Kromatiini juurdepääsetavus ja mikroRNA ekspressioon nefroni eellasrakkudes neerude arengu ajal

Lisateabe saamiseks:ali.ma@wecistanche.com

Andrew Clugston^1,2,3, Andrew Bodnar^2,3, Débora Malta Cerqueira^2,3, Yu Leng Phua^2,5,6, Alyssa Lawler^8,9,10, Kristy Boggs⁷, Andreas Pfenning^8,10,Jacqueline Ho^2,3*ja Dennis Kostka^1,4*

¹Pittsburghi ülikooli meditsiinikooli arengubioloogia osakond, Pittsburgh, PA, USA²Rangose ​​uurimiskeskus, Pittsburghi UPMC lastehaigla, Pittsburgh, PA, USA³Pediaatria osakond, nefroloogia osakond, Pittsburghi ülikooli meditsiinikooli, PA, USA⁴Arvutus- ja süsteemibioloogia osakond ning Pittsburghi evolutsioonibioloogia ja meditsiini keskus, Pittsburghi ülikooli meditsiinikool, Pittsburgh, PA, USA⁵Geneetilise ja genoomse meditsiini osakond, Pediaatria osakond, Pittsburghi UPMC Lastehaigla, Pittsburgh, PA, USA⁶Patoloogia osakond, kliinilise biokeemilise geneetika labor, UPMC lastehaigla Pittsburgh, Pittsburgh, PA, USA⁷Pediaatria osakond, Pittsburghi ülikooli meditsiinikooli gastroenteroloogia, hepatoloogia ja toitumise osakond, Pittsburgh, PA, USA.⁸Arvutusbioloogia,⁹Bioloogiateadused ja¹⁰Neuroteaduse instituut, Carnegie Melloni ülikool, Pittsburgh, PA, USA

Abstraktne

Imetajate nefronid pärinevad populatsioonistnefroni eellasrakud, ja muutused nende rakkude transkriptoomides aitavad kaasa nefrogeneesi lakkamisele, mis on oluline nefronite arvu määraja. MikroRNA (miRNA) ekspressiooni iseloomustamiseks ja oletatavate cis-regulatiivsete piirkondade tuvastamiseks kogusime hiirelt nefroni eellasrakudneerudembrüonaalsel päeval 14,5 ja postnataalsel päeval null ning analüüsiti väikest RNA ekspressiooni ja transposaasile ligipääsetavat kromatiini. Tuvastasime 1104 miRNA ekspressiooni (114 ekspressioonimuutustega) ja 46 374 kromatiinile ligipääsetavat piirkonda (2103 muutustega ligipääsmatus). Kogu genoomi hõlmavad meie andmed tõstavad esile selliseid protsesse nagu rakkude diferentseerumine, rakkude migratsioon, rakuvälise maatriksi interaktsioonid ja arengu signalisatsiooniteed. Lisaks tuvastavad nad Eya1 ja Pax8 uued kandidaat-cis-regulatiivsed elemendid, mõlemad geenid, millel on roll nefroni eellasrakkude diferentseerumises. Lõpuks seostame ekspressiooni muutvaid miRNA-sid, sealhulgas let-7-5p, miR-125b-5p, miR-181a-2-3p ja miR{{ 20}}p, cis-reguleerivate elementide ja sihtgeenidega. Need analüüsid toovad esile uued oletatavad cis-regulatiivsed lookused miRNA jaoks nefroni eellasrakkudes.

Sissejuhatus

Funktsionaalne üksusneerudon nefron, mille ülesandeks on jäätmete filtreerimine ja normaalse vee, happe-aluse ja elektrolüütide homöostaasi säilitamine kehas. Inimestel on nefronite arv väga erinev (tavaliselt kahesaja tuhande ja enam kui miljoni nefroni vahel (Hughson et al., 2003)) ja see määratakse inimestel enne sündi (hiirtel ligikaudu sünnijärgsel päeval 2-3 (Hartman et al.) ., 2007; Hinchliffe et al., 1991)). Nefronid ei saa pärast sündi taastuda ja nefronite vähenemist seostatakse kroonilise neeruhaiguse ja hüpertensiooni suurenenud riskiga (Bertram et al., 2011). Nefronite arvu omakorda määrab suures osas rakkude populatsioon, mida nimetataksenefroni eellasrakud(Cebrian et al., 2014b). Viimastel etappidelneerudArengu käigus suurendavad nefroni eellasrakud oma kalduvust diferentseeruda, mis kahandab järk-järgult nende populatsiooni ja tähistab nefrogeneesi võimalikku lakkamist (Hartman et al., 2007; Rumballe et al., 2011; Volovelsky et al., 2018). Nefrogeneesi lakkamist reguleerivate mehhanismide mõistmisel on oluline mõju nefronite vara ja järgneva neeruhaiguse riski määramisele.

ajalneerudareng, iseeneslikult uuenevad Cited1 plus /Six2 plus nefroni eellased muutuvad esmaseks Cited1-/Six2 pluss eellasrakkudeks ja seejärel diferentseeruvad Wnt{5}}ekspresseerivateks neerupõiekesteks vastusena Wnt9b/ -kateniinile (McMahon). et al., 2016; Rumballe jt, 2011). Sisemised transkriptsioonilised muutused varases ja hilises nefroni eellasrakkudes hõlmavad geene ja radu, mis mõjutavad tüvirakkude vananemist, eriti mTori ja selle repressori hamartiini (S. Chen et al., 2015; Volovelsky et al., 2018). Tõepoolest, arvatakse, et hamartiin desensibiliseerib nefroni eellasrakke eneseuuendamise signaalide suhtes ja aitab sel viisil kaasa nefrogeneesi lakkamisele (S. Chen et al., 2015). Kooskõlas ideega, et varastel nefroni eellasrakkudel on suurem kalduvus ise uueneda, on tähelepanek, et kromatiini juurdepääsetavus on rikastatud tuuma nefroni eellasrakkude transkriptsioonifaktorite, sealhulgas Six2 ja Wt1 sidumissaitide jaoks, võrreldes hiliste nefroni eellastega (Hilliard et al. , 2019). On näidatud, et need transkriptsioonifaktorid seovad võimendajajärjestusi, mis asuvad genoomi "regulatiivsetes kuumades punktides" (O'Brien et al., 2018). Nefroni eellasrakkude indutseerimine toimub kateniini taseme tõusu tõttu, mille tulemuseks on Lef1/Tcf7 komplekside aktiveerimine geenides, mis on valmis nefrogeneesi programmi aktiveerimiseks (Park et al., 2012), ning on soovitatud kompleksida Tcf7l1 ja Tcf7l2-ga. luua ja säilitada regulatoorseid kromatiini silmuseid, mis hõlbustavad geenide aktiveerimist (Guo et al., 2021).

Klõpsake selleksCistanche tubulosa pulber neeruhaiguste raviks

Hiljutised uuringud on kaasanud mikroRNA-d (miRNA) nefrogeneesi lakkamise reguleerimisse. miRNA on lühikesed, mittekodeerivad RNA molekulid, mis on suunatud messenger-RNA transkriptidele (mRNA), et vähendada translatsiooni või tõhustatud lagunemist RNA-indutseeritud vaigistamiskompleksi (RISC) kaudu (Bartel, 2009). Valk Lin28b on tuntud miRNA-de perekonna repressor (Heo et al., 2008). Lin28b ekspressioon väheneb nefroni eellasrakkudes nefrogeneesi edenedes ja see langeb kokku let-7 miRNA perekonna ekspressiooni suurenemisega (Yermalovich et al., 2019). Lisaks põhjustab Lin28b ekspressiooni tingimuslik indutseerimine Wt1-liinis let-7 miRNA allasurumise, mis on piisav nefrogeneesi pikendamiseks (Yermalovich et al., 2019). Pole teada, kas teised miRNA-d reguleerivad nefrogeneesi ajastust. Lisaks, kuigi on tuvastatud võimendajad, mis reguleerivad pikka mittekodeerivat RNA ekspressiooni nefrogeneesi ajal (Nishikawa et al., 2019), ei ole näidatud, et ükski ei reguleeri miRNA ekspressiooni nefroni eellasrakkudes.

Selles uuringus püüdsime samaaegselt tuvastada uudset miRNA-d, mis aitab kaasa nefrogeneesi peatamisele koos võimalike cis-regulatiivsete omadustega. Seetõttu, et jälgida muutusi miRNA ekspressioonis ja kromatiini ligipääsetavuses embrüonaalse päeva 14.5 (E14.5) ja sünnijärgse päeva nulli (P0) vahel, koostasime primaarsetest ja läbimata andmetest sobitatud mRNA-seq ja ATAC-seq andmestikud.nefroni eellasrakudnendel kahel ajahetkel. Tuvastasime 114 miRNA-d, mida ekspresseeritakse erinevaltnefroni eellasrakudnende kahe ajapunkti vahel, samuti 2103 muutuva kromatiini juurdepääsetavuse piirkonda, mida me nimetame erinevalt juurdepääsetavateks piirkondadeks (DAR). Oluliselt muutuva miRNA prognoositud geenisihtmärkide ja DAR-ide genoomsete asukohtade rikastamisanalüüsid hõlmavad teid, mis mõjutavad epiteelirakkude diferentseerumist, rakkude migratsiooni, rakuvälise maatriksi interaktsioone ja peamisi arengusignaaliradasid, nagu Wnt, Notch ja TGF-signalisatsioon. . Me täheldame olulisi muutusi kromatiini juurdepääsetavuses ja esitame mitmeid tõendeid, mis viitavad kahele genoomsele piirkonnale kui geenide Eya1 ja Pax8 oletatavatele võimendajatele nefroni eellasrakkudes. Lõpuks tuvastasime järjekindlad kromatiini ligipääsetavuse ja miRNA ekspressioonimuutused 33 paari miRNA-de ja DAR-ide puhul, sealhulgas let-7-5p, miR-125b-5p, miR-181a{ {11}}p ja miR-9-3p ning esitlevad oletatavaid sihtgeene, mida ekspresseeritakse erinevalt ekspresseeritud miRNA-de nefroni eellasrakkudes.

