Siirdamiseelse ja -järgse neeru äratõukereaktsiooni iseloomustamine B-rakkude immuunrepertuaari järjestuse järgi
Mar 16, 2022
Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791
Immuunsüsteemi repertuaari uurimine elundisiirdamise kontekstis annab olulist teavet selle kohta, kuidas adaptiivne immuunsus võib kaasa aidata ja moduleerida siiriku äratõukereaktsiooni. Siin iseloomustame isikute perifeerse vere immuunrepertuaari enne ja pärastneerudsiirdamine, kasutades B-rakkude retseptori sekveneerimist pikisuunalises kliinilises uuringus. Isikutel, kellel tekib pärast siirdamist äratõukereaktsioon, on enne siirdamist mitmekesisem immuunrepertuaar, mis viitab eelsoodumusele siirdamisjärgse äratõukereaktsiooni tekkeks. Lisaks näitavad 2-aastase jälgimisperioodi jooksul äratõukereaktsiooniga patsiendid spetsiifilist laiendatud kloonide komplekti, mis püsivad pärast äratõukereaktsiooni. Kuigi perifeersete B-rakkude mitmekesisus on üldiselt vähenenud, mis on tõenäoliselt tingitud suurenenud üldisest immunosupressiooniga kokkupuutest selles kohordis, toetab spetsiifilise IGHV geenikasutuse tuvastamine kõigis äratõukereaktsioonis patsientides, et ühine immunogeensete antigeenide kogum võib põhjustada siirdamisjärgset äratõukereaktsiooni. Meie leiud võivad avaldada kliinilist mõju neerutransplantaadi äratõukereaktsiooni ennustamisele ja kliinilisele juhtimisele.
Neersiirdamine on lõppstaadiumis neeruhaiguse (ESRD) ja kroonilise neeruhaiguse eelistatud ravineerudhaigus. Kuigi doonori/retsipiendi inimese leukotsüütide antigeenide (HLA) l histo-sobivuse testimise põhjal on tehnoloogiaid ja kudede sobitamist oluliselt täiustatud, on siiriku tulemuse ennustamine endiselt lahendamata probleem. Mõõdetud kudede mittevastavus teistes väiksemates mitte-HLA lookustes23 võib samuti põhjustada alloimmuunkahjustusi ägeda ja kroonilise äratõukereaktsiooniga, mille tulemuseks on halvad pikaajalised transplantaadi tulemused4. Veelgi enam, umbes 50 protsentineerudallotransplantaadid, ilma suuremate HLA mittevastavusteta, kaovad endiselt 10 aasta jooksul pärast siirdamist². Oleme varem oletanud, et mitte-HLA lookused võivad mõjutada retsipiendi immuunvastust tema vastu.neeruddonor graft6. More research needs to be done to better understand and predict the recipient's risk of rejection to substantially improve long-term patient and graft outcomes. Nevertheless, the diversity of the immune response to various immunogenic epi-topes is as yet, poorly understood. The role of T cells in organ transplant rejection has been demonstrated, but there is increasing appreciation of the additional role of B cells and antibodies in triggering this process8. In this regard, B-cell receptor sequencing(BCRSeq)is a promising high-throughput technique that allows the sequencing of millions of Immunoglobulin (Ig)regions in parallel to study the immune response. The key feature of B cells is their enormous diversity. Each individual is capable of producing >1013 erinevat antikeha0, mis võimaldab neil ära tunda suure hulga võõrantigeene. Inimese BCR või Ig koosneb kahest identsest raskest ahelast (I), mille moodustavad viis isotüüpi: IgM, IgD, IgA, IgE ja IgG, ning kahest kergest ahelast. Intaktne antikeha sisaldab muutuvat ja konstantset domeeni. Antigeeni sidumine toimub varieeruvas domeenis, mis tekib muutujate (V), mitmekesisuse (D) ja B-raku immuunrepertuaari moodustavate geenisegmentide (J) ühendamise teel, ning selle mitmekesisus on koondunud peamiselt komplementaarne määrav piirkond 3 (CDR3). Afiinsuse küpsemise protsessi käigus toimub muutuvas piirkonnas somaatiline hüpermutatsioon (SHM). Tugev adaptiivne immuunvastus sõltub B-raku kloonide laienemisest ja protsessist, mida nimetatakse afiinsusküpseks, mille käigus viiakse Ig geeni ümberkorraldustesse somaatilised mutatsioonid ja valitakse B-rakud, millel on suurem afiinsus antud antigeeni suhtes.
Elundite siirdamise immuunrepertuaari uurimine on ülioluline, et mõista, mis vallandab ja toetab äratõukereaktsiooni ning kuidas see võib lõpuks kiirendada siirdamise ebaõnnestumise teed. Järgmise põlvkonna järjestuse ja tugevate arvutusmeetodite edusammude abil saame VDJ piirkonda üksikasjalikult uurida, 12. Tänaseks on T-raku immuunrepertuaari analüüs aastalneerudsiirdamist on teostatud väga piiratud arvul patsientidel3-15 ja kuigi BCRSeq-i on rakendatud muude haiguste ja inimese immuunvastuste puhul, nagu hulgi-sdleroos6, gripivaktsiin7või immuunpuudulikkuse häired8, puuduvad siirdamise alased uuringud. tagasilükkamine. Seesneerudsiirdamine, BCRSeq on läbi viidud ainult tolerantsuse kontekstis, HLA sensibiliseeritudneerudsiirdamise kandidaadid, kes saavad desensibiliseerivat ravi20, ja B-rakkude infiltratsioon, võrreldes kloonide laienemist veres ja transplantaat2l. Veel üks siirdamise BCSeqi rakendus avaldati varem väikeses 12 südamesiirdamise retsipiendi rühmas.
Tunnistades immuunvastuse humoraalse õla tähtsust hilise transplantaadi äratõukereaktsiooni ja kroonilise allotransplantaadi ebaõnnestumise korral, iseloomustame perifeerse vere immuunrepertuaari, kasutades BCSeqi prospektiivses pikisuunalises uuringus. Leiame, et immuunrepertuaari mitmekesisus enne siirdamist on suurem neil inimestel, kes hülgavadneerudmis näitab ka teatud kloonide ja IGHV geenide laienemist 24-kuulise jälgimisperioodi jooksul. Need tulemused võivad aidata ennustada äratõukereaktsiooni riski enne siirdamist ja neil võib olla kliiniline mõju teatud antigeenide tuvastamisel, mis põhjustavad äratõukereaktsiooni.
Cistanche on hea neerufunktsioonile
Tulemused
Õppeained. Tegime BCRSeqi 83 perifeerses vereproovis 27 ainulaadselt patsiendilt ja teostasime joonisel 1 näidatud analüütilise torujuhtme. Selles uuringus võeti arvesse kolme kliinilise fenotüübi rühma, mis on määratletud Banffi kriteeriumide alusel 23, 24 ja kroonilise allotransplantaadi kahjustuse indeksi (CADI) skooriga saadud järjestikuste allotransplantaadi biopsiate pimestatud keskpatoloogia lugemite põhjal: mitteprogressorid (NP; n{6}}) oli madal mitteinkrementaalne CADI skoor ilma ägeda äratõukereaktsioonita, progresseeruvatel ilma tagasilükkamiseta (PNR;n=10) oli CADI skoor 2 aasta jooksul ilma tagasilükkamiseta ja progresseeruvatel patsientidel, kellel oli tagasilükkamine (PR; n=7) järk-järgult kõrged CADI-skoorid 2 aasta jooksul koos äratõukepisoodidega. Demograafia, põhjusedneerudimmuunsupressiooni kasutamine on toodud tabelis 1. Oluline on esile tuua mõned nende patsientide omadused. Vanemuuringus, kuhu need patsiendid kaasati, oli biopsiaga kinnitatud ägedate äratõukereaktsioonide määr üldiselt madal (17 protsenti) (keskmine {min, max}=12 {6,24}kuuline äratõukereaktsioon). Kõigil neil patsientidel oli madal immunoloogiline risk äratõukereaktsiooni tekkeks (tipppaneeli reaktiivse antikeha sensibiliseerimise staatus<20%), and="" also="" had="" low="" rates="" of="" generation="" of="" donor-specific="" antibody(dsa)and="" only="" two="" of="" the="" rejection="" phenotype="" patients="" included="" in="" the="" analysis="" had="" dsa.="" the="" generation="" of="" dsa="" to="" hla="" and="" mica="" was="" measured="" in="" all="" serial="" sera="" throughout="" the="" study25.="" national="" experience="" with="" similar="" immunosuppressive="" protocols="" in="" similar="" patient="" cohorts="" have="" confirmed="" similar="" good="" clinical="" outcomes="" and="" low="" rejection="">
B-raku immuunrepertuaari järjestamine. BCRSeq viidi läbi genoomse DNA (gDNA) proovidega, mis ekstraheeriti verehüüvetest 81 prooviga 27-st.neerudsiirdatud retsipientidele kolmel ajahetkel (0,6,24 kuud). Järjestus andis pärast kvaliteedikontrolli (vt meetodite jaotist) kokku 327 703 lugemist (keskmine 4045 proovi kohta). Tulemuste kinnitamiseks ja iga isotüübi edasiseks hindamiseks ekstraheerisime täiendavalt RNA sobivast PBMC-st, mis oli saadaval 55 proovi jaoks, mis koguti verehüübega samal ajal, ja teostasime täiendava DNA (cDNA) sekveneerimise sügavamal, saades 1 773 330 lugemist. IgD jaoks (keskmine 31 667 proovi kohta), 1 708 227 lugemist IgM jaoks (keskmine 30 504 proovi kohta), 973 444 lugemist IgA jaoks (keskmine 17 383 proovi kohta), 139 7345 lugemist IgG jaoks, 9,2 ja 24 ampli,{53/24 ampli }} näitab IgE (keskmine 5178 proovi kohta) (täiendav joonis 1). Iga isotüübi raamatukogud amplifitseeriti eraldi ja ühendati sekveneerimiseks; seetõttu ei ole isotüüpide võrdlev analüüs teostatav.
