CD8 ja CD4 T-rakkude populatsioonid inimese neerudes
Mar 25, 2022
Abstraktne:Taust: Piirialadel ja siseorganites aitavad kudedes elavad mälu T-rakud (TRM) luua immuunbarjääri patogeenide, nagu viirused, bakterid, seened ja vähk, vastu. Kuid teave nende rakkude olemasolu ja funktsiooni kohta inimese neerudes on napp. Selle organi T-rakkude poolt vahendatud immunoloogilise kaitse paremaks mõistmiseks püüdsime määrata tervetes ja allograftis esinevate CD8 ja CD4 T-rakkude fenotüüpsed ja funktsionaalsed aspektid.neerud pabertaskurätik. Meetodid: kasutades mitmekanalilist kaastsütomeetriat, hindasime T-rakkude fenotüüpi ja funktsiooni tervetes neerukoe proovides (n=5) janeerudallotransplantaadi koe (n=7) ja võrdles neid aspekte tervete kontrollide (n=13) perifeerse vere T-rakkudega. Tulemused:Neerkoeproovid sisaldasid märkimisväärses koguses CD8 ja CD4 T-rakke. Erinevalt ringlevatest rakkudest,neerudT-rakud ekspresseerisid sageli CD69 ja CD103 ning liikusid sagedamini tsükliliselt. Lisaks peaaegu kõikneerudT-rakud ekspresseerisid CXCR3 ja sageli ekspresseerisid CXCR6 võrreldes T-rakkudega vereringes. Märgatavalt,neerudT-rakud tootsid suuremas koguses IFN-i kui ringlevad rakud ja olid sageli polüfunktsionaalsed. Järeldus: TRM-i iseloomulike tunnustega funktsionaalsed T-rakud asuvad inimeselneerudkoed. Need rakud on sagedamini tsüklilised ja ekspresseerivad sageli CXCR3 ja CXCR6.
Märksõnad:kudedes elavad lümfotsüüdid; T-rakud; CD8; CD4; CD69; CD103; neerud; allograft
CISTANCHE PARANDAB NEERU-/NEERUHAIGUST
1. SissejuhatusResident-mälu T-rakud (TRM) püsivad kudedes, et pakkuda pikaajalist lokaliseeritud kaitset patogeenide vastu. Erinevalt retsirkuleerivatest T-rakkudest ei saa TRM-i populatsioone perifeerses veres tuvastada ja need erinevad oluliselt retsirkuleerivatest T-rakkude populatsioonidest nende fenotüübi, funktsiooni ja metabolismi poolest [1]. Tõepoolest, see pole üllatav, arvestades asjaolu, et erinevad elundisüsteemid, nagu kopsud, puutuvad kokku suuremate erinevate patogeenide koormustega kui vereringe, mis on üldiselt välismaailmast isoleeritud [2].TkM-i säilimine kudedes püsib aastaid ja seda vahendavad mehhanismid, mis hõlmavad sfingosiin-1-fosfaadi retseptor1 (S1PR1)-sfingosiin1-fosfaadi (SP1) telge. S1PR1 on T-rakkude poolt ekspresseeritud retseptor, mis vahendab väljumist sekundaarsetest lümfoidsetest elunditest pärast seondumist bioaktiivse signaalmolekuliga SP1, mis on T-rakkude kaubitsemise oluline vahendaja. Selle telje võib katkestada CD69, membraaniga seotud c-tüüpi lektiin, mis antagoniseerib S1PR1 ekspressiooni, vahendades seega retentsiooni. Lisaks indutseerib hiirtel S1PR1 ekspressiooni transkriptsioonifaktor Krüppeli sarnane faktor 2 (KLF2), mis leiti olevat TRM-is allareguleeritud, inhibeerides seeläbi ka lümfotsüütide väljapääsu [3]. Omakorda selgus, et KLF2 allareguleerimist vahendab Blimpli transkriptsioonifaktori homoloog T-rakkudes (Hobit), mida ekspresseeritakse hiire T-rakkudes TpM-spetsiifilisel viisil [4]. Lisaks ekspresseerib mõned TRM-id ka CD103 (integriin E), kusjuures TRM-i saab tuvastada CD69 ja CD103 ekspressiooni abil [1].
Kuigi teadmised TRM-i fenotüübi ja funktsioonide kohta suurenevad erinevate inimkudede kohta, on nende aspektide kohta vähe teadaneerud. Siin puutuvad T-rakud kokku erinevate patogeenidega, nagu alumiste kuseteedest tõusvad bakterid ja renotroopsed viirused, nagu polüoomiviirus BK (BKPyV). Tõepoolest, me kirjeldasime hiljuti, kuidas inimese neerud sisaldavad CD69 ja/või CD103 ekspresseerivate T-rakkude alamhulka, mille hulgas on CD8 T-rakke, mis on spetsiifiliselt suunatud BKPyV valkude virion protein1 (VP1) ja suure T antigeeni (LTAG) valgu vastu [5]. Meie ja teised demonstreerisime ka limaskestaga seotud invariantsete T (MAIT) rakkude olemasolu CD69/CD{7}}neerudkude [6,7].
Et paremini mõista, millised T-rakud moodustavad selles elundis lokaliseeritud immuunvastuse, kasutasime mitmekanalilist voolutsütomeetriat, et uurida nende fenotüüpi ja funktsiooni.neerudTRM-id, doonorilt eraldatudneerudNeerutransplantaadi retsipientide (RTR) ja tervete materjalneerudneerurakkude kartsinoomide kõrval, et näha, kuidas neid populatsioone võrrelda vereringes olevate T-rakkude populatsioonidega.Leidsime selle inimeseneerudkude sisaldab märkimisväärses koguses CD4 ja CD8 T-rakke, mis ekspresseerivad ainult CD69, CD69 ja CD103 või mitte ühtegi neist markeritest. Leidsime, et CD69-CD103- lahtrid asukohasneerudkude erineb oluliselt T-rakkudest vereringes ja võib esindada TRM-i populatsiooni, millel puuduvad kanoonilised TRM-markerid. Lisaks näitame, et neeru T-rakud liiguvad verega võrreldes sagedamini aktiivsemalt, mida hinnatakse Ki-67 suurenenud ekspressiooni järgi. Samuti leidsime, et CD8 ja CD4 T-rakudneerudkude ekspresseerib peaaegu alati CXCR3 ja ekspresseerib sageli CXCR6. Need leiud viitavad nende kemokiini retseptorite rollile neerudes elavate mälu T-rakkude populatsioonide ligitõmbamisel ja säilitamisel.