Tulemused

Nefroni eellasrakkude populatsioonide eraldamine E14.5-st ja P0neerud

Nefroni eellasrakudisoleeriti positiivse selektsiooni teel Itg 8 suhtes E14.5 või P0 juures ja iga proov jagati mRNA-seq, ATAC-seq ja kvaliteedikontrolli läbiviimiseks (täiendav joonis 1 AB). Kvantitatiivne PCR (qRT-PCR) kinnitas, et nefroni eellasmarkergeenid Six2 ja Cited1 (Huang et al., 2016) ekspresseeruvad tugevalt isoleeritud nefroni eellasproovides võrreldes tervikuga.neerud, rohkem kui teiste rakutüüpide markerid (sealhulgas kusejuhade pungad (Caleb) (Cebrian et al., 2{{10}}14a), endoteelirakud (Pecan) (Kobayashi et al., 2008), neeru strooma (Pdgfr ) (S. Chen et al., 2015) ja neerupõieke (Lhx1) (Brunskill et al., 2014) (täiendav joonis 1 C). Seoses sooga oli E14.5 proovides kasutatud allapanu vahemikus 27–50 protsenti emaseid ja pesakondades P0 proovide puhul oli 31–75 protsenti emaseid. E14.5 proovidest oli keskmiselt 38 protsenti emaseid ja P0 proovidest 49 protsenti emaseid (täiendav joonis 1 D). Need vananevad hoolikalt -sobivad nefroni eellasrakkude populatsioonid võimaldasid meil analüüsidakromatiini juurdepääsetavusja väike RNA ekspressioon samades arenguetappides kahel ajahetkel (E14.5 ja P0).

Varastel ja hilistel nefroni eellastel on erinevad miRNA transkriptsiooniprofiilid

Väikese RNA sekveneerimine tuvastas 1,104 teadaolevat miRNA transkripti ja tuvastas 114 miRNA-d, mis näitasid olulist ekspressioonimuutust E14.5 ja P{{10}} proovide vahel (vale avastamise määr ( FDR)=0.05; Täiendav tabel 1). Pooled erinevalt ekspresseeritud miRNA-dest näitavad suurenenud ekspressiooni väärtusel P0 võrreldes E14.5-ga ja põhikomponendi analüüs toob esile suurema homogeensuse miRNA ekspressioonis E14.5 proovide hulgas võrreldes P0-ga (joonis 1A). Hierarhiline klasterdamine näitab miRNA-de selget rühmitamist vastavalt suureneva ja väheneva ekspressiooniga E14.5 ja P0 vahel (joonis 1B). MiRNA-de -7perekonna liikmed on kõige enam tuvastatud miRNA-d ja märgime, et kõigil oluliste muutustega pereliikmetel on P0 ekspressioon suurenenud (andmeid pole näidatud). See on kooskõlas tulemustega, mis näitavad, et Lin28b ekspressiooni vähenemine toob kaasa let-7 perekonna ekspressiooni ulatusliku suurenemise nefrogeneesi käigus (Yermalovich et al., 2019). Teiste P0 juures oluliselt kõrgema ekspressiooniga miRNA-de hulka kuuluvad miR-429-3p, mis on miR-200 perekonna liige, mis teadaolevalt mõjutab podotsüütide diferentseerumist (Z. Li et al., 2016) ja mõlemad miR{{30} }}a-5p ja miR-125b-5p. Kaks viimast neist represseerivad teadaolevalt Lin28 transkripte erinevates rakukeskkondades (Chaudhuri et al., 2012; Potenza et al., 2017). P0 juures oluliselt madalama ekspressiooniga miRNA hõlmab angiogeneesi (S. Wang et al., 2008) ja proliferatsiooni soodustavat (Schober et al., 2014) miR-126.

DIANA miRPath tööriist võimaldab miRNA KEGG raja analüüsi nende vastavate geenisihtmärkide põhjal, nagu ennustab mikro T-CDS (Vlachos et al., 2015). Leiame, et suurimate ekspressioonimuutustega E14.5 ja P0 vahel (üles või alla) on miRNA-d, mis reguleerivad nefrogeneesis võtmerolli omavaid radu (joonis 1C, täiendav joonis 2). Näiteks Tgf- sekreteerivad ümbritsevad stroomarakud, et soodustada nefroni eellasrakkude diferentseerumist (Rowan et al., 2{{50}}18) ja me täheldame nefroni eellasrakkude miRNA ekspressiooni vähenemist, mis on suunatud nefroni eellasrakkude allavoolu efektoritele. "TGF-signalisatsioonirada" (KEGG rada mmu04350, p-väärtus 1,45e- 6). "MAPK signaalirada" (mmu04010) mõjutab nefroni eellaste organiseerimist ja praimimist diferentseerumiseks ning reguleerib nende interaktsioone ekstratsellulaarse maatriksiga (ECM) Itg 8 kaudu (Ihermann-Hella et al., 2018). Märkame märkimisväärsel hulgal üles- ja allareguleeritud miRNA-sid, mis sihivad selles MAPK signaalirajas erinevaid geene (p-väärtused vastavalt 3,5e- 6 ja 3,0e- 4 üles- ja allaloendite korral) . Lõpuks on KEGG rada "Ekstratsellulaarse maatriksi (ECM) retseptori interaktsioon" (mmu04512) kõige olulisemalt rikastatud rada ja selle koostises olevad geenid on palju olulisemalt suunatud miRNA poolt, mille ekspressioon aja jooksul suureneb (p-väärtus 7,4e{ {32}} suureneva miRNA hulgas versus 1,1e-2 kahaneva hulgas). ECM-iga seotud geenide sihtmärgiks on mõned meie tuvastatud kõige tugevamalt ekspresseeritud ja oluliselt suurenevad miRNA-d, sealhulgas miR-196a-5p, miR-148a-3p, miR -125a-5p ja lase-7f-5p. Eelkõige on miR-196a-5p meie proovides kõige kõrgem ekspresseeritud miRNA ja see näitab 8-kordset suurenemist E14.5 ja P0 vahel. Geenitranskriptid, mis olid miRNA ennustatud sihtmärgid (kasutades TargetScani (Agarwal et al., 2015)) koos suurenenud ekspressiooniga P0 juures, hõlmavad Bach2, pakutud molekulaarset seost MAPK/AP1 ja Six2/-kateniini radade vahel eneseuuendamiseks ja diferentseerumiseks. vastavalt nefroni eellasrakkudes (Hilliard et al., 2019).

Diferentsiaalselt ekspresseeritud miRNA-de oletatavate sihtmärkide tuvastamiseks nefroni eellasrakkudes kasutasime miRDB-s esitatud miRNA-de arvutuslikke annotatsioone (Y. Chen & Wang, 2020) ning mördi aluspõhja (HY) annoteeritud eksperimentaalseid miRNA-mRNA interaktsioone. Huang et al., 2020) koos meie varem loodud E14.5 üherakulise RNA järjestuse andmestikuga (Bais et al., 2020). Seega koostasime loendi potentsiaalsetest miRNA-mRNA interaktsioonidest, mis põhinevad miR-i diferentsiaalsel ekspressioonil E14.5 ja P0 vahel nefroni eellasrakkudes koos vastava muutusega sihtgeeni ekspressioonis iseeneslikult uuenevate ja praimitud nefroni eellaste vahel, samuti praimitud ja diferentseerivad nefroni eellasrakud (joonis 2). Meie analüüs näitab, et Meis2 ja Hmga2 on let-7 miRNA-de perekonna potentsiaalsed sihtmärgid nefroni eellasrakkudes (joonis 2), kusjuures Meis2 ja Hmga2 ekspressioon on seotud let-7 pereliikmete suurenenud ekspressiooniga. nefroni eellasrakkude diferentseerumisel või vananemisel. Transkriptsioonifaktor Meis2 ekspresseerub tugevalt nefroni eellasrakkudes ja neeru stroomasneerudareng (Lam et al., 2014) ja on seotud rakkude proliferatsiooni reguleerimisega muudes kontekstides (Abruzzese et al., 2019). Hmga2 on mittehistooni kromatiini siduv valk, seda ekspresseeritakse tugevalt tüvirakkudes ja seda on seostatud mitmesuguste mesenhümaalsete kasvajatega (Fusco & Fedele, 2007; Lam et al., 2014). Samamoodi suureneb Jag1 ekspressioon, mis on seotud miR-34b-5p, miR-983p ja miR-200a-3p ekspressiooni vähenemisega diferentseerumisel. või vananevad nefroni eellased (joonis 2). Jag1 on Notchi signaalimise võtmeligand, mille ekspressioon suureneb nefroni eellaste diferentseerumisel (Chung et al., 2016). Kõik ennustatud või annoteeritud miRNA sihtmärgid geenide jaoks, mille ekspressioonimuutused on iseeneslikult uuenevate, praimitud ja diferentseeruvate nefroni eellaste vahel, on saadaval lisas.

Joonis 1. Olulised muutused miRNA ekspressioonis E14.5 ja P0 nefroni eellasrakkude vahel. A) Põhikomponentide analüüs näitab, et arengu ajahetk on miRNA ekspressiooni varieerumise peamine tegur. B) Kuumakaart, mis kujutab kõigi oluliselt muutuvate miRNA suhtelist ekspressiooni. Vasakpoolsed E14.5 proove sisaldavad veerud on märgistatud helerohelisega ja P0 proovidega veerud paremal on märgistatud tumerohelisega. C) Spetsiifiliste KEGG radade geenide rikastamine üles- ja allareguleeritud miRNA prognoositavate geenisihtmärkide hulgas (vastavalt punased ja sinised ribad). Minimaalne kaasatud p-väärtus on 1e-5.

