2. peatükk: Neerutorukujulised peroksisoomid on normaalse neerufunktsiooni jaoks asendamatud

Lisateabe saamiseks. kontaktitina.xiang@wecistanche.com

Arutelu

Peroksisoomide suur arvukus proksimaalses tuubulis koos neeruhäirete esinemisega ZSD-ga patsientidel on kindlalt viidanud peroksisoomide olulisele rollileneerud. Lisaks on mitmete peroksisomaalsete ensüümide neeruspetsiifiline ekspressioon toetanud ideed, et neeruperoksisoomidel võivad olla teiste kudede funktsioonidest osaliselt erinevad bioloogilised funktsioonid (15). Nende hüpoteeside kontrollimiseks uurisimeneerufunktsioonhiirtel, kellel puuduvad spetsiifiliselt peroksisoomidneerutuubul. Peroksisoomide rolli uurimiseks kasutatud erinevate hiiremudelite hulgast valisime hiired, kes võimaldasid peroksisoomide moodustamiseks olulise peroksisoomi biogeneesi faktorit PEX5 kodeeriva Pex5 tingimuslikku geneetilist inaktiveerimist. See mudel valiti, kuna (i)Pex5-null-hiirtel on mitmeid biokeemilisi ja funktsionaalseid kõrvalekaldeid, mis meenutavad neid, mida täheldati ZSD-ga patsientidel(11) ja (i) suur hulk hiiremudeleid Pex5 koespetsiifilise ablatsiooniga. on analüüsitud (16), mis võimaldab meil võrrelda neerutuubulite peroksisomaalse puudulikkuse funktsionaalseid tagajärgi teistes kudedes täheldatud tagajärgedega. Nagu näitasid Baes et al., ilmnes Pex{7}}null hiirtel emakasisene kasvupeetus, aju väärareng ja tõsine hüpotoonia ning nad surid esimese 72 elutunni jooksul (11). Biokeemilised analüüsid näitasid mitmeid ZSD tunnuseid, sealhulgas plasmalogeenide ammendumist maksas ja ajus ning VLCFA taseme tugevat suurenemist plasmas. Pex{{10}}null-hiirte neerudes P0,5 juures kortikaalseid neerutsüste ei leitud, kuid täheldati glomerulite emakasisese küpsemise aeglustumist. Kaltsiumoksalaadi ladestumist ei uuritud.

Tistanche ürdi eeliste tundmaõppimiseks klõpsake siin

CKOm hiirtel ei põhjustanud peroksisomaalse biogeneesi ablatsioon neerutuubulis ühtegi olulist fenotüüpi, välja arvatud vähenenud KW ja BW imikute cKOm hiirtel ning vähenenud KW / BW suhe täiskasvanud cKOm hiirtel. CKOf hiirtel viitas flokseeritud Pex5 alleeli mittetäielik ekstsisioon koos Pex5 deletsiooni palju leebema mõjuga neeru transkriptoomile ja metaboomile, et mõned jääkperoksisoomid võivad jääda neerutuubulisse. Kuid,seksSamuti ei saa välistada neerude peroksisomaalsete funktsioonide spetsiifilisust. Me ei leidnud cKOm hiirte neerudes olulist morfoloogilist erinevust, mis võiks selgitada madalamat KW või KW / BW suhet. Selle erinevuse võimalikuks põhjuseks võib aga olla proksimaalse raku laiuse vähenemise tendents. Oluline on see, et neeru homöostaatiline funktsioon säilis cKOm hiirtel vaatamata märgatavatele muutustele ioonide, vee, aminohapete, orgaaniliste anioonide ja katioonide transepiteliaalses transpordis osalevate valkude, fosfaadi, uraadi ja megaliini vahendatud multiliidide transkriptsioonide ekspressioonitasemetes. gand endotsüütide rada. Pange tähele, et enamik allareguleeritud transkripte kodeeris transportereid, mis ekspresseerusid proksimaalses tuubulis, samas kui enamik ülesreguleeritud transkripte kodeeris transportereid, mida ekspresseeriti nefroni kaugemates osades. Näiteks Nkcc2, Clc-Kb, Ncc ja ENaC transkriptide suurenenud ekspressioon viitas kompenseerivale ülesreguleerimisele postproksimaalses naatriumi reabsorptsioonis. Neeru transkriptoomi ja metaboolia integreeritud analüüs näitas sügavaid muutusi mitmesugustes rakuteedes, mis on seotud raku metabolismi, lipiidmembraani koostise ja redoks-homöostaasiga. cKOm hiirte neerudes oli umbes 8 protsendil transkriptoomist ja umbes 24 protsendil tuvastatud metaboliitidest erinev tase võrreldes Ctrl hiirtega. Nagu oodatud, olid paljud neist transkriptidest ja metaboliitidest seotud peroksisomaalse funktsiooniga. Täheldati peroksisoomides sünteesitud eeterfosfolipiidplasmalogeenide arvukuse dramaatilist vähenemist (~67% cKOm hiirtel ja ~50% cKOf hiirtel, kõigi tuvastatud plasmalogeeniliikide kaalumata summa). Plasmalogeenid on peamised rakumembraani fosfolipiidid, millel on kasvav arv omistatud funktsioone, sealhulgas membraani terviklikkus, raku signaalimine ja antioksüdantide kaitse. Neerudes moodustavad plasmalogeenid ligikaudu 20 protsenti fosfolipiidide koguarvust (17), mis viitab sellele, et cKOm ja cKOf hiirte neerudes erines vähemalt 10 protsenti fosfolipiidide koostisest vastavatest kontrollidest. Plasmalogeenide ammendumist kompenseeris potentsiaalselt struktuurselt sarnaste fosfatidüületanoolamiinide (PE) ja fosfatidüülkoliinide (PC) suurenenud arvukus, mis rikastasid oluliselt nii cKOm kui ka cKOf hiirte neerusid. Tuleb märkida, et sarnast kompenseerivat PE-de ja PC-de suurenemist täheldati ZSD-ga patsientide neerudes (17).

Proksimaalse tuubuli metabolism sõltub peamiselt rasvhapete oksüdatsioonist, mida iseloomustab nii mitokondrites kui ka peroksisoomides toodetud ROS-i kõrge põlvkond. cKO hiirtel olid rasvhapete lagunemise / biosünteesiga seotud teed oluliselt ülesreguleeritud, mis võib viidata nende substraatide mitokondriaalse energia tootmise kompenseerivale suurendamisele. Kuna peroksisoomide üks peamisi funktsioone on ROS-i detoksifitseerimine, oletasime, et peroksisoomi biogeneesi ablatsioon indutseeriboksüdatiivne stresscKO hiirte neerudes. Molekulaaranalüüsid ei näidanud aga muutusi oksüdatiivse stressi antioksüdantide võimes ja biomarkerites. Väljakutse HFD-ga ei kutsunud esile muutusi funktsionaalses fenotüübis, välja arvatud uriini mahu kerge suurenemine ning kaltsiumi ja uraadi eritumine uriiniga cKOm hiirtel. Integreeritud transkriptoomi- ja metaboolne analüüs võimaldas tuvastada glutatiooni rada kui võimalikku kompenseerivat mehhanismi üldise antioksüdandi võime säilitamiseks neerude proksimaalsetes tuubulite rakkudes, millel puuduvad peroksisoomid.

Pex5 tingimuslik deletsioon loote maksas (12), pankrease rakkudes (18) ja kesknärvisüsteemi erinevates rakutüüpides (vaadatud viites 16) põhjustab muutuvaid, kuid enamasti tõsiseid elundispetsiifilisi funktsionaalseid halvenemisi. Neeru puhul see nii ei olnud. Selles uuringus tuvastasime mitu sisemist neerumehhanismi, mis potentsiaalselt võimaldavad toime tulla peroksisoomide puudumisega. Kuna neer on organ, millel on kõrge vereperfusiooni kiirus, on veel üks võimalus vähemalt osa metaboliitide ekstrarenaalses päritolus, mida neer peroksisoomide puudumisel ei tooda, kuid mis on vajalikud normaalseks neerufunktsiooniks. Meie andmed näitavad kollektiivselt, et neerutuubulaarsed peroksisoomid on normaalse neerufunktsiooni jaoks asendamatud ja et ZSD-ga patsientide neerude patofüsioloogilised muutused on ekstrarenaalset päritolu.

meetodid

Loomad. Pex5a/la/Pax8-ntTA/LC-1 Cre hiirte genereerimiseks kasutatud protseduure kirjeldati varem (13). Selles uuringus kasutatud 3 hiireliini on sisearetatud tüved, mis on aretatud C57BL/6J hiire geneetilisel taustal (The Jackson Laboratory). Enne kõiki katseid kohandati hiired 12-tunnise valguse/12-tunnise pimeduse tsükliga. Kõik katsed viidi läbi ööpäevasel ajal ZT3 (ZT0on aeg, mil valgus on sisse lülitatud, ja ZT12 on aeg, mil valgus on välja lülitatud).

Kasutati Pex5bxlo/Pax8-rtTA/LC1 kolmekordseid transgeenseid isaseid või emaseid hiiri (nimetatud kui cKOm ja cKOf) ja Pex5l/a hiiri (viidatud kui Ctrl või Ctrl). Pex5 rekombinatsioon vastsündinutel viidi läbi 0,2% DOX-i ja 2% sahharoosi lisamisega tiinete emaste hiirte joogivette 2 nädala jooksul, alates nende 14. raseduspäevast. Pex5 rekombinatsiooniks täiskasvanud hiirtel lisati 8-nädala vanuste hiirte joogivette DOX-i ja sahharoosi. Neerude struktuuri ja funktsiooni hinnati 4 nädalat pärast DOX-ravi lõppu nädala vanustel väikelastel või 14-nädalastel täiskasvanud hiirtel. Pärast 3-nädalast võõrutamist toideti hiiri standardse kontrolltoiduga, mis sisaldas 4,2 protsenti rasva (madala rasvasisaldusega Sniffi kontrolldieet) või, kui mainiti, 4 nädalat sobiva HFD-ga, mis sisaldas 20,7 protsenti rasva (enamasti LCFA-sid).

Metaboolsed puurid ning vere ja uriini keemia. Hiiri hoiti individuaalsetes metaboolsetes puurides (Tecniplast). Uriini kogumine viidi läbi pärast 3-päevast kohanemisperioodi. Uriini ja vere keemiat analüüsiti, nagu eelnevalt kirjeldatud (19). Plasma ja uriini koostist mõõdeti Laboratoire Central de Chimie Clinique'is, Center Hospitalier Universitaire Vaudoise'i ülikoolihaiglas (Lausanne, Šveits).

Elektronmikroskoopia. Neeruproovid lõigati umbes 1 mm³ tükkideks ja fikseeriti 2,5% glutaaraldehüüdi lahuses (EMS) fosfaatpuhvris (PB, 0,1 M pH 7,4) (MilliporeSigma) 2 tunniks toatemperatuuril. Seejärel loputati neid kolm korda, iga kord 5 minutit, PB puhvris ja seejärel fikseeriti toatemperatuuril 2 tunni jooksul värske seguga, mis sisaldas 1 protsenti osmiumtetroksiidi (EMS) ja 1,5 protsenti kaaliumferrotsüaniidi (MilliporeSigma) PB-s. Seejärel pesti proove 3 korda destilleeritud veega ja dehüdreeriti atsetoonilahuses (MilliporeSigma) astmelistes kontsentratsioonides (30 protsenti 90 minutit; 70 protsenti 90 minutit; 100 protsenti 120 minutit; 100 protsenti 240 minutit). Sellele järgnes infiltratsioon Epon vaiguga (MilliporeSigma) astmelistes kontsentratsioonides (Epon/atsetoon [1/3; maht/maht] 4 tundi; Epon/atsetoon [3/1; maht/maht] 4 tundi, Epon/atsetoon [1 /1;v/v] 8 tundi; Epon/atsetoon [1/1; v/v] 24 tundi) ja lõpuks polümerisatsioon 48 tundi temperatuuril 60 kraadi ahjus. Üliõhukesed 50 nm lõigud lõigati seadmega Leica Ultracut (Leica Mikrosysteme GmbH) ja koguti vasest piluvõrele, 2 × 1 mm (EMS), mis oli kaetud polüstüreenkilega (MilliporeSigma). Sektsioone värviti 10 minutit 2-protsendilise uranüülatsetaadiga (MilliporeSigma) H, O-s, loputati mitu korda H, O-ga, millele järgnes Reynoldsi pliitsitraadiga 10 minutit, ja loputati mitu korda H, O-ga.

Stereoloogia. Stereoloogiliseks analüüsiks analüüsiti 3 neerukoore tükki hiire kohta, 15 mikropilti proovi kohta pikslisuurusega 4,08 nm, kasutades süstemaatilist ühtlast juhuslikku proovivõttu ülekandeelektronmikroskoobiga (Philips CM100, Thermo Fisher Scientific) kiirenduspingel 80 kV digikaameraga TVIPS TemCam-F416 (TVIPS GmbH).

Transkriptoomiline analüüs. Kõik sekveneerimisandmed on avalikult kättesaadavad NIH Gene Expression Omnibusi (juurdepääsunumber GSE179202) kaudu. RNA-Seq raamatukogud valmistati, kasutades 200 ng kogu neeru RNA-d, nagu on kirjeldanud Nikolaeva et al. (19). Kasutati Illumina TruSeq SR Cluster Kit v4 reaktiive. Järjestusandmeid töödeldi Mus musculuse abil. GRCm38.{6}} geeni annotatsioon, Statistiline analüüs viidi läbi R-s (versioon 3.4.0). Madala arvuga transkriptid filtreeriti välja vastavalt reeglile 1 count per million (CPM) vähemalt ühes proovis. Raamatukogu suurused skaleeriti TMM-i normaliseerimisega ja logaritmiliselt teisendati CPM-iks, kasutades voomi (20). Põhikomponentide analüüs näitas väikest varieeruvust kordusproovide vahel. Diferentsiaalne ekspressioon cKO ja Ctrl hiirte vahel arvutati 1 F testiks, kasutades limma (21). P väärtused kohandati vastavalt kirjeldusele (22) FDR-i väärtusteks, et kaaluda mitut võrdlust, kasutades kõigi meeste ja naiste transkriptide tulemusi või valitud transporterite või peroksisoomiga seotud transkriptide tulemusi ainult meestel. FDR-iga ärakirjad<5% were="" considered="" significant.="" comparisons="" of="" expression="" levels="" were="" done="" using="" the="" mean="" fc="" of="" cpm="" in="" cko="" mice="" as="" compared="" with="" ctrl="" mice.="" for="" a="" graphical="" representation="" of="" individual="" values="" in="" box-and-whisker="" plots,="" individual="" values="" were="" normalized="" between="" 0="" and="" 1.="" a="" weighted="" gsea="" was="" performed="" using="" the="" unfiltered="" transcript="" list="" ranked="" by="" signed="" p-value="" (product="" of="" p-value="" and="" sign="" of="" the="" fc).="" the="" analyses="" were="" performed="" using="" the="" gsekegg="" function="" from="" the="" r="" package="" cluster="" profile(version="" 3.16.1)(23).="" kegg="" pathway="" collections="" were="" restricted="" to="" gene="" sets="" with="" minimum="" and="" maximum="" sizes="" of="" 10="" and="" 500,="" respectively.="" the="" enrichment="" scores="" were="" normalized="" by="" gene="" set="" size,="" and="" their="" statistical="" significance="" was="" assessed="" by="" permutation="" tests="" (n="">

Ainevahetusanalüüs. Külmutatud neeruproovide metaboliidid tuvastati ülikõrge jõudlusega vedelikkromatograafia-tandem-massispektroskoopia abil ja kvantifitseeriti, kasutades AUC (Metabolon Inc). Toorväärtused teisendati logaritmiliselt ja normaliseeriti töötlemata alade arvu järgi. Kahesuunalisi ANOVA kontrastsuse teste kasutati biokemikaalide tuvastamiseks, mis erinesid oluliselt mõlemast soost cKO ja Ctrl hiirtel. P väärtused kohandati vastavalt kirjeldusele (22) FDR-i väärtusteks, et kaaluda mitmekordset võrdlust, ja metaboliitidele FDR-iga<5% were="" considered="" significantly="" modulated.="" for="" log2fc="" calculation,="" missing="" values,="" if="" any,="" were="" replaced="" with="" the="" minimum="" observed="" value="" in="" mice="" of="" the="" same="" sex,="" for="" each="" compound.="" for="" a="" graphical="" representation="" of="" individual="" values="" in="" box-and-whisker="" plots,="" normalized="" values="" were="" divided="" by="" the="" median="" value="" obtained="" in="" mice="" of="" the="" same="" sex,="" for="" each="">

Ühine transkriptoomi-metaboloomi analüüs. Integreeritud metaboolsete radade analüüs, mis ühendas geeniekspressiooni ja metaboolsete uuringute tulemusi, viidi läbi, kasutades MetaboAnalyst 5.{1}} veebisaidil (24) olevat liigeste raja analüüsi moodulit. Metaboliitide liitnimetus ja transkriptide ametlik geenisümbol, mis on oluliselt enam-vähem rikkalik (FDR<0.05), along="" with="" their="" respective="" fcs="" in="" ckom="" mice="" as="" compared="" with="" ctrl="" mice,="" were="" inputs.="" the="" integration="" was="" performed="" using="" kegg="" metabolic="" pathways="" with="" default="" settings(hypergeometric="" test="" for="" overrepresentation="" analysis,="" degree="" centrality="" for="" pathway="" topology="" analysis,="" and="" tight="" integration="" by="" combining="" queries).="" pathways="" with=""><0.1 were="" considered="" significantly="" affected="" in="" ckom="">

Plekid. Neeru globaalse struktuuri, kaltsiumoksalaadi ladestumise või neutraalse lipiidide ladestumise värvimine viidi läbi 5 μm paksustel põikisuunalistel neeruviiludel. Hiired anesteseeriti, välja arvatud neutraalne lipiidide värvimine, ja nende vasak neer perfuseeriti enne kudede kogumist läbi kõhuaordi 4-protsendilise paraformaldehüüdi lahusega. Globaalse neerustruktuuri analüüsimiseks deparafiiniti parafiini sisestatud neeruviilud, rehüdreeriti, värviti H&E-ga, dehüdreeriti ja paigaldati ROTI Histokitt'i (Carl Roth GmbH). Neutraalsed lipiidid värviti OCT ühendisse (Tissue-Tek) sisestatud neeruviiludesse, kasutades Oil Red O lahust. Kaltsiumoksalaadi ladestused värviti vastavalt Pizzolato (25) kirjeldatud meetodile. Lühidalt, parafiini sisseehitatud neeruviilud deparafiiniti ja rehüdreeriti, seejärel sukeldati 5-protsendilise hõbenitraadi ja 30-protsendilise vesinikperoksiidi 1:1 lahusesse ning asetati 30 minutiks 60 W lambipirni alla. Slaidid pesti põhjalikult destilleeritud vees ja värviti Nuclear Fast Rediga (MilliporeSigma), seejärel dehüdreeriti enne paigaldamist.ROTI Histokitt. Kaltsiumoksalaadi nefropaatiast põhjustatud dieediga (1,5 protsenti kaltsiumi pluss 1,5 protsenti hüdroksüproliini segatud standardse toiduga 3 nädala jooksul) saanud hiire pikisuunalised neerulõigud toimisid positiivse kontrollina kaltsiumoksalaadi ladestumise üle neerudes. Tulemusi analüüsiti Zeiss AxioScan.Z1 slaidiskanneriga algse suurendusega 100× või 200×.

ELISA ja Troloxi test.{0}}HNE mõõdeti, kasutades lipiidide peroksüdatsiooni (4-HNE) testikomplekti firmalt Abcam (ab238538). Üld- ja mitteensümaatilist antioksüdantide mahtu hinnati Troloxi testikomplektiga firmalt Abcam (ab65329).

Statistika. Kõik andmed on väljendatud keskmisena ± SEM. Statistilisi teste ja olulisuse läve kirjeldatakse jooniste legendides või sobivates meetodite jaotistes. Statistiline analüüs viidi läbi R-pakettide või GraphPad Prism tarkvara versiooni 8.2.1 abil. Kõik t-testid olid kahe sabaga.

Uuringu heakskiit. Kõik katsed loomadega viidi läbi vastavalt Šveitsi loomahoolduse juhistele, mis vastavad riiklikele tervishoiuasutuste loomade hooldamise juhistele ning on heaks kiidetud Šveitsi kantoni (Canton de Vaud) ja föderaalsete veterinaarasutuste (DF-i luba 31827) (Direction generalale) poolt. de P'agriculture, de la viticulture et des affairs vetérinaires, Epalinges, Šveits).

Eelnev avaldamine: osa sellest tööst on esitatud kokkuvõttena Ameerika Nefroloogiaühingu 2021. aasta koosolekule (4. novembril 2021. https://www.asn-online.org/education/kidney-week/2021) /program-abstract.aspx?controlId=3605774).