Nagu on näidatud joonisel fig 1b, määratlesime klooni kui rakkude rühma, mis põlvnevad ühisest esivanema molekulist, millel on sama IGHV ja IGHJ segment, sama CDR3 pikkus ja 90 protsenti CDR3-de nukleotiidide identsus, nagu on eelnevalt määratletud adaptiivse B uuringutes. -rakkude vastused'8. See määratlus võimaldab uurida mitmekesisust, jagatud või ühiseid koonuseid ja kloonide laienemist alloimmuunsuse kontekstisneerudsiirdamised. Unikaalsete koonuste arv isendi kohta igal ajahetkel on näidatud lisamaterjalis (täiendav joonis 1) barplotina. Andmeanalüüsi rangemaks muutmiseks diskonteerisime proove<100 clones="" (69="" samples="" from="" gdna="" and="" 55="" samples="" from="" cdna="" were="" left="" for="" further="" study.="" ige="" isotype="" was="" discarded="" completely="" due="" to="" a="" very="" small="" number="" of="" reads).="" in="" addition,="" we="" filtered="" outpatient="" 8="" in="" the="" np="" group="" from="" subsequent="" analysis,="" as="" we="" recognized="" after="" the="" run,="" that="" he="" had="" developed="" ebv+post="" transplant="" lymphoproliferative="" disease(ptld)at="" 2.2="" years="" post="">neerudsiirdamine, mida iseloomustab Epstein Barri vohamine
Joonis 1Üldine uuringukonveier.a Skemaatiline esitus antikehade struktuurist ja VDJ-rekombinatsiooni protsessist, mis vastutab immuunrepertuaaris tekkiva mitmekesisuse eest.b B-raku kloon, mis on määratletud kui ühise esivanema rakud ja uuringu analüütiline torujuhe: B-rakk gDNA ja cDNA sekveneerimine, mitmekesisuse analüüs, võttes arvesse kloonide arvu (rikkust) ja iga klooni sagedust (Shannoni entroopia), võrguanalüüs ning kloonide ja IGHV geenide analüüs
viirusega (EBV) nakatunud B-rakud. Me täheldasime sellel patsiendil 6. ajal kloonide arvu suurenemist, varem oli kloonide mitmekesisus väiksemneerudpärast siirdamist ja 24 kuud pärast neerusiirdamist. Kuna raamatukogusid amplifitseeriti muutumatust kogusest matriitsist, võis B-rakkude suurem osa veres kaasa tuua suurema arvu klonotüüpe, mis on sekveneeritud produktides esindatud. Selle patsiendi erineva ja ainulaadse patoloogilise protsessi tõttu jäeti see proov tulevasest analüüsist välja.
Siirdamiseelne B-rakkude mitmekesisus on seotud äratõukereaktsiooniga. Nagu on näidatud joonisel 1c, uurisime B-rakkude immuunrepertuaari mitmekesisust, võttes arvesse liigirikkust (unikaalsete kloonide arv) ja Shannoni entroopiat (võrrand (1) meetoditest) ajapunktide lõikes ja kliinilisi tulemusi, kasutades lineaarse regressiooni mudelit, võttes arvesse arvu. kloonide või entroopia kui sõltuva muutuja ja kliinilise tulemuse või SHM kui sõltumatu faktori muutuja. Repertuaar enneneerudsiirdamine PR-is oli oluliselt mitmekesisem kui NP-s (rikkus: P-väärtus=0.005, entroopia: P-väärtus=0.01), sama trend püsis ka 6 kuud pärastneerudsiirdamine (rikkus: P-väärtus=0.02, entroopia: P-väärtus=0,02) ja 2 aastat pärast siirdamist ei olnud eristatavaid rühmade erinevusi (joonis 2a). ja täiendav joonis 2). Siirdamisjärgsed cDNA sekveneerimisandmed näitasid sama suundumust suuremas repertuaari mitmekesisuses 6 kuud pärast siirdamist, peamiselt IgD isotüüpide puhul (rikkus: P-väärtus=0.02, entroopia: P-väärtus=0). 03) (joonis 2b ja täiendav joonis 2). Erinevatest demograafilistest ja kliinilistest muutujatest, nagu retsipiendi vanus, sugu, rass, doonori allikas, immunosupressiooni tüüp, HLA mittevastavus ja neerupuudulikkuse põhjus, saadud andmetele ei olnud segavat mõju. Kuna 1-aastase (andmete minimaalne vanus) ja 19-aastase (andmete maksimaalne vanus) B-raku vastus võib olla väga erinev, teostasime tundlikkuse analüüs, jättes need kaks patsienti välja, ja tulemused jäid oluliseks (NP vs PR ajahetkel 0: rikkus: P-väärtus=0.01, entroopia: P-väärtus=0.03). Teises immuunrepertuaari mitmekesisuse mõõtmises hindasime SHM-i, mis määratleti mutatsioonide sagedusena igas V geenisegmendis, ja leidsime suundumuse SHM-i arvu suurenemisele PR jaoks enne siirdamist ja kõrgema SHM-i suundumuse IgD isotüübis. PR-s 6 kuud pärast siirdamist (P-väärtus=0.06).
B-rakkude mitmekesisus muutub aja jooksul kliiniliste tulemuste järgi. Et teada saada, kas immuunrepertuaari mitmekesisus aja jooksul kliinilise tulemuse järgi muutub, modelleerisime pikisuunalised andmed lineaarsete segaefektide mudelite abil, võttes arvesse kliinilise tulemuse ja aja vahelist koostoimet. Leidsime, et NP ja PR käitusid pärast siirdamist aja jooksul erinevalt, näidates NP mitmekesisuse suurenemist ja PR mitmekesisuse vähenemist, samas kui PNR-i puhul jäi mitmekesisus aja jooksul muutumatuks. Seda täheldati gDNA (rikkus: P-väärtus=0.007, entroopia: P-väärtus=0.001, joonis 3a) ja kõigi cDNA isotüüpide puhul, kusjuures kõige olulisemad erinevused entroopias on IgM ja IgD isotüüpide jaoks (IgA: P-väärtus=0.07, IgD: P-väärtus=0.02, IgG: P-väärtus=0.05, IgM: P-väärtus=0.04, joonis 3b). Rikkuse graafikud koos vastavate P-väärtustega on näidatud lisajoonisel 3. Nagu graafikutel on täheldatud, on ühel isendil 32 kuu pärast lisaproov, mis võib tulemusi moonutada, mistõttu viidi läbi tundlikkuse analüüs, jättes selle proovi välja. analüüs ja sarnaste tulemuste vaatlemine, välja arvatud IgG ja IgM isotüübid, mille puhul olulisus on kadunud (gDNA-entroopia: P-väärtus=0.004. cDNA-entroopia: IgA: P-väärtus=0.1 , IgD: P-väärtus=0.05, IgG: P-väärtus=0.08, IgM: P-väärtus=0.1).
Bioloogiline ja tehniline proovide võtmine võib mõjutada mitmekesisust. Proovi mitmekesisus võib märkimisväärselt erineda repertuaari üldisest mitmekesisusest, kuna esindatud on vaid murdosa miljarditest rakkudest, mida nimetatakse puuduvate liikide probleemiks. Tehniline proovivõtt võib esineda, kuna iga proovi järjestussügavus ja teatud katsevigade määr võib erineda. Puuduvate liikide probleemi lahendamiseks kasutasime tööriista Recon (hinnatud kloonide rekonstrueerimine vaadeldud arvudest)29, mis hindab klooni üldist suurusjaotust. Recon väljastab täpsed ja kindlad hinnangud mitmekesisuse mõõtmise, sealhulgas rikkuse ja entroopia kohta, mis võimaldab üksikisikute vahelist mitmekesisust põhjalikult võrrelda. Järjestussügavuse ja teatud määral katsevigade käsitlemiseks viisime läbi alladiskreetimisstrateegia; väga hästi kasutatav strateegia immuunrepertuaari analüüsis11,17,30. Recon analüüsis (täiendav joonis S4: A-E) korrati gDNA andmete rikkust ja mitmekesisust. cDNA andmetes näitab aja 6 IgD isotüüp suundumust, kuid ei saavutanud tähtsust, kuigi IgA, IgD ja IgG isotüüpide pikisuunalisi tulemusi korrati. Alaproovi võtmise analüüsis (täiendav joonis S4: F–J) korratakse kõike, kuid gDNA andmete jaoks on aeg 0. See võib tuleneda diskreetimise piirangust
Joonis 2 Viiuli graafikud, mis näitavad kloonide arvu (rikkust) kolme kliinilise tulemuse lõikes. arv kloone korraga 0, 6 ja 24 gDNA proovidest. b Kloonide arv ajahetkel 6 cDNA proovide IgD isotüübi jaoks. P-väärtused saadakse lineaarse regressioonimudeli kohandamisel, võttes arvesse kloonide arvu kui sõltuvat muutujat ja kliinilist tulemust sõltumatu faktori muutujana (n=27 proovi). Viiuli graafikud näitavad andmete tõenäosustihedust iga väärtuse juures. Punktmarker tähistab kvartiilidevahelise vahemiku mediaanväärtust. Lähteandmed esitatakse lähteandmete failina
Joon. 3 Pikisuunalised andmed, mis on kujutatud iga kliinilise tulemuse jaoks sobiva joonega. Shannoni entroopiaga mõõdetud mitmekesisus, mida esindavad ajapunktide lõikes kolm gDNA kliinilist tulemust (NP, PNR, PR). b Shannoni entroopiaga mõõdetud mitmekesisus, mis on esindatud ajapunktide lõikes kolme kliinilise tulemusega (NP, PNR, PR) cDNA isotüüpide järgi. P-väärtused vastavad interaktsiooni terminile, mis on määratud aja × kliinilise tulemusega, kohandades lineaarset segaefekti mudelit (n=27 proovi). Iga punkt tähistab entroopiat proovi kohta kogu aja jooksul koos selle kohandatud joone ja usaldusvahemikuga. Lähteandmed esitatakse lähteandmete failina
strateegiad, eriti gDNA andmete puhul, kus järjestuste arv on palju väiksem kui cDNA andmetel. Piisava järjestuse säilitamiseks piirasime gDNA-s analüüsi üksikisikutega, kellel on vähemalt 1 000 klooni. Vähendatud proovide võtmine viidi läbi minimaalselt 1062 kloonini, võrreldes 62 173 klooniga cDNA-s. Vaatamata sellele piirangule jälgisime aja 0 suundumust, säilitasime gDNA pikisuunalise analüüsi olulisuse ja kordasime kõiki cDNA seoseid. Mõlemas analüüsis (recon ja downsampling) kordasime tulemusi vaatamata mõningatele siin esile tõstetud piirangutele, näidates eelnevalt teatatud tulemuste kehtivust.
