Krooniline neeruhaigus suurendab aju mikrobleed hiire ja inimese

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Wei Ling Lau1,2 & Ane C. F. Nunes 1 & Vitali Vasilevko3 & David Floriolli4 & Long Lertpanit 1 & Javad Savoj 1 & Maria Bangash 1 & Zhihui Yao 1,5 & Krunal Shah6 & Sameen Naqvi 1 & Annlia Paganini-Hill6 & Nosratola D. Vaziri 1 & David H Cribbs3 & Mark Fisher6,7

Saadud: 25. august 2018 /Muudetud: 28. jaanuar 2019 /Aktsepteeritud: 22. veebruar 2019 /Avaldatud veebis: 4. mai 2019

# Autor(id) 2019

Cistanchevõib leevendadaneeruhaigus

Abstraktne

Aju mikrobliidid suurenevadkroonilineneertõbi(CKD) ja nende olemasolu suurendab kognitiivse languse ja insuldi riski. Uurisime CKD ja aju mikrohemorraagiate (mikrobleedide neuropatoloogiline substraat) koostoimet hiire- ja rakukultuuri mudelites ning uurisime mikrobleedi koormuse progresseerumist inimeste aju seeriapildistamisele. Hiireuuringud: uuriti kahte CKD mudelit: adeniini poolt indutseeritud tubulointerstitsiaalne nefriit ja kirurgiline 5/6 nefrektoomia. Rakukultuuri uuringud: bEnd.3 hiire aju endoteelirakud kasvatati kokkulangevuseks ja monokihi terviklikkust mõõdeti pärast kokkupuudet 5–15% inimese ureemilise seerumiga või karbamiidi kontsentratsiooni suurenemisega. Inimuuringud: Aju mikrobleedide progresseerumist hinnati seeria MRI-l kontrolli alt, dialüüsieelsetest CKD-dest ja dialüüsieelsetest patsientidest. 5/6 nefrektoomia mudelis suurendati mikrohemorraagiaid 2–2,5 korda hiirtel, kelle CKD ei sõltunud kõrgemast vererõhust. IgG värvimist suurendati CKD loomadel, mis on kooskõlas vere-aju barjääri läbilaskvuse suurenemisega. bEnd.3 rakkude inkubeerimine ureemilise seerumi või kõrgendatud karbamiidiga põhjustas trans-endoteeli elektrilise takistuse annusest sõltuva languse. Suurenenud karbamiidi indutseeritud aktiin tsütoskeleti kõrvalekalded ja vähenenud klaudiin-5 ekspressioon. Inimestel oli mikrobleedide levimus mõlemas CKD kohordis 50%, võrreldes 10% -ga vanusega sobitatud kontrollides. Rohkem dialüüsi kohordi patsiente oli 1,5 aasta pärast suurendanud mikrobleete järelkontrolli MRI-l. CKD häirib vere-aju barjääri ja suurendab aju mikroverejooksu hiirtel ja mikrobleedidel inimestel. Kõrgendatud karbamiid muudab aktiini tsütoskeletooni ja tihedaid ühendusvalke kultiveeritud endoteelirakkudes, mis viitab sellele, et see mehhanism selgitab (vähemalt osaliselt) loom- ja inimuuringutes täheldatud mikrohemorraame ja mikrobleene.

Märksõnad Krooniline neeruhaigus. Mikrobleedid. Hiire mudel. Endoteeli rakukultuur. BrainMRI

et leevendadakroonilineneerhaigus kooscistanche

Sissejuhatus

Viimaste aastate üks olulisemaid insuldineuroloogia avastusi onkroonilineneertõbimõju, mis ulatub kaugemale traditsioonilistest riskiteguritest nagu hüpertensioon ja diabeet [10, 11]. Arvestades aju mikrobörkide suurt levimust (umbes 50%) ja kognitiivseid häireid kaugelearenenud CKD-ga patsientidel [2–4, 6, 7], väärib see suhe täiendavat uurimist.

