Glycyrrhiza Uralensise õhust osade aktiivsed flavonoidkomponendid ja potentsiaalsed mehhanismid kroonilise prostatiidi korral võrgufarmakoloogia ja eksperimentaalse valideerimise põhjal

Abstraktne:

Eesmärk: Määrata Cistanche õhust pärinevate flavonoidide toimeained ja võimalikud toimemehhanismid kroonilise prostatiidi korral. Meetodid: Cistanche õhust osade alkoholiekstrakti peamiste flavonoidsete koostisosade tuvastamiseks kasutati üliefektiivset vedelikkromatograafiat – kvadrupool – elektrostaatiline väli Orbitrap kõrglahutusega massispektromeetriat (UPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS). Võrgufarmakoloogiat ja molekulaarset dokkimist kasutati kroonilise prostatiidiga seotud põhikomponentide ja peamiste sihtmärkide ennustamiseks. Kroonilise prostatiidi roti mudel kutsuti esile karrageeniga ja HE värvimisega täheldati roti eesnäärme histopatoloogilisi muutusi. DHT, IFN-, IgG, IL-6, PSA ja TNF- tasemeid seerumis mõõdeti ELISA abil, et hinnata ekstrakti terapeutilist efektiivsust. Tulemused: alkoholiekstraktis tuvastati kokku 44 flavonoidi. Võrgufarmakoloogia näitas, et põhikomponendid, sealhulgas glütsürritsiin, trikotetseenisoflavoonid, kipitav manzanita florifera ja glütsürritsiin (ennustatud tüüpiliste koostisosadena), avaldavad kroonilise prostatiidi vastast toimet, toimides sellistele peamistele sihtmärkidele nagu AKT1, TNF, VEGFA, nendega seotud signaalide rada ja MMP-d. Molekulaarne dokkimine näitas soodsat sidumisafiinsust põhikomponentide ja peamiste sihtmärkide vahel. Loomkatsed näitasid, et Cistanche õhust osade alkoholiekstrakt avaldas rottidel kroonilise prostatiidi korral selget ravitoimet. Järeldus: Cistanche õhust osade kroonilise prostatiidivastane efektiivsus on kinnitatud. Aktiivsed komponendid, sealhulgas aristolohitsiin, trihhostatiini isoflavoonid ja glütsürritsiin, võivad toimida PI3K-AKT signaaliraja kaudu, et moduleerida EGFR-i, AKT1 ja MMP9.

Märksõnad: Cistanche õhust osad; krooniline prostatiit; flavonoid; UPLC-Q-Exactive Orbittrap-MS; võrgufarmakoloogia

 

 

cistanche eelised eesnäärme tervisele

Võtke meiega ühendust osta kohe

 

 

Sissejuhatus:

Traditsiooniline Hiina ravimtaim Cistanche (Cistanche spp.) sisaldab kuivatatud ravimmaterjali, mida kasutatakse peamiselt TCM-is. See on Hiinas oluline meditsiiniline ressurss, mille funktsioonid on toniseerivad ja toetavad keha funktsioone, puhastavad soojust ja detoksifitseerivad, leevendavad valu ja ühtlustavad koostisi ning seda kasutatakse tavaliselt abikomponendina paljudes mitmest ravimtaime retseptist. Turunõudlus on suur nii riigisiseselt kui ka rahvusvaheliselt. Õhust osad, sealhulgas varred ja lehed, on külluslikud ressursid, mis ootavad arendamist ja kasutamist.

Krooniline prostatiit on noorte ja keskealiste meeste seas levinud uroloogiline haigus. Kliiniliste sümptomite hulka kuuluvad valu alakõhus või vaagnapiirkonnas, düsuuria ja urineerimissagedus. Ilma õigeaegse ravita võib see põhjustada seksuaalfunktsiooni häireid, nagu enneaegne ejakulatsioon ja erektsioonihäired, mis mõjutab tõsiselt meeste füüsilist ja vaimset tervist.

Flavonoide leidub Cistanche õhust osades rohkesti ja neil on märkimisväärne põletikuvastane ja kasvajavastane toime. Varasemad uuringud on näidanud, et õhust osad on rikkad kasvajavastase ja põletikuvastase toimega flavonoidide poolest. Flavonoidide rikastamine õhust osadest näitas in vitro head antioksüdantset aktiivsust. Farmakodünaamilised uuringud on samuti leidnud, et õhust pärit flavonoididel on kroonilise prostatiidi ennetav ja raviv toime.

Selles uuringus kasutati UPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS-i Cistanche õhust osade alkohoolse ekstrakti flavonoidide profileerimiseks. Võrgufarmakoloogiat kasutati kroonilise prostatiidi peamiste sihtmärkide ja radade ennustamiseks, mehhanismide järeldamiseks kasutati molekulaarset dokkimist ja kroonilise prostatiidi vastase aktiivsuse kinnitamiseks viidi läbi loomkatsed, mis pakkusid viiteid järgnevaks ravimite väljatöötamiseks ja kliiniliseks kasutamiseks.

