1598013-15), Lääne-Austraalia meditsiini- ja terviseuuringute infrastruktuurifond, Arthritis Australia Foundation, Lääne-Austraalia ülikooli (UWA) teaduskoostöö auhind ning Austraalia tervishoiu- ja terviseagentuur. Meditsiiniuuringute Nõukogu (NHMRC, nr 1107828 ja 1027932).

HUVIDE KONFLIKTID

Autorid kinnitavad, et huvide konflikti ei esine.

VIITED

Ahn, J., Chae, HS, Shin, YW ja Kim, J. (2017). Uute fenüülpropanoid-asendatud diglükosiidide dereplikatsiooniga isoleerimine Cistanche salsast ja nende inhibeeriv toime NO tootmisele makrofaagides. Molecules, 22(7), 1138.
Balkan, W., Martinez, AF, Fernandez, I., Rodriguez, MA, Pang, M. ja Troen, BR (2009). NFAT-i sidumissaitide tuvastamine, mis vahendavad katepsiin K promootori aktiivsuse stimuleerimist RANK ligandi poolt. Gene, 446(2), 90–98.
Boyle, WJ, Simonet, WS ja Lacey, DL (2003). Osteoklastide diferentseerumine ja aktiveerimine. Loodus, 423(6937), 337–342.
Cai, RL, Yang, MH, Shi, Y., Chen, J., Li, YC ja Qi, Y. (2010). Cistanche deserticola fenüületanoidirikka ekstrakti väsimusvastane toime. Fütoteraapia uuringud, 24(2), 313–315.

Cheng, J., Zhou, L., Liu, Q., Tickner, J., Tian, ​​Z., Li, X., … Xu, J. (2018). Tsüanidiinkloriid pärsib ovariektoomiast põhjustatud osteoporoosi, pärssides RANKL-i vahendatud osteoklastogeneesi ja sellega seotud signaaliradu. Journal of Cellular Physiology, 233(3), 2502–2512.

Cooper, C. ja Melton, LJ, 3. (1992). Osteoporoosi epidemioloogia. Trends in Endocrinology and Metabolism, 3(6), 224–229.