Tserebraalmikroobid on väikesed hemosideriini-raua fookused, mida saab tõestada magnetresonantstomograafial (MRI), mis usutavasti peegeldavad aju mikrohemorraagiaid [12, 13] ja näitavad suurenenud insuldiriski, nii hemorraagilist kui ka isheemilist [9, 14]. Spetsiifilised MRI järjestused (astmikkaja ja tundlikkusega kaalutud kujutis) näitavad neid signaalikaotuse fookuspiirkondi aju parenhüümis, mille mõõtmed on ≤ 10 mm [12, 15]. Aju mikrobleedid on vanusest sõltuvad, levimus läheneb 65.-aastaselt 20%-le [16]. Lisaks vanusele on hüpertensioon ja aju amüloidide angiopaatia kõige paremini kirjeldatud riskitegurid mikrobleedide tekkeks [13, 17]. Hilises staadiumis CKD-s esineb mikrobleede kuni 50% elanikkonnast [2–4].

Samaaegselt on kognitiivsed häired nii levinud kui ka raskemad madalamal tasemelneerfunktsioon[18], jõudes kroonilise dialüüsiga patsientidel 30–70%ni [6, 7]. Ristlõikeanalüüsis, milles osales 338 hemodialüüsipatsienti vanuses 55 aastat ja vanemad vanusega sobitatud kontrollid, oli 34%-l dialüüsipatsientidest raske kognitiivne kahjustus võrreldes 12%-ga kontrollidest [6]. Veel 35%-l dialüüsi kohordist oli mõõdukas kognitiivne kahjustus [6].

Mitmed uuringud mitte-CKD kohortide kohta on näidanud tugevat seost aju mikroblektorite ja kognitiivse funktsiooni vähenemise vahel [19–22]. Epidemioloogilised andmed toetavad MRI mikroobide koormuse ja kognitiivse düsfunktsiooni kooseksisteerimist lõppstaadiumis neeruhaiguse (ESRD) patsientidel [8, 23]. Lisaks näitas hiljutine aruanne 28 kroonilise dialüüsiga patsiendi kohta, kellel oli seeria aju MRI, seost uute mikrobleedide ja mini-vaimse seisundi uuringu (MMSE) skoori vähenemise vahel [4]. Lisaks on ESRD patsientidel nii isheemiliste kui ka hemorraagiliste insultide esinemissagedus 3–4 korda suurem kui üldpopulatsioonil [5]. Jaapani hemodialüüsipatsientide kohordis, kes olid algtasemel insuldivabad, oli aju mikrobleedide esinemine 5-aastase jälgimisperioodi jooksul intratserebraalse verejooksu sõltumatu ennustaja [9].

Siin teatame hiirte ja CKD-patsientide uuringute tulemustest. Leidsime CKD hiirtel suurenenud aju mikrohemorraagiaid ja kirjeldame endoteeli tiheda ristmiku ja ac-tina tsütoskeleti häireid kui mikrohemorraagia moodustumise võimalikke mehhanisme CKD miljöös. Mitte-CKD, dialüüsieelsete ja krooniliste hemodialüüsi subjektide seeria aju MRI retrospektiivne analüüs kinnitas, et ESRD on mikrobüüsi koormuse progresseerumise oluline riskitegur.

Meetodid

Hiirte eksperimendid

Katseloomad ja ravirühmad

Uuriti kahte CKD hiire mudelit. (1) Adeniini tubulointerstitsiaalne nefriitmudel: Jackson Laboratories'ist (Bar Harbor, ME) pärit isased C57BL/6J hiired vanuses 10–12 nädalat toideti 18 päeva jooksul 0,2% adeniini sisaldava dieediga kroonilise interstitsiaalse nefropaatia esilekutsumiseks, mis pandi 2 nädalaks tagasi korrapärasele chow'le ja seejärel puututi 1 nädala jooksul uuesti kokku adeniini dieediga, et säilitada CKD (joonis 1a). Kontrollhiire hoiti regulaarselt chow'l. (2) 5/6 nefrektoomia mudel: 10 nädala vanused isased C57BL/6J hiired läbisid Jackson Laboratories'is kaheastmelise operatsiooni, mis hõlmas vasakut osalist nefrektoomiat, millele järgnes õige täielik nefrektoomia 1 nädal hiljem. Loomad toimetati laborisse 1 nädal pärast

Teine operatsioon. Neid kahte mudelit kasutati hüpertensiooni mõju määramiseks; hüpertensioon on 5/6 nefrektoomia mudeli tunnuseks, samas kui adeniin- CKD ei ole hüpertensiivne [24].