2. Materjalid ja meetodid
2.1. Patsiendid ja proovidProovid saadi Amsterdami UMC asukoha AMC Biobank Renal Diseases'ist. Selles Biopangas patsiendi proovid, nagu vere- janeerudkudesid, kogutakse ja säilitatakse tervislikust eluviisistneeruddoonorid ja RTR-id, mida jälgitakse enne ja pärast neerusiirdamist. See uuring viidi läbi Helsingi ja Istanbuli deklaratsioonides kirjeldatud põhimõtete kohaselt ning kõik osalejad andsid enne Biopanka registreerumist kirjaliku teadliku nõusoleku. Lisaks annetas patoloogia osakond kasvaja nefrektoomia läbinud patsientide jääkkude (kasvajast kaugemal paiknev neerukude), mida säilitati ka biopangas. Neid kudesid töödeldi anonüümselt vastavalt Hollandi meditsiiniteaduslike seltside föderatsiooni käitumisjuhendile (Inimkoe ja meditsiinilised uuringud: vastutustundliku kasutamise käitumiskoodeks, 2011 www.federa.org).
2.2. Perifeerse vere mononukleaarsed rakud (PBMC)Vereproovid saadi tsütomegaloviiruse (CMV) seronegatiivsetest tervetest kontrollidest (elusneeruddoonorid enne operatsiooni, n= 13). Selles uuringus osalejate omadused on toodud tabelis 1. PBMC-d eraldati naatriumhepariini verest standardse tihedusega gradienttsentrifuugimisega ja seejärel külmsäilitati analüüsipäevani.
2.3. NeerukudeTerved neerukoe proovid (n {0}}) saadi neerudest, mis eemaldati kirurgiliselt neerurakulise kartsinoomi (neeru kontralateraalsest poolusest kaugemal paiknev mittekasvajaline kude) ja siirdatud neerukoe (n {{1) tõttu. }}) saadi siirdatud neeru allotransplantaatidest pärast siirdamise ebaõnnestumist. Neid proove nimetatakse vastavalt tervete ja siirdatud neerude proovideks. Neerukoore viilud lõigati McElwain Tissue Chopperiga (Ted Pella, Redding, CA, USA) 1- mm kuubikuteks, kanti üle 50 ml tuubidesse ja pesti külma PBS-ga, kuni verd ei tulnud. nähtavalt ja supernatant oli selge. Lisati eelsoojendatud (37 kraadi) seedekeskkond, 40 ml 10 g koe kohta (IV tüüpi DNA (50 KU/mL) (Sigma Aldrich, Zwiindrecht, Holland), IV tüüpi kollagenaas (0,5 mg/mL) (Worthington Biochemical, Lakewood, NJ, USA), BSA (60 mg/ml) (Sigma Aldrich), 20 uL/ml vasikaloote seerum (FCS, VWR International BV, Amsterdam, Holland), TRIS (0,025 M) (Merck BV, Amsterdam, Holland), penitsilliin-streptomütsiin (Biochrom GMBH, Berliin, Saksamaa) HBSS-is (Westburg BV, Leusden, Holland)) ja inkubeeriti loksutis 20 minutit 37 kraadi juures. Soe suspensioon viidi üle C-torusse (Miltenvi, Bergisch Gladbach, Saksamaa) ja allutati GentleMacsi (Miltenyi) programmile M_spleen_04.01. Seedimiskeskkond deaktiveeriti külma PBS-ga ja saadud rakususpensioon lasti läbi rakusõela, et saada üherakuline suspensioon, mida tsentrifuugiti standardse tiheduse gradiendiga vastavalt tootja protokollile (Lymphoprep, Abbott Diagnostics Technologies AS, Oslo, Norra). ). Eraldatud mononukleaarsed rakud (neeru MNC-d) olidkülmsäilitatud kuni analüüsipäevani IMDM-is, millele on lisatud 20% FCS, 000036 mahuprotsenti -merkaptoetanooli, 5% DMSO-d, penitsilliini ja streptomütsiini.
2.4. VoolutsütomeetriaMõõtmised viidi läbi LSRFortessa voolutsütomeetriga (BD Biosciences). Iga proovi puhul analüüsiti 2 × 106 PBMC-d või 0,5 × 106 kuni 106 × 106 neeru MNC-d. Iga värvimisreaktsiooni maht oli rakkude arvu suhtes ja antikehade kontsentratsioonid jäid konstantseks. Rakke inkubeeriti pinnaantikehadega (täiendav tabel S1) 30 minutit 4 kraadi juures pimedas. Surnud rakud välistati, kasutades fikseeritavat elujõulist värvi eFluor455UV (eBioscience Inc., Thermo Fisher Scientific, San Diego, CA, USA). Intratsellulaarsete sihtmärkidega monoklonaalsed antikehad (täiendav tabel S1) lisati pärast rakkude fikseerimist ja permeabiliseerimist, kasutades FoxP3 / transkriptsioonifaktori värvimiskomplekti (eBioscience Inc.). Järgiti avaldatud meetodeid voolutsütomeetria ja rakkude sorteerimiseks immunoloogilistel eesmärkidel [8]. Fenotüüpse analüüsi jaoks kasutatud väravastrateegia leiate lisajoonisel S1. Oleme varem näidanud, et neeru MNC-de isoleerimiseks kasutatud seedimismeetod ei mõjutanud ühtegi analüüsitud markerit [7].