Joonis 2. miRNA-mRNA interaktsioonid, millel on võimalik roll nefroni eellasrakkude vananemises ja diferentseerumises. Kuvatud on miRNA (ringid) ja mRNA (ruudud). MiRNA-d, mille ekspressioon on suurenenud E14.5 ja P0 vahel, on näidatud punasega, miRNA-d, mis vähenevad, on näidatud sinisega. Annoteeritud sihtgeenid (pärimustest mirDB ja mir TarBase), millel on suurenev ekspressioon iseuuenevate, praimitud või diferentseeruvate vahelnefroni eellasrakud(Bais et al., 2020) on näidatud punaselt, mRNA väheneva ekspressiooniga sinisega. MirDB ja mirTarDB servad, mis on vastuolus täheldatud ekspressioonimuutustega, on välja jäetud, kuid need on lisatud täiendavasse tabelisse 2.

Varastel ja hilistel nefroni eellastel on erinevad kromatiinikeskkonnad

E14.5 ja P0 nefroni eellasrakkude ATAC-seq andmed võimaldasid meil tuvastada 46 374 ligipääsetava kromatiini piirkonda (vähendamatu avastamissagedusega (Boleu et al., 2015) läviväärtusega {{ 22}}.1, vt (täiendav joonis 3 C, lisatabel 3), mis on kombineeritud valimite ja ajapunktide vahel. Pange tähele, et meie andmed vastavad projekti ENCODE ATAC-seq juhistele (ENCODE, nd) (täiendav joonis 3 A, B) ja et me täheldame IDR-i piikide hulgas suurenenud säilivusmäärasid, kui on näha randomiseeritud kontrollides (täiendav joonis 3 D). Meie teatatud IDR-idest sisaldab 3576 VISTA-s dokumenteeritud võimendajaid (Visel et al., 2007) ja/või FANTOM5 (de Rie et al., 2017) võimendajate andmebaasid ja 13 495 sisaldavad DNA järjestusi, millel on EnhancerAtlas 2.0 (Gao & Qian, 2020) kohaselt vähemalt ühes hiire koes või rakutüübis ennustatud regulatiivne roll.

Põhikomponentide analüüs (korrigeeritud proovidevaheliste sooerinevuste järgi) näitas proovide selget rühmitamist arengu ajapunktide järgi (joonis 3A). Kromatiini juurdepääsetavuse muutustega genoomsete lookuste tuvastamiseks võrdlesime ATAC-seq signaali E14.5 ja P0 proovide vahel. Täheldasime 2,103 DAR-i, mis kontrollisid FDR-i 10 protsendi juures. Neist 1323 (55 protsenti) näitasid paremat ligipääsetavust P0 juures võrreldes E14.5-ga ja hierarhiline rühmitamine näitas selget erinevust DAR-ide vahel, mis avanevad ja sulguvad vastavalt E14.5 ja P0 vahel (joonis 3B).

Transkriptsioonifaktori jalajäljed tuvastati HINT abil ja sobitati DNA-d siduvate valkudega, kasutades HOCOMOCO 11 andmebaasi motiive (Kulakovskiy et al., 2018). 431 testitud motiivi hulgas näitavad DAR-id, mis sisaldavad mitme nefrogeneesiga seotud transkriptsioonifaktori valgu jalajälgi, juurdepääsu suurenemist E14.5 ja P{7}} vahel. Keskmiselt ligipääsetavust suurendavates DAR-ides asuvate jalajälgede hulgas on esikuus transkriptsioonifaktori jalajäljed, mis vastavad Pax8 ({{10}.15), Six2 (0.14), Cebpd (0.13), Six4 (0.13), Jun (0.12) ja Fos (0.11). Suletavates DAR-ides märgitud jalajäljed hõlmavad transkriptsioonifaktoreid E2F2 ja E2F4, mis teadaolevalt mõjutavad rakutsükli kulgu (Gaudet et al., 2011) ja soodustavad rakkude proliferatsiooni (D. Wang et al., 2000) muudes rakulistes kontekstides (täiendav joonis). 4).

DAR-ide avamise ja sulgemise bioloogilise konteksti hindamiseks kasutasime Genomic Regions Enrichment of Annotations Tool (GREAT) (McLean et al., 2010), et tõsta esile geenikomplekte koos nendega seotud muutuvate kromatiini piirkondade rikastamisega. Selle lähenemisviisi abil tuvastame geeniontoloogia (GO) bioloogilised protsessid, mis on tihedalt seotud nefroni eellasrakkude arenguga: eelkõige on DAR-ide avamise rikastatud protsess "epiteelirakkude diferentseerumise reguleerimine" (GO:0030856, binoomne Q-väärtus {{3). }}.5e-5) ja "Epiteelirakkude diferentseerumise positiivne regulatsioon" (GO:0030858, binoomne Q-väärtus=5e-3) on 10 kõige olulisemalt rikastatud ( Täiendav joonis 5). Mõlemad on kooskõlas nefroni eellasrakkude kalduvuse suurenemisega diferentseerudes läbida mesenhümaal-epiteeli üleminekud (MET) (S. Chen et al., 2015). Teiste oluliselt rikastatud radade hulka kuulub "Notch-signaaliraja positiivne regulatsioon" (GO:0045747, binoomne Q-väärtus=2e-5), mis on kooskõlas Notch-signaali rolliga nefroni eellasrakkude diferentseerumise edendamisel ( Chung et al., 2016). Avastatud 10 083 sulgevat DAR-i ei näidanud olulisi GO-termineid GREATi olulisuse vaikekriteeriumide alusel (vt lisajoonis 5).

Joonis 3. Erinevused kromatiini juurdepääsetavuses iseloomustavad E14.5 vs. P0nefroni eellasrakud.A) ATAC-seq proovide põhikomponentide analüüs toob esile arenguajapunktid kui peamise variatsiooni allika. B) Kuumakaart, mis näitab oluliselt muutuvaid IDR-piirkondi ATAC-seq proovides. E14.5 proovid/veerud on märgistatud helerohelisega ja P0 proovid/veerud tumerohelisega. C) GO bioloogilise protsessi terminid, mis on rikastatud genoomsete piirkondade jaoks, mis avanevad vahemikus E14.5 kuni P0 vastavalt SUURELE, järjestatud binoomilise P-väärtuse alusel, FDR on väiksem või võrdne 0,001.

Järgmisena uurisimekromatiini juurdepääsetavusgenoomi piirkondades, mis sisaldavad geenide promootoreid ja võimendajaid, millel on avaldatud roll nefroni eellasrakkude diferentseerumises. Nende hulgas on Six2 transkriptsioonifaktor kriitilise tähtsusega multipotentsuse säilitamiseksnefroni eellasrakud(Self et al., 2006) ja kõigis proovides täheldasime selle promootorit ümbritsevat ligipääsetavat kromatiini ja teadaolevat Six2 võimendajat ~ 50 kb Six2 transkriptsiooni algussaidist (TSS) ülesvoolu (O'Brien et al., 2018) (joonis) 4A, B, sinise varjundiga alad). Samuti märgime promootoril ligipääsetava kromatiini piirkonnad ja avaldatud võimendaja valgu Gdnf jaoks (joonis 4D, E), mida sekreteerivad nefroni eellased, et soodustada kusejuhade pungade hargnemist (Sanchez et al., 1996; Vega et al., 1996). ). See võimendaja asub geeni promootorist ~ 113 kb ülesvoolu ja on teada, et see reageerib Wnt signaaliülekandele nefroni eellaste arendamise kontekstis (Park et al., 2012). Kuigi Gdnfi promootor aja jooksul oluliselt ei muutu, suurendab märkustega võimendaja oluliselt ligipääsmatust. Märgime ka ligipääsetava kromatiini piirkonnad, mis ümbritsevad avaldatud võimendajat, mis on aktiivne Eya1 nefroni eellasrakkudes, mis asub ~325 kb ülesvoolu geeni TSS-st (Park et al., 2012) (täiendav joonis 6). Eya1 on transkriptsioonifaktor, mis interakteerub Six2-ga, et säilitada nefroni eellasrakkude multipotentsust (J. Xu et al., 2014).

Vaatleme mitmeid DAR-e, mis ei kattu teadaolevate regulatiivsete funktsioonidega, kuid hõlmavad piirkondi, millel on ennustatud võimendaja aktiivsus konkreetsete geenide jaoks erinevates hiirerakutüüpides, nagu on märgitud EnhancerAtlas 2-s.0 (Gao & Qian, 2020). Lisaks avaldatud Eya1 võimendajale (Park et al., 2012) (täiendav joonis 6) hõlmab sulguv DAR ühes Eya1 intronis (joonis 5A–B) piirkonda, millel ennustatakse hiire Eya1 geeni võimendaja aktiivsust. neuraalsed eellasrakud ja granulotsüütide-monotsüütide eellasrakud (Gao & Qian, 2020). Kooskõlas võimendaja aktiivsuse vähenemisega oleme varem täheldanud, et Eya1 ekspressioon väheneb nefroni eellasrakkude diferentseerumisel, kasutades E14.5 scRNA-seq andmeid (täiendav joonis 7) (Bais et al., 2020). See on kooskõlas avaldatud ChIP-seq andmetega primaarsetes E16.5 nefroni eellasrakkudes, mis näitavad aktiivse võimendaja märgi H3K27ac puudumist ja Ctnnb1, Lef1, Six2 ja Tcf7 seondumise puudumist (joonis 5) (Guo et al. ., 2021). See potentsiaalne võimendaja sisaldab oma tipus ka Hoxd10 transkriptsioonifaktori jalajälgi, mis on transkriptsioonifaktor, mis on oluline nefroni eellaste diferentseerumiseks ja integreerimiseks mesenhümaal-epiteliaalse ülemineku (MET) ajal (Yallowitz et al., 2011).