Crotti, TN, Sharma, SM, Fleming, JD, Flannery, MR, Ostrowski, MC, Goldring, SR ja McHugh, KP (2008). PU.1 ja NFATc1 vahendavad hiire beeta3 integriini promootori osteoklastilist induktsiooni. Journal of Cellular Physiology, 215(3), 636–644.
Feng, H., Cheng, T., Steer, JH, Joyce, DA, Pavlos, NJ, Leong, C., … Xu, J. (2009). Müotsüütide võimendaja faktor 2 ja mikroftalmiaga seotud transkriptsioonifaktor teevad koostööd NFATc1-ga, et transaktiveerida V-ATPaasi d2 promootorit RANKL-i indutseeritud osteoklastogeneesi ajal. The Journal of Biological Chemistry, 284(21), 14667–14676.
Feng, X. (2005). Rakusiseste signaalide HINDAMINE osteoklastides. IUBMB Life, 57(6), 389–395.
Gruber, R. (2015). Luu resorptsiooni molekulaarne ja rakuline alus. Wiener Medizinische Wochenschrift, 165 (3–4), 48–53.
Guo, Y., Cao, L., Zhao, Q., Zhang, L., Chen, J., Liu, B. ja Zhao, B. (2016). Cistanche deserticola polüsahhariidi esialgsed iseloomustused, antioksüdant ja hepatoprotektiivne toime. International Journal of Biological Macromolecules, 93, 678–685.
Ha, H., Bok kwak, H., Woong lee, S., Mi jin, H., Kim, HM, Kim, HH ja Hee lee, Z. (2004). Reaktiivsed hapnikuliigid vahendavad osteoklastides RANK signaaliülekannet. Experimental Cell Research, 301(2), 119–127.
Hyeon, S., Lee, H., Yang, Y. ja Jeong, W. (2013). Nrf2 puudulikkus kutsub esile oksüdatiivse stressi ja soodustab RANKL-i poolt indutseeritud osteoklastide diferentseerumist. Free Radical Biology & Medicine, 65, 789–799.
Ikeda, K. (2008). Osteotsüüdid osteoporoosi patogeneesis. Geriatrics & Gerontology International, 8(4), 213–217.
Ishida, N., Hayashi, K., Hoshijima, M., Ogawa, T., Koga, S., Miyatake, Y., … Takeya, T. (2002). Osteoklastogeneesi suuremahuline geeniekspressiooni analüüs in vitro ja NFAT2 kui võtmeregulaatori selgitamine. The Journal of Biological Chemistry, 277(43), 41147–41156.
Jia, Y., Guan, Q., Guo, Y. ja Du, C. (2012). Põletikulise hüperplaasia vähendamine soolestikus käärsoolevähile kalduvatel hiirtel Cistanche deserticola vesiekstrakti abil. Phytotherapy Research, 26(6), 812–819.
Kanzaki, H., Shinohara, F., Itohiya, K., Yamaguchi, Y., Katsumata, Y., Matsuzawa, M., … Nakamura, Y. (2017). RANKL indutseerib Bach1 tuumaimporti ja nõrgendab Nrf2-vahendatud antioksüdantseid ensüüme, suurendades seeläbi rakusisest reaktiivsete hapnikuliikide signaaliülekannet ja osteoklastogeneesi hiirtel. FASEB Journal, 31(2), 781–792.
Kim, JH ja Kim, N. (2016). Signaalteed osteoklastide diferentseerumisel. Chonnam Medical Journal, 52(1), 12–17.
Koh, JM, Lee, YS, Kim, YS, Kim, DJ, Kim, HH, Park, JY, … Kim, GS (2006). Homotsüsteiin suurendab luu resorptsiooni, stimuleerides osteoklastide moodustumist ja aktiivsust suurendades
rakusisene ROS genereerimine. Journal of Bone and Mineral Research, 21(7), 1003–1011.
van der Kraan, AGJ, Chai, RCC, Singh, PP, Lang, BJ, Xu, J., Gillespie, MT, … Quinn, JMW (2013). HSP90 inhibiitorid suurendavad osteoklastide eellasrakkude diferentseerumist ja MITF-i (mikroftalmia transkriptsioonifaktori) aktiivsust. The Biochemical Journal, 451(2), 235–244.
Liu, Q., Wu, H., Chim, SM, Zhou, L., Zhao, J., Feng, H., … Xu, J. (2013). SC-514, IKKbeta selektiivne inhibiitor, nõrgendab RANKL-i poolt indutseeritud osteoklastogeneesi ja NF-kappaB aktivatsiooni. Biochemical Pharmacology, 86(12), 1775–1783.
Lorenzo, J. (2017). Osteoklastide aktiveerimise mitmed viisid. The Journal of Clinical Investigation, 127(7), 2530–2532.
Manolagas, SC (2000). Luurakkude sünd ja surm: põhilised regulatsioonimehhanismid ja tagajärjed osteoporoosi patogeneesile ja ravile. Endocrine Reviews, 21(2), 115–137.