Koeproovide piirangute tõttu jäeti proovid kardinapaneelidest välja. Tervete PBMC-de, tervete neerude MNC-de ja TX-neerude proovi kohta analüüsitud CD3 pluss rakkude arv on toodud joonisel S3. MNC-d Proove analüüsiti ainult siis, kui need sisaldasid lümfotsüütides üle 50 protsendi elusrakkudest, nagu hinnati elujõulisuse dve-ga, ja CD69/CD103-põhiseid T-rakkude alamhulka iseloomustati täiendavalt ainult siis, kui nende rakkude koguarv ületas 50.
CISTANCHE PARANDAB neeru-/NEerupuudulikkust
2.5. StimulatsioonianalüüsPBMC ja neeru MNC stimuleeriti, nagu eelnevalt kirjeldatud [7, 9]. PBMC-d ja neerude MNC-d sulatati DNAse I (200 KU/mL) juuresolekul, pesti ja lasti üleöö taastuda töötlemata ümarapõhjalistel 96-süvendplaatidel (Corning) söötmes (RPMI, millele oli lisatud 10% FCS ja penitsilliin-streptomütsiin) kontsentratsiooniga 20 × 106/mL (100 μl süvendi kohta).
Järgmisel hommikul lisati rakkude stimuleerimiseks forbool{0}}müristaat13-atsetaati (PMA, 10 ng/mL; Sigma Aldrich) ja ionomütsiini (1 ug/mL; Sigma Aldrich). Negatiivse kontrollina lisati ainult sööde. Kõik inkubatsioonid viidi läbi söötmes CD28 (kloon 15E8; 2 ug/mL), CD29 (kloon TS 2/16; 1 ug/mL), brefeldiin A (10 ug/ml, Invitrogen) ja GolgiStop ( BD Biosciences) lõppmahus 200 uL 4 tundi 37 kraadi juures ja 5% CO2 juures.
Seejärel inkubeeriti rakke 30 minutit pinnaantikehadega (täiendav tabel S2). Surnud rakud välistati, kasutades fikseeritavat elujõulist värvi eFluor780 (bioscience Inc., Thermo Fisher Scientific, San Diego, CA, USA). Monoklonaalsed antikehad intratsellulaarseks värvimiseks (tabel S1) lisati pärast rakkude fikseerimist ja permeabiliseerimist, kasutades Cytofix/Cytoperm reagentide komplekti (BD Biosciences). Rakke pesti kaks korda ja analüüsiti LSRFortessa voolutsütomeetril. Funktsionaalanalüüsis kasutatud väravastrateegia leiate lisajoonisel S2. Iga T-rakkude alamhulga polüfunktsionaalsuse määramiseks arvutati iga populatsiooni keskmine funktsioonide arv järgmise valemi abil:((1 tsütokiini tootvate rakkude protsent]*1) pluss ([2 tsütokiini tootvate rakkude protsent]*2) pluss ([3 tsütokiini tootvate rakkude protsent]*3) pluss ([4 tsütokiini tootvate rakkude protsent]*4) pluss ([kõiki 5 tsütokiini tootvate rakkude protsent]*5))/100.
2.6.Andmete analüüs
Andmeid analüüsiti, kasutades FlowJo versiooni 10 (FlowJo, Ashland, OR, USA). Kõik graafikud ja joonised loodi Graphpad Prism versiooni 8.00 abil Windowsi jaoks (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA). Sama programmi kasutati ka andmete statistiliseks analüüsiks. Paarimata proovide olulisuse määramiseks kasutati mitteparameetrilist Mann-Whitney-U testi. Paarisproovide võrdlemiseks kasutati Wilcoxoni märgistatud auaste testi. p-väärtused<0.05 were="" considered="" statistically="">
3. Tulemused
3.1. CD8 ja/või CD4 ja koe elukoha markerite eristav ekspressioon T-rakkude poolt terves neerukoesEsiteks võrdlesime CD4 ja CD8 ekspressiooni CD3-positiivsete T-rakkude poolt perifeerses veres terves neerukoes tuvastatud rakkudega. CD4-CD8 pluss (CD8) T-rakke tuvastati neerukoes oluliselt sagedamini kui veres ((mediaan)25% vs.38% )(joonis la). Seevastu CD4*CD{{9} }(CD4)T-rakke tuvastati veres suurema sagedusega kui neerukoes ((70 protsenti vs. 52 protsenti) Joonis la). Üldiselt nähti CD4 T-rakke terves neerukoes sagedamini kui CD8 T-rakke (joonis 1b).
Järgmisena uurisime koe asukohamarkerite CD69 ja CD103 ekspressiooni CD8 ja CD4-määratletud T-rakkude alamhulkades. Ootuspäraselt ei ekspresseerinud perifeerse vere rakud CD69 ja CD103 praktiliselt (joonis 1c). Terves koes ekspresseeriti CD69-CD103-, CD69 pluss CD103-, CD69tCD103 plus ja CD69-CD103 pluss fenotüüpe 46 protsenti , 45 protsenti , 6,6 protsenti ja 1,8 protsenti CD8T-rakkudest, 61 protsenti, 38 protsenti, 0,44 protsenti ja 0,43 protsenti CD4T-rakkudest (joonis lc). Kokkuvõtteks võib öelda, et terve inimese neerukoes tuvastati märkimisväärsel hulgal CD8, kuid eriti CD4 T-rakke. Lisaks tuvastati CD69 ja CD103, koe-residentsuse markerite, ekspressioon peamiselt terves koes, mitte veres leitud T-rakkude hulgas.