CKD loomad randomiseeriti ilma lipopolüsahhariidi (LPS) või LPS-süstideta. (Pilootuuringutes lõpetasime, et on vaja pikemat ureemia kestust, et tuvastada ravimata CKD-loomadel spontaansete mikrohemorraagiate suurem koormus; hiirtel, kes olid adeniini dieedil ainult 10 päeva pärast esialgset 18-päevast kokkupuudet, oli 3,0 ± 0,4 mikrohemorraagiat cm2 kohta.)

Viis nädalat pärast esialgset CKD induktsiooni ja samaväärses vanuses kontrolle tehti hiirtele intraperitoneaalseid (i.p.) LPS-i süste (Salmonella enterica serotüüp Typhimurium, L6511-10MG, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), et indutseerida aju mikrobleene. LPS-i manustati kolmes annuses, 1 mg/kg 0, 6 ja 24 h juures [25]. LPS-iga ravitud hiirtele manustati hüdratatsiooni nahaaluste soolalahuste süstidega kaks kuni kolm korda päevas 3 päeva jooksul pärast LPS-ravi. Vererõhku (BP) mõõdeti 2 päeva enne LPS-süstimist saba-manseti pletüsmograafia (CODA-S2 mitmekanaliline, Kent Scientific) kaudu. Kõik katsed kiitis heaks California ülikool, Irvine'i institutsionaalne loomade hooldus ja kasutuskomitee.

Kudede lõikus ja vere keemikud

Hiired eutaniseeriti 1 nädal pärast LPS-i süstimist või ravimata loomadel samaväärses vanuses ekssanguinatsiooni teel, kasutades sissehingatava südame punktsiooni all sissehingatava isoflurane anesteesia all. Kanüülina kasutati 26-kaliibrilist nõela, mis sisestati vasakusse vatsakesesse, ning jääkülma PBS lahust rakendati voolukiirusel 7–8 ml/min. Pärast

perfusioon 5 minutit, vasak ajupoolkera oli lääne bloti jaoks külmutatud. Parem ajupoolkera ja mõlemad neerud fikseeriti üleöö 4% paraformaldehüüdis ja seejärel säilitati külmas PBS-is enne jagunemist. Seerumit aliquoted vere keemikute jaoks. Vere karbamiidi lämmastikku (BUN) mõõdeti BioAssay Systemsi (Hayward, CA) kolorimeetrilise komplekti abil. Seerumi kreatiniini mõõdeti kapillaarelektroforeesi abil O'Brieni neeruuuringute keskuses (TÜ Southwestern, Dallas, TX).

Mikrohemorraažide avastamine

Ajud paigaldati 1,5% agaroos ja sekreteeriti vibraatoriga, et tekitada koronaallõike (40 μm). Iga 5. osa koguti Preisi siniseks värvimiseks mikrohemorraagiate avastamiseks [26]. Preisi sinine värvimine viidi läbi värskelt valmistatud 5% kaaliumheksaanoferaadi-tri hüdraadi ja 10% soolhappe abil. Kakskümmend minutit hiljem loputati sektsioone vees ja tasakaalustati tuumakiire punase, veetustatud ja kattega. Mikrohemorraagia tuvastati × 20 suurendusega, kuna kolme süstiga loendatud lilla-sinised hoiused anti 0,6 ja 24 tundi. Nahaalust soolalahuse hüdratatsiooni manustati 3 päeva pärast LPS-i süstimist. Saba vererõhku (BP) mõõdeti enne LPS-süstimist. Hiired ohverdati 1 nädal pärast LPS-i süstimist. b Esindaja H&E värvitud neeruosad, mis näitavad adeniinist põhjustatud tubulointerstitsiaalset vigastust CKD hiired (parem paneel) võrreldes CTL looma (vasak paneel) normaalse neeruga, × 20 suurendus. Skaalariba = 100 μm