Materjalid

 

Loomad

SPF-klassi isased SD-rotid (n=24), 6–7 nädala vanused, kehakaal 230–250 g [Beijing Speifu Biotechnology Co., Ltd.; tootmislitsents: SCXK (Jing) 2019-0010]. Loomi majutati Pekingi Hiina Meditsiiniülikooli katseloomade keskuse SPF-loomakeskuses. Protokolli kiitis heaks institutsiooniline eetikakomitee (kinnitus nr: BUCM-2023110204-4271).

 

Instrumendid

 

Ultimate 3000 UPLC süsteem (Dionex, USA)

Kõrge eraldusvõimega massispektromeeter Thermo Q Exactive Plus (Thermo Fisher Scientific, USA)

Digitaalne ultrahelipuhasti KH500DE (Kunshan Hechuang)

FA2004N elektrooniline tasakaal (Beijing Sartorius)

H1650 väikese kiirusega jahutustsentrifuug (Changsha Xiangyi)

RE-5023 pöördaurusti (Shanghai Yarong)

Elektrooniline temperatuuriga reguleeritav küttemantel (Tianjin Teste)

Multiskan MK3 mikroplaadi lugeja (Thermo Scientific, Shanghai)

Pööratud bioloogiline fluorestsentsmikroskoop B032 (Nikon Instruments, Shanghai)

UV-spektrofotomeeter N5000 (Shanghai Youke)

Reaktiivid

Cistanche õhust osad (varred, lehed ja väike kogus kaunasid) koguti 2019. aasta septembris Gansu provintsis Guazhou maakonnast Jiuquani linnast ning prof Wang Wenquan (ravimtaimede arendamise instituut, CAMS) kinnitas need nimega Cistanche spp.

Muud reagendid: Ulatan (Shandong Keyuan Biochemical Co., partii C15887472); karrageen (Peking Solarbio, partii 20220601); Qianliekang Pule'ani tabletid (Zhejiang Conba Pharmaceutical); naatriumkarboksümetüültselluloos (CMC-Na; Shanghai YuanYe, partii S14016); ELISA komplektid roti DHT, IFN-, IgG, IL-6, PSA ja TNF- jaoks (Shanghai ensüümidega seotud biotehnoloogia); Multiskan MK3 mikroplaadi lugeja (Thermo Scientific); koefiksaator (Guangzhou Shuopu, partii 23257838); etanool (Beijing Chemical Works, analüütiline puhastus); metanool, sipelghape, atsetonitriil (Fisher Scientific, MS klass); vesi (Wahaha Group). Võrdlusstandardid (puhtus > 98%, Shanghai YuanYe): likviritigeniin, puerariin, isoorientiin II, naringeniin, isokvertsitriin, isoliquiritiin, ononiin, isokvertsitriin, kvertsetiin, astragaliin, kaempferool, formononetiin.

Meetodid ja tulemused

 

2.1 Cistanche'i õhust osadest pärit alkoholiekstrakti keemiline profileerimine

2.1.1 Proovi ettevalmistamine

Sobiv kogus õhust osi ekstraheeriti 70% etanooliga. Ekstrakt kontsentreeriti kuivaks. Jääk lahustati ultraheliga vees 20 minutit, tsentrifuugiti kiirusel 3000 p/min-1 15 minutit ja supernatant kontsentreeriti kuivaks. Sobiv kogus kuivatatud proovi pandi 5 ml mõõtekolbi ja viidi metanooliga mahuni, et saada uuritav lahus.

 

2.1.2 Kromatograafilised ja massispektromeetrilised tingimused

 

UPLC tingimused: ACQUITY UPLC BEH C18 kolonn (2,1 mm × 100 mm, 1,7 μm); liikuv faas A, atsetonitriil; liikuv faas B, 0,5% sipelghape vees; gradientelueerimine (0–20 min, 5%–20% A; 20–70 min, 20%–30% A); voolukiirus 0,2 mL·min-1; süstimismaht 2 μL; kolonni temperatuur 30 kraadi.

MS tingimused: HESI allikas; positiivsete ja negatiivsete ioonide režiimid; täielik skaneerimine; pihustuspinge +3.2 kV (positiivne) ja −3,0 kV (negatiivne); kapillaaride temperatuur 320 kraadi ; mantligaas 40 arb; abigaas 15 arb; lisaküttekeha 350 kraadi ; MS eraldusvõime 70 000; MS/MS eraldusvõime 17 500; skaneerimisvahemik m/z 100–1500.

Cistanche'i tehniliste andmete loend

2.1.3 Komponentide identifitseerimine

Õhuosa proovi analüüsiti TIC-de saamiseks UPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS abil (joonis 1). Andmeid töödeldi Thermo Xcaliburiga ja võrreldi komponentide raamatukogude ja kirjandusega, tuvastades kokku 44 flavonoidi (tabel 1).