DAR, mis suurendab 24. kromosoomi ligipääsmatust, kattub kromatiini piirkonnaga koos prognoositud transkriptsioonifaktori Pax8 võimendaja aktiivsusega rakkudes, mida kasvatatakse hiire neerudest, sooleepiteelist ja emakast (Gao & Qian, 2020). Pax8 on Pax2-ga osaliselt üleliigne, kuid vähemalt üks neist kahest transkriptsioonifaktorist on vajalik nefroni eellasrakkudesneerudareng (Bouchard et al., 2002; Narlis jt, 2007). Varem täheldasime, et Pax8 ekspressioon suureneb diferentseeruvates ja diferentseerunud nefroni eellasrakkudes (täiendav joonis 7) ja täheldame seda regulatiivset funktsiooni hõlmava DAR-i juurdepääsetavuse olulist suurenemist. See piirkond on seotud ka aktiivse võimendaja märgiga H3K27ac ja Ctnnb1, Lef1, Six2 ja Tcf7 seondumisega primaarsete E16.5 nefroni eellaste avaldatud ChIP-seq andmetes (joonis 5) (Guo et al., 2021). Me täheldame mitmeid transkriptsioonifaktori jalajälgi, mis jäävad selle DAR-i väga konserveerunud juurdepääsetavuse tippu, sealhulgas kaks Sall1 jaoks, mis on teadaolevalt nefrogeneesi mõjutav tuumafaktor (Kanda et al., 2014) ja seitse tihedalt rühmitatud jalajälge MYC-ga seotud tsingi sõrmede jaoks. valk (Maz), transkriptsioonifaktor, millel on näidatud annusest sõltuv toimeneerudareng inimestel ja hiirtel (Haller et al., 2018). Täiendav tabel 3 sisaldab täielikku loendit meie leitud juurdepääsetavatest piirkondadest, samuti nende vastavat diferentseeritud juurdepääsetavuse statistikat, nende kattuvate geenide, eksonite ja promootorite märkusi ning tuvastatud peamiste nefrogeneesiga seotud transkriptsioonifaktori jalajälgede loendeid.

Joonis 4. ATAC-seq profiilid teadaolevates ja oletatavates regulatiivsetes lookustes. Iga paneeli puhul ülalt alla tähistavad tahud voldi rikastamistkromatiini juurdepääsetavusE14.5 ja P0 proovides, kusjuures IDR-id ja DAR-id on esile tõstetud sinise (muutumatu IDR) ja rohelisena (avav DAR). ja punane (DAR-i sulgemine). Järgmine tahk kujutab geeni annotatsioone, nukleosoomide positsioone (hall) ja nukleosoomivabu piirkondi (punane), mõõdetuna E14.5 ja P0 koondproovides, ning PhastCon60 säilitusskoore (must tähistab 1{{ 12}}0 protsenti säilivust, valge 0 protsenti konserveeritud A) Six2 transkriptsioonifaktori promootor ja geenikeha. B) Six2 täiustaja, avaldanud Park et. al. C) Erinevalt juurdepääsetav Gdnf-i võimendaja, millel on P0 suurem juurdepääs. D) Gdnf-i edendaja.

Joonis 5. DAR-id, mis kattuvad potentsiaalsete uute võimendajatega nefrogeneesiga seotud geenide jaoks. A ja C) Paneelid kujutavad huvipakkuvat geeni ümbritseva 1 MB piirkonna kaarti, kus valku kodeerivad geenid on rohelised ja kavandatud võimendaja/promootori interaktsioon on must silmus . B ja D) Ülevalt alla paneelid kujutavad voldi rikastamistkromatiini juurdepääsetavusmõõdetud E14.5 ja P0 proovides, kusjuures IDR-id on esile tõstetud rohelise (avamine) ja punasega (sulgemine), millele järgnesid ChIP-seq mõõtmised nendes piirkondades, mida mõõdeti Guo et. al. primaarses nefroni eellasrakud(Guo et al., 2021). Kolmas paneel kujutab geenimärkusi (sinine) ja Enhancer Atlas 2.0 (punane) ennustatud regulatiivseid elemente ning neljas paneel tähistab ATAC-seq andmetes tuvastatud transkriptsioonifaktori jalajälgi. Viies paneel kujutab nukleosoome (hall) ja NFR-e (punane) ning alumine paneel näitab säilimist. A) 1 MB piirkond, mis sisaldab Eya1 geenikeha ja potentsiaalset Eya1 võimendajat ligikaudu 325 kb ülesvoolu. B) 4,5 kb piirkond, mis sisaldab potentsiaalset Eya1 võimendajat. C) 1 MB piirkond, mis sisaldab Pax8 geeni lookust ja prognoositavat võimendajat. D) 4,5 kb piirkond, mis sisaldab prognoositavat võimendajat ja selle kattuvat DAR-i.

Topoloogiliselt seotud domeenid aitavad tuvastada potentsiaalseid võimendaja-miRNA suhteid

Topoloogiliselt seotud domeenid (TAD) on kõrgema järgu kromatiini organiseerituse megabaasi mastaabis piirkonnad, mis tulenevad kromatiini pakkimisest tuuma kolmemõõtmelises ruumis (Dixon et al., 2012) ning võimendaja-promootori interaktsioonid on tavaliselt piiratud elemendid samas TAD-is (Symmons et al., 2014). Lähendasime nefroni eellasrakkude TAD-e, kasutades hiire embrüonaalsete tüvirakkude (ESC) annotatsioone (Y. Wang et al., 2018). MiRNA võimalike cis-regulatiivsete piirkondade skriinimiseks korreleerisime muutusikromatiini juurdepääsetavusdiferentsiaalselt ekspresseeritud miRNA-ga samas TAD-is. Üldiselt asub märkustega TAD-ides 42 778 ainulaadset juurdepääsetavat piirkonda (umbes 92 protsenti) ja neist 30 626 (umbes 72 protsenti) ei kattu tuntud promootoriga. See hõlmab 2103 DAR-i, millest vastavalt 1180 ja 923 avaneb ja sulgub aja jooksul. Viisteist avanevat DAR-i jagavad TAD-i ühe või mitme miRNA-ga, mille ekspressioon on E14.5 ja P0 vahel suurenenud, ja üheksa sulgevat DAR-i jagavad TAD-i ühe või mitme vähenenud ekspressiooniga miRNA-ga. Joonis 6 võtab selle lähenemisviisi kokku ja illustreerib DAR-ide ja nende sobitatud miRNA vahelisi kaugusi, mis jäävad vahemikku 27 kb kuni üle 1 mb (keskmine: 447 kb). Tabelis 1 on toodud võimalike DAR-miRNA suhete komplektid, kus iga sobitatud miRNA kohta on loetletud üks DAR.

Annoteeritud miRNA-võimendajate paaride hulgas märgime kolme erilist huvi. Esiteks tuvastati avanev DAR 120 kb kaugusel let-7c-5p-st ja 73 kb allavoolu miR-125b-5p-st, mis on seotud Six2-ga. seondumissait varem avaldatud E16.5 nefroni eellase ChIP-seq andmekogus (joonis 7A) (Guo et al., 2021). Let-7c-5p on üks kõrgeima ekspressiooniga let-7 miRNA-sid, mida me tuvastame, ning teadaolevalt surub perekond let-7 alla ka Lin28b-transkripte (Slack & Ruvkun, 1997; Zhu et al., 2011). Märgime, et Hmga2 ja Meis2 on samuti tuvastatud kui potentsiaalsed uudsed let-7 perekonna sihtmärgid nefroni eellasrakkudes (joonis 2). Samuti on näidatud, et miR-125b-5p represseerib Lin28 transkripte hiire vereloome- ja eellasrakutüüpides (Chaudhuri et al., 2012). Teiseks on miR-9-3p pöördkomplement miR-9-5p-le, miRNA-le, mis kaitseb hiljutineerudfibroos, sihtides metaboolseid radu (Fierro-Fernández et al., 2020). Tuvastasime miR-9-3ptranskriptide enam kui 10-kordse vähenemise E14.5 ja P0 nefroni eellasrakkude vahel ning tuvastasime potentsiaalse reguleeriva elemendi umbes 249 kb kaugusel (joonis 7B). Vaatleme seotud DAR-is Snai1 ja Snai2 transkriptsioonifaktori jalajälgi, mis on näidanud, et need soodustavad epiteeli-mesenhümaalseid üleminekuid (EMT) (Sundararajan et al., 2019). Lõpuks sobitasime miR-181a-2-3p võimaliku intergeense cis-regulatoorse lookusega 131 kb ülesvoolu kromosoomil 2, kus märgime transkriptsioonifaktori jalajälje transkriptsioonifaktori Wt1 jaoks, mis on nefroni eellasorganismi põhiregulaator. ellujäämine (Kreidberg et al., 1993) ja Six2 seondumine avaldatud E16.5 nefroni eellase ChIP-seq andmekogumis (joonis 7C)) (Guo et al., 2021).

Tabel 1. miRNA ekspressioonimuutused, mis on sobitatud ühe või mitme DAR-iga samas TAD-is.

Joonis 6. Kandidaatvõimendi – sihtmärk-miRNA paaride leidmine. A) Vooskeem, mis näitab, kuidas juurdepääsetavuse piirkonnad olid miRNA ekspressiooni võimalikuks reguleerimiseks prioriteediks. B) Iga sõelutud miRNA genoomsed asukohad nende võimendaja kandidaadi suhtes (oranž vertikaalne triip). Nende log2-kordse muutuse skaala on näidatud y-teljel ja suureneva või väheneva ekspressiooniga miRNA on esile tõstetud vastavalt rohelise ja punasega.

Joonis 7. Neli potentsiaalset võimendajat – sihtmärk-miRNA paari.TAD-d on esile tõstetud halliga, joondatud lähtepunktide järgi ja joonistatud suhtelise suuruse illustreerimiseks samas skaalas. Ensembli teadaolevad geenid on näidatud lillana ja tumedamad piirkonnad näitavad eksoneid. Suhteline juurdepääsetavus E14.5 ja P0 on näidatud tulpdiagrammidena vastavalt horisontaalse musta joone kohal ja all, samuti sisestusgraafikutena, mis illustreerivad kuhjamist määratud DAR-is koos Guo et avaldatud ChIP-seq andmetega . al. (Guo et al., 2021). HINT-i tuvastatud transkriptsioonifaktori jalajäljed on loetletud oranžide ribadena. Parempoolsetes eraldi paneelides olevad tulpdiagrammid näitavad miRNA ekspressiooni (roheline) ja normaliseeritud Tn5 sisestamise sündmusi kavandatud võimenduspiirkondades (oranž). A) Let-7 pereliige let-7c-5p väljendub väga tugevaltnefroni eellasrakudja see vastab geenidevahelises piirkonnas 119 kb kaugusel olevale "peak_54636". B) miR-9-3p on sobitatud DAR-iga 249 kb kaugusel. C) miR-181a 2-3p asub 131 kb kaugusel "tipust_5887", mis on võimalik geenidevaheline võimendaja.