sõltumatud vaatlejad ja siis arvutati keskmine. Vaadeldud positiivselt värvitud sektsioonide pildid jäädvustati fotomikroskoobi abil (Nikon Eclipse, Jaapan) kolme looma jaoks rühma kohta mikrohemorraagia piirkonna arvutamiseks. Skaneeriti terveid slaidipilte ja riiklike tervishoiuinstituutide (www.imagej.nih.gov/ij/) tasuta ImageJ tarkvara (versioon 10.2) kasutati selleks, et

arvutada kogu aju pindala. Mikrohemorraagiate arv normaliseerus kogu aju pindalani looma kohta.

Western Blotting

Valguanalüüsiks mõeldud ajupoolkerad külmutati kudede kogumise ajal ja homogeniseeriti jääkülmas kudede ekstraheerimise reaktiivis I (Thermo Fisher Scientific), mida täiendati proteaasi inhibiitori kokteiliga (Roche Applied Science, Indianapolis, IN). Valgu kontsentratsioone mõõdeti BCA valgu analüüsikomplektiga (Thermo Fisher Scientific). SDS-PAGE geeli elektroforeesi tehti 100 μg valguga proovi kohta. Valgud kanti PVDF-membraanidele ja blokeeriti seejärel

1 h 5% rasvata kuiva kooritud piimas, mis on valmistatud TBS-T puhvris (10 mM Tris–HCl, 150 mM NaCl ja 0,1% Tween-20) ning inkubeeritud primaarsete antikehadega, mis on suunatud claudin-5-le (lahjendatud 1:200, Sigma-Aldrich SAB4502981), okludiinile (lahjendatud 1:200, Invitrogen 711500, Thermo Fisher Scientific) ja inkubeeritakse GAPDH sisekontrollile (lahjendatud 1:10 000, Abcam, Cambridge, MA) 5% rasvata piima TBS-T üleöö temperatuuril 4 °C. Seejärel inkubeeriti blotid toatemperatuuril 2 tunni jooksul vastavate küüliku- või hiirevastaste sekundaarsete antikehadega. Pärast pesemist TBS-T-ga tuvastati ribad Luminestscent Image Analyzer LAS-3000 (Fujifilm Life Science, Stamford, CT) abil.

Immunohistochemistry

Vere-aju barjääri (BBB) lekke avastamiseks inkubeeriti sektsioonid biotinüleeritud hiirevastase IgG sekundaarse antikehaga kell 1:100 1 h toatemperatuuril (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA). Pärast pesemist PBS-iga inkubeeriti sektsioonid 30 minutiks avidiini-biotiini-peroksüdaasi kompleksiga (Vector Laboratories) lahjendusel kell 1:200. Värvimine töötati välja 3′,3′- diaminobenzidiini (DAB, Vector Laboratories) abil kromo-genina. IgG-ga värvitud protsentuaalset ala analüüsiti ImageJ tarkvara abil mitte-LPS CTL-i ja CKD-ajudes. Positiivse IgG värvimise künnis valiti IgG värvimise kontrolllooma käsitsi hindamise teel ja seejärel hoiti see künnis kõigi kaasatud loomade puhul võrdsena [27].

Cistanche deserticola hoiab ära neeruhaiguse

Rakukultuuri eksperimendid

Aju endoteelirakkude kultuur ja seerumi ravi

Immortalized hiir bEnd.3 rakud osteti Ameerika tüübikultuuri kollektsioonist (ATCC, Manassas, VA). Endoteelirakkude fenotüüp kinnitati von Willebrandi faktori immunostainingu abil.

