CD73 üleekspressioon podotsüütides: uudne podotsüütide vigastuse marker inimese neeruhaiguste korral
Feb 26, 2022
Abstraktne:CD73 rada on erinevates haigusseisundites oluline põletikuvastane mehhanism. Hiiremudelite vaatlused näitasid, et CD73-l võib olla kaitsev rollneerukahjustus; siiski pole otseseid tõendeid selle rolli kohta inimesesneeruhaiguson siiani kirjeldatud. Siin püstitasime hüpoteesi, et inimese podotsüütide kahjustusneeruhaigusedmuudab CD73 ekspressiooni, mis võib hõlbustada podotsütopaatia diagnoosimist. Hindasime CD73 ja selle ühe funktsionaalselt olulise sihtmärgi, CC kemokiini retseptori tüüp 2 (CCR2) ekspressiooni podotsüütidesneerudbiopsiad 39 patsiendilt, kellel oli podotsütopaatia (sealhulgas fokaalne segmentaalne glomeruloskleroos (FSGS), minimaalse muutusega haigus (MCD), membraanne glomerulonefriit (MGN) ja amüloidoos) ja kontrollrühm. Podotsüüdi CD73 ekspressioon igas haigusrühmas oli kontrollrühmaga võrreldes oluliselt suurenenud (p < 0.0{{10}}1–p="">< 0,0001).="" veelgi="" enam,="" cd73="" ja="" ccr2="" ekspressiooni="" vahel="" oli="" märgatav="" negatiivne="" korrelatsioon,="" mida="" kinnitasid="" immunohistokeemia="" ja="" immunofluorestsents="" (pearson="" r="−" 0,5068,="" p="0,0031;" pearson="" r="−" 0,4705,="" p="0.0313)," mis="" viitab="" cd73="" kaitsvale="">neerukahjustus.Lõpuks tuvastame CD73 inimese podotsütopaatia uudse potentsiaalse diagnostilise markerina, eriti MCD puhul, mis on olnud kurikuulus valgusmikroskoopia ja immunohistokeemia abil äratuntavate patoloogiliste tunnuste puudumise tõttu.
Märksõnad:podotsüütide; minimaalse muutusega haigus; CD73; CCR2;neerukahjustus;neerupuudulikkus
Sissejuhatus
Adenosiintrifosfaadi (ATP) kui üldlevinud intratsellulaarse energiaallika evolutsioonilist olulist rolli on enam kui kolm aastakümmet tagasi uuendatud revolutsioonilise arusaamaga, et purinergilise süsteemi liikmed (ATP, adenosiindi- ja trifosfaat (vastavalt ADP ja AMP)) võib samuti edastada rakuväliseid signaale rakkude interaktsioonide vahendamiseks [1, 2]. See kontseptsioon viis arusaamisele, et purinergiline süsteem osaleb immuunvastuste kujundamises retseptori ekspressiooniprofiili moduleerimise, tsütokiinide sekretsiooni, reaktiivsete hapnikuliikide (ROS) tootmise ja rakusisene patogeeni seedimine [3–7]. Ekstratsellulaarne ATP toimub CD39 (ekto-nukleosiidtrifosfaatdifosfohüdrolaas 1) kaudu ADP-ks ja AMP-ks konverteerimine/defosforüülimine ning lõpuks laguneb AMP adenosiiniks CD73 (ekto{9}} [nukleotiidaasi) toimel. CD73 võib esineda membraaniga seotud või lahustuval kujul. Membraanivormil on dimeerne struktuur, mis koosneb kahest identsest 70 kD alaühikust, mis seonduvad plasmamembraan C-terminaalse seriini ja glükosüülfosfatidüülinositooli (GPI) vahelise sideme kaudu [9]. Tähelepanuväärne on see, et CD39 substraadid ATP ja ADP näivad olevat CD73 konkureerivad inhibiitorid [9–11]. CD73 ekspressioon esindab seega kriitilist rada adenosiini taseme häälestamiseks ekstratsellulaarses ruumis. CD73 ei ole raku- või elundispetsiifiline molekul; selle ekspressioon erinevate organite leukotsüütides, endoteelis, epiteeli- või mesenhümaalsetes rakkudes (neerud, kopsud, maks, käärsool, aju ja süda) ja tüvirakud on hästi dokumenteeritud [12–14]. Peralta jt teatasid esmakordselt adenosiini kaitsvast rollist lämmastikoksiidi (NO) sünteesiraja kaudu maksaisheemiast põhjustatud vigastuses. [15]. Kooskõlas nende andmetega on näidatud, et selle toime leevendab ägedat kopsukahjustust, allografti hingamisteede äratõukereaktsiooni, ägedat transplantaat-peremehe vastu haigust ja sepsist [4,16–19].