3.2. Ühiste alamhulka nimetavate markerite erinevad väljendusmustrid T-rakkude poolt tervises/neerukudedes
CD45RA, türosiinfosfataas, CCR7, kemokiini retseptor, mis teadaolevalt vahendab T-rakkude liikumist sekundaarsetesse lümfoidorganitesse, ning CD28 ja CD27, mõlemad kostimuleerivad retseptorid, mis on tugevalt seotud T-rakkude aktiveerimisega, on kõik markerid, mida traditsiooniliselt kasutatakse funktsionaalsete T-rakkude alamhulkade tuvastamiseks J1{ {53}},1l. Tahtsime uurida, mil määral erineb nende alarühmade jaotus veres jaotumisest neerukoes. Ootuspäraselt olid suurimad vereringes tuvastatud CD8 T-rakkude alamhulgad (st need, mis puudutavad rohkem kui 5 protsenti kogupopulatsioonist) need, millel oli CD45RA pluss CCR7 pluss CD28 pluss CD27 plus (naiivsed T-rakud või TN, () mediaan) 13 protsenti), CD45RA-CCR7 pluss CD28 pluss CD27 plus (keskmälu T-rakud või TcM, 6 protsenti), CD45RA-CCR7-CD28 pluss CD27 pluss (TEv1,3{56}} protsenti), CD45RA-CCR7-CD28 pluss CD27-(Tau2,10 protsenti), CD45RA-CCR7-CD28-CD27*(TEy3,6 protsenti) , CD45RA-CCR7-CD28-CD27-(TM4,6 protsenti) ja CD45RA pluss CCR7-CD28-CD27-(TEMRA) ,10 protsenti) fenotüüp. Terves koes ei tuvastatud peaaegu ühtegi (0,6 protsenti) TN-fenotüübiga CD8 T-rakku ja ainult vähestel (0,8 protsenti) oli Tax-fenotüüp. Seevastu terves neerukoes tuvastatud CD8 T-rakud koosnesid märkimisväärsest TEv1-(22 protsenti), TEM2-(12 protsenti), Tpx3-(18 protsenti), TEx-st {65}} (23 protsenti) ja TEyRA (11 protsenti) T-rakkude populatsioonid (joonis ld ja joonis S4). Kui vaadata CD4 T-rakke veres, olid suurimad populatsioonid need, mis ekspresseerisid Ty-(35 protsenti ), TcM (25 protsenti ), TEMl (16 protsenti ), TFM2- (9 protsenti) ja muul viisil määratlemata CD45RAtCCR7-CD28 pluss CD27* fenotüübiga populatsioon (0,4 protsenti) (joonis 1d ja joonis S4). Terves neerukoes ekspresseerisid vähesed CD4 T-rakud TN- (3 protsenti) või TcM-i -(3 protsenti) fenotüüp. Selle asemel tuvastati terves koes suur hulk TEM1-(22 protsenti), TEM2-(40 protsenti) või TEM4 (14 protsenti) fenotüübiga rakke (joonis ld ja joonis S4). . Kokkuvõttes erineb CD45RA/CCR7/CD28/CD{101}}määratletud CD8 ja CD4 T-rakkude alamhulkade jaotus vere ja terve neerukoe vahel oluliselt.
3.3. CD8 ja CD4 T-rakud terves inimese neerukoes koosnevad sagedamini aktiivselt ringlevatest rakkudestJärgmisena uurisime, kas tsütotoksilise efektor-mälu profiilile tüüpiliste markerite ekspressioonis on erinevusi CD8 ja CD4 T-rakkude populatsioonide vahel veres ja neerukoes. Esiteks vaatasime T-kasti transkriptsioonifaktorite T-bet ja eomeso-dermin (Eomes) ekspressiooni. Need transkriptsiooniregulaatorid on otseselt seotud ägeda faasi efektorrakkude genereerimisega, selliste molekulide nagu interferoon-y ja gransüüm B ekspressiooni indutseerimisega ning sekundaarsete mälureaktsioonide tekitamisega. Nagu oodatud, oli T-bet ekspressioon vereringe CD8 T-rakkude seas sage (54 protsenti), samas kui vereringe CD4 T-rakud avaldasid seda transkriptsioonifaktorit harva (13 protsenti). Huvitav on see, et CD4 T-rakkude puhul oli T-bet ekspressioon terves neerukoes tuvastatud T-rakkude hulgas oluliselt kõrgem kui vereringes (53 protsenti vs 13 protsenti). Teatud ekspressiooni tuvastati sageli ka vereringe CD8 T-rakkude seas (59 protsenti), samas kui vereringe CD4 T-rakkude seas oli see jällegi haruldane (15 protsenti). Kuid Eomesi ekspressioon oli neerukoe CD4 T-rakkude hulgas sagedamini (32 protsenti) kui veres (joonis 2a, b).
Järgmisena uurisime gransüüm B ekspressiooni, seriinproteaasi, mis teadaolevalt vahendab apoptoosi pärast tsütotoksiliste T-rakkude tsütoplasmasse süstimist. Kooskõlas varasemate aruannetega tuvastati tsirkuleerivates CD8 T-rakkudes märkimisväärsel hulgal T-bet ja gransüüm B ekspressiooni (28 protsenti). Kuid selle ekspressioon oli ringlevate CD4 T-rakkude seas haruldane (1 protsent). CD8 T-rakkude puhul oli gransüüm B ekspressioon neerukoes ja ringlevates populatsioonides sarnane (28 protsenti ys.23 protsenti) (joonis 2c). Huvitaval kombel ei vastanud neeru CD4 T-rakkudes tuvastatud kõrgemad T-bet ja Eomesi ekspressioonisagedused gransüüm B kõrgemale ekspressioonisagedusele selles sektsioonis (5 protsenti). Seejärel vaatlesime KLRGl ekspressiooni, kaasinhibeerivat retseptorit, mida teadaolevalt ekspresseerivad valdavalt tsütotoksilised ägeda faasi efektorrakud ja efektor-mälurakud. KLRG1 ekspresseeriti sageli tsirkuleerivates CD8 T-rakkudes (54 protsenti), kuid mitte CD4 T-rakkudes ( 10 protsenti). CD8 või CD4 T-rakkude KLRG1l ekspressioonis anatoomiliste sektsioonide vahel erinevusi ei leitud. Lõpuks uurisime Ki-67 ekspressiooni – markerit, mis tähistab aktiivselt tsüklilisi rakke. Kooskõlas varasemate tähelepanekutega oli Ki-67 ekspressioon ringlevate CD8 ja CD4 T-rakkude seas haruldane (vastavalt 1% ja 2%). Huvitav on see, et CD8 T-rakkude, kuid eriti CD4 T-rakkude hulgas tuvastati Ki -67 ekspressioon oluliselt sagedamini neerukoe T-rakkudes (vastavalt 3 protsenti ja 11 protsenti) (joonis 2e). Kokkuvõtteks võib öelda, et CD4 T-rakud tuvastati terve inimese neerukoes, kuid mitte CD8 T-rakke selles sektsioonis, sagedamini ekspresseeritud T-bet ja Homes. Kuid see ei tähendanud granüüm B sagedasemat ekspressiooni neeru CD4 T-rakkude poolt. Veelgi enam, kuigi tsükliliste rakkude üldine arv oli madal, sisaldas neerukude oluliselt aktiivsemalt tsüklilisi CD8 ja CD4 T-rakke kui vereringe.