Rakukultuure inkubeeriti kõrge glükoosisisaldusega dulbecco modifitseeritud Eagle'i keskkonnas (DMEM, ATCC 30-2002), mis sisaldas 25 mM glükoosi, millele lisandus 10% loote veiste seerum (FBS) ja 1% penitsilliini-streptomütsiin niisutatud inkubaatoris temperatuuril 37 °C 5% CO2 ja 95% õhu atmosfääris. Rakke kasutati läbimisel 5 kõigi katsete jaoks. Rakud külvati 5× 106 tihedusega 12-hästi polüester Transwelli sisetükkidel (0,4 μm poore, Costar) ja kokkulangevus saavutati 24–48 h juures. Seejärel muudeti kultuurikeskkonda, et paljastada rakud dialüüsipatsientide FBS-i, inimese normaalse seerumi (HNS) või ureemilise seerumi (CKD) erinevatele kontsentratsioonidele. TEER näitu mõõdeti EVOM2 volt/ohm meteri (World Precision Instruments, Sarasota, FL) abil kolmes kohas kaevu kohta, et saada keskmine. Katsed jätkusid 21 päeva ja kultuurimeediumi värskendati iga 3–4 päeva järel. NHS ja ureemiline seerum pärinesid varem pangas olevatest proovidest, mis saadi pärast IRB heakskiitu ja teadlikku nõusolekut.

Karbamiidi rakukultuuri eksperimendid

Karbamiidi (kõige rikkalikum säilinud toksiin CKD-s) toime uurimiseks inkubeeriti bEnd.3 rakke kõrge glükoosisisaldusega DMEM-is ainult 10% FBS-iga või keskmises täiendatud 42 või 72 mg/dl (70 või 120 μm) karbamiidiga (Sigma- Aldrich). Need karbamiidi kontsentratsioonid on ligilähedased hemodialüüsieelsetele ja -järgsetele väärtustele, mida tavaliselt leidub ESRD patsientidel, ning neid peetakse kliiniliselt oluliseks [28]. 24-tunnise inkubatsiooniperioodi lõppedes mõõdeti TEER-i ning koguti ja töödeldi rakke Lääne bloti analüüsiks. Aktiini tsütoskeleti visualiseerimiseks kasvatati bEnd.3 rakke klaaskatte liblikatetel ja puututi kokku ülaltoodud karbamiidi kontsentratsioonidega 24 tunni jooksul, kinnitati 10 minutiks jahutatud 4% formaliinis/PBS-is ja seejärel töödeldi immunofluorestsentsvärvimiseks aktiistaini 488 fluorestseeruva phalloidini abil DAPI tuumaplekiga (kataloog# PHDG1-A, Cytoskeleton Inc., Denver, CO). Grupi kohta tehti kolmekordseid slaide ja ImageJ tarkvara slaidi kohta pildistati kolm kaadrit, et arvutada DAPI piirkonda normaliseeritud phalloidini värvimise ala.

Western Blotting

bEnd.3 uurea katsetest saadud rakud granuleeriti, seejärel lüüsiti kudede ekstraheerimise reaktiivis I (Thermo Fisher Scientific), mida täiendati proteaasi inhibiitori kokteiliga (Roche Applied Science). Valgu kontsentratsioone mõõdeti BCA valgu analüüsikomplektiga ja Western blot tehti nagu eespool kirjeldatud klaudiin-5 (lahjendatud 1:500) ja okludiiniga (lahjendatud 1:500), mis normaliseerusid GAPDH sisekontrolliks (lahjendatud 1:20 000). Lääne plekke korrati iga proovi puhul vähemalt kolm korda.

Inimuuringud

Retrospektiivne aju MRI diagrammi ülevaade

Elektroonilised meditsiinilised andmed 1. jaanuarist 2008 kuni 31. detsembrini 2014 California-Irvine'i ülikooli meditsiinikeskuses sõeluti pärast IRB heakskiitu Honest Broker süsteemi ja UCReXi (California ülikooli teadusbörs) abil. Tuvastati dialüüsieelne CKD (n = 8) ja kroonilise hemodialüüsiga patsiendid (n = 9), kellel oli vähemalt kaks aju MRI skaneeringut eraldi ajahetkedel (10-st algselt tuvastatud hemodialüüsipatsiendist eemaldati 1 lõppanalüüsist radioloogia PACS-süsteemis puuduvate piltide tõttu). Normaalse neerufunktsiooniga (n = 10) kontrollid sobitati käsitsi hemodialüüsi CKD patsientidega soo ja vanuse järgi ± 5 aastat.