CISTANCHE PARANDAB neeru-/NEerupuudulikkust
Nagu mitmetes hiiremudelites veenvalt näidatud, võib CD73 osaleda tubulo-glomerulaarses interaktsioonisneerud. On näidatud, et CD73-vahendatud adenosiini teke, mis tuleneb CD73-st tubulaarset päritolu ATP-st isheemia-reperfusioonikahjustuse ajal, nõrgendab põletikku neutrofiilide efektorfunktsiooni pärssimise kaudu [20]. Veelgi enam, CD73-puudulikel hiirtel on autoimmuunne põletik, millega kaasneb vähenenud podotsüütide arv ja endoteeli fenestratsioon [21]. Seda nähtust seostati põletikueelsete tsütokiinide, nagu kasvaja nekroosifaktor (TNF)-alfa või kemokiini CXC motiivi ligand 2 (CXCL-2), suurenenud seerumitasemega. Inimese taustalneeruhaigus,On oletatud, et podotsüütide kahjustus kujutab endast tõenäoliselt patoloogilistele stiimulitele reageerimise adaptiivsete ja destruktiivsete mehhanismide segu, mis ei pruugi tingimata kajastada in vitro või loommudelite avaldatud tähelepanekuid. Podotsüüdi kahjustuse etioloogia varieerub mehaanilisest stressist (glomerulaarhüperfiltratsioon), oksüdatiivsest stressist (nagu hüpertensiivne või diabeetiline nefropaatia, toksiline vigastus, põletikuliste rakkude infiltratsioon või minimaalse muutusega haiguse loommudelid) kuni immunoloogilise stressini (st immuunkompleksi ja komplemendi vahendatud kahjustused). glomerulonefriidi ajal) [22]. Glomerulonefriidi põletikuline seisund võib stimuleerida podotsüüte sünteesima erinevaid tsütokiine, potentsiaalselt CC kemokiini retseptori 2 (CCR2) vahendatud signaaliülekande kaudu. Siiski on vähe teada CD73 rollist inimeselneeruhaigus, eriti kroonilise põletiku ja podotsüütide vigastuse korral.
Käesolevas uuringus püstitasime hüpoteesi, et CD73 mängib rolli inimese glomerulaarhaiguste patogeneesis ja analüüsisime podotsüütide CD73 ekspressiooni inimesel.neerudbiopsiad patsientidelt, kellel on podotsütopaatiaga seotud patoloogiad. Näitame, et CD73 podotsüütide pinnaekspressioon on usaldusväärne podotsüütide kahjustuse marker, toetades seega eriti CD73 diagnostilist väärtust minimaalse muutusega haiguses (MCD). Lisaks teatame negatiivsest korrelatsioonist podotsüütide CCR2 ja CD73 ekspressiooni vahel, mis viitab sellele, et CD73 üleekspressioon kujutab endast adaptiivset vastust glomerulaarsele kahjustusele.