B-raku võrgud näitavad kloonide laienemise erinevusi. B-raku repertuaari saab loomulikult kujutada võrgustikuna, mis põhineb järjestuste mitmekesisusel31. Meie andmetes töötasime välja iga proovi jaoks visuaalse võrgu (joonis 4 ja täiendavad joonised 5-7), kus iga tipp esindas ainulaadset BCR-i ja nende nukleotiidjärjestuste põhjal identsete BCR-ide arv määras tipu suuruse. Tippude vahel eksisteerib serv, kui need kuuluvad samasse klooni, nii et B-rakkude klastreid saab näidata omavahel ühendatud tippude rühmadena, mis moodustavad klooni. Võrgu kvantifitseerimiseks kasutasime Gini indeksit, mis on ebatasasuse mõõt, mida rakendati tippude ja klastri jaotustele. Kui rakendatakse tipu suurusele Gini(V), on esindatud üldine klonaalne olemus. Kui Gini(V) on lähemal 1-le, on tipud ebavõrdsed, näidates mõne neist laienemist, ja vastasel juhul on tipud 0-le lähemal. Klastri suurusele Gini(C) rakendades on esindatud kloonide domineerimine. Kui see on lähemal 1-le, on klastrid ebavõrdsed ja esindavad seetõttu domineerivaid kloone, kui aga väärtusele 0 lähemal, on kõik klastrid võrdse suurusega.
Joonisel 4 on näide märgatavatest visuaalsetest ja kvantitatiivsetest erinevustest iga kolme kliinilise tulemuse rühma esindavate B-rakkude repertuaaride vahel kolmel erineval ajahetkel (siirdamiseelne ja siirdamisjärgne 6 ja 24 kuud) . PR-repertuaaris on arvukalt B-raku järjestusi, mis moodustavad NP-ga võrreldes rohkem ja suuremaid kloonide klastreid, samas kui PNR asub nende vahel. Aja jooksul näitab PR-rühm BCR-i ja ainulaadsete kloonide arvu vähenemist võrreldes NP-ga. Iga uuringus osalenud inimese üksikasjalikud B-raku võrgud on esitatud täiendavatel joonistel. 5–7. Huvitav on jälgida B-rakkude võrgustiku väga mitmekesist mustrit isikul, kellel tekkis NP-rühmas PTLD (täiendav joonis 5), ilma B-rakkude laienemiseta enne siirdamist, millele järgnes B-rakkude arvu suurenemine pärast 6. kuud ja selge kloonide laienemine, millega kaasnes mitmekesisuse vähenemine 24 kuud pärast siirdamist.
Gini indeksi mõõtmise edasisel hindamisel (joonis 5) näitas PR-rühm järjekindlalt nii tipu kui ka klastri jaoks märkimisväärselt kõrgemaid näitajaid võrreldes NP rühmaga, mis viitab sellele, et PR-rühma patsientidel oli algtasemel suurem kloonide laienemine.
Joonis 4 B-rakkude repertuaarivõrgustikud kolmelt isikult, mis esindavad kolme kliinilist tulemust ajapunktide lõikes. Iga tipp tähistab ainulaadset BCR-i, mis on tipu suurus, mis on määratud identsete BCR-ide arvuga, võttes arvesse nukleotiidjärjestusi. Serv eksisteerib tippude vahel, kui need kuuluvad samasse klooni, nagu varem määratletud, seega on klastrid omavahel seotud tippude rühmad, mis moodustavad klooni. Iga valim näitab tipu suuruse (Gini(V)) ja klastri suuruse (Gini(C) jaoks saadud gini indeksit). BCR peegeldab selle konkreetse proovi B-raku retseptorite koguarvu ja kloonid peegeldavad ainulaadsete kloonide koguarvu. Lähteandmed esitatakse lähteandmete failina
ja domineerivate kloonide alamhulga edasine siirdamisjärgne laiendamine (P-väärtus [lineaarne regressioon] < 0.05,="" joonis="" 5).="" pnr-i="" rühm="" jääb="" np="" ja="" pr="" vahele,="" nagu="" eelnevalt="" näidatud,="" kuigi="" see="" aeg="" erineb="" oluliselt="" np="" rühmast="" ajahetkel="" 24="" (p-väärtus="" [lineaarne="" regressioon]="">< 0,05).="" kuigi="" joonise="" 5="" andmed="" saadi="" gdna="" andmetest,="" näitas="" cdna="" igm="" isotüüp="" samu="" erinevusi="" (p-väärtus="" [lineaarne="" regressioon]="0,05)" (täiendav="" joonis="">
Teatud kloonid ja IGHV geenid on seotud äratõukereaktsiooniga.
Kuigi meie peamine eesmärk oli iseloomustada B-rakkude repertuaari kliiniliste tulemuste rühmade kaupa, andes globaalse pildi immuunvastusest enne ja pärast siirdamist, võimaldasid meie andmed teha ka kloonis ja IGHV-s Ig järjestusspetsiifilist analüüsi. geeni tase.
Kloonianalüüsi jaoks hindasime iga konkreetse klooni (118 223 klooni kokku) olemasolu või puudumise seost kliinilise tulemusega (PR, PNR, NR) igal ajahetkel. Rakendades Fisheri täpset testi, leidsime 8, 4 ja 21 klooni, mis olid nominaalselt seotud kliiniliste tulemustega vastavalt 0, 6 ja 24 kuu jooksul (täiendav tabel 1). Kuigi ükski neist ei läbinud mitmekordse testimise parandust, peamiselt võimsuse puudumise tõttu, kuna analüüsis on tuhandete parameetritega (kloonidega) piiratud valimi suurus, võisime täheldada, et vähesed kloonid, mis lähenesid olulisusele (P-väärtus < {{="" 11}}.05)="" jagati="" ainult="" pr-rühma="" patsientide="" vahel="" ja="" rikastati="" 24="" kuud="" pärast="">
Samuti kaalusime, kas mõned kloonid püsisid proovivõtuaja jooksul rohkem kui teised iga kliinilise tulemuse piires (täiendav joonis 9). Me võtame arvesse kahte erinevat mõõdet: (1) püsivate kloonide arv ja (2) kloonide laienemine. Täheldasime, et PR-s püsivad kloonid olid oluliselt laienenud (P-väärtus [lineaarne regressioon]=0,01, PR vs. NP) ja näitasid püsivate kloonide suurema arvu trendi (P- väärtus [lineaarne regressioon]=0.09). Lisaks uurisime, kas neid püsivaid kloone jagati ka erinevate isikute vahel iga kliinilise tulemuse puhul. 263 tuvastatud püsivast kloonist jagati 23 üksikisikute vahel. Viis jagati samas PNR-is ja kuus PR-rühmas ning NP-rühma vahel ei jagatud ühtegi klooni. Kokku oli 12 jagatud klooni mõlemas patsientide rühmas, kellel oli aja jooksul progresseeruv krooniline siirdamiskahjustus ja fibroos (PR ja PNR). Üksikisikute vahel jagatud kloonide loend on esitatud lisamaterjalis (täiendav tabel 2).
Järgmisena teostasime IGHV geenianalüüsi, vaadeldes IGHV geeni kasutamist proovi kohta, mis määratleti iga IGHV geeni kasutuskordade arvuna, normaliseeriti kloonide arvuga (et vältida teatud IGHV geenide proovivõtu kõrvalekaldeid), filtreerides välja madala ekspressiooniga.
Joonis 5. Vertex Gini Index graafikuna klastri Gini indeksi suhtes. Hajumisdiagramm kujutab iga proovi aegadel 0, 6 ja 24. Kastdiagrammid näitavad Gini(V) ja Gini(C) erinevusi ajahetkel 24. P-väärtused saadakse lineaarse regressioonimudeli kohandamisest võttes arvesse Gini (V) ja Gini (C) kui sõltuvat muutujat ja kliinilist tulemust sõltumatu teguri muutujana iga ajapunkti kohta (n=27 proovi). Kastigraafikul on näidatud ainult aeg 24, kuid aeg 0 ja 6 on samuti olulised NP vs. PR jaoks: aeg 0: P (Gini (V))=0.1, P ( Gini(C))=0.05; aeg 6 P (Gini(V))=0.02, P (Gini(C))=0.01; aeg 24: P (Gini(V))=0.003, P (Gini(C))=0.01. Kasti sees olev riba tähistab mediaanväärtust, kast määratleb kvartiilidevahelise vahemiku (IQR) ja vurrud määratlevad esimese ja kolmanda kvartiili ± 1,5 × IQR. Lähteandmed esitatakse lähteandmete failina
geenid (IGHV geenikasutus > {{0}.05 vähemalt 10 protsendil proovidest) ja lineaarse regressioonimudeli rakendamine nende geenide leidmiseks, mis olid seotud iga kliinilise tulemusega, igal ajahetkel. 27 IGHV geenist, mis läbisid madala ekspressiooniga filtri, leidsime olulised geenid PR- ja NP-rühma vahel (P-väärtus < 0,05)="" kolme="" geeniga="" ajahetkel="" 0,="" 7="" ajal="" 6="" ja="" 16.="" aeg="" 24="" (joon.="" 6a–c).="" nendest="" geenidest="" 1="" (ighv3-11)="" ajahetkel="" 0,="" 5="" geeni="" (ighv3-7,="" ighv3-15,="" ighv3-21,="" ighv3-23,="" ighv{="" {22}})="" ajahetkel="" 6="" ja="" 16="" geeni="" (ighv1-8,="" ighv1-18,="" ighv1-46,="" ighv2-="" 5,="" ighv3-7,="" ighv{{="" 30}},="" ighv3-15,="" ighv3-23,="" ighv3-30,="" ighv3-33,="" ighv3-48,="" ighv3-74,="" ighv{{37="" }},="" ighv4-59,="" ighv4-61,="" ighv5-51)="" sooritas="" ajal="" 24="" valetuvastussageduse="" (fdr)="" mitmekordse="" testimise="" paranduse.="" huvitaval="" kombel="" avastasime,="" et="" ighv3-23="" oli="" np="" ja="" pr="" võrdluse="" kõigi="" kolme="" ajapunkti="" juures="" kõige="" olulisem="" ja="" rikkalikum="" geen="" (aeg="" 0:="" p-väärtus="0.04," aeg="" 6:="" p-).="" väärtus="0,003," aeg="" 24:="" p-väärtus="0,02)" (joonis="" 6d).="" lisaks="" hindasime,="" kas="" ighv3-23="" järjestused="" olid="" eelmise="" kloonanalüüsi="" jagatud="" järjestuste="" hulgas="" üleesindatud.="" kasutades="" fisheri="" täpse="" testiga="" rikastusanalüüsi,="" leidsime,="" et="" ighv="" 3-23="" järjestused="" olid="" märkimisväärselt="" üleesindatud="" mõlemas="" püsivates="" kloonides,="" mis="" jagunesid="" indiviidide="" vahel="" (täiendav="" tabel="" 2)="" (p-väärtus="">< 2,2="" ×="" 10-16="" )="" ja="" kliinilise="" tulemusega="" seotud="" kloonid="" ajal="" 24="" (täiendav="" tabel="" 1)="" (p-väärtus="">< 2,2="" ×="" 10-16).="" täheldasime,="" et="" nr-rühma="" isik="" 9,="" kellel="" oli="" eelmiste="" analüüside="" käigus="" leitud,="" et="" jagasid="" püsivaid="" kloone="" progressoritega,="" klassifitseeriti="" igal="" ajahetkel="" pr-rühma.="" erinevatest="" demograafilistest="" ja="" kliinilistest="" muutujatest,="" nagu="" retsipiendi="" vanus,="" sugu,="" rass,="" doonori="" allikas,="" immunosupressiooni="" tüüp,="" hla="" mittevastavus="" ja="" neerupuudulikkuse="" põhjus,="" saadud="" andmetele="" ei="" olnud="" segavat="" mõju.="" lisaks="" leiti,="" et="" see="" geen="" on="" oluline="" nii="" igm="" (p-väärtus="" [lineaarne="" regressioon]="0.008)" kui="" ka="" igd="" (p-väärtus="" [lineaarne="" regressioon]="0.05)" isotüübis.="" cdna="" põhjal="" 24="" kuud="" pärast="" siirdamist,="" kooskõlas="" eelmiste="" tulemustega,="" mis="" näitavad="" kooskõla="" nende="" kahe="" isotüübiga,="" mis="" on="" pr-rühmas="" kõige="" enam="" rikastatud.="" ainult="" kolm="" muud="" geeni="" leiti="" olevat="" cdna="" analüüsis="" olulised="" ja="" kõik="" olid="" 24="" kuud="" pärast="" siirdamist="" igd="" ja="" igm="" isotüüpides="" (ighv3-15="" ja="" ighv4-="" 61="" igd-s="" ja="" ighv{85}}="">
Arutelu
Mitmekesisus on immuunsüsteemi oluline omadus ja tervetel inimestel on see haigustega toimetulemiseks kriitilise tähtsusega patogeenide vastu. Elundite siirdamise korral viiakse kliiniliselt sisse tahtlik terapeutiline manipuleerimine, et võimaldada võõrorganit aktiivselt ignoreerida või oma patsiendi immuunsüsteemil aktsepteerida, et mitte tekitada alloimmuunvastust, mis viib äratõukereaktsioonini. B-rakud on selle protsessi oluline komponent ja meie rühm ja teised on näidanud, et need on nii antigeeni esitlemisel32, 33 kui ka alloantikehade tootmisel34, 35 määrava tähtsusega. Selles töös oleme kasutanud suure läbilaskevõimega B-rakkude sekveneerimist, et paremini mõista B-rakkude mitmekesisust ja klonaalsust.neerudsiirdatud retsipiendi vereringet nii enne siirdamist kui ka pärast 24-kuulist jälgimist koos B-raku immuunrepertuaari pikisuunalise hinnanguga. Üldiselt näitab meie analüüs B-rakkude suuremat mitmekesisust enne siirdamist, erinevusi pikisuunas koos mitmekesisuse vähenemisega, millega kaasneb kloonide laienemine, ja teatud IGHV geenikasutuse suurenemist nende seas, kes siirdeid tagasi lükkavad.
Elundi siirdamise peamine rahuldamata kliiniline vajadus on mitteinvasiivse, tundliku ja täpse prognoosi puudumine siirdamisvigastuste ja halbade tulemuste kohta. Selle ülesande muudab keeruliseks asjaolu, et transplantaadi ellujäämist mõjutavad mitmesugused tegurid36. Selles uuringus leidsime, et stabiilsetel isikutel oli enne siirdamist B-raku immuunrepertuaari mitmekesisus võrreldes elundi hülganud isikutega. Järgmine samm peaks olema B-rakkude repertuaari mitmekesisuse ennustava väärtuse demonstreerimine, pakkudes potentsiaalseid paremaid biomarkereid äratõukereaktsiooni ennustamiseks enne siirdamist ning võimalust rakendada kliinilises hoolduses ja immunosupressioonivalikutes enne ja pärast.neerudsiirdamine. Kui see omadus on tingitud mis tahes tegurist, mis soodustab stabiilsete indiviidide mitmekesisuse vähenemist, näiteks keskkonna- või geneetilised tegurid, ei saa me mitte ainult äraütlemist ennustada, vaid ka seda ära hoida. Tõepoolest, väga hiljutised leiud näitasid, et immuunsüsteemi varieeruvus on tingitud keskkonna- ja geneetilistest teguritest37, 38. Meie uuringus ei leidnud me seost ühegi demograafilise ja muude patsiendi kliiniliste tunnustega (vanus, sugu, rass, immuunsupressioon, elundiallikas, HLA mittevastavus ja ESRD). Sellega seoses vajame uut analüüsi, et kinnitada, kas konkreetsed tegurid mõjutavad B-rakkude repertuaari mitmekesisust ja siirdamise tulemusi.
Veel üks huvitav leid meie uuringust näitab, et immuunrepertuaar käitub aja jooksul erinevalt sõltuvalt kliinilise tulemuse rühmast. Neil, kellel ilmneb siirdamisjärgne elundi äratõukereaktsioon, on B-rakkude mitmekesisus algselt suurem ja seejärel aja jooksul väheneb, samas kui vastupidist mitmekesisust täheldatakse patsientidel, kellel ei teki äratõukereaktsiooni ega kroonilist transplantaadi vigastust. Kuigi kõik isikud said pärast siirdamist sama immunosupressioonikoormust, võib mõned võimalikud selgitused äratõukereaktsiooniga patsientide mitmekesisuse vähenemisele olla seotud asjaoluga, et need patsiendid saavad äratõukereaktsiooni raviks ajutiselt oluliselt suurenenud immunosupressioonikoormust ja seejärel. hoitakse kõrgemal baasjoonel. Kuigi see võib seletada B-rakkude mitmekesisuse vähenemist aja jooksul ja erinevust 24 kuud pärast siirdamist, ei ole see tõenäoliselt põhjus, kuna PR-rühma vähenenud mitmekesisus on
Joonis 6 IGHV geenide kasutamise analüüsi soojuskaart ja kastplokk. Soojuskaart, mis näitab IGHV geene, mis on valitud nominaalselt olulisteks (P-väärtus < 0.05)="" ajahetkel="" 0="" (a),="" 6="" (b)="" ja="" 24="" (c)="" np="" jaoks="" vs="" pr.="" punane="" värviskaala="" tähistab="" iga="" geeni="" ekspressiooni="" proovides.="" ülaosas="" olevad="" ribad="" näitavad="" esrd="" kliinilist="" tulemust="" ja="" põhjust.="" kastgraafik,="" mis="" näitab="" ighv3-23="" avaldist="" ajapunktide="" lõikes="" np="" vs.="" pr="" jaoks="" (aeg="" 0:="" p-väärtus="0.04," aeg="" 6:="" p-väärtus="0.003," aeg="" 24:="" p="" -väärtus="0.02)" (d).="" kasti="" sees="" olev="" riba="" tähistab="" mediaanväärtust,="" kast="" määratleb="" kvartiilidevahelise="" vahemiku="" (iqr)="" ja="" vurrud="" määratlevad="" esimese="" ja="" kolmanda="" kvartiili="" ±="" 1,5="" ×="" iqr.="" p-väärtused="" saadakse="" lineaarse="" regressioonimudeli="" kohandamisel,="" võttes="" arvesse="" v-geene="" kui="" sõltuvat="" muutujat="" ja="" kliinilist="" tulemust="" kui="" sõltumatut="" muutujat.="" (n="12" näidist).="" lähteandmed="" esitatakse="" lähteandmete="">
näha ka 6 kuud pärast siirdamist, ajal, mil patsientidel ei ole veel äratõukereaktsiooni välja kujunenud, mis viitab sellele, et tõenäoliselt on kaasatud ka muud aktiivsed protsessid. Selektiivse kloonide laienemise jälgimine domineerivate kloonidega ainult patsientidel, kellel areneb nii äratõukereaktsioon ja/või progresseeruv krooniline haigusneerudsiirdamise vigastus viitab teatud kloonide bioloogiliselt olulisele alloantigeenipõhisele valikule, püsivusele ja laienemisele aja jooksul, mis põhjustab ajalise mitmekesisuse üldist vähenemist. Kuigi võime oletada, et nende kloonide laienemine on tõenäoliselt seotud siiriku alloimmuunse kahjustusega, nõuavad otsesed tõendid selle kohta, et nende kloonide laienemine on alloimmuunne, täiendavaid in vitro ja loomkatseid.
Äge äratõukereaktsioon jääb siiriku pikaajalise ellujäämise tugevaimaks negatiivseks teguriks hoolimata immuunsupressiooniravi kiirest paranemisest39, 40. Selles uuringus leitakse ka seos mõne IGHV geeni kasutamise ja tagasilükkamisega, kuigi põhjuslikku seost tuleks tulevastes uuringutes uurida. IGHV3-23 on gDNA analüüsis kõige huvitavam geen, kuna seda kasutatakse märkimisväärselt sagedamini patsientidel, kellel areneb äratõukereaktsioon kõigil mõõdetud ajahetkedel, ning see on üleesindatud indiviidide vahel jagatud püsivates kloonides ja rikastatud kloonides. äratõukereaktsiooniga patsiendid 24 kuud pärast siirdamist. See geen on samuti valideeritud 24 kuud pärast siirdamist nii IgD kui ka IgM isotüüpides cDNA analüüsis. IGHV3-23-d on laialdaselt seostatud kroonilise lümfotsütaarse leukeemia halva prognoosiga41 ja on näidatud, et valdav enamus IGHV3-23 järjestusi säilitas võime vahendada superantigeenide interaktsioone42. B-raku superantigeene toodavad viirused ja bakterid, mis teadaolevalt seonduvad immunoglobuliinidega väljaspool tavalisi antigeeni sidumissaite43. On näidatud, et B-rakkude kohtumine superantigeeniga kutsub esile proliferatsiooni, aktivatsiooni, migratsiooni ja deletsiooni44. Siirdatudneerud, on potentsiaalne pidev kokkupuude viiruse ja bakteriaalsete antigeenidega, mis on seotud kas primaarse vesikoureterilise refluksi etioloogiaga, mis on ESRD või sekundaarse kuseteede refluksi põhjus pärast siirdatud kusejuha reimplantatsiooni, või refluksi pärast kuseteede infektsiooni, mis suureneb kroonilise immunosupressiooniga pärast siirdamist. Kohandasime analüüsitulemusi neerupuudulikkuse põhjuste, teiste kliiniliste ja demograafiliste tegurite hulgas; eelnevalt käsitletud tulemused on endiselt olulised, kuigi mõistsime, et analüüsis valesti klassifitseeritud NP patsiendil (joonis 6) oli reflukshaigus. Cheng et al. on ka varem avastanud, et B-rakkude poolt infiltreeritud neerutransplantaadi retsipientide biopsiakoes leiduvates kloonides oli teiste hulgas ülekaalus IGHV3-23 geen45. Grover jt 46 näitasid, et selle konkreetse geeni antikehad ei tundnud ära doonori HLA antigeene, vaid olid pigem spetsiifilised E. coli suhtes ning Modena jt 47 näitasid, et bakterite arv uriinis oli palju suurem patsientidel, kellel oli interstitsiaalne fibroos ja tubulaarne atroofia kui need, kelle transplantaadid toimisid hästi. Laiendame neid leide, näidates, et IGHV3-23 geeni kasutamine on märkimisväärselt suurem perifeerses veres mitmete äratõukereaktsioonidega patsientidel ja võib äratõukereaktsiooni esile kutsuda teatud levinud antigeenid. Tulevikus võidakse IGHV3-23 ekspressiooni kasutada siirdatud inimese immuunvastuse jälgimiseks.neerud.
Laiendades oma uuringut cDNA sekveneerimisega, võime korrata suuremat osa oma tulemustest kahes isotüübis (IgM ja IgD), mis näitavad NP-s väiksemat mitmekesisust enne siirdamist, mis on pikisuunalises analüüsis kaks kõige olulisemat, millel on suurem laienemine ja domineerimine. kloonid võrguanalüüsis ja replitseerivad ka IGHV3-23 geeni. Esimesed antikehad, mis tekivad humoraalse immuunvastuse käigus, on alati IgM ja arenevad kiiresti kõigi erinevate isotüüpide, IgD, IgA, IgG ja IgE tootmiseni, kuid eriline huvi nõuab IgD isotüüpi48. IgD ekspresseeritakse koos IgM-ga ja sekreteeritud IgD eksisteerib ning sellel on funktsioon veres, limaskesta sekretsioonides ja kaasasündinud immuunefektorrakkude, näiteks basofiilide pinnal49. Basofiilid on valged rakud, mis võitlevad viiruste, bakterite, parasiitide ja seentega ning on seotud neeruhaiguste ja transplantaadi äratõukereaktsiooniga50. Seega on veel üks tõend, mis seob B-rakkude vastuseid tagasilükkamisprotsessile viiruste ja bakteritega.
Tulevased uuringud on vajalikud näitamaks, et see aktiveerimine on tingitud erinevustest vastuvõtja mikrobioomis, mis mõjutab diagnostikat ja ravi.
See uuring võimaldas meil tuvastada mõnede nende BCR-kloonide asjakohasust, tuvastada kliiniliselt olulised BCR-kloonid allotransplantaadi äratõukereaktsiooniga ja näidata, et nende kloonide puhul on heteroloogse immuunsusega kloonide tõenäoline tähtsus, arvestades nende kloonide rikastamist patsientidel, kellel on koloniseeritud kuseteede enne siirdamist ja nende bioloogiline tähtsus patogeeni vastustele. Parem arusaamine immuunrepertuaari käitumisestneerudsiirdamine poleks olnud võimalik ilma BCRSeqi rakendamiseta koos arvutuslike ja statistiliste torustike jõulise rakendamisega. Sellegipoolest on meie lähenemisviisil mitmeid piiranguid, mida tuleks tunnistada: esiteks on meie valimi suurus väga valitud ja suhteliselt väike paljudes pediaatriliste patsientide hulgas ning kuigi saavutasime oma analüüsis statistilise olulisuse ja kinnitasime kahe erineva andmeallika, tulemuste kinnitamiseks on vaja täiendavat analüüsi. Teiseks ei ole meie tulemused vabastatud bioloogilise ja tehnilise proovide võtmise mõjust meie analüüsis. Mitmekesisuse mõõdud sõltuvad mitmest probleemist: asjaolust, et proovis on esindatud vaid murdosa miljarditest rakkudest repertuaaris, järjestuse sügavuse erinevused ja võimalikud katsevead. Oleme kõiki neid probleeme põhjalikult kontrollinud, esiteks laboris, käitades sama kogust verd sama partii iga proovi kohta ja teiseks, arvutuslikult ja statistiliselt, rakendanud üldise repertuaari hindamiseks recon-tööriista ja teostades sekveneerimissügavuse kontrollimiseks proovide allavõtmist. ja katsevead. Kolmandaks oleme teostanud BCRSeqi, kasutades kahte erinevat allikat, gDNA ja cDNA. gDNA sekveneerimine hõlbustab antud Ig järjestuse klonaalsuse hindamist, kuna järjestuste lugemiste arv on võrdeline gDNA molekulide arvuga. cDNA sekveneerimine annab hinnangu erinevate repertuaaris olevate Ig järjestuste suhtelise ekspressioonitaseme kohta. On näidatud, et T-raku retseptorite puhul ei ole cDNA-ga teostatud klonotüübi iseloomustus nii hea kui gDNA-ga, mis näitab, et üksikute kloonide suhteline osakaal erines oluliselt15 või et HIV-spetsiifiliste kloonide jälgimine õnnestub ainult gDNA-ga, kuid mitte mRNA51. Neljandaks võib seda tüüpi analüüsis segavaks teguriks olla immunosupressiooni mõju. Selles uuringus on kõik proovid pärit kliinilisest uuringust, kus kõik patsiendid said pärast siirdamist sama immunosupressioonikoormust. Sellegipoolest kontrollisime kahte tüüpi steroidipõhist ja steroidivaba, et veenduda, et see pole probleem, jälgides tulemustes erinevusi. Lõpuks on siin esitatud kohort laste siirdamine. Suurem osa siirdatud kliinilistest aspektidest on lastel ja täiskasvanutel sarnased. Immuunsupressioon ja kasutatavad režiimid on sarnased, kreatiniin on seerumi peamine biomarker, äge äratõukereaktsioon määratakse peamiselt biopsia abil, kasutades Banffi kriteeriume, ja äratõukereaktsiooni mehhanismid.neerudtransplantaadid on üldiselt sarnased52, seetõttu võib suurem osa täiskasvanutel või lastel tehtud uuringutest kehtida mõlema kohta. Kuid muud aspektid, nagu immunosupressiooni mittevastavus/mittejärgimine, immunoloogilised aspektid, esmased neeruhaigused, mis põhjustavad sageli uroloogiliste probleemidega kaasnevat neerupuudulikkust, ja enne siirdamist nõutavad immuniseerimised võivad erineda, seetõttu on vaja täiendavat analüüsi Nende leidude üldistamiseks on vaja täiskasvanud elanikkonda.
Nendest piirangutest hoolimata näitavad meie andmed, et inimestel, kes jätkavad elundi hülgamist, täheldatakse suuremat siirdamiseelset mitmekesisust, mis viitab äratõukereaktsiooni eelsoodumusele, mis võib tulevikus mõjutada äratõukereaktsiooni riski ennustamist enne siirdamist, immunosupressiooni valikuid ja kliinilist hooldust. tavasid. Pärast 24-kuulist jälgimist täheldati äratõukereaktsiooni rühmas mitmekesisuse üldist vähenemist aja jooksul, millega kaasneb teatud kloonide püsimine ja laienemine ning mitmete IGHV geenide suurem kasutamine, mis võib põhjustada teatud levinud antigeene. Erilist huvi on täheldatud IGHV3-23 geeni suurenenud kasutamise vastu äratõukereaktsiooniga patsientide seas, kuna seda on varem seostatudneerudsiirdamine ja see võib olla äratõukereaktsiooni võtmekomponent. Selles töös esitatakse B-raku immuunrepertuaari pikisuunaline analüüs elundisiirdamisel, mis soodustab rohkem uuringuid nende leidude kinnitamiseks, kuna neil võib olla kliiniline mõju ennustamisele, kontrollimisele, jälgimisele ja ravile.neerudtagasilükkamine.
meetodid
Uuringu ülesehitus. Uurisime 81 gDNA proovi ja 56 sobitatud proovi cDNA jaoks pikisuunas aegadel 0, 6 ja 24 kuud kokku 27 lapselt, kes said esmase ravi.neerudsiirdamine. Selles uuringus osalenud isikud pärinevad kliinilisest uuringust (multikeskuseline uuring SNSO1), kus katsealused randomiseeriti (1:1) traditsioonilisele madala annusega steroidipõhisele immunosupressioonirežiimile (steroidid, standardne daklizumabi induktsioon kuni teise kuuni pärast siirdamist, ja immunosupressiooni säilitamine takroliimusega (Prograf, Astellas Pharma) ja MMF-iga (CellCept, Hoffman-La Roche) või steroidivaba immuunsupressioonirežiimiga (pikaaegne daklitsumabi induktsioon kuni kuuenda siirdamisjärgse kuuni, takroliimus ja MMF). registreeriti pärast IRB heakskiitu ja neil oli teadlik nõusolek. Selles uuringus said 14 patsienti steroidide vältimise raviskeemi ja 13 steroidipõhist immunosupressiivset raviskeemi53 ja ükski neist patsientidest ei saanud enne siirdamist immunosupressiooni, kuna see oli üks välistamiskriteeriume. Äratõukereaktsiooni ravi koosnes kolmest intravenoosse kortikosteroidi (10 mg/kg) impulsist ja immunosupressiooni intensiivistamise algtasemest.
Kõigil uuringus kasutatud proovidel oli seotud seeriatransplantaadi biopsia, mille luges keskpatoloog, kasutades poolkvantitatiivseid histoloogilisi skoori. Kliiniline äge äratõukereaktsioon määratleti ägeda äratõukereaktsiooni episoodina, mis on seotud transplantaadi düsfunktsiooniga ja mis põhines seerumi kreatiniini taseme tõusul enam kui 10 protsenti algväärtustest ja mida kinnitati biopsiate tsentraalse patoloogilise lugemisega vastavalt uuendatud Banffi klassifikatsioonile23, 24. Krooniline allotransplantaadi vigastus määrati kroonilise allotransplantaadi kahjustuse indeksi (CADI) skoori abil. Patsiendid liigitati kolme kliinilise tulemuse järgi, mis määrati CADI skoori ja äratõukereaktsiooni episoodide alusel. Mitteprogresseeruvatel patsientidel (NP) oli kolmel järjestikusel biopsial 2 aasta jooksul madal mittekasvav CADI skoor, ilma ägeda äratõukereaktsioonita, progresseeruvatel patsientidel, kellel ei olnud äratõukereaktsiooni (PNR), oli kõrgem CADI. nende seeriabiopsiate skoor 2 aasta jooksul ja järkjärguline ajapunktide lõikes ilma äratõukereaktsioonita ja hülgamisreaktsiooniga (PR) progresseeruvate patsientide seeriabiopsiate CADI skoor 2 aasta jooksul koos äratõukepisoodidega. Need patsiendid valiti väga hoolikalt suuremast 120 patsiendist koosnevast kohordist, mis sobitati demograafiliste muutujate ning kõigi NP ja PNR-i jaoks, et neil ei oleks biopsia või subkliinilise vigastuse põhjal põletikku, mõõdetuna doonorispetsiifiliste antikehade puudumisel. Ühelgi neist ei olnud HLA-d ega haploidentilist transplantaati, kuna see oli registreerimisel välistamiskriteerium54. Kõik proovid koguti 12 erinevast USA laste siirdamisprogrammist aastatel 2004–2006 IRB poolt heaks kiidetud protokollide alusel. Uuringu kiitis heaks ka San Francisco California ülikooli inimuuringute kaitseprogramm (HRPP) ja Stanfordi ülikool, et võimaldada biopanga proovide analüüsi. Kõik patsiendid/eestkostjad andsid uuringus osalemiseks teadliku nõusoleku, järgides täielikult Helsingi deklaratsiooni. Teatatud kliinilised ja uurimistegevused on kooskõlas Istanbuli deklaratsiooni põhimõtetega, nagu on kirjeldatud Istanbuli deklaratsioonis elundikaubanduse ja siirdamisturismi kohta.
gDNA ja RNA eraldamine. Vereproovid (4,5 ml) koguti 5 ml punasesse katsutisse ja inkubeeriti toatemperatuuril 30 minutit, kuni tekkis tromb. Seejärel tsentrifuugiti proovi 2000 × g juures 5 minutit, kasutades pöörlevat ämbrirootorit. Seerumi ülemine kiht kanti seejärel teise krüotorusse ja trombi hoiti kuni kasutamiseni samas tuubis -80 kraadi juures. Täisteravere hüübimistest pärit genoomne DNA ekstraheeriti, kasutades Clotspin Baskets ja Gentra PuregeneBlood Kit (Qiagen, Valencia, CA).
RNA ekstraheerimiseks alatesneerudnõela biopsia (Qiagen, Valencia, CA) ja säilitatud temperatuuril -80 kraadi; kogu RNA ekstraheeriti, kasutades 790 µl TRIzoli ja 10 µl glükogeeni põhisegu. Koeproovid homogeniseeriti, inkubeeriti 15-25 kraadi juures 5 minutit ja faaside eraldamiseks lisati 160 µl kloroformi. Segu inkubeeriti uuesti 25 kraadi juures 2 minutit, seejärel tsentrifuugiti 4 kraadi juures ja kasutati RNA ekstraheerimiseks, kasutades RNeasy Micro Kit (Qiagen kataloogi nr 4004). RNA kogus ja terviklikkus määrati vastavalt Thermo Scientific NanoDrop ND-2000 UV-Vis spektrofotomeetri ja Agilent Bioanalyzeriga.
B-rakkude sekveneerimine. Valmistati genoomse DNA matriitsiga PCR reaktsioonid
100 ng gDNA alikvoodist, et luua kuus sõltumatut vöötkoodiga teeki proovi kohta. Kasutati IgH J või FR1 või FR2 raamistiku piirkondadele multipleksitud praimereid vastavalt BIOMED-2 disainile55. Iga PCR reaktsiooni jaoks kasutati proovi identiteedi ja replikatsiooni raamatukogu identiteedi näitamiseks praimerites kümne nukleotiidi "vöötkoodijärjestusi". PCR viidi läbi AmpliTaq Gold (Roche) polümeraasiga järgmise programmiga: 94 kraadi 5 min; 35 tsüklit (94 kraadi 30 sekundit, 60 kraadi 45 sekundit, 72 kraadi 90 sekundit); ja lõplik pikendamine 72 kraadi juures 10 min. Teine PCR reaktsioon viidi läbi tagamaks, et raamatukogusid ei amplifitseeritud enne geeli puhastamist ja sekveneerimist. Kokkuvõttes 0,4 ul igast esimesest PCR produktist matriitsis teise PCR reaktsiooni, kasutades väliseid praimereid, mis olid spetsiifilised 454 linkerjärjestuse jaoks; võimendamine viidi läbi programmiga: 94 kraadi 15 minutit, 12 tsüklit (94 kraadi 30 sekundit, 60 kraadi 45 sekundit, 72 kraadi 90 sekundit) ja lõplik pikendus 72 kraadi juures 10 minutit. AmpliTaq Goldi veamäär peaks avaldama minimaalset mõju klooniliselt seotud järjestuste tuvastamisele või somaatiliste mutatsioonide määrade hindamisele järjestustes, nagu on kirjeldatud kusagil mujal56. cDNA sünteesiti kokku 300 ng RNA-st juhuslike heksameeride praimimisega. Malle amplifitseeriti PCR abil, kasutades Biomed IGHV praimereid raamistikus 1 (FR1) ja isotüübispetsiifilisi praimereid, mis paiknesid konstantsete piirkondade esimeses eksonis. Need praimerid18,57 kodeerisid ka ligikaudu poole Illumina linkerjärjestustest, mis on vajalikud klastri genereerimiseks ja sekveneerimiseks MiSeq instrumendil. Proovi identiteet kodeeriti igas praimeris kaheksa nukleotiidi multiplekssete identifikaatorite vöötkoodidega. Illumina klastri äratundmiseks kodeeriti neli randomiseeritud nukleotiidi praimerites vahetult pärast Illumina linkerjärjestust konstantse piirkonna praimerites. Iga proovi iga antikeha isotüüp amplifitseeriti eraldi PCR reaktsioonis, et vältida risti-isotüübi kimäärsete PCR produktide moodustumist. PCR viidi läbi AmpliTaq Goldiga (Roche), järgides tootja juhiseid ja kasutati programmi 94 kraadi 7 minutit, 35 tsüklit (94 kraadi 30 sekundit, 58 kraadi 45 sekundit, 72 kraadi 120 sekundit) ja lõpuks. pikendamine 72 kraadi juures 10 min. Teist PCR-etappi kasutati Illumina linkerite ülejäänud osa lisamiseks amplikonitele ja see viidi läbi Qiagen Multiplex PCR komplektiga (Qiagen) vastavalt tootja juhistele, kasutades matriitsina 0,4 mikroliitrit esimest PCR produkti. 30 mikroliitrine reaktsioon. PCR-programm teise PCR-etapi jaoks oli 94 kraadi 15 minutit, 12 tsüklit (94 kraadi 30 sekundit, 60 kraadi 45 sekundit, 72 kraadi 90 sekundit) ja lõplik pikendus 72 kraadi juures 10 minutit. Iga PCR reaktsiooni produktid ühendati hinnangulistes ekvimolaarsetes kogustes, elektroforeesiti agaroosgeelidel ja geel ekstraheeriti QIAquick komplektidega (Qiagen). Genoomse DNA malliga raamatukogude suure läbilaskevõimega sekveneerimine viidi läbi platvormil 454 (Roche), kasutades Titanium keemiat. cDNA raamatukogu sekveneerimine viidi läbi Illumina MiSeq instrumendiga, kasutades 600-tsükli sekveneerimiskomplekte. Täielik nimekiri MiSeq-iga (M154 ja M155) ja 454 titaaniga (T7) kasutatavatest praimeritest on lisatud 1. lisaandmetesse.
Järjestuse lugemisi töödeldi järgmiselt: paarisotsa lugemised liideti FLASH58 abil, kus pärast järjestused demultipleksiti ja lõigati vöötkoodidest ja IGHV praimeri järjestustest. V-, D- ja J-piirkonnad ning V-D (N1), D-J (N2) ristmikud tuvastati joondusprogrammi IgBLAST59 abil. Järjestused filtreeriti, et eemaldada mitte-IGH artefaktid, V-geeni sisestamise või deletsiooniga järjestused, kimäärsed järjestused ja mittefunktsionaalsed järjestused. Valimi tasemel jätsime välja need, kellel oli<100 clones="" (defined="" by="" same="" v="" and="" j="" segments,="" same="" cdr3="" length,="" and="" 90%="" nucleotide="" identity)="" as="" a="" control="" for="" bad="" quality="" samples.="" after="" quality="" control,="" for="" gdna,="" we="" had="" complete="" longitudinal="" data="" for="" 69="" samples="" at="" times="" 0,="" 6,="" and="" 24="" with="" a="" total="" number="" of="" 327,703="" reads="" (mean="" 4045="" per="" sample).="" for="" cdna,="" we="" had="" complete="" data="" for="" 55="" matched="" samples,="" although="" no="" time="" 0="" samples="" were="" further="" available.="" in="" this="" case,="" we="" had="" isotype-="" specific="" information="" (1,773,330="" reads="" for="" igd="" (31,667="" per="" sample),="" 1,708,227="" reads="" for="" igm="" (30,504="" per="" sample),="" 973,444="" reads="" for="" iga="" (17,383="" per="" sample),="" 139,7345="" reads="" for="" igg="" (24,953="" per="" sample),="" and="" 29,000="" reads="" for="" ige="" (5,178="" per="">
Mitmekesisuse analüüs. Mitmekesisust mõõdetakse liigirikkuse järgi, võttes arvesse kloonide arvu proovi kohta. See meede ei arvesta iga liigi esinemissagedust, seega kasutasime mitmekesisuse mõõtmiseks ka Shannoni entroopiat (H).
teave liikide suurusjaotuse kohta populatsioonis. H on määratletud kui:
kus N on unikaalsete kloonide arv ja pi on klooni i sagedus. H on vahemikus 0 (ainult ühe klooniga proov) kuni Hmax ¼ log2N (ühtlase kloonide jaotusega proov).
Seejärel kasutasime üldist lineaarset mudelit, et leida seos rikkuse ja entroopia vahel kliinilise tulemusega erinevatel ajahetkedel. Kohandasime seda mudelit kõigi tabelis 1 näidatud kliiniliste muutujate põhjal, et olla kindlad, et patsiendi mis tahes omadus oli segav tegur.
Andmete pikisuunalise komponendi modelleerimiseks kasutasime lineaarset segaefekti mudelit, võttes arvesse tingimuslikku kasvumudelit, nagu on näidatud lisajoonisel 10. Selle mudeli rakendamiseks kasutasime R-s paketti lme4, võttes arvesse kliinilise tulemuse ja kulumisaja vahelist koostoimet. leida seos rikkuse ja mitmekesisusega, kusjuures aeg on juhuslik mõju.
Et tulla toime tõsiasjaga, et mitmekesisuse mõõtmeid võivad mõjutada puuduvate liikide probleem (repertuaaris on esindatud vaid murdosa miljarditest rakkudest) ning sekveneerimis- ja katsevead, viisime lisaks andmete täielikule analüüsile läbi kaks strateegiat. Esiteks kasutasime puuduvate liikide probleemi lahendamiseks Reconi (hinnanguliste kloonide rekonstrueerimine vaadeldud arvude põhjal)29. Recon on modifitseeritud maksimaalse tõenäosuse meetod, mis annab proovi mõõtmistest välja repertuaari üldise mitmekesisuse. Recon väljastab täpsed ja kindlad hinnangud mitmekesisuse mõõtmise, sealhulgas rikkuse ja entroopia kohta, mis võimaldab üksikisikute vahelist mitmekesisust põhjalikult võrrelda. Teiseks viisime läbi allaproovimise strateegia, võttes iga proovi jaoks juhusliku lugemite alamhulga, mis võrdub väikseima järjestuse suurusega, millele järgnes B-raku kloonide ümberarvutamine, et kohandada sekveneerimissügavust ja käsitleda võimalikke eksperimentaalseid vigu. gDNA puhul on väga madala lugemiga proove (< 1000)="" ning="" paljude="" järjestuste="" ja="" andmete="" tegelikkuse="" kaotamise="" vältimiseks="" jätsime="" välja="" kokku="" üheksa="" proovi,="" millel=""><1000 reads.="" in="" the="" case="" of="" cdna,="" this="" was="" not="" necessary.="" we="" generated="" ten="" random="" subsamples="" to="" account="" for="" possible="" stochastic="" effects="" and="" performed="" the="" diversity="" analysis="" at="" each="" time="" point="" and="" the="" longitudinal="" data="" analysis="" on="" the="" mean="" value="" of="" ten="" independently="" downsampled="" diversity="">
Võrgu analüüs. Võrgu genereerimise algoritm on väga sarnane eelnevalt määratletule31. Lühidalt, iga tipp esindab B-raku jada, mille suuruse määravad kõik identsed jadad. Servad arvutatakse klooni definitsiooni abil (samad V ja J segmendid, sama CDR3 pikkus ja 90% nukleotiidide identsus CDR3 vahel) ja klastrid esindavad iga klooni repertuaaris. Analüüs tehti R-i graafikupaketi abil, kasutades graafiku loomiseks suvandit layout_with_graphopt.
Võrgu kvantifitseerimiseks arvutasime tipu suuruse ja klastri suuruse Gini indeksi. Gini indeks on ebatasasuse mõõt, mida kasutatakse laialdaselt jõukuse jaotuse mõõtmiseks. See mõõdab sagedusjaotuse väärtuste ebavõrdsust. Tippude suuruse ja klastri suuruse jaotuse Gini koefitsiendi arvutamiseks kasutasime Gini funktsiooni ühest R-paketist. Gini koefitsient null väljendab täiuslikku võrdsust ja Gini koefitsient 1 väljendab maksimaalset ebavõrdsust.
Klonaalne analüüs. Kliiniliste tulemustega seotud spetsiifiliste kloonide uurimiseks koostasime maatriksi kõigi kloonidega, mis esinevad rohkem kui ühes proovis (koguarv=118,223) kõigi proovide kaupa igal ajahetkel. Seejärel uurisime seost iga konkreetse klooni kliinilise tulemusega, määratledes ühe muutuja klooni kohta kui olemas/ei ole. Lõpuks rakendasime Fisheri täpset testi, et võtta arvesse 2 × 3 tabelites iga klooni olulisust igal ajahetkel. Samuti uurisime püsivuskloone, mis on määratletud nende kloonidega, mis on iga indiviidi puhul rohkem kui ühes ajapunktis. Seejärel rakendasime kliinilise tulemuse erinevuste arvessevõtmiseks lineaarset mudelit, mis määratles sõltuva muutujana kloonide arvu (püsivuse erinevuste mõõtmiseks) ja iga klooni loenduste arvu (kloonide laienemise mõõtmiseks) ja kliinilise tulemuse. sõltumatu ennustaja.
IGHV geenikasutuse analüüs. IGHV geenide uurimiseks hindasime IGHV geeni kasutamist proovi kohta, kuna iga geeni kasutuskordade arv normaliseeriti kloonide arvuga, et vältida teatud IGHV geenide üleesindust. Statistilise analüüsi jaoks filtreerisime välja väga madala ekspressiooniga geenid (IGHV kasutus/kloonid < {{0}}.05)="" vähemalt="" 10="" protsendis="" proovidest.="" kokku="" analüüsisime="" 27="" ighv="" geeni,="" mis="" vastasid="" 63="" proovile.="" seejärel="" rakendasime="" lineaarset="" mudelit,="" et="" leida="" geenid,="" mis="" olid="" seotud="" kliinilise="" tulemusega="" igal="" ajahetkel,="" ja="" korrigeerisime="" neid="" tulemusi="" mitme="" testimisega,="" kasutades="" benjamini="" ja="" hochbergi="" fdr="">< 0,05.="" kohandasime="" seda="" mudelit="" kõigi="" tabelis="" 1="" näidatud="" saadaolevate="" kliiniliste="" muutujate="" põhjal,="" et="" olla="" kindlad,="" et="" patsiendi="" mis="" tahes="" omadus="" oli="" segav="">
Aruandluse kokkuvõte. Lisateavet uurimistöö kavandamise kohta leiate selle artikliga seotud loodusuuringute aruandluse kokkuvõttest.
Viited
1.Cai,J.& Terasaki,PI Transplantatsioonijärgse antikeha monitooring ja HLA 1.(antikeha epitoobi tuvastamine. Curr.Opin.Immunol. 20, 602-606(2008).
2. Sigdel, TKet al. Immunogeensete epitoopide vastased mitte-HLA antikehad ennustavad kroonilise neerutransplantaadi kahjustuse arengut. J. Olen. Soc. Nephrol.23, 750-763 (2012).
3. Li, L. et al. MICA antikehade sektsioonide lokaliseerimine ja kliiniline tähtsus pärast neerusiirdamist. Transplantation 89,312-319(2010).
4. Lamb, KE, Lodhi, S.& Meier-Kriesche, H.-U. Pikaajaline neerutransplantaadi ellujäämine Ameerika Ühendriikides: kriitiline ümberhindamine. Am.J. Siirdamine. 11, 450-462(2011).
5. Transplantaadi retsipientide teadusregister. Kättesaadav aadressil: https://rtr. transplant.hrsa.gov/annual_reports/2012/Default.aspx.(Kasutatud: 24. mai 2018)Pineda, S. et al. Uued mitte-histo-ühilduvusega antigeenide mittevastavad variandid
6. Parandage võimet ennustada antikehade poolt vahendatud äratõukereaktsiooni riski neerusiirdamise korral. Esiosa. Immunol. 8 1687 (2017).
7. Valuiskikh, A.Baldwin, WM& Fairchild, RLHiljutised edusammud ja uued perspektiivid T-rakkude vastuste uurimisel allograftidele. Am.J. Transplant.10, 117-1125 (2010).
8. Zarkhin, V, Chalasani, G. & Sarwal, MM. B-rakkude yin ja yang siiriku äratõukereaktsioonis ja tolerantsuses. Transplant. Rev.24,67-78(2010).