3.4. CD8 ja CD4 T-rakud terves neerukoes on peaaegu kõik CXCR{4}}positsioonisSeejärel otsisime erinevusi teiste markerite ekspressioonis, mis on tüüpilised mitte kohe tsütotoksiliste mälurakkude tsirkuleerivates populatsioonides, nagu on näidatud varem ringlevate T-rakupopulatsioonide kohta. Esmalt vaatlesime IL-7R ekspressiooni, mis väljendub peamiselt vereringes olevatel naiivsetel ja varakult diferentseerunud mälurakkudel, kus see osaleb homöostaatilise proliferatsiooni säilitamises [10,12,13]. Perifeerses veres ekspresseerisid IL-7Ra sageli CD8 T-rakud (84 protsenti) ja CD4 T-rakud (98 protsenti). CD8 ja CD4 T-rakud terves neerukoes väljendasid seda markerit oluliselt harvemini kui ringlevad T-rakud (vastavalt 71 protsenti ja 76 protsenti) (joonis 2f).
Järgmisena uurisime erinevate teiste kemokiiniretseptorite ekspressiooni. Huvitav on see, et CXCR3, kemokiini retseptor, mis osaleb T-rakkude kaubitsemisel põletikulistesse kudedesse[14-17], ekspresseeriti neerukoes äärmiselt suures arvus CD8 ja CD4 T-rakke (99). protsenti ja vastavalt 91 protsenti) ning oluliselt harvem ringlevate T-rakkude kaudu (vastavalt 58 protsenti ja 26 protsenti) (joonis 2g). Lõpuks määrasime kindlaks CXCR6 ekspressiooni, mis on teadaolevalt seotud TRM-i populatsioonide moodustamisega [18-22]. Kuigi CXCR6 ekspresseeris ainult väike ringlevate CD8 T-rakkude populatsioon (16 protsenti), ja praktiliselt mitte tsirkuleerivad CD4 T-rakud. oluliselt suurem osa CD8 ja CD4 T-rakkudest neerukoes ekspresseeris seda molekuli (vastavalt 40 protsenti ja 40 protsenti) (joonis 2h). Kokkuvõtteks võib öelda, et neeru CD8- ja T-rakkudes ekspresseerusid markerid, mida tavaliselt seostatakse mitte koheselt diferentseerunud olekuga vereringes, tõenäoliselt -7Ra, CCR7, CD28 ja CD27, oluliselt harvemini kui veres. seevastu ekspresseerisid neeru T-rakud sagedamini CXCR6 ja peaaegu alati CXCR3.
3.5. Terve neeru ja allotransplantaadi T-rakkude fenotüübi erinevused on minimaalsedJärgmisena tahtsime uurida, kas need leiud jäid erinevate kliiniliste näidustuste jaoks saadud siirdatud neeru allotransplantaatide kudedes seisma (tabel 1).Seoses CD8 ja CD4 T-rakkude arvuga terves ja allograft koes ei täheldatud erinevusi (joonis 3a). Siiski märkasime ebaolulist suundumust rohkemate CD4T-rakkude ja vähem CD8T-rakkude poole terves koes kui allograftkoes (joonis 3b). Lisaks, kui vaadata CD69/CD103ekspressiooni ja CD45RA/CCR7/CD28/CD{11}}määratletud alamhulka, ei ole CD69/CD{13}} või CD45RA/CCR7/CD28/CD{17}} jaotuses erinevusi. märgiti kindlaks määratud alamhulgad, sõltumata CD8 / CD4 fenotüübist (joonis 3d ja joonis S5). Tsütotoksiliste ringlevate T-rakkude jaoks tüüpilisemate markerite ekspressioonisageduste uurimisel ei leidnud me erinevusi T-bet, KLRG1 või gransüüm B ekspressioonis tervete neeru- või allografti T-rakkude vahel (joonis 3a, gh). Leidsime, et Eomesi ekspressiooni täheldati allotransplantaadi koe CD4 T-rakkudes harvemini kui tervete kudede T-rakkudes (joonis 3f). Teiste markerite ekspressioonis erinevusi ei täheldatud. (Joonis 3-l ja joonis S5b-d). Kokkuvõtteks võib öelda, et peale Eomesi madalama ekspressioonisageduse allotransplantaadi CD4 T-rakkude hulgas ei erinenud rakupopulatsioonid uuringupopulatsioonide vahel.