Tulemused
Podotsüüdi kahjustuse kliinilised andmed ja ultrastruktuurne pildistamineTabelis 1 on toodud uuringusse kaasatud juhtumite kliiniline esitus vanuse, soo, kreatiniini ja üldproteinuuria väärtuste osas. Kõigil FSGS-i patsientidel oli esmane NOS-i (muul määramata) vorm. 12-st MGN-iga patsiendist 5 olid fosfolipaasi A2 retseptori (PLA2R) suhtes positiivsed (42 protsenti). Amüloidoosi rühmas oli 2 patsiendil AA-amüloidoos (16,7 protsenti) ja 10 AL-amüloidoos (83,3 protsenti); kahel AL-amüloidoosiga patsiendil ilmnes kerge ahela kappa (20 protsenti) ja 8 olid lambda suhtes positiivsed (80 protsenti AL-amüloidoosi rühmast). Kõigil MCD, FSGS, MGN ja amüloidoosiga patsientidel tuvastati elektronmikroskoopia abil podotsüütide kahjustused (joonis 1).
Joonis 1. Primaarse ja sekundaarse podotsüütide kahjustuse ultrastruktuurne pilt. ( a ) Podotsüüdi keha levimine glomerulaarsele basaalmembraanile (nool) koos jalaprotsesside tagasitõmbamisega MCD korral. ( b ) Ulatuslik podotsüütide jala protsessi kustutamine (nool) ja tsütoplasmaatiline vakuolisatsioon (täht) primaarse FSGS-iga patsiendil. ( c ) Jalaprotsessi kustutamine (nool), vakuolisatsioon ja silmapaistvad organellid (topeltnool) koos epimembraanse elektrontiheda materjaliga (täht) primaarse membraanse glomerulonefriidi korral. ( d ) Amüloidfibrillide (kahe peaga nool) subepiteliaalne kogunemine koos podotsüütide järjestikuse eraldumisega (pöördumatu podotsüütide kahjustuse märgina) AL-amüloidoosiga (lambda) patsiendil. Kõik elektronmikropildid on esitatud 4000-kordse suurendusega. Inserdid – vastavad valgusmikroskoopilised mikrofotod (40 × /0,65 NA; skaala riba suurus: 50 µm (a, c, d) ja 100 µm (b); PAS-värvimine).
CD73 pinna ekspressioon on seotud inimese neeruhaiguse podotsüütide vigastusega
Et uurida, kas podotsüüdid ekspresseerivad CD73 füsioloogilises keskkonnas, ja hinnata topodotsüütide kahjustustega seotud CD73 erinevate haigusseisundite mustrit, viidi läbi CD73 ekspressiooni immunohistokeemiline analüüs. Ultrastruktuurne analüüs kinnitas podotsüütide kahjustust kui tsütoskeleti ebakorrapärasust koos vähemalt jala protsessi tuhmumisega (joonis 1). Meie negatiivses kontrollrühmas ilma podotsüütide kahjustuseta ei leitud CD73 olulist podotsüütide ekspressiooni vaatamata sisekontrolli (peritubulaarsed kapillaarid) positiivsusele, mis tavaliselt värvub positiivselt (joonis 2). Teisest küljest näitasid podotsüütide kahjustusrühmad (MCD, FSGS, MGN ja amüloidoos) statistiliselt väga olulist podotsüütide CD73 ülesreguleerimist (p < 0.{{1{{20}}}}="" 001);="" märkimisväärne="" kasv="" oli="" järjepidev="" ka="" üksikute="" üksuste="" võrdlemisel="" negatiivse="" kontrolliga="" (p="" vähemalt="">< 0,001).="" huvitaval="" kombel="" oli="" cd73="" ülesreguleerimise="" ulatus="" mcd="" rühmas="" madalam,="" kuigi="" oluliselt="" madalam="" ainult="" võrreldes="" mgn="" proovidega="" (p="0.0043)" (joonis="" 2).