Arutelu

Selles uuringus püüdsime samaaegselt tuvastada uudset miRNA-d, mis aitab kaasa nefrogeneesi peatamisele koos võimalike cis-regulatiivsete omadustega. Tuvastasime 114 miRNA-d, mis ekspresseeruvad erinevalt nefroni eellasrakkudes, samuti 2,103 DAR-i E14.5-s võrreldes P0-ganeerud. Jälgime mitmeid funktsioone, mis ennustavad geenide Eya1 ja Pax8 jaoks uusi oletatavaid võimendajaidnefroni eellasrakud. Lõpuks tuvastasime järjekindlakromatiini juurdepääsetavusja miRNA ekspressioonimuutused 33 paari miRNA-de ja DAR-ide puhul, sealhulgas let-7-5p, miR-125b-5p, miR-181a-2-3p ja miR-9-3p ja esitavad oletatavad sihtgeenid, mida ekspresseeritakse erinevalt ekspresseeritud miRNA-de nefroni eellasrakkudes. Üheskoos näitavad meie andmed, et nefroni eellasrakkudele omased ja nefrogeneesi staadiumist sõltuvad muutused kajastuvad eellasraku kromatiinikeskkonnas ja selle miRNA transkriptoomis.

Nefroni eellas-miRNA transkriptoomis täheldatud muutuste hulgas märgime eellaste vananedes ulatuslikku ekspressiooni suurenemist kogu let{{0}} perekonnas. See on kooskõlas varasemate aruannetega: Lin28b valk ja miRNA-de perekond let{2}} on vastastikku antagonistlikud ja moodustavad bistabiilse lüliti, mis reguleerib let-7 ekspressiooni imetajatel (Zhu et al., 2011) ja nefroni eellasrakkude puhul mõjutab üleminek suurenenud let{5}} ekspressioonile otseselt nefrogeneesi lakkamise aega (Yermalovich et al., 2019). Samuti täheldame miR-125b-5p suurenenud ekspressiooni, mis teadaolevalt pärsib ka Lin28b ekspressiooni teistes rakulistes kontekstides (Chaudhuri et al., 2012; Potenza et al., 2017). Perekond let-7 ja miR-125b-5p kuuluvad 114 miRNA hulka, mis ekspresseeritakse erinevalt E14.5 ja P0 vahel nefroni eellasrakkudes, mis viitab miRNA-de rollile nefroni eellasrakkude arengus. ei piirdu ainult let-7/Lin28b-ga. Näiteks ekspressiooni vähenevate miRNA-de hulka kuuluvad kaks miR-200 perekonna liiget, millel on väidetavalt osa podotsüütide diferentseerumises (Z. Li et al., 2016): miR-200b -3p ja miR-429-3lk. Lisaks täheldame miR-126a 5p ekspressiooni vähenemist, mis teadaolevalt soodustab vaskulogeneesi (Schober et al., 2014; S. Wang et al., 2008). See võib kajastada vaskulogeensete ja nefroni eellasrakkude ühist mesenhümaalset päritolu ning nende rakkude alamhulga pühendumust saada nefroni eellasrakkudeks.

Muutuvate miRNA-de prognoositavate geenisihtmärkide rajaanalüüsid, kasutades DIANA miRPathi (Vlachos et al., 2015), näitavad rikastamist MAPK ja TGF-signaali edastamisel, mis on mõlemad nefroni eellasrakkude peamised regulaatorid (Hilliard et al., 2019; Ihermann-Hella jt, 2018). ). Mitmed teised KEGG-rajad on samuti üleesindatud ülesreguleeritud miRNA-de ennustatud geenisihtmärkide hulgas, sealhulgas rakuvälise maatriksi, aktiini tsütoskeleti ja fokaalse adhesiooniga seotud rajad: kõik raku migratsiooni, diferentseerumise, hargnemise, kinnitumise, polarisatsiooni ja proliferatsiooni olulised küljed. (Rozario ja Desimone, 2010). ECM-iga seotud geenide sihtmärgiks on mõned meie tuvastatud kõige tugevamalt ekspresseeritud ja märkimisväärselt suurenevad miRNA-d, sealhulgas meie tuvastatud kõrgeima ekspressiooniga transkriptsioon: miR-196a-5p. Teadaolevalt on miR-196a-5p sihtmärgiks Col1a1, Col1a2 ja Col3a1 – geenid, mis on ülesreguleeritud Pax2-puudulikes nefronite eellasrakkudes, mis läbivad transdiferentseerumise neeru stroomiks (Naiman et al., 2017). Seega võib suurenenud miR-196a-5peekspressioon omada rolli suguvõsa piiride tugevdamisel, kuna eellasloomad vananevad. Lisaks tuvastame uudsed potentsiaalsed miRNA-mRNA sihtmärgi interaktsioonid, mis võivad aidata kaasa nefrogeneesi peatamisele, sealhulgas let-7 perekonna ülesreguleerimine, mis võib olla suunatud Hmga2 ja Meis2 (seotud rakkude proliferatsiooniga) (Abruzzese et al. ., 2019; Fusco & Fedele, 2007; Lam jt, 2014; Mugford et al., 2009), kuna nefroni eellased vananevad. Hmga2-l pole teadaolevat rollineerudarengut. Siiski arvatakse, et Meis2 funktsionaalne kattub seotud transkriptsioonifaktoriga Meis1, mis on teadaolevalt vajalik neerude arenguks (Hisa et al., 2004). Samuti jälgime miR-ide (miR-34b-5p, miR-983p ja miR-200a-3p) allareguleerimist, mis võivad sihtida Jag1, mis on teadaolevalt ülesreguleeritud ja oluline nefronite diferentseerumisel (Chung et al., 2016).

Koos muutuva miRNA transkriptoomiga mõõtsime samaaegselt muutusi nefroni eellasraku kromatiinikeskkonnas vahemikus E14.5 kuni P0. Kirjeldame kahte oletatavat uudset võimendajat Eya1 ja Pax8 jaoks, mis põhinevad (i) nende lähedusel nendele geenipromootoritele, (ii) nende vastavatele muutustelekromatiini juurdepääsetavusarengu ajal on kooskõlas pseudoaja geeniekspressiooni muutustega diferentseerumise ajal, (iii) jalajäljedneerudarengu transkriptsioonifaktorid, (iv) järjestuse säilimine, (v) tõendid võimendaja funktsiooni kohta teistes kudedes/rakutüüpides Enhancer Atlas2-st.0 (Gao & Qian, 2020) ja (vi) ChIP-seq andmed E16-s .5 nefroni eellasrakud Ctnnb1, Lef1, Six2 ja Tcf7 aktiivsete võimendajate (H3K27ac) ja transkriptsioonifaktori sidumise märgi jaoks. Me täheldame kromatiini kättesaadavuse vähenemist Eya1 võimendaja jaoks, mis on kooskõlas Eya1 rolliga nefroni eellasrakkude multipotentsuse edendamisel ja teadetega, et Eya1 kadumine põhjustab eellaspopulatsiooni varajase epiteliseerumise (J. Xu et al., 2014; PX Xu et al., 1999). Pax8 ja selle homoloog Pax2 aitavad kaasa nefroni eellasrakkude liini spetsifikatsioonile (Bouchard et al., 2002) ja nefroni eellasrakud, millel pole vähemalt ühte neist geenidest, ei läbi MET (Narlis et al., 2007). Suurenenud kromatiini juurdepääsetavus, mida me oletatava Pax8 võimendaja puhul tuvastame, on kooskõlas Pax8 suurenenud ekspressiooniga neeruepiteelis, kuna nefronid diferentseeruvad.

DAR-ide rikastamisanalüüs (McLean et al., 2010) näitas, et "epiteeli diferentseerumise reguleerimine" on avanevate kromatiinipiirkondade seas kõige olulisem termin, mis näitab, et meie tuvastatud DAR-id võivad sisaldada regulatiivseid funktsioone, mis juhivad või reageerivad signaale diferentseerumiseks ja arendamiseks.nefroni eellasrakudepiteelirakkude tüüpidesse. Notch-signalisatsioon on üks kõige olulisemalt rikastatud GO-termineid, mis on tuvastatud avavate DAR-ide hulgas, ja nefroni eellasrakkude puhul pärsib see rada teadaolevalt Six2 ekspressiooni ja soodustab nefroni eellasrakkude diferentseerumist (Chung et al., 2016). Selle rajaga seotud geenide hulgas on Jag1, Notchi signaalimise võtmeligand, mille ekspressioon on väidetavalt pöördvõrdelises korrelatsioonis Six2 ja Hes1 ekspressiooniga (Chung et al., 2016). Märgime, et Jag1 on annoteeritud sihtmärk kolmele suureneva ekspressiooniga miRNA-le (miR34b-5p, miR98-3p ja miR200a-3p, joonis 2). Lõpuks jälgime DAR-ide avamisel veresoonte ümberkujundamise ja morfogeneesiga seotud geenide rikastumist, kuigi see näib olevat nende arenguradade ja epiteelirakkude diferentseerumise vahel jagatud geenide tagajärg, sealhulgas Jag1, Eya1, Hes1, Foxc1 ja Hey2.

Muutused sissekromatiini juurdepääsetavusseasnefroni eellasrakudon mõõdetud varasemates uuringutes (Guo et al., 2021; Hilliard et al., 2019).