Aju mikrobleedide MRI ülevaade

Mikrobleede loendas osalev neuroradioloog (DF) ja seda analüüsiti aja jooksul progresseerumiseks. Aju MRI koos T2 * kaalutud ja tundlikkusega kaalutud im- vananemisega (SWI) ja FLAIR (vedeliku nõrgestatud inversiooni taastumine) piltidega viidi läbi 1,5T ja 3T MRI skanneritel. Kihi paksus SWI järjestuste jaoks viidi läbi 2 mm, vahekihi intervalliga 0. Mikroobid loendati 2 mm aksiaalse SWI põhjal. FLAIR oli per-

moodustatud valge aine kahjustuste avastamiseks 3 mm viilu paksusega, samuti vahekihi intervalliga 0.

Statistiline analüüs

Grubbsi testiga sõelumisel ei olnud andmete võõrväärtusi (äärmuslik üliõpilaste kõrvalekaldumise meetod, http://graphpad.com / kiirkõned / grubbs1 / ). Hiirte ja inimese rühmade vahelisi erinevusi võrreldi kategooriliste muutujate ja t-testide chi-ruudu (Fisheri täpne) testidega ning pidevate muutujate ANOVA-ga. Pidevad andmed esitatakse SEM-± keskmisena. Hiireandmete puhul viisime läbi nii Kruskal–Wallise mitteparameetrilise kui ka ühesuunalise ANOVA koos Tukey HSD testidega. CKD interaktsiooni testimiseks kasutati kahesuunalist ANOVA-d (CKD-jah/ei ja LPS- jah/ei). Erinevusi rühmade vahel peeti oluliseks, kui P< 0.05.="" figures="" were="" generated="" using="" graphpad="" prism="" 4="" software="" (graphpad="" software,="" san="" diego="">

Tulemused

Ellujäämine LPS-raviga

LPS-iga ravitud CKD hiirtel oli elulemus 80%. Ainult hiired, kes elasid kuni 1 nädal pärast LPS-ravi, olid

Lisatud lõplikesse analüüsidesse. Kõik hiired teistes rühmades elasid kuni katse lõpuni.

CKD suurendas oluliselt aju mikroverejooksu

Koormus pärast LPS-i ravi

Adeniinist indutseeritud ja 5/6 nefrektoomiaga CKD-ga loomadel oli CTL-loomadega võrreldes märkimisväärselt kõrgenenud veresuamiidi lämmastik (BUN) ja seerumi kreatiniini väärtused (tabel 1). Tail BP oli nefrektoomia-CKD loomadel oluliselt suurem kui CTL- ja adeniin-CKD-loomadel (tabel 1); kuid mikroobide arv kahes CKD rühmas oli sarnane. H&E värvimine kinnitas adeniinist tingitud tubulointerstitsiaalse žürii CKD hiirte neerudes (joonis 1b).

Keskmine aju mikrohemorraagia koormus oli 2,0 ± 0,5 cm2 kohta mitte-LPS CTL hiirtel ja suurenes 2–2,5 korda mitte-LPS CKD loomadel (adeniin-CKD hiired 4,5 ± 0,9 cm2 kohta;

nefrrektoomia-CKD hiired 4,2 ± 1,1 cm2 kohta) (tabel 1; joonis 2a). Mitte-LPS-rühmade puhul oli adeniin-CKD puhul märkimisväärne mikrohemorraagia suurenemine võrreldes CTL-iga, kuid mitte nefrrektoomia-CKD puhul. LPS-ravi suurendas mikrohemorraagia moodustumist samal määral CTL- ja CKD-loomadel