="" podotsüütide="" kahjustuste="" rühmades="" ei="" leitud="" korrelatsiooni="" poolkvantitatiivse="" cd73="" skoori="" ja="" proteinuuria="" vahel="" binaarsel="" (nefrootiline/mitte-nefrootiline)="" ega="" kvantitatiivsel="" (g/24="" h)="" tasemel="" (spearmani="" r="−" 0,0807,="" p="0" 0,6302="" ja="" spearmani="" r="−" 0,076,="" p="0,6497;" joonis="" 3a).="" üldiselt="" puudus="" korrelatsioon="" cd73="" skoori="" ja="" kreatiniini="" taseme="" vahel="" (spearmani="" r="0.0722," p="0.6259;" joonis="" 3b).="" lisaks="" ei="" suutnud="" me="" tuvastada="" olulist="" korrelatsiooni="" cd73="" ekspressiooni="" ja="" hüpertensiooni="" (spearman="" r="−" 0,03024,="" p="0.8384)" või="" suhkurtõve="" (spearman="" r="−" 0,1784,="" p="" {{45)="" vahel.="">
Podotsüüdist pärineva CD73 ülesreguleerimine inimese glomerulaarhaiguse korral korreleerub negatiivselt CCR2 retseptori ekspressiooniga ega ole korrelatsioonis nefriini ja podotsiini ekspressioonigaHinnates avaldatud andmeid makrofaagide CCR2 ekspressiooni alareguleerimise kohta pärast CD73 üleekspressiooni tüvirakkude mudelis, oletasime, et CD73 ülesreguleerimine podotsüütide vigastuse ajal korreleerub pöördvõrdeliselt põletikueelse CCR2 ekspressiooniga ja teostasime immunohistokeemilise CCR2 analüüsi. Kontrollrühmas ei tuvastatud CCR2 ekspressiooni või oli see ainult kerge, ilma märkimisväärse lahknevuseta võrreldes samade proovide CD73 signatuuriga. Seevastu võis enamikus podotsüütide kahjustuse biopsiatest võetud proovides näha pinna CCR2 põhilist ülesreguleerimist (siiski erineva intensiivsusega) ja see oli kontrollrühmaga võrreldes üldiselt ülesreguleeritud (p=0.0206; täiendav joonis). S1). Haigusrühmad ei erinenud selles osas üksteisest oluliselt.
Lisaks analüüsisime potentsiaalset korrelatsiooni CD73 ja CCR2 ekspressiooniintensiivsuse vahel. Tõepoolest, võrreldes podotsüütide vigastuse biopsia kohorti CD73 ja CCR2 skoori, võis täheldada märkimisväärset negatiivset korrelatsiooni (Spearman r=− 0.4821, p=0.{18} }052), (joonis 4). Märkimisväärne on see, et CD{11}}positiivsete podotsüütidega glomerulites oli CCR2 ekspressioon vähenenud mitte ainult podotsüütides, vaid ka ümbritsevates rakkudes, näiteks parietaalsetes epiteelirakkudes (joonis 4). Pöördkorrelatsiooni kinnitas CD73/CCR2 immunofluorestseeruva kaasvärvimise hindamine kahjustatud podotsüütides konfokaalse mikroskoopia abil (Spearman r=− 0,4478, p=0.0282), (joonis 5). CD73 positiivsuse ja podotsüütide-spetsiifilise valgu ekspressiooni (kadumise) vahelise seose käsitlemiseks teostasime nefriini ja podotsiini jaoks täiendavad immunofluo-restsentsvärvid ning hindasime nende ekspressioonimustrit kontroll-, MCD- ja FSGS-rühmades (joonis 6a) ning kaasvärvimist. CD73-ga podotsüütide kahjustusega proovides (joonis 6b – e). Me ei suutnud tuvastada olulist korrelatsiooni podotsiini või nefriini ekspressiooni ühe poole keskmise fluorestsentsi intensiivsuse ja teisel pool CD73 keskmise ekspressiooni vahel (n=39, Spearman r=0.212, p {{33}). }.1948 podotsiinile ja n=60, Spearman r=0.01906, p=0.8851 nefriinile).