 

2.2 Võrgufarmakoloogia

Tuvastatud koostisosad imporditi TCMSP 2.3 andmebaasi (http://tcmspw.com/tcmsp.php). Suukaudse biosaadavuse (OB) põhjal, mis oli suurem või võrdne 30,00% ja ravimisarnasusega (DL) 0,18 või suurem, skriiniti 19 aktiivset komponenti. Kroonilise prostatiidi aktiivsete komponentide ja haiguse sihtmärkide prognoositud sihtmärgid lõigati, saades 88 ühist sihtmärki. PPI võrgu ehitamiseks kasutati STRING 11.0 (http://string-db.org). Kraadide järgi järjestatud põhisihtmärkide hulka kuulusid AKT1, TNF, VEGFA, EGFR, SRC, ESR1, PTGS2, MMP9, BCL2L1 ja MMP2. GO ja KEGG rikastamine (DAVID 6.8, http://david.ncifcrf.gov) näitas selliseid bioloogilisi protsesse nagu proteiinkinaasi B positiivne regulatsioon, apoptoosi negatiivne regulatsioon ja MAPK aktiivsuse positiivne regulatsioon; rakulised komponendid, sealhulgas ekstratsellulaarne piirkond, makromolekulaarsed kompleksid ja retseptori kompleksid; molekulaarsed funktsioonid, sealhulgas türosiinkinaasi, seriini kinaasi ja treoniinkinaasi aktiivsused. KEGG radu rikastati vähi, PI3K-AKT signaaliülekande, eesnäärmevähi ja resistentsuse EGFR türosiinkinaasi inhibiitorite suhtes. Cytoscape 3.7.1 kasutati võrgu "aktiivkomponent-tuum sihtmärk-rada" konstrueerimiseks (joonis 2). Kümme parimat komponenti kraadide järgi olid likviritigeniin, spinatsetiin (tüüpiline flavoon), isoviteksiin, krüsoeriool, santiin, kaempferool, šaftosiid, luteoliin, ononiin ja formononetiin.

Molekulaarne dokkimine viidi läbi paarikaupa 10 põhikomponendi ja PPI analüüsi peamiste sihtmärkide vahel. Põhikomponentide molekulaarstruktuurid laaditi alla TCMSP 2.3-st (mol2-vorming) ja peamiste sihtmärkide 3D-struktuurid saadi esialgsest eelarveprojektist (//www.rscb.org/) pdb-vormingus. Autodocki kasutati iga ligandi-valgu paari dokkimiseks. Seondumisenergiad < -20,92 kJ·mol-1 näitasid soodsat seondumist; mida madalam on energia, seda parem afiinsus. Parima tulemuse saanud sihtmärk-ligand paarid on loetletud tabelis 2. PyMol visualiseeriti tüüpilised viie sihtmärgiga dokkimiskompleksid (joonis 3).

 

2.3 In vivo valideerimine

Karrageeni abil loodi kroonilise prostatiidi roti mudel. HE värvimine näitas mudelloomadel kroonilisele prostatiidile iseloomulikke histopatoloogilisi kahjustusi, samas kui ravi Cistanche õhust osade alkoholiekstraktiga parandas näärmete arhitektuuri ja vähendas põletikulist infiltratsiooni. ELISA näitas, et võrreldes mudelrühmaga reguleerisid ravirühmad seerumi DHT, IFN-, IgG, IL-6, PSA ja TNF-i normaalse taseme suunas, mis näitab terapeutilist efektiivsust.

Arutelu
Põhjalik analüüs, mis ühendab kõrge eraldusvõimega MS-põhist profiilide koostamist, võrgufarmakoloogiat, molekulaarset dokkimist ja loomade valideerimist, toetab seda, et Cistanche õhust pärinevatel flavonoididel on kroonilise prostatiidi vastane toime. Oletatavad mehhanismid hõlmavad PI3K-AKT ja sellega seotud põletiku ja proliferatsiooniga seotud radade ja peamiste sihtmärkide, nagu EGFR, AKT1 ja MMP9, moduleerimist. Tulemused annavad teadusliku aluse Cistanche õhust valmistatud flavonoidpreparaatide väljatöötamiseks ja kliiniliseks kasutamiseks kroonilise prostatiidi ravis.

Järeldus
Cistanche õhust pärit flavonoidid näitavad terapeutilist potentsiaali kroonilise prostatiidi vastu, tõenäoliselt PI3K-AKT raja reguleerimise ja koostoime kaudu EGFR-i, AKT1 ja MMP9-ga. Keemilise profiilide koostamise, võrgufarmakoloogia, molekulaarse dokkimise ja loomkatsete integreerimine kinnitab nende tõhusust ja selgitab usutavaid mehhanisme.