5. peatükk Ensüümide aktiivsuse muutused ensüümide kääritamise ajal

5. peatükk Ensüümide aktiivsuse muutused ensüümide kääritamise ajal

 

Proteaas, lipaas jasuperoksiidi dismutaas (SOD)on peamised funktsionaalsed ensüümidmikroobsed ensüümi tervislikud toidud. Nende seas,proteaasmängib rollivalgu hüdrolüüsi soodustamine toidusinimkehas. Lisaks võib see lagundada ka mõned surevad rakud, eemaldada mustuse nahapinnal ja pooridelt ning mängida rolli koorimisel, nii et seda kasutatakse laialdaselt vannitoodetes. Lipaas toimib rasvhapete ja glütserooli vahelise estri sidemega ning hüdrolüüsi substraat on üldiselt looduslikud õlid. Seetõttu nähakse seda paljudes kaalukaotustoitudes ja tervisetoodetes. Paljud naised on kaalulanguse teema pärast äärmiselt mures, mistõttu on ensüümid kogu maailmas kiiresti populaarseks muutunud.Ensüümid on rikkad lipaasi, mis tähendab, et neil on kõrge uurimistöö ja rakenduse väljavaated.Mätason spetsiaalne metalliensüüm, mis katalüüsibsuperoksiidi anioonradikaalid, seeläbiSuperoksiidi anioonradikaalide eemaldaminekehas. See on organismide kaitsebarjäär, seega kasutatakse seda laialdaselt meditsiinivaldkonnas.
See peatükk võtab näitena Apple ensüümi. Alates kääritamise algsest etapistsuperoksiidi dismutaasi tegevused, amülaasi, lipaasi, proteaasi ja tsellulaas eksperimentaalrühmas ja kontrollrühmas mõõdeti iga 15 päeva tagant, et terviklikult ja süstemaatiliselt kajastada ensüümide aktiivsuse muutuvat suundumust kogu kääritamisprotsessi ajal.

Uued ürdid Cistanche

Lisateabe saamiseks klõpsake

 

Wecistanche toetav teenus-Hiina suurima tsistanche eksportija:
E -post: wallence.suen@wecistanche.com
Whatsapp/tel: +86 15292862950

 

 

 

 

 

 

5.1 Materjalid ja meetodid

5.1.1 Materjalid

(1) eksperimentaalsed materjalid

Pese steriilsetes tingimustes värsked õunad steriilsetes tingimustes, kuivatage need looduslikult steriilsele töölauale, koorige need ja viilutage hilisemaks kasutamiseks. Lisage valge suhkur ja õunad steriliseeritud klaasist purki massisuhtega 1: 1. Aktiveerige eksperimendi jaoks vajalikud bakterid ja nakatage need ensüümi vastavalt optimaalsele skeemile (see toimingutapp jäetakse kontrollrühma jaoks välja), tihendage see ja asetage see jahedasse ja kuiva kohta. Pärast 3 -kuulist toatemperatuuri kääritamist võtke proov kogu tselluloosi sisaldava ensüümi vedeliku saamiseks ja filtreerige see. Võtke eksperimentaalse valimina supernatant. Pärast valimi tsentrifuugitamist 10, 000 p / min 15 minutit kiires tsentrifuugis, kasutatakse seda asjakohaste andmete mõõtmiseks. Väärib märkimist, et ensüümide valmistamise käigus viidi tarbetu saastumise vältimiseks kõik meie toimingud läbi steriilsetes tingimustes.

(2) Põhiinstrumendid
Katse jaoks vajalikud instrumendid on samad kui 3.1.1 (2).

 

5.1.2 Meetodid

(1) Superoksiidi dismutaasi (SOD) aktiivsuse määramine [66]
Pürogallooli lahus eelsoojendati teatud aja jooksul 25 -kraadises konstantses temperatuurivannis. Tabeli 5.1 kohaselt lisati katseklaasi sobiv kogus puhvrit, destilleeritud vett ja sama maht soolhapet või pürogallooli lahust. Pidev temperatuuri veevann seati 2 0 miniks 25 kraadi. Pärast segatud vedeliku kiiresti raputamist süstiti see kohe Cuvette'i. Proovi neeldumisväärtust A0 mõõdeti spektrofotomeetri abil iga 30 sekundi järel lainepikkusel 325nm.