3.6. CD69-CD103-T-rakud neerukoes erinevad tsirkuleerivatest rakkudestArvestades CD8 ja CD4 T-rakkude sarnast fenotüübilist koostist, mis leiti terves neerukoes ja neerude allotransplantaadi koes, ühendasime mõlema uuringurühma andmed, et uurida nende rakkude omadusi vastavalt CD69 ja CD103 ekspressioonile. Kuna CD69-CD103 pluss rakke tuvastati alati väga madalatel sagedustel (<50 events),="" we="" excluded="" these="" cells="" from="" further="" analyses.="">Esiteks uurisime nende alamhulkade erinevusi vastavalt CD69/CD103 koekspressioonile neeru T-rakkude populatsioonides (joonis 4 ja joonis S6). Huvitaval kombel täheldati nii CD8 kui ka CD4 T-rakkude puhul olulisi erinevusi CD45RA/CCR7/CD28/CD{10}}määratletud alamhulkade jaotuses CD69-CD103-, CD69 ja CD{ {14}}ja CD69*CD103* alamhulgad. CD8 T-rakkude puhul sisaldasid CD69-CD103-rakud märkimisväärset TeyRA rakkude populatsiooni (21 protsenti), mis oli CD69 pluss CD103- ja CD69 pluss CD103 alamhulkade hulgas palju väiksem (5,8). protsenti ja 2,2 protsenti vastavalt). Selle asemel sisaldasid need viimased populatsioonid palju suuremaid TEy3 (vastavalt 13 protsenti, 30 protsenti ja 32 protsenti) ja TEy4 (vastavalt 8 protsenti, 19 protsenti ja 33 protsenti) alampopulatsioone. CD4 T-rakkude puhul leiti vähe TEyRA rakke CD69-CD103-, CD69*CD103- ja CD69 pluss CD103* alamhulkade hulgas (2,6 protsenti, 0 protsenti ja 1,7 protsenti, vastavalt). Selle asemel olid nendes rakkudes suured alampopulatsioonid TFw1 (vastavalt 26%, 24% ja 10%) ja TEy2 (vastavalt 30%, 46% ja 27%). CD69 ja CD hulgast CD69*CD103*rakkude hulgas oli palju suurem TEM4 alampopulatsioon (vastavalt 6 protsenti, 11 protsenti ja 34 protsenti).
Arvestades neid erinevusi ja varasemat tähelepanekut, et neeru T-rakkude populatsioonid koosnesid vaevu TN- ja TcM-rakkudest, uurisime täiendavalt neerukoes leiduvaid CD{0}}CD103-rakke, et teha kindlaks, mil määral need rakud olid mitte ainult tsirkuleerivad rakud, mis läbivad neeru vereringet. Selleks võrdlesime neid rakke ringlevate rakkudega. CD69-CD103~ rakud neerukoes erinesid oluliselt vereringes leiduvatest: T-bet, Ki-67 ja CXCR3 ekspresseerusid sagedamini neeru T-rakud, sõltumata CD8/CD4 fenotüübist (joonis 5a-c). Seevastu IL-7R, CCR7, CD28 ja CD27 ekspresseerusid CD69-CD103- neeru T-rakkude poolt oluliselt harvemini, sõltumata CD8/CD4 fenotüübist (joonis 5d- g). CD69-CD103-CD4 T-rakud neerukoes ekspresseerisid KLRG1 oluliselt sagedamini kui veres ja CD69-CD103-CD8 T-rakud neerukoes ekspresseerisid Eomesid oluliselt sagedamini kui veres.
Järgmisena tahtsime näha, kuidas CD69 ja CD103 koosekspressioon mõjutas funktsionaalse potentsiaali markereid. Esiteks vaatasime tsütotoksilise potentsiaaliga seotud markereid. Kuigi üksikute alampopulatsioonide vahel täheldati erinevusi, ei täheldatud CD69 või CD103 koosekspresseerimisel CD8 T-rakkudes T-bet ja Eomes-i puhul mingeid tagajärgi (joonis 6a, b). Seevastu CD4 T-rakkudes suurenesid need transkriptsioonifaktorid mõlemad koos CD69 ja CD103 koosekspressioon (joonis 6a, b). KLRG1 vaadates märkasime, et CD8 T-rakkude puhul vähenes KLRG1 ekspressioon koos CD69 / CD103 koekspressiooniga. CD4 T-rakkude puhul täheldati sarnast suundumust. Kuid siin ekspresseerisid ainult CD{17}}CD103-rakud KLRG1 kõrgema sagedusega kui CD69 pluss CD103- ja CD69 pluss CD103* rakud (joonis 6c). Gransüüm B ekspressioonisagedused langesid samuti koos koe-residentsuse markeritega, kusjuures selle ekspressioonisagedus oli madalaim CD69 pluss CD103* rakkude hulgas nii CD8 kui ka CD4 T-rakkudes (joonis 6d). Ki-67 ekspressioon, mis oli kõrgem neeru T-rakkude seas, võrreldes T-rakkudega veres, ei erinenud vastavalt CD69 või CD103 koekspressioonile (joonis 6e).
Seejärel uurisime markereid, mis on tavaliselt seotud mittetsütotoksilise mäluprofiiliga vastavalt CD69 / CD103 koekspressioonile. IL-7Ra, CCR7 ja CD28 ekspressioon oli kõrgeim CD69-CD103- populatsioonides, kusjuures ekspressiooni defineerimise trend koos CD69/CD103 koekspressiooniga (joonis 6f-h ). Seejärel vaatasime CXCR3 ja CXCR6 ekspressiooni. Mõlemat kemokiini retseptorit ekspresseerisid kõige sagedamini CD69tCD103t rakud, sõltumata CD8/CD4 fenotüübist, ja need näitasid tõusutrendi koos CD69/CD103 koosekspressiooniga. Ainult CXCR6 puhul oli see suundumus statistiliselt oluline, mõjutades nii CD8 kui ka CD4 Telli (joonis 6j, k). Kokkuvõtteks võib öelda, et neerukoe CD69-CD103- rakud erinevad oluliselt vereringes olevatest rakkudest ja võivad puudutada teist TBv populatsiooni, mida ei tähista CD69 või CD103 ekspressioon. Ainus marker, mis CD69 ja CD103 koekspressiooni osas järjekindlalt erines, sõltumata CD8/CD4 fenotüübist, oli CXCR6.