Üldiselt on meie tulemused nende varasemate uuringutega kooskõlas, tõstes esile Notchsignalingi ja Pax{0}}seotud geenid. Siiski on nendes varasemates uuringutes käesoleva aruandega võrreldes mõningaid eksperimentaalseid erinevusi. GFP-d ekspresseerivate nefroni eellasrakkude eraldamine fluorestsents-aktiveeritud raku abil Six2-TGC transgeeni reporterhiirelt on potentsiaalselt segaduses järeldusega, et selle alleeli nefronite arv on vähenenud ligikaudu 45 protsenti (Hilliard et al. , 2019; Volovelsky et al., 2018). Lisaks on näidatud, et kultiveeritud nefroni eellasrakkudel (kasvatatud kas väikese või suure annusega CHIR-iga) on primaarsetest nefroni eellastest erinevad transkriptoomid, mis viitab sellele, et ka nende kromatiini kättesaadavus oleks erinev (Guo et al., 2021; Hilliard et al., 2019). Kuna meie uuringu eesmärk oli mõista, kuidas kromatiini maastiku muutused mõjutavad miRNA ekspressiooni varases ja hilises nefroni eellasrakkudes, oli vajalik primaarsete nefroni eellaste analüüs.

Cistanche on neerudele parem

Kombineerides need kromatiini keskkonnas täheldatud muutused miRNA ekspressiooni sobivate muutustega, kaasame nefrogeneesi peatamisse edasiseks uurimiseks mitu uut oletatavat miRNA-võimendaja paari. Näiteks miRNA-d miR-125a-5p ja let-7c-5p näevad ekspressiooni olulist suurenemist E14.5 ja P0 vahel. , ja seda kirjeldab DAR-i (chr16:77,719,058 77,720,407) kasvav ligipääsmatus samas TAD-is. See DAR on seotud ka Six2 sidumissaidiga (Guo et al., 2021) ja võib tähistada võimendajat, mis mõjutab miR-125a-5p ja/või let{{18} }c-5p, mis omakorda võib soodustada eristumist Lin28b represseerimise kaudu. Samamoodi jälgime miR 181a võimalikku võimendajat, mis teadaolevalt moduleerib reniini ekspressiooni inimestel (Marques et al., 2015) ja mida on peetud terapeutiliseks sihtmärgiks nefrotoksilisuse vähendamisel, kuna see suudab represseerida BIRC6 ja apoptoosi (Liu et al., 2015) al., 2018). Lõpuks jälgime sulgevat DAR-i, mis on seotud miR-9-3p-ga, millel on Wnt signaalidele reageerivate valkude Snai1 ja Snai2.miR-9-3p pöördkomplemendi, miR-9-5p transkriptsioonifaktori jalajäljed. eest kaitstakse teadaolevaltneerudfibroos (Fierro-Fernández et al., 2020), Snai1 ja Snai2 on näidanud, et need soodustavad kartsinoomi metastaase hiire nahavähirakkudes (Olmeda et al., 2008) ja soodustavad epiteeli-mesenhümaalseid üleminekuid (EMT) vähihaigetel. (Sundararajan et al., 2019), samas kui miR-9 soodustab teadaolevalt angiogeneesi ja kasvaja endoteelirakkude migratsiooni (Zhuang et al., 2012). Võib eksisteerida mehhanism, mille korral suurenenud Wnt signaalimine põhjustab Snai1 ja Snai2 vähenenud ekspressiooni, mis omakorda vähendab miR-9-3p ekspressiooni, et toetada nefroni eellasrakkude diferentseerumist.

Meie uuring tuvastas igakülgselt muutused nefroni eellaste kromatiini maastikus ja miRNA transkriptsioonis embrüonaalse arengu ajal ning oleme tuvastanud kandidaadid cis-reguleerivad piirkonnad ja miRNA, mis võivad mängida rolli nefrogeneesi peatamisel. Nii mRNA-seq kui ka ATAC-seq andmete rikastusanalüüsid annavad köitvaid vihjeid mehhanismide kohta, mis võivad olla kaasatud, näiteks teed, mis reguleerivad nefroni eellaste diferentseerumist, sealhulgas Notch ja TGF-. Samuti teatame kahest uudsest oletatavast regulatiivsest elemendist Eya1 ja Pax8 jaoks, geenid, mis on teadaolevalt olulisedneerudareng ja võimalikud regulatiivsed järjestused võtme miRNA jaoks, mis on seotud nefrogeneesi peatamisega.

meetodid

Hiire tüved

Metsiktüüpi CD{0}} ajapaaritatud tiined emased saadi ettevõttest Charles River Laboratories, Inc. (Wilmington, MA, USA, RRID: MGI:5659424) janeerudkoguti pesakondadest embrüonaalsel päeval E14.5 või P0. Kõik loomad paigutati Pittsburghi UPMC lastehaigla Rangose ​​uurimiskeskuse (Pittsburgh, PA, USA) vivaariumisse ja kõik loomkatsed viidi läbi vastavalt ülikooli institutsionaalse loomade hooldamise ja kasutamise komitee poliitikale. Pittsburgh. Iga embrüo või poegade sugu tuvastati PCR-i abil sabalõiketest eraldatud genoomse DNA-ga, kasutades Y-kromosoomi geeni Sry jaoks järgmisi praimereid: SryF 5ʹ-GATGATTTGAGTGGAAATGTGAGGTA-3ʹ ja SryR 5ʹ-CTTATGTTTATAGGCAT,-3GTA', varem avaldatud (McFarlane et al., 2013).

Väikese RNA sekveneerimine ja analüüs

Kogu RNA isoleeritudnefroni eellasrakudjärelejäänud ATAC-seq rakufraktsiooni eemaldamine esitati Pittsburghi UPMC lastehaigla Health Sciences Sequencing Core'ile raamatukogu ettevalmistamiseks, kasutades QIAseq miRNA raamatukogu ettevalmistuskomplekti (Qiagen 3315{{10}}2). MRNA-seq raamatukogude üheotsaline sekveneerimine viidi läbi Illumina NextSeq500 abil ja raamatukogud sekveneeriti umbes 50 miljoni ühe otsaga lugemise sügavusele raamatukogu kohta. Seejärel joondati järjestatud lugemised hiire mm10 genoomiga, kasutades paketti Rsubread (Liao et al., 2019) (versioon 2.0.1) ja lisati annotatsioonid teadaolevale miRNA-le, mis on loetletud miRBase'is (versioon 22) (Kozomara & Griffiths-Jones, 2014). paketi Rsubread funktsiooniga Counts. Tuntud miRNA diferentsiaalset ekspressiooni mõõdeti DESeq2 R paketi (versioon 1.26.0) abil (Love et al., 2014). Teadaoleva miRNA-ga annoteeritud joondatud lugemiste osa ja emaste embrüote osa proovi kohta lisati DESeq2-le esitatud testimismudeli kofaktoritena. Seejärel tuvastati diferentsiaalselt ekspresseeritud miRNA, kontrollides valede avastamise määra 5 protsendi juures, ja nende muutumise suund (suurenemine vs. kahanemine) määrati nende kordne muutuse väärtuse põhjal ("suurenemine", mis näitab kõrgemat ekspressiooni P0 juures võrreldes E14.5-ga). . Regulatiivsete radade rikastumine miRNA ennustatud geenisihtmärkide vahel koos oluliselt suureneva ja väheneva ekspressiooniga arvutati DIANA tööriistade miRPath versiooni 3.0 abil (Vlachos et al., 2015). MiRNA prognoositud sihtmärk-transkriptid saadi TargetScani (Agarwal et al., 2015) ja miRDB (Y. Chen & Wang, 2020) hoidlatest.

Nefroni eellasrakkude isoleerimine

Neerudlõigati {{0}} E14.5 embrüote või P0 poegade pesakondadest ja iga pesakond loeti üheks prooviks. RNA täielikuks isoleerimiseks kasutati proovi kohta ühte neeru, mida kasutati järgnevates analüüsides "terve neeru kontrollina" (vt allpool). Igal ajahetkel koguti kokku kolm proovi. Seejärel eraldati igast proovist kortikaalsed rakud, kasutades magnetiliselt aktiveeritud rakkude sorteerimist (MACS), nagu varem avaldatud (Brown et al., 2011). Lühidalt, neerud lagundati osaliselt 2 mM kollagenaas A-ga (Roche 11088793001) ja 3,5 mM pankreatiiniga (Sigma P1625) fosfaatpuhverdatud soolalahuses (PBS) 15 minutit temperatuuril 37 kraadi. Seedimisreaktsioon peatati külma 100% veise looteseerumi (FBS) abil ning rakususpensioon koguti ja resuspendeeriti külmas Dulbecco fosfaatpuhverdatud soolalahuses (DPBS) koos 1 mM fenüülmetüülsulfonüülfluoriidi (PMSF) proteaasi1 inhibiitoriga (Sigma-Aldrich 10803). Rakud pesti ja resuspendeeriti jääkülmas isoleerimispuhvris, mis sisaldas 2% FBS-i PBS-is, seejärel inkubeeriti magnethelmestega (Dynabeads FlowComp Flexi komplekt, ThermoFisher 11061D), mis olid biotinüülitud Integrin alfa 8, AF R&D078 (AF4 R&D078) antikehade suhtes. kasutades DSB-X Biotin Protein Labeling Kit (ThermoFisher D-20655). Nende helmestega seotud nefroni eellased isoleeriti nagu varem avaldatud (Hemker et al., 2020) ja ühendati iga proovi jaoks neerude vahel. 50,{29}} nefroni eellasraku alikvooti töödeldi kohe läbikromatiini juurdepääsetavusraamatukogu ettevalmistamise protokolli (vt allpool) ja kogu RNA ekstraheeriti ülejäänud rakususpensioonist, kasutades Qiagen miRNeasy Mini komplekti (Qiagen 217004).

Rikastumise kinnitamiseksnefroni eellasrakudvõrreldes teiste rakutüüpidega eraldati kogu RNA nii nefroni eellastest kui ka tervestneerud(kogu neeru kontroll, vt eespool) ja kvantitatiivne pöördtranskriptsiooni PCR (qRT-PCR) viidi läbi järgmiste markerite jaoks: nefroni eellasmarkerid Six2 ja Cited1 (L. Huang et al., 2016) ning Lhx1, Pdgfr, Pekaanipuu ja Caleb, mis märgivad neerupõiekesi (Brunskill et al., 2014), neeru stroomi (S. Chen et al., 2015), endoteeli (Kobayashi et al., 2008) ja kusejuha (Cebrian et al., 2014a) ) rakud vastavalt; vt ka Täiendav joonis 1. Gapdh (Barber et al., 2005) kasutati majapidamisgeenina ja suhteline kvantifitseerimine arvutati 2-ΔΔCt meetodi abil (Livak & Schmittgen, 2001). Nende transkriptide praimerid on toodud tabelis 2.