Arutelu
Kirjeldame siin esimest korda CD73 ekspressiooni inimese vigastatud podotsüütide pinnalneeruhaigus. Analüüsimineneeru-silmapaistvate podotsüütide kahjustustega, näiteks MCD, FSGS, MGN ja amüloidoosiga patsientide biopsiate põhjal teatame kõigis nendes rühmades podotsüütide CD73 ekspressiooni olulisest ülesreguleerimisest võrreldes kontrolliga.neerud,sõltumata podotsüütide kahjustuse etioloogiast. Lisaks teatame pöördvõrdelisest korrelatsioonist CD73 ja CCR2 ekspressiooni vahel podotsüütide kahjustusrühmade podotsüütide poolt. On näidatud, et võimendatud podotsüütide-spetsiifiline CCR2 vahendab diabeetineerukahjustushiirtel [23]. Lisaks on teatatud, et CCR2 blokeerimine adriamütsiini poolt indutseeritud FSGS-i hiiremudelis vähendab proteinuuriat ja glomerulaarkahjustusi [24]. Hiljutine Lee jt uuring, milles kasutati ka hiiremudelit, näitab, et CCR2 ammendumine võib oksüdatiivse stressi ja lipiidide akumulatsiooni blokeerimise kaudu leevendada rasvumisest põhjustatud albuminuuriat [25]. Tõepoolest, in vitro süsteemis, milles kasutatakse hiire perikardi koest pärit mesenhümaalseid tüvirakke (MSC), on näidatud, et CD73-üleekspresseerivad MSC-d dikteerivad põletikuvastase toime kaudu reparatiivseid protsesse, muu hulgas ka CCR{ inhibeerimise tõttu. {9}}positiivne makrofaagide infiltratsioon [13]. Seega on meie tulemuste ja avaldatud andmete valguses ahvatlev oletada, et CD73 ekspressioon podotsüütide poolt võib toimida kaitsvaltneerukahjustus, võib-olla CCR2 nõrgestavate radade kaudu. CCR2 signaalimine on tihedalt seotud makrofaagide adhesiooni ja aktivatsiooniga [26, 27]. Kuna makrofaagid võivad mõjutada podotsütopaatiaga seotud patogeneesineeruhaigused(nagu primaarne MGN, kus CD68 pluss, CCR2 pluss makrofaagide infiltratsioon on tunnistatud lõppstaadiumis oluliseks näitajaksneerupuudulikkus[28]), täiendavad uuringud seoste kohta monotsüütide/makrofaagide sisalduse, päritolu (infiltreeruv vs. resident), aktivatsiooniprofiilide (M1 – põletikuvastane vs. M2 – alternatiivselt aktiveeritud) ja CD73 ekspressiooni vahel inimesel.neeruhaiguson vajalikud, et kontrollida meie tulemuste vastavust hiiremudelite varasemate andmetega.
Põletikulises mikromiljöös, mida võib täheldada hüpoksia, isheemia-reperfusiooni või autoimmuunse koekahjustuse korral, vabastavad mitmed rakud purinergilise signaalisüsteemi liikmed, peamiselt põletikueelse ATP või ADP kujul [29, 30]. Nendes seadetes on ektonukleotiidaas CD73 ja selle toodetud adenosiinid olulised tegurid immuunvastuse reguleerimisel ja vaigistamisel. Loommudelites on näidatud, et CD73 kaitsebneerudisheemia reperfusioonikahjustus ja selle puudulikkus indutseerisid podotsüütide düsfunktsiooni, mis põhjustab autoimmuunpõletikku janeeruhaigus[21, 31]. Teised hiire in vivo katsed, milles kasutati isheemia reperfusioonikahjustust, näitasid proksimaalsete tubulaarsete epiteelirakkude poolt ekspresseeritud CD73 olulist põletikuvastast toimet ja selle olulist toimetneerudkaitse diabeetilise nefropaatia ajal adenosiini-endoteliaalse Adora2b retseptori signaaliülekande kaudu [20, 32]. Podotsütopaatiad on kõige sagedasem glomerulaarsete kahjustuste rühm, mis põhjustab proteinuuriat. MCD, prototüüp "primaarne" podotsütopaatia, on üle 1-aastastel lastel kõige levinum nefrootilise proteinuuria põhjus [33, 34]. Praegused hüpoteesid MCD patogeneesi kohta viitavad tsütokiinide ja teiste immuunmediaatorite olulisele rollile podotsüütide-glomerulaarse basaalmembraani terviklikkuse rikkumises [35-38]. MCD iseloomulik tunnus on lahknevus valgusmikroskoopias nähtavate muutuste puudumise ja raske proteinuuria vahel; Ultrastrukturaalsed tõendid podotsüütide kahjustuse kohta elektronmikroskoopia abil on seega MCD diagnoosimise tingimuseks. See diagnostikaalgoritm rõhutab sellega seoses täiendavate esmavaliku diagnostikavahendite olulisust. CD73 ekspressiooni uurimine, eriti elektronmikroskoopia piiratud kättesaadavuse korral, võib seega aidata eristada proteinuuria glomerulaarseid (st podotsütopaatilisi) ja ekstraglomerulaarseid (nt tubulaarseid või paraproteineemilisi) allikaid. Immunohistokeemia ja immunofluorestsentsi võrdlus meie uuringus räägiks viimase kasuks.