Manolagas, SC (2010). Östrogeenikesksest vananemise ja oksüdatiivse stressini: osteoporoosi patogeneesi muudetud perspektiiv. Endocrine Reviews, 31(3), 266–300.
Manolagas, SC, O'Brien, CA ja Almeida, M. (2013). Östrogeeni ja androgeeni retseptorite roll luu tervises ja haigustes. Nature Reviews Endocrinology, 9(12), 699–712.
Minkin, C. (1982). Luuhappe fosfataas: tartraadiresistentne happeline fosfataas osteoklastide funktsiooni markerina. Calcified Tissue International, 34(3), 285–290.
Mizukami, J., Takaesu, G., Akatsuka, H., Sakurai, H., Ninomiya‐Tsuji, J., Matsumoto, K., & Sakurai, N. (2002). NF-kappaB ligandi (RANKL) retseptori aktivaator aktiveerib TAK1 mitogeen-aktiveeritud proteiinkinaasi kinaasi RANK, TAB2 ja TRAF6 sisaldava signaalikompleksi kaudu. Molecular and Cellular Biology, 22(4), 992–1000.
Nan, Z., Zeng, K., Shi, S., Zhao, M., Jiang, Y. ja Tu, P. (2013). Põletikuvastase toimega fenüületanoidglükosiidid Tarimi kõrbes kasvatatud Cistanche deserticola vartest. Fitoteraapia, 89, 167–174.
Seger, R., & Krebs, EG (1995). MAPK signalisatsioonikaskaad. FASEB Journal, 9 (9), 726–735.
Snipes, RG, Lam, KW, Dodd, RC, Gray, TK ja Cohen, MS (1986). Happefosfataasi aktiivsus mononukleaarsetes fagotsüütides ja U937 rakuliinis: Monotsüütidest pärinevad makrofaagid ekspresseerivad tartraadiresistentset happelist fosfataasi. Blood, 67(3), 729–734.
Snytnikova, OA, Tsentalovich, YP, Stefanova, NA, Fursova, AZ, Kaptein, R., Sagdeev, RZ ja Kolosova, NG (2012). Mitokondritele suunatud antioksüdantide SkQ1 ja Cistanche deserticola terapeutiline toime on seotud trüptofaani ja kinureniini suurenenud tasemega rotiläätses. Doklady Biochemistry and Biophysics, 447, 300–303.
Song, F., Zhou, L., Zhao, J., Liu, Q., Yang, M., Tan, R., … Xu, J. (2016). Eriodictyol inhibeerib RANKL-i poolt indutseeritud osteoklastide moodustumist ja funktsiooni NFATc1 aktiivsuse pärssimise kaudu. Journal of Cellular Physiology, 231(9), 1983–1993.
Takayanagi, H., Kim, S., Koga, T., Nishina, H., Isshiki, M., Yoshida, H., … Taniguchi, T. (2002). Transkriptsioonifaktori NFATc1 (NFAT2) indutseerimine ja aktiveerimine integreerib RANKL-i signaaliülekande osteoklastide terminaalsesse diferentseerumisse. Arengurakk, 3(6), 889–901.
Teitelbaum, SL (2000). Luu resorptsioon osteoklastide poolt. Teadus, 289 (5484), 1504–1508.
Teitelbaum, SL ja Ross, FP (2003). Osteoklastide arengu ja funktsiooni geneetiline regulatsioon. Nature Reviews Genetics, 4(8), 638–649.
Xu, J., Tan, JW, Huang, L., Gao, XH, Laird, R., Liu, D., … Zheng, MH (2000). NF-kappaB ligandi retseptori aktivaatori roti homoloogi kloonimine, sekveneerimine ja funktsionaalne iseloomustus. Journal of Bone and Mineral Research, 15(11), 2178–2186.
Yip, KH, Zheng, MH, Steer, JH, Giardina, TM, Han, R., Lo, SZ, … Xu, J. (2005). Thapsigargin moduleerib osteoklastogeneesi, reguleerides RANKL-i indutseeritud signaaliradu ja reaktiivsete hapnikuliikide tootmist. Journal of Bone and Mineral Research, 20(8), 1462–1471.
Yu, Q., Li, X. ja Cao, X. (2016). Cistanche deserticola fenüületanoidglükosiididerikka ekstrakti kardioprotektiivne toime isheemia-reperfusioonist põhjustatud müokardiinfarkti korral rottidel. Annals of Vascular Surgery, 34, 234–242.
Zhou, L., Liu, Q., Yang, M., Wang, T., Yao, J., Cheng, J., … Xu, J. (2016). Dihüdroartemisiniin, malaariavastane ravim, pärsib östrogeeni puudulikkusest põhjustatud osteoporoosi, osteoklastide moodustumist ja RANKL-i indutseeritud signaaliradu. Journal of Bone and Mineral Research, 31(5), 964–974.
Zhu, S., Yao, F., Qiu, H., Zhang, G., Xu, H. ja Xu, J. (2018). Sidetegurid ja eksosomaalsed pakkimismikroRNA-d on seotud luude remodelleerumise reguleerimisega. Biological Reviews of the Cambridge Philosophical Society, 93(1), 469–480.