3.7. T-rakud neerukoes toodavad sagedamini interferooni kui T-rakud veresLõpuks uurisime tsütokiinide tootmisvõimet CD8/CD{1}}määratletud T-rakkude populatsioonide järgi neerukoes. Esiteks võrdlesime interferoon-y (IFNy), tuumori nekroosifaktori (TNF), interleukiini-2 (IL-2), granulotsüütide-makrofaagide kolooniaid stimuleeriva faktori (GM-CSF) ja IL-17 stimuleeritud CD8/CD4-määratletud T-rakkude populatsioonide poolt, mis leiti verest terves neerukoes (joonis 7a–e). Huvitav on see, et ainult IFNy ekspresseeris järjekindlalt suurem osa T-rakkudest terves neerukoes, võrreldes T-rakkudega veres, sõltumata CD8 / CD4 fenotüübist (joonis 7a). Erinevusi märgati ka üksikute alarühmade tasandil. Täpsemalt, TNF-i ja GM-CSF-i tootsid sagedamini neerukoes olevad CD4 T-rakud (joonis 7b.c). Seoses polüfunktsionaalsusega (st samaaegselt toodetud tsütokiinide arvuga), leiti, et CD4 T-rakud neerukoes on polüfunktsionaalsemad kui CD4 rakud veres (joonis 7f).
Järgmisena vaatlesime tsütokiinide tootmisvõimsuse erinevusi tervete ja allograftkoe stimuleeritud T-rakkude vahel. Tervete või allografti neerukoe T-rakkude vahel ei tuvastatud erinevusi üksikute tsütokiinide või mitmete samaaegselt toodetud tsütokiinide tootmises (joonis S7). Kuna CD69 ekspresseerub T-rakkude stimuleerimisel, uurisime ainult erinevust CD103-negatiivsete ja CD103-ekspresseerivate CD4 ja CD8 T-rakkude vahel (joonis 7g-). Võrreldes CD103 ekspresseerivaid CD4 ja CD8 T-rakke rakkudega, mis neerukoes CD103 ei ekspresseeri, märkasime, et CD8 ja CD4 CD103 rakud ekspresseerisid rohkem IFNy-d kui CD{15}}rakud (joonis 7g). Lisaks, kuigi IL-1ZA-d tootvaid rakke oli neerukoes CD103 pluss CD8 ja CD4 T-rakkude hulgas vähe, leiti neid selles populatsioonis järjekindlalt sagedamini kui CD103- populatsioonis. Kokkuvõtteks võib öelda, et rohkem T'-rakke neerukoes tootis IFNy võrreldes ringlevate T-rakkudega, sõltumata CD8/CD4 fenotüübist. Tõepoolest, suurim protsent IFNy-d tootvaid rakke leiti CD{26}}ekspresseerivate CD4 ja CD8 neerudest pärinevate T-rakkude hulgas. Lisaks ei erinenud neeru allotransplantaatide T-rakud nende parameetrite poolest terve neerukoe omadest.
4. Arutelu
Käesolevas uuringus käsitlesime T-rakkude alamhulkade mitmekesisust vastavalt CD8 ja CD4 ekspressioonile ning koe-residentsuse markeritele, CD69 ja CD103, inimese neerudes ja võrreldes nendega verega. Neerukoes tuvastati tõepoolest märkimisväärne arv CD8 ja CD4 T-rakke. Lisaks sisaldasid need T-rakud neerudes märkimisväärsel hulgal CD69*CD{8}}rakke. Samuti tuvastati CD69 pluss CD103 pluss rakud, kuid valdavalt CD8 T-rakkude hulgas ja neid CD4 T-rakkude hulgas praktiliselt ei eksisteerinud. Sarnane leid puudutas varem kopsude TRM-i [23]. Ootuspäraselt sellised CD69 ja CD{15}}ekspresseerivad populatsioonid ringlusest peaaegu puudusid. Silmatorkav erinevus neeru T-rakkude ja veres leiduvate T-rakkude võrdlemisel seisnes traditsiooniliste CD45RA/CCR7/CD28/CD{19}}määratletud alamhulkade erilises jaotuses. Huvitaval kombel ei ekspresseeritud CD28 ekspressiooni sagedamini, kui T-rakud ekspresseerisid CD69 üksi või kombinatsioonis CD103-ga. Teoreetiliselt peaks see muutma need populatsioonid CD80 ja CD kostimuleerivate signaalide suhtes vähem vastuvõtlikuks86. Teised erinevused olid seotud CXCR3, CXCR6 ja Ki{27}} kõrgema ekspressioonisagedusega. Lisaks sisaldasid neeru T-rakud sagedamini IFNy-d tootvaid rakke ja olid sageli polüfunktsionaalsed. Tõepoolest, neerudes sisaldas CD103 pluss Tpys rohkem IFN-i tootvaid rakke kui nende CD{31}}negatiivsed vasted. Lisaks tootsid CD103T rakud sagedamini IL-17, kuigi see puudutas tagasihoidlikku populatsiooni.
CISTANCHE PARANDAB NEeru-/NEERUNEKTSIOONI
Seoses CXCR3 sagedasema ekspressiooniga CD8 ja CD4 neeru T-rakkude poolt, on varem näidatud, et CXCR3/CXCL10 telg osaleb TpM populatsioonide kujundamisel nahas, maksas ja lümfoidkoes [24-28]. Lisaks on see seotud stressiga epiteeli ja põletikuga kaubitsemises üldises mõttes [14-17]. Arvestades CXCR3 kõrgeid sagedusi nende T-rakkude hulgas terves neerukoes, näib, et CXCR3 on seotud ka TRM-i homöostaasiga neerukoes ja ei pruugi tingimata hõlmata põletikku või ohusignaale. Seoses CXCR6-ga on CXCR6/CXCL16 telg tõepoolest juba osutunud oluliseks Tpst-i transportimisel erinevatesse piirkondadesse, nagu kopsud, nahk, maks ja aju, ning see võib olla universaalne mehhanism, mis on oluline TRM-i suunamiseks ja säilitamiseks kudedes, puudutades ka TRM-i inimese neerukoes [18-22].