CISTANCHE PARANDAB NEERU-/NEERUHAIGUST
Mitmed väljaanded on veenvalt dokumenteerinud podotsüütide-spetsiifiliste valkude ebanormaalset jaotumist ja kadu erinevatesneeruhaigussätted, mis hõlmavad podotsüütide vigastust ja proteinuuriat, nagu hiljuti vaadatud [39]. Meie uuringus ei suutnud me podotsüütide kahjustuste rühmas tuvastada olulist korrelatsiooni podotsiini / nefriini fluorestsentsi intensiivsuse ja CD73 ekspressiooni intensiivsuse vahel. Spetsiifilised piirangud välistavad aga podotsiini/nefriini ja CD73 statistiliste andmete patofüsioloogilise tõlgendamise. Esiteks valisime fluorestsentsi intensiivsuse hindamiseks podotsüüdid, kasutades konfokaalse mikroskoopia tehnilist suurendus- ja eraldusvõimet. Kuigi need tingimused võimaldavad kergesti podotsüütide kehasid tuvastada, jäävad peamised protsessid ja eriti jalaprotsessid ebaselgeks, mistõttu neid ei pruugita märgistada/analüüsida. Teiseks ei saa õigustada korrelatsiooni CD73 ekspressiooni ja podotsüütidespetsiifiliste valkude vahel tervetes glomerulites: kuigi podotsiini ja nefriini hindamine sellel tasemel oleks õigustatud (kuna on mõistlik eeldada, et ükski teine glomerulaarne rakk neid valke ei ekspresseeri), ei saa see olla väidetakse CD73 kohta, mida vähemalt osaliselt ekspresseerivad endoteelirakud. Kolmandaks, ainuüksi keskmise fluorestsentsi intensiivsuse hindamine podotsüütide kahjustuse sõltumatu markerina on küsitav, kuna see ei hõlma podotsiini ja nefriini patoloogilist granuleeritud jaotusmustrit glomerulites, mida võime selgelt jälgida joonisel 6. Seetõttu oleme vastumeelsed seostada CD73-podotsiini ja CD73-nefriini korrelatsiooni puudumist meie analüüsis nende markerite lahknevate molekulaarsete radadega. Täiendavad podotsüütide in vitro ja loomkatsed on vajalikud, et uurida võimalikke häireid nende signaalikaskaadide vahel.