Vahekaart.5.1 Lisage autoksüdatsiooni kiiruse määramiseks külgneva benseeni kolme fenoolreaktiivi kogus

 

SOD aktiivsuse määramise meetod on põhimõtteliselt sama kui ülaltoodud toiming. Ainus erinevus on see, et enne pürogalloli lisamist tuleb lisada 5 ml erinevate kontsentratsioonide ensüümiproovilahust. Samal ajal lisatakse sama maht destilleeritud vett. Mõõdetud neeldumine on ASOD. Inhibeerimiskiirus ja SOD ensüümi aktiivsus arvutatakse vastavalt valemile 5.1 ja valemile 5.2: inhibeerimiskiirus (%) =} (△ a 0- △ ASOD)/△ {0} × 100 (5.1) ensüümi aktiivsus (u/ml) {{{{{} {{} {{{{{{{} {{{} V1/V2 × N (5.2) kus: V1 on lahuse kogumaht, ML; V2 on ensüümi proovilahuse maht, ML; △ A0 on pürogallooli autooksüdatsiooni kiirus; △ ASOD on proovi neeldumise väärtuse muutumise kiirus; n on amülaasi aktiivsuse lahjendus mitmekordse määramine Selles uuringus kasutati amülaasi aktiivsuse määramiseks joodi tärni kolorimeetrilist meetodit. Konkreetsed operatsiooni etapid viitavad "riikliku kliinilise labori operatsiooni protseduurile" [67]. See jaguneb peamiselt kaheks järgnevaks punktiks:

 

① Lahenduse ettevalmistamine
Puhverdatud tärkliselahendus ({{{0}}}. 4G/L): kaaluge täpselt 9g naatriumkloriidi, 22,6 g veevaba disatriumvesinikfosfaati ja 12,5 g anhüdroosset kaaliumfosfaati, lahutades neid 5 {15} {{{} {{} {} {} {} {} {} keeb; Kaaluge täpselt 0,4 g lahustuvat tärklist, lahustage see 10 ml destilleeritud vees, segage ühtlaselt ja reguleerige pastaga; Süstige tärkliselahus pastaga ülaltoodud keeva lahusesse ja peske keeduklapp korduvalt, kuni tärklis kantakse täielikult keeva vee lahusesse. Pärast klaasist vardaga ühtlast segamist jahutage toatemperatuurini, lisage 5 ml 37% juuste formaldehüüdilahust ja lahjendage destilleeritud veega 1L -ni. Lahuse pH väärtus on 7,0 ± 0,1 ja see asetatakse kasutamiseks külmkappi.
Joodlahus (0. 1 Mol/L): kaaluge täpselt 1,7835G kaaliumjodaat ja 22,5 g kaaliumjodiid puhta 500ml abil
Lisage aeglaselt ja ühtlaselt 4,5 ml kontsentreeritud vesinikkloriidhapet, segades pidevalt lisamisprotsessi ajal, lahjendage skaalale destilleeritud veega ja segage ühtlaselt. Pange see kasutamiseks külmkappi ja hoidke seda pruuni reagendi pudelis.
Jood Application Solution ({{{0}}}. 01Mol/L): võtke teatud kogus joodi varulahust (0,1 mol/L), lahjendage see kümme korda destilleeritud veega, pange see külmkappi kasutamiseks ja hoidke seda kuni ühe kuu jooksul.

② Eksperimentaalsed toimingud
Võtke ensüümilahus ja lahjendage see kümme korda füsioloogilise soolalahusega ning toimige vastavalt tabelile 5.2. Segage hästi, spektrofotomeetri lainepikkus on 660 nm ja kolorimeetrilise tassi kerge tee on 10mm. Null destilleeritud veega ja lugege iga toru neeldumist. Arvutage amülaasi aktiivsus põhiarvutusvalemil 5.3.

 

Vahekaart.5.2 Amülaasi määramise toimingud

 

(3) Lipaasi aktiivsuse määramine

Määramismeetod viidi läbi vastavalt QB/T {{0}}} [68]. 2% ensüümi testilahus valmistati 0 -ga. 0 25 mol/l fosfaatpuhvriga (pH 7,5), indikaatorina kasutati fenoolftaleiini ja rasvhapped tiitriti standardse naatriumhüdroksiidilahusega. Lipaasi aktiivsus arvutati katses tarbitud naatriumhüdroksiidi mahu põhjal. Reegel on: pH korral 7,5 ja ümbritseva õhu temperatuuril 40 kraadi, 1 ml vedela ensüümi lahust hüdrolüüsib lipaasi 1 minut, et saada 1 μmol rasvhapet, mis on üks lipaasi aktiivsus, mida väljendatakse U/ml -na. Seejärel arvutati lipaasi aktiivsus vastavalt valemile 5.4: ensüümi aktiivsus (u/ml) {= (BA) × C/0,05 × 50 × 1/15 × N=200/3 × 3 × (BA) × C × N (5.4), kus: B -maht; A on tühja kontrollrühmas ML -is tarbitud naatriumhüdroksiidi standardlahuse maht; C on naatriumhüdroksiidi standardlahuse kontsentratsioon, mol/l; 0,05 on naatriumhüdroksiidi standardlahuse kontsentratsiooni muundumus; 50 on naatriumhüdroksiidi lahuse rasvhapete sisaldus; 15 minutit on reaktsiooniaeg; n on lahjendus mitu.

(4) Proteaasi aktiivsuse määramine

Vt GB/T 23527-2009 [69] kergete modifikatsioonidega.
① Standardkõvera ettevalmistamine
Võtke 1 ml türosiini standardlahust erinevate massi kontsentratsioonidega, mis on 0, 1 0, 20, 30, 40 ja 50 mg/L ning lisage 5 ml 0,4 mol/l naatriumkarbonaadilahust ja 1 ml folin reaktiivse lahenduse jaoks. Reageerige 20 minutit temperatuuril 40 kraadi. Pärast reaktsiooni lõpuleviimist eemaldage reaktsioonilahus ja mõõtke lahuse neeldumisväärtust lainepikkusel 680Nm, kasutades spektrofotomeetri abil. Joonistage horisontaalteljena türosiini kontsentratsiooniga türosiini standardkõver ja vertikaalteljena neeldumise väärtus.

Uued ürdid Cistanche tugeva antioksüdantse jõuga

② Proteaasi aktiivsuse määramine
Katserühm: võtke 1 ml kaseiinilahust kontsentratsiooniga 10 g/l ja segage see ühtlaselt testitava proovilahusega 1 ml ja reageerib 10 minutit ümbritseva õhu temperatuuril 40 kraadi; Filtreerige ja hankige filtraat pärast seismist, võtke 1 ml filtraati, 5 ml naatriumkarbonaatlahust ja 1 ml folin reagenti, segage ühtlaselt ja reageerige 20 minutit ümbritseva õhu temperatuuril 40 kraadi; Lahuse neeldumisväärtuse mõõtmiseks lainepikkusel 680 nm.
Tühi kontrollrühm: võtke testimiseks 1 ml proovilahust, lisage trikloroäädikhape, reageerib täielikult proteaasi inaktiveerimiseks ja muud töömeetodid on samad kui eksperimentaalrühm.

Arvutage proteaasi aktiivsus vastavalt valemile 5.5:
Proteaasi aktiivsus (u/ml)=AK × 4/10 (5.5) kus: a on ensüümilahuse neeldumine katserühmas; K on türosiini kogus, kui neeldumine on võrdne 1 -ga; 4 on reaktsioonilahuse kogumaht, ML; 10 on reaktsiooniaeg, min.

(5) Tsellulaasi aktiivsuse määramine [70]

Tsellulaasi aktiivsust ensüümides ekspresseerub üldiselt glükoosi koguse kaudu, mis vabaneb teatud kogus ensüümilahust ajaühiku kohta. Filterpaberi meetodi kasutamise põhimõte on tsellulaasi aktiivsuse mõõtmiseks see, et tsellulaas võib filterpaberis lagundada tselluloosi, et saada sekundaarseid metaboliite nagu glükoos, ja glükoos võib reageerida 3 -ga, 5- dinitrosalitsüülhappega, moodustades kollase kompleksi. Selle reaktsiooni värv on suhteliselt ere, mis võib hästi kindlaks teha glükoosi koguse ja muude toodetud suhkrute koguse.

 

①3, 5- Dinitroalitsitsülitsehappe kolorimeetriline aine
Kaaluge täpselt 1 {0 g 3, 5- dinitrosalitsüülhapet {168-169 kraadi sulamistemperatuuriga, lahustage see destilleeritud veega, lisage 20 g naatriumhüdroksiidi ja 200 g kaaliumhüdroksiidi ja kaaliumhiumitooraat, jätkake kuumutamist, kuni tahked on täielikult distsiititud, kuni 500m. 0,5 g veevaba naatriumsulfiidi, segage lisamisprotsessi ajal pidevalt, kuni see on täielikult lahustunud, lõpetage kuumutamine pärast ühtlase segunemist, jahutage toatemperatuurini, viige kõik 1000 ml mahukasse kolbi, lahjendage märgile destilleeritud veega, asetage toatemperatuuril ühe nädala jooksul, filter, hankige supernatant, ja ladustage pruunist reagist.②ensümaatiline hüdrolüüs
Täpselt Pipette {{0}}, 0. 5, 1. 0, 1,5, 2,0 ml ensüümi proovilahust 2 ml äädikhappe-naatriumpuhverlahusesse, mille pH väärtus on 4,5. Pärast 5 -minutist pidevat temperatuuri veevanni 40 kraadi juures lisage 6 tükki kromatograafiafiltripaberi, mille pindala on vastavalt 1 × 1cm2, ja alustage kohe ajastust, et reaktsiooniaeg oleks täpne 60 minutini. Viige kohe 10 minutiks reaktsiooniks keeva veevanni ja tsellulaas kaotab oma aktiivsuse.

 

 

③ Värvireaktsioon
Võtke ensüümiproovilahus, lisage 3ml 3, 5- dinitrosalitsüülhappe kolorimeetriline aine, mis on valmistatud ① -s, kuumutage keevas veevannis 15 minutit, võtke välja, jahutage toatemperatuurini, lisage 10 ml destilleeritud vett, segage ühtlaselt, kasutage 550 nm lainepikkust 550 nm, korrigeerige selle neeldurühma zerosse.
④ glükoosistandardkõvera joonistamine
Valmistage ette glükoosistandardlahendus, mille kontsentratsioon on täpselt 1 mg/ml, ja kasutage destilleeritud vett, et muuta glükoosistandardlahendus 0 mahuga, 0. 2, {0. 4, 0. 6, {{{{8}. 3ml 3, 5- dinitrosalitsüülhappe kolorimeetriline aine, mis on valmistatud ① värvi arengureaktsiooni teostamiseks. Joonistage standardkõver glükoosikontsentratsiooniga horisontaalteljena ja vertikaalteljena neeldumine.
⑤Kalkulatsioon
Kasutage neeldumisväärtust A pärast värvi arengut ensüümilahusega ja arvutage seejärel glükoosi vabanemise kogus m vastavalt glükoosistandardi kõverale ja arvutage vastavalt valemile 5.6:
Tsellulaasi aktiivsus (u/ ml)=m/ (t · m) (5.6) kus: m on glükoosi vabastamise kogus, ug; t on ensümaatiline hüdrolüüsi aeg, min; M on ensüümide sisaldus reaktsioonis, ug/ml.