Tabel 2. RT-PCR praimerid.

Kromatiini juurdepääsetavusraamatukogu ettevalmistamine

Umbes 50,000nefroni eellasrakudkasutati iga ATAC-seq sekveneerimisraamatukogu genereerimiseks, kasutades Nextera DNA Flex Library Prep Kit (Illumina FC-121-1030) koos modifikatsioonidega vastavalt varem avaldatud meetodile (Buenrostro et al., 2013). Lühidalt öeldes suspendeeriti rakud raku lüüsimiseks 10 minutiks jääkülmas mitteioonses lüüsipuhvris, mis sisaldas 10 mM Tris, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 1 mM PMSF proteaasi inhibiitor ja 0,05 mahuprotsenti Triton X-100. membraane, jättes tuumamembraanid puutumata. Intaktsed nefroni eellastuumad resuspendeeriti transpositsioneerimispuhvris, mis sisaldas transposaasi ensüümi, ja inkubeeriti 37 kraadi juures 30 minutit. Transpositsiooniprotsessi käigus vabanenud vaba genoomne DNA puhastati MinElute PCR puhastuskomplekti (Qiagen 28004) abil ja seejärel indekseeriti Nextera Index Kit (Illumina FC{19}} päri- (i7) ja pöörd- (i5) indeksi praimerite abil. Indeksi ligeerimine ja fragmentide amplifikatsioon saavutati meetodi PCR amplifikatsiooni termilise tsükli programmi abil.

ATAC-seq raamatukogu jaoks vajalike amplifikatsioonitsüklite optimaalse arvu määramiseks viidi läbi qPCR kõrvalreaktsioon, kasutades SsoAdvanced SYBR Supermixi (BioRad 1725274) ja 96-kaevu C100 Thermal Cycler (Bio-Rad), et arvutada normaliseeritud väärtus. reporteri väärtus (Rn) iga tsükli jaoks. Tsükliarv, mille juures reaktsioon saavutas ühe kolmandiku oma maksimaalsest fluorestsentsist, tuvastati optimaalse järelejäänud amplifikatsioonitsüklite arvuna ja ülejäänud indekseeritud ATAC-seq transpositsioonireaktsiooni maht allutati sellele arvule täiendavatele tsüklitele lõplikus amplifikatsioonis. programm. Lõplikud raamatukogud puhastati Ampure XP magnethelmestega (Beckman Coulter A63881).

Kromatiini juurdepääsetavusjärjestamine

ATAC-seq teegi paarisotsa sekveneerimise teostas Pittsburghi UPMC lastehaigla Health Sciences Sequencing Core Illumina NextSeq500, multipleksiti raamatukogu kontsentratsioonidega, mille tulemuseks on eeldatavasti 90 miljonit paarisotsaga lugemist proovi kohta. . Lugemist kärbiti kvaliteetselt TrimGalore'i (BabrahamLab, 2014) (versioon 0.4.3) abil režiimis "--paired" ja muude vaikeseadetega. Lugemised joondati mm10 genoomiga (Church et al., 2011), kasutades Bowtie2 (Langmead et al., 2009) (versioon 2.3.1) seadetega "--local -q -X 2000 -- m". Sama DNA fragmendi PCR duplikaatide tulemusel saadud lugemised märgiti Picard Toolsi (Broad Institute, 2016) funktsiooni MarkDuplicates (versioon 2.10.9) abil vaikeseadetega. Lugemised, mis kaardistati mitmetähenduslikult rohkem kui ühe asukohaga genoomis, määrati juhuslikult ühte nendest asukohtadest, kui võimalust oli vähem kui neli, ja muul viisil elimineeriti (ENCODE, nd) (kasutades Pythoni skripti, mis on saadaval aadressil https://github). com/kundajelab/atac_dnase_pipelines, (Lee, 2017) seadetega "--paired-end -k"). Samtoolsi (H. Li et al., 2009) (versioon 1.3.1) kasutati dubleeritud, kaardistamata, orvuks jäänud ja mitokondriaalsete lugemiste filtreerimiseks, samuti BAM-failide sortimiseks ja indekseerimiseks. ATAC-seq andmete kvaliteedikontroll järgis projekti ENCODE ATAC-seq juhiseid (ENCODE, nd) ja näidisteegid valiti juhuslikult allapoole, et igaüks sisaldaks 31 miljonit paarisotsa lugemist, et normaliseerida raamatukogu suuruste erinevusi.

Cistanche võib ära hoida neeruinfektsiooni

Ligipääsetavate kromatiini piirkondade tuvastamine

Filtreeritud ATAC-seq lugemisi sisaldavad BAM-failid teisendati paarisotsa BED-vormingusse, kasutades Bedtoolsi (Quinlan & Hall, 201{{20}}) (versioon 2.26.0) 'pommitatud ' funktsioon seadetega "- bed pe -mate1". Ligipääsetava kromatiini piirkonnad tuvastati ChIP-seq tööriista mudelipõhise analüüsi (MACS2, versioon 2.1.1.20160309) laia tipptaseme helistamisalgoritmi (Zhang et al., 2008) abil seadetega "--format BEDPE {{ 18}}g mm -p 0.{21}}lai --nihutus 37 --teksti suurus 75 --keep-dup all --mudel". Suure usaldusväärsusega ligipääsetavate piirkondade tuvastamiseks viidi läbi paaripõhised võrdlused (iga korduste kombinatsiooni kohta antud ajapunktist) ja arvutati reprodutseerimata avastamismäär (IDR) (Q. Li et al., 2011), kasutades avalikult kättesaadavat Pythoni juurutamine (GitHub https://github.com/nboley/idr) (Boleu et al., 2015) seadetega "--input-file-type wide peak --rank p.value {{ 35}}pehme IDR-lävi 0.{39}}väljundfaili tüüpi voodi". Täpsemalt esitati iga ajahetke jaoks kõigi juurdepääsetavate piirkondade konkateneeritud BED-fail iga võrdluse argumendi "--peak-list" kaudu (näiteks kahe E14.5 proovi võrdlemisel on kõik E14.5 laiad piigid kasutatakse kõigi kolme korduse vahel). Ligipääsetavuse piirkonnad, mis olid IDR-i järgi järjepidevad vähemalt kahes paaripõhises kordusvõrdluses (vähemalt 20-protsendilise kattumisega), ühendati ühtseks suure usaldusväärsusega juurdepääsetavate piirkondade kogumiks ("IDR-i piirkonnad").

Muutused juurdepääsetavates kromatiini piirkondades

Iga IDR piirkonna juurdepääsetavus antud proovis kvantifitseeriti, loendades transpositsioonisündmuste arvu, mis toimusid proovide järjestuse GC-sisalduse normaliseerimisel. See saavutati kohandatud skripti abil (saadaval kaasasolevas tarkvarahoidlas, vt lisaandmeid). Selle juurdepääsetavuse muutused määrati seejärel nende väärtuste võrdlemisel ajapunktide lõikes, kasutades tarkvarapaketti Limma-voom (versioon 3.42.2) (Ritchie et al., 2006). Embrüo soo arvessevõtmiseks lisati igas proovis emaste embrüote osa kofaktorina diferentsiaalse ligipääsetavuse analüüsi jaoks kasutatud lineaarsetes mudelites ja see eemaldati visualiseerimistes partiiefektina, kasutades Limma paketi partiiefekti eemaldamise funktsiooni. Erinevalt ligipääsetavad kromatiini piirkonnad (DAR) peeti märkimisväärselt avanevateks (suurenenud juurdepääsetavus vahemikus E14.5 kuni P0) või sulguvateks (juurdepääsetavus E14.5 ja P0 vahel vähenenud), kui kontrolliti valetuvastussagedust 10 protsendi juures. . Genoomiliste piirkondade avamise ja sulgemise funktsionaalse rikastamise analüüsid määrati, esitades vastavad koordinaadid Genomic Regions Enrichment of Annotations Toolile (GREAT, saadaval aadressil http://great.stanford.edu/public/html/) (McLean et al., 2010). ). Tuntud ja prognoositud võimendajate annotatsioonid saadi FANTOM5 (Andersson et al., 2014), VISTA (Visel jt, 2007) ja EnhancerAtlas 2.0 (Gao & Qian, 2020) hoidlatest.

Transkriptsioonifaktori jalajäljed

Transkriptsioonifaktori jalajäljed tuvastati, ühendades kõik BAM-failid samast ajahetkest, seejärel käivitades Regulatory Genomics Toolboxi Hmm-põhise TF-jälgede tuvastamise (HINT) tarkvara (versioon 0.12.3), täpsemalt ATAC-i jalajälje mudeli. -seq andmed (saadaval aadressil www.regulatory-genomics.org ) (Z. Li et al., 2018). Seda tarkvara käitati seadetega "right-hint footprinting --organism=mm10 --at-seq --paired-end". Seejärel märgiti jalajälgedele teadaolevad hiire sidumismotiivid andmebaasist HOCOMOCO 11 (Kulakovskiy et al., 2018), kasutades HINTi motiivide sobitamise funktsiooni seadistustega "parempoolse motiivi analüüs, mis sobib --organism=mm10". Jäljed, mille HINT skoor oli alla 10, jäeti välja. Lõpuks mõõdeti motiiviga sobitatud jalajälgede diferentsiaalseid aktiivsusmustreid, kasutades programmi RGT-HINT diferentsiaalfunktsiooni seadetega "parempoolse vihje diferentsiaal --organism=mm10 --bc {{27} }NC 12 --väljundprofiilid". Oluliselt muutuvad aktiivsustasemed tuvastati p-väärtuse piirväärtuse 0, 05 põhjal (Friedmani-Nemeny meetod).

Cistanche võib parandada neerufunktsiooni

Nukleosomaalne konfiguratsioon

Samast ajapunktist pärit joondatud lugemised koondati üheks BAM-failiks ja NucleoATAC-i paketti (versioon 0.3.4) kasutati lugemispikkuste mustrite tuvastamiseks, mis viitavad nii seotud nukleosomaalsetele diaadidele kui ka nukleosoomivabadele piirkondadele ( NFR-id) (Schep et al., 2015). See tarkvara käivitati vaikeseadeid kasutades. Nukleosoomid märgiti 146 aluspaari pikkuse piirkonnana, mille keskpunkt oli iga nukleosoomidüaadi ümber.

Üherakuline RNA ekspressioon

Üherakulisi geeniekspressiooni andmeid töödeldi eelmise käsikirja jaoks (BioRxiv https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.09.16.300293v1) (Bais et al., 2020) ja need saadi Gene Expression Omnibusist (GEOID GSE158166). Täiendavale joonisele 7 lisatud töödeldud andmed hõlmavad rakutüüpe, geeniekspressioonitasemeid, madaladimensioonilisi (tSNE) manuseid ja pseudoaja annotatsioone, mis on seotud prolifereeruvate ja diferentseeruvate nefroni eellaste klastrite vahel loodud trajektooriga. Andmetele juurdepääseti ja neid korraldati SingleCellExperiment R paketi abil (Lun & Risso, 2019).

miRNA-mRNA interaktsioonid nefroni eellasrakkude vananemisel ja diferentseerumisel

Geenid, millel on muutuv väljendus iseuuenev, eelnev ja eristuvnefroni eellasrakudsaadi täiendavatest tabelitest 3 ja 4, mille on avaldanud Bais et al. (FDR< 0.1="" for="" all="" genes,="" 99="" genes="" total).="" mirtarbase="" v8.0="" for="" the="" mouse="" was="" downloaded="" (https://mirtarbase.cuhk.edu.cn/~mirtarbase/mirtarbase_2022/cache/download/8.0/mmu_mt="" i.xls)="" while="" mirdb="" version="" 6.0="" predictions="" were="" obtained="" from="" the="" mid="" b="" website="" (y.="" chen="" &="" wang,="" 2020);="" high-quality="" mirna-to-target-gene="" predicted="" interactions="" with="" a="" minimum="" score="" of="" 90="" were="" considered.="" annotated="" mir="" target="" genes="" and="" differentially="" expressed="" genes="" were="" then="" intersected="" using="" the="" r="" programming="" environment="" to="" generate="" figure="" 2="" and="" supplemental="" table="">

Kromatiini immunosadestamise sekveneerimine primaarsetes nefroni eellasrakkudes

Kromatiini immunosadestamise sekveneerimise (ChIP-seq) andmed -kateniini, Lef1, Six2 ja Tcf7 seondumise kohta primaarsetes nefroni eellasrakkudes saadi Guo et al., 2021. aasta GEO hoidlas (GSE131119) asuvatest BedGraphi failidest. kordusproovide vahel.

MiRNA ekspressiooni mõjutavate regulatoorsete elementide sõelumine

MiRNA potentsiaalsete võimendajate skriinimiseks märkisime miRNA-d ja DAR-id topoloogiliselt seotud domeenidega (TAD-dega), milles need asuvad, põhinedes hiire embrüonaalsete tüvirakkude mm10 annotatsioonidel, mis on alla laaditud 3D genoomibrauserist (saadaval aadressil http://3dgenome). .fsm.northwestern.edu/) (Y. Wang et al., 2018). Piirkonnadkromatiini juurdepääsetavusja miRNA-d peeti võimendajakandidaatideks - miRNA paarideks, kui nad hõivasid sama TAD-i ja näitasid järjekindlaid muutusi juurdepääsetavuses ja ekspressioonis (juurdepääsetavus suurenes miRNA ekspressiooni suurenemisega ja vastupidi). DAR-e peeti võimalikeks "regulatiivseteks tunnusteks" ainult siis, kui need ei kattu tuntud promootori või eksoni otsaga. Potentsiaalsed miRNA ja oletatavate regulatoorsete elementide paarid olid prioriteediks, kui need 1) langesid samasse TAD-i ja 2) kogesid olulisi muutusi E14.5 ja P0 vahel (suurendades miRNA ekspressiooni ja suurendades IDR piirkonna juurdepääsetavust ja vastupidi) .

Tänuavaldused

Shelby Hemker ja Abha Bais aitasid kaasa eksperimentaalsele disainile. ATAC-seq ja mRNA-seq sekveneerimise viis läbi Pittsburghi UPMC lastehaigla Health Sciences Sequencing Core.

Konkureerivad huvid

Konkureerivaid huve ei ole deklareeritud

Rahastamine

AC-d toetasid riikliku diabeedi ja seedimise instituudi toetused jaNeerriikliku terviseinstituudi (T32DK061296-17) alla kuuluvad haigused. DK-d toetati riikliku terviseinstituudi riikliku üldmeditsiiniteaduste instituudi (R01GM115836) toetustega. JH-d toetasid riikliku tervishoiuinstituudi riikliku diabeedi ning seede- ja neeruhaiguste instituudi stipendiumid (R01DK103776 ja 125015). DMC-d toetasid Nephrotic Syndrome Study Network (NEPTUNE) karjääriarengu auhind ja Pittsburghi teadusnõuandenõukogu lastehaigla järeldoktorantuuri stipendium. YP-d toetasid Pittsburghi UPMC lastehaigla ja Põhja-Ameerika mitokondriaalsete haiguste konsortsiumi toetused.

Andmete kättesaadavus

Prognoositavad hiire võimendajad saadi FANTOM5-st (DOI: 10.1038/nature12787; fail on saadaval siit), Vistast (DOI: 10.1093/var/gkl822; fail on saadaval siin) ja EnhancerAtlasest (DOI: 10.1093/var/gkz980); hiirefailid on saadaval siit; andmebaasid. Hiire mm10 genoom ja selle annotatsioonid laaditi alla Illumina genoomide projekti kaudu (saadaval siin). Ahelaülene fail mm9 koordinaatide tõstmiseks mm10-le saadi UCSC genoomibrauserist (DOI: 10.1101/gr.229102; fail on saadaval siin). Hiire embrüonaalsete tüvirakkude TAD-märkused saadi 3D genoomibrauserist (DOI: 10.1186/s13059-018-1519-9; fail on saadaval siin). Prognoositavad miRNA transkripti sihtmärgid saadi TargetScanist (DOI: 10.7554/eLife.05005, fail on saadaval siin) ja miRDB versioonist 6 (DOI: 10.1093/var/gkz757, fail on saadaval siin). ATAC-seq andmed, sealhulgas IDR/DAR asukohad, annotatsioonid ja diferentsiaalse rikastamise tulemused, on saadaval GEO-s (GSE168339), nagu ka mRNA-seq andmed, sealhulgas annotatsioonid ja diferentsiaalekspressiooni tulemused (GSE168342). Andmete töötlemiseks ja analüüsimiseks ning arvude genereerimiseks kasutatav arvutikood on saadaval aadressil https://bitbucket.org/clugstonA/mirna_enhancers

Bibliograafia

Abruzzese, MP, Bilotta, MT, Fionda, C., Zingoni, A., Soriani, A., Petrucci, MT, Ricciardi, MR, Molfetta, R., Paolini, R., Santoni, A. ja Cippitelli, M (2019). Homeoboksi transkriptsioonifaktor MEIS2 on vähirakkude ellujäämise ja IMiD-de aktiivsuse regulaator hulgimüeloomi korral: moduleerimine bromodomeeni ja ekstra-terminaalsete (BET) valgu inhibiitoritega. Rakusurm ja -haigused, 10(4). https://doi.org/10.1038/s41419-019-1562-9

Agarwal, V., Bell, GW, Nam, JW ja Bartel, DP (2015). Tõhusate mikroRNA sihtmärkkohtade ennustamine imetajate mRNA-des. ELife. https://doi.org/10.7554/eLife.05005

Andersson, R., Gebhard, C., Miguel-Escalada, I., Hoof, I., Bornholdt, J., Boyd, M., Chen, Y., Zhao, X., Schmidl, C., Suzuki, T ., Ntini, E., Arner, E., Valen, E., Li, K., Schwarzfischer, L., Glatz, D., Raithel, J., Lilje, B., Rapin, N., … Sandelin, A. (2014). Inimese rakutüüpide ja kudede aktiivsete võimendajate atlas. Loodus, 507(7493), 455–461. https://doi.org/10.1038/nature12787

BabrahamLab. (2014). Kärbi Galore. Bioinformaatikas. http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore

Bais, AS, Cerqueira, DM, Clugston, AS, Ho, J., & Kostka, D. (2020). Üherakuline RNA sekveneerimine näitab rakutsükli diferentsiaalset aktiivsust võtmerakkude populatsioonides nefrogeneesi ajal. BioRxiv. https://doi.org/https://doi.org/10.1101/2020.09.16.300293

Barber, RD, Harmer, DW, Coleman, RA ja Clark, BJ (2005). GAPDH kui majapidamisgeen: GAPDH mRNA ekspressiooni analüüs 72 inimese koest koosnevas paneelis. Füsioloogiline genoomika. https://doi.org/10.1152/physiolgenomics.00025.2005

Bartel, DP (2009). MicroRNA sihtmärgi tuvastamine ja reguleerivad funktsioonid. Cell, 136 (2), 215–233. https://doi.org/10.1016/j.cell.2009.01.002.MicroRNA

Bertram, JF, Douglas-Denton, RN, Diouf, B., Hughson, MD ja Hoy, WE (2011). Inimese nefroniarv: mõju tervisele ja haigustele. Pediatric Nephrology, 26(9), 1529–1533. https://doi.org/10.1007/s00467-011-1843-8

Boleu, N., Kundaje, A., Bickel, PJ ja Li, Q. (2015). Reprodutseerimatu avastamismäär (2,0,3). https://github.com/nboley/idr

Bouchard, M., Souabni, A., Mandler, M., Neubüser, A., & Busslinger, M. (2002). Pax2 ja Pax8 nefrilise päritolu spetsifikatsioon. Geenid ja areng. https://doi.org/10.1101/gad.240102

..............

Alates: Journal Pre-proof

2021 Väljaandja Elsevier Inc.