Farber ja kaastöötajad on põhjalikult iseloomustanud ja võrrelnud CD8 ja CD4 TRM populatsioone, mis elavad erinevates elundidoonoritelt saadud inimkoetüüpides. Nad kirjeldasid, kuidas TRM-i populatsioonid kopsudes, põrnas, peensooles ja erinevates sekundaarsetes lümfoidkudedes erinevad transkriptoomi, aga ka erinevate valkude, sealhulgas tsütokiinide ekspressiooni osas, mida praeguses uuringus uuriti [29-31. Kuid need uuringud ei hõlmanud TRM-i populatsioone inimese neerudes ega selle kohta andmeid
teemat napib. Varem näitasime, et allografti neerudes on tuvastatavad CD8 T-rakud, mis on suunatud polüoomiviiruse BK VP1 ja LTAG valkudele, mis pärinevad viirusest, millel on neeruepiteelirakkude suhtes tugev tropism. Need viirusspetsiifilised T-rakud ekspresseerisid CD69 ja CD103 suuremal hulgal kui nende analoogid, mida leidus samade patsientide vereringes. Lisaks ekspresseerisid need T-rakud üldiselt CD45RA-CD27-gransüüm B-negatiivset fenotüüpi[5]. Hiljem on teised teatanud ka TRM-i populatsioonidest inimese neerukoes, mis on saadud siirdatud nefrektoomiatest. Selles väljaandes teatavad autorid, et nende kudede T-rakud puudutasid peamiselt CD8 T-rakke [321. Selle asemel leidsime, et CD4 T-rakud hõlmasid tegelikult suurimat T-rakkude alamhulka. Siiski leidsime ka, et tasakaal nihkus, kuigi mitte oluliselt, suurema hulga CD8 T-rakkude suunas allograftkoes võrreldes terve neerukoega. Sellisena võib seda lahknevust seletada erinev uurimisrühm ja võib juhtuda, et tervises on immunoloogiline kaitse rohkem keskendunud rakuvälistele ohtudele, nagu bakterid, võrreldes rohkem rakusiseste ohtudega, nagu viirused ja vähk immuunpuudulikkusega peremeesorganismides. Me ei leidnud muid erinevusi uuritud markerites tervete neerude ja allografti T-rakkude vahel. Siiski tuleks teha täiendavaid uuringuid, kasutades transkriptoomide laiema vaatega tehnikaid, nagu RNA sekveneerimine või proteoomi, nagu massispektromeetria, et teha kindlaks, kas see on tõesti nii.
Lisaks de Leur et al. kirjeldage, kuidas TRM neerudes ekspresseeris sageli gransüüm B-d, samas kui me tuvastasime nii terves kui ka allografti neerukoes ainult väikeses koguses gransüümi B [32]. Siiski tuvastasime neerukoes olulisi T-bet ja Eomesi ekspresseerivaid T-rakke, mis ringlevates T-rakkude populatsioonides on tavaliselt tõepoolest seotud gransüüm B kõrgema ekspressiooniga [10]. Kuigi viimane ei pruugi olla üllatav, arvestades asjaolu, et gransüüm B ekspressiooni indutseerib otseselt ka T-bet [33, 34], ei olnud see seos praeguses uuringus neeru T-rakkude seas ilmne. Nagu meie ja teised on näidanud, on ka inimese kopsudest, ajust ja nahast pärinevate TRM-i [25,26,3536], aga ka neerude kudedest pärit MAIT ællide 【6,7】 granüüm B-sisaldus madal. sisu, kuigi see väljendab sageli märkimisväärses koguses T-bet ja Eomesi, võib see olla (inimese) TkM tavaline tunnus. Lisaks täheldati kopsudes TRM-i gransüüm B ekspressiooni stimuleerimisel kiiresti ülesreguleerimist [35l, mis viitab sellele, et see võib esineda ka teistes TeM-des. Siin püstitasid autorid hüpoteesi, et selline "varjatud tsütotoksilisus" kaitseb kudede struktuurset terviklikkust tsütotoksiliste T-rakkude kahjustuste eest.
Kokkuvõtteks näitame, et neerukoes esinevad Tcll-d märkimisväärsel hulgal ja need hõlmavad populatsioone, mis ekspresseerivad sageli CD69 pluss ja CD103 plus , molekule, mille abil T-rakud kleepuvad kudedesse ja püsivad neis. Sellegipoolest näivad CD69-CD103- T-rakud neerukoes olevat erinevad ringlevatest T-rakkudest ja võivad puudutada teist erinevat TiM-i populatsiooni, mis võib-olla säilib neerudes muude mehhanismide tõttu, mida tuleb avalikustada. Teine võimalus võib olla see, et need CD69-CD103-T-rakud puudutavad populatsiooni, mille heinad väljusid vereringest alles hiljuti, ja haye omandas neerude mikrokeskkonnaga interaktsiooni tõttu ainult ajutiselt uusi fenotüüpseid tunnuseid. Nende võimaluste väljaselgitamiseks on vaja selle populatsiooni täiendavaid uuringuid. Lisaks. CD8 ja CD4 neeru T-rakud olid sageli aktiivselt tsüklilised ja ekspresseerisid sagedamini CXCR6. Lisaks tõrjusid CD8 ja CD4 populatsioonid välja eriti kõrge CXCR3 ekspressiooni, mõjutades tugevalt neid kemokiini retseptoreid, aga ka CXCR6 TRM-i kogunemist ja püsivust inimese neerudes. Seetõttu on vaja täiendavaid uuringuid, et parandada meie kuvandit Tpv populatsioonidest inimese neerudes. Sellegipoolest moodustavad siin esitatud leiud kindla esimese sammu neerukoe T-rakkude populatsioonide ja nende rolli tervises ja haigustes üksikasjalikuma iseloomustamise suunas.