9. Georgiou, G. et al. Plussantikehade repertuaari suure läbilaskevõimega sekveneerimise lubadus ja väljakutse. Nat. Biotechnol.32,158-168(2014).
10. Schroeder, HW Hiire ja inimese antikehade repertuaaride arengu ja ekspressiooni sarnasus ja erinevus. Dev. Comp. Immunol. 30,119-135(2006).
11. Yaari, G. & Kleinstein, SH Praktilised juhised B-raku retseptori repertuaari sekveneerimise analüüsiks. Genome Med.7, 121 (2015).
12. Shugay, M. et al. VDJtööriistad: T-rakkude retseptorite repertuaaride ühendav järelanalüüs. PLOS-arvuti. Biol.11, e1004503 (2015).
13. Alachkar, H. et al. T-rakkude repertuaari ja biomarkerite kvantitatiivne iseloomustus neerutransplantaadi äratõukereaktsioonis. BMC Nephrol.17,181(2016). 14. Morris, H. et al. Doonori-reaktiivsete T-rakkude jälgimine: tõendid kloonide deletsiooni kohta tolerantsetel neerutransplantaadiga patsientidel. Sci. Tõlk. Med.7272ral0 (2015).
15. Dziubianau, M. et al. TCR-i repertuaarianalüüs järgmise põlvkonna sekveneerimisega võimaldab T-rakkudega seotud patoloogiate keerulist diferentsiaaldiagnostikat. Olen. J.Transplant.13,2842-2854 (2013).
16. Palanichamy, A. et al. Immunoglobuliini klassiga vahetatud B-rakud moodustavad hulgiskleroosi korral aktiivse immuuntelje kesknärvisüsteemi ja perifeeria vahel. Sci. Tõlk. Med.6, 248ra106-248ra106(2014).
17. Strauli, NB& Hernandez, RDS Statistiline järeldus konvergentse antikeharepertuaari vastuse kohta gripivaktsiinile. Genome Med. 8,60 (2016).
18. Roskin, KM et al. Tavalise muutuva immuunpuudulikkuse IgH järjestused näitavad muutunud B-rakkude arengut ja selektsiooni. Sci. Tõlk. Med.7,302ra135 (2015).
19.Massart, A., Ghisdal, L., Abramowicz, M. & Abramowicz, D. Operatsioonitaluvus neerusiirdamisel ja seotud biomarkerid. Clin. Exp. Immunol.189, 138-157(2017).
20. Beausang, JFet al.B rakkude repertuaarid HLA-ga sensibiliseeritud neerutransplantaadi kandidaatidel, kes saavad desensibiliseerivat ravi. J. Tõlk. Med.15, 9 (2017).
21. Ferdman, J. et al. B-raku kloonide laienemine ja somaatiline hüpermutatsioon inimese äratõukunud neerutransplantaatides. Transplantation 98,766-772(2014).
22. Vollmers, C. et al. Farmakoloogiliselt indutseeritud immunosupressiooni jälgimine immuunrepertuaari sekveneerimisega, et tuvastada siirdatud südamega patsientidel ägedat allografti äratõukereaktsiooni: kontseptsiooni tõestusuuring diagnostilise täpsuse täpsusega. PLOS Med. 12, e1001890 (2015).
23. Solez, K. jt Banff'05 koosoleku aruanne: Kroonilise allograftikahjustuse diferentsiaaldiagnostika ja kroonilise allografti nefropaatia (CAN) elimineerimine. Olen. J. Transplant.7, 518-526(2007). immunosupressioon neerusiirdamisel: kas on aeg pidada seda standardraviks? Kidney Int.76,825-830(2009).
28. Legendre, C. et al. Kolmeaastased tulemused neerutransplantaadiga patsientidel, kes randomiseeriti steroidivaba immunosupressiooni või steroidide ärajätmise rühma enterokattega naatriummükofenolaatnaatriumi ja tsüklosporiiniga: lõpmatuse uuring. J. Transplant.2014,1-8(2014).
29. Kaplinsky, J. & Arnaout, R. Tugevad hinnangud üldise immuunrepertuaari mitmekesisuse kohta proovide suure läbilaskevõimega mõõtmiste põhjal. Nat. Commun.7, 11881 (2016).
30. Stern, JNHet al. B-rakud, mis asustavad hulgiskleroosi aju, küpsevad emakakaela lümfisõlmedes. Sci. Tõlk. Med.6,248ra107 (2014).
31. Bashford-Rogers, RJMet al. Inimese B-raku retseptori repertuaaride sügavast sekveneerimisest tuletatud võrguomadused piiritlevad B-rakkude populatsioone. Genome Res.23, 1874-1884 (2013).
32. Sarwal, Met al. Molekulaarne heterogeensus ägeda neeru allotransplantaadi äratõukereaktsiooni korral
tuvastatakse DNA mikrokiibi profiilide abil. N.Engl.J. Med.349,125-138(2003). 33.Zarkhin, V., Lovelace, PA, Li, L., Hsieh, S.-C. & Sarwal, MMPhenotypic Evaluation of b-cell subsets after rituksimabi ägeda neerusiirdamise äratõukereaktsiooni raviks pediaatrilistel retsipientidel. Transplantation 91, 1010-1018 (201).
34. Clatworthy, MR& Targeting, B. Rakud ja antikehad siirdamisel. Amm. J. Transplant.11, 1359-1367 (2011).
35. Dijke, EIet al.Brakud siirdamisel.J. Südame kopsusiirdamine.35,704-710(2016).
36. Nankivell, BJ& Kuypers, DR. Kroonilise neeru allotransplantaadi kaotuse diagnoosimine ja ennetamine. Lancet 378, 1428-1437(2011).
37. Patin, E. et al. Kaasasündinud immuunraku parameetrite loomulik varieeruvus on peamiselt tingitud geneetilistest teguritest. Nat. Immunol.19, 302-314(2018). 38. Liston, A. & Goris, A. Inimese immuunsuse mitmekesisuse päritolu.Nat. Immunol. 19,209-210(2018).
39. Meier-Kriesche, H.-U, Schold, JD, Srinivas, TR& Kaplan, B. Neerude allotransplantaadi elulemuse vähenemine vaatamata ägeda äratõukereaktsiooni määra märgatavale vähenemisele viimasel ajal. Am.J. Transplant.4, 378-383 (2004).
40. Keith, DS, Vranic, G. & Nishio-Lucar, A. Siiriku funktsioon ja neerusiirdamise vahepealsed tulemused paranesid viimasel kümnendil: Ameerika Ühendriikide neerusiirdamise andmebaasi analüüs. Siirdamine. otsene 3,el66 (2017).
41. Bomben, R. et al. Muteeritud IGHV3-23 geenide ekspressioon kroonilise lümfotsütaarse leukeemia korral tuvastab haiguse alamhulga, millel on omapärased kliinilised ja bioloogilised tunnused. Clin. Cancer Res. 16,620-628(2010).
42. Levinson, AI, Kozlowski, L, Zheng, Y. & Wheatley, L. B-rakkude superantigeenid: definitsioon ja võimalik mõju immuunreaktsioonile.J. Clin. Immunol.15, 26S-36S(1995.
43. Silverman, GJ & Goodyear, CSA mudeli B-rakkude superantigeen ja B-lümfotsüütide immunobioloogia. Clin. Immunol.102, 117-134(2002).
44. Silverman, GJ & Goodyear, CS. B-rakkude kaitsemehhanismide segamine: õppetunnid stafülokoki superantigeenist. Nat. Rev. Immunol.6,465-475(2006). 45. Cheng, J. et al. Ektoopilised B-rakkude klastrid, mis infiltreeruvad siirdatud inimese neerudesse, on klonaalsed. Proc. Natl Acad. Sci. 108, 5560-5565 (2011).
46. Grover, RKet al. Kostimuleeriv immunogeen LPS indutseerib B-rakkude kloone, mis infiltreeruvad siirdatud inimese neerudesse. Proc. Natl Acad. Sci. USA 109, 6036-6041(2012).
47,Modena,BDet al. Muutused uriini mikrobioomi populatsioonides korreleeruvad neerusiirdamise korral interstitsiaalse fibroosi ja tubulaarse atroofiaga, mis on dokumenteeritud varases seirebiopsiates. Olen. J. Transpl.17, 712-723 (2017).
48. Chen, K. & Cerutti, A. Uued arusaamad immunoglobuliini D mõistatustest. Immunol. Rev. 237, 160-179 (2010).
49. Chen, K. et al. Immunoglobuliin D suurendab immuunseiret, aktiveerides basofiilides antimikroobseid, põletikuvastaseid ja B-rakke stimuleerivaid programme. Nat. Immunol. 10, 889-898(2009).
50. Mack, M. & Rosenkranz, AR Basofiilid ja nuumrakud neerukahjustuse korral. KidneyInt.76, 1142-1147 (2009).
51. Nixon, DFet al. Inimese immuunpuudulikkuse viiruse molekulaarne jälgimine
nef-spetsiifiline tsütotoksiline T-raku kloon näitab kloonispetsiifilise T-raku retseptori DNA, kuid mitte mRNA püsivust pärast varajast kombineeritud retroviirusevastast ravi. Immunol. Lett.66, 219-228(1999).
52. Dharnidharka, VR, Fiorina, P.& Harmon, WEKidney transplantation in children.N.Engl. J. Med. 371, 549-558(2014).
53. Sarwal, MMet al. Täielik steroidide vältimine on neerutransplantaadiga lastel tõhus ja ohutu: mitmekeskuseline randomiseeritud uuring kolmeaastase jälgimisega. Am.J.Transplant.12,2719-2729(2012).
24. Solez, K. et al.Banff 07 neeru allotransplantaadi patoloogia klassifikatsioon: uuendused ja tulevikusuunad. Am.J.Transplant.8, 753-760 (2008).
54. Li, L et al. steroidivaba immunosupressioon alates 1999. aastast: 129 laste neerusiirdamist koos püsiva siiriku ja patsiendi kasuga. Am.J. Transpl. 9, 1362-1372(2009).
25. Chaudhuri, A. et al. Humoraalse immuunsuse kliiniline mõju laste neerusiirdamisel. J. Olen. Soc.Nephrol.24, 655-664 (2013).