Kokkuvõttes, tunnistades väikese valimi suurust meie uuringu peamiseks piiranguks, demonstreerime siin järjekindlat CD73 üleekspressiooni vigastatud podotsüütide poolt ja soovitame CD73 kui uudset podotsütopaatia diagnostilist markerit. Minimaalse muutusega haiguse korral võivad meie tulemused aidata tuvastada kahjustatud podotsüüte ja viia vähem aega ja kulunõudvasse diagnostikaprotsessi. Lisaks on meie tulemused kooskõlas hiire eksperimentaalsete lähenemisviiside avaldatud andmetega ja viitavad kaitsvale interaktsioonile CD73 ja CCR2 vahel inimeselneeruhaigus. Inimese CD73 signaaliülekande mehhanismide käsitlemiseks on vaja täiendavaid mitmekeskuselisi uuringuid suuremate patsientide rühmadeganeerudhaigus ja selle prognostiline väärtus. Samamoodi oleks haiguse tõsiduse ja CD73 ekspressiooni vahelise võimaliku korrelatsiooni tuvastamiseks vaja suuremaid kohortide arvu.
Materjalid ja meetodid
Uuringu kohortSellesse uuringusse kaasatud kokku 49 biopsiat 49 erinevalt patsiendilt diagnoositi 1. jaanuarist 2018 kuni 31. detsembrini 2019 Heidelbergi ülikooli Mannheimi ülikooli haiglas. Täiendavad valikukriteeriumid olid esinduslik biopsia koos võimalusega teha kolmikdiagnostikat immunohistokeemia ja EM-ga, piisav kliiniline teave, selge diagnoos ja piisav materjal selle uuringu jaoks. Kõik patsiendid olid täiskasvanud ja kaukaaslased. Uuringud hõlmasid 39 biopsiat erineva etioloogiaga podotsüütide kahjustusega patsientidelt (7 biopsiat primaarse fokaalse segmentaalse glomeruloskleroosiga (FSGS) patsientidelt; 8 minimaalse muutusega haigusega (MCD); 12 membraanse glomerulonefriidiga (MGN) patsientidelt; 12 amüloidoosiga patsientidelt). Negatiivsed kontrollid olidneerudbiopsiad 10 patsiendilt ilma podotsüütide kahjustuseta ja ilma proteinuuriata (6 patsienti kerge nefroskleroosiga, 2 patsienti interstitsiaalse nefriidiga ja 2 patsienti ilma patoloogiliste muutusteta). Kõik ülalmainitud biopsiad kaasati podotsüütide CD73 ekspressiooni analüüsi; CCR2 puhul pärast ebapiisava arvu mittesklerootiliste glomerulitega parafiinilõikude väljajätmist (<5), we="" performed="" analysis="" of="" surface="" expression="" and="" of="" correlation="" with="" cd73="" signature="" in="" 6="" samples="" from="" fsgs,="" 8="" from="" mcd,="" 10="" from="" mgn="" and="" 8="" from="" the="" amyloidosis="" group.="" in="" the="" ccr2="" analysis,="" the="" control="" group="" consisted="" of="" 6="" biopsies.="" relevant="" clinical="" data="" were="" collected="" from="" electronic="" medical="" records="" (table="" 1).="" informed="" consent="" was="" waived="" because="" of="" the="" retrospective="" nature="" of="" the="" study,="" because="" of="" the="" fact="" that="" anonymous="" clinical="" data="" were="" used="" for="" analysis="" and="" because="" the="" study="" was="" performed="" on="" already="" existing="" formalin-fixed,="" paraffin-embedded="" tissue="" after="" completing="" the="" diagnostic="" process,="" as="" approved="" by="" the="" ethic="" committee="" of="" the="" university="" medical="" centre="" mannheim,="" university="" of="" heidelberg="" (reference="" number:="">
Histoloogia, immunohistokeemia, immunofluorestsents ja elektronmikroskoopia1 µm seerialõigud tehti parafiiniga manustatudneerudbiopsiad ja värviti hematoksüliini/eosiiniga (H/E), perioodilise happe-Schiffiga (PAS), Massoni trikroomvärvimisega, samuti standardse rutiinse immunohistokeemiaga diagnostilistel eesmärkidel. Formaliiniga fikseeritud parafiiniga manustatud biopsiate immunohistokeemiline ja immunofluorestsentsvärvimine viidi läbi käsitsi, kasutades küüliku anti-inimese CD73 monoklonaalset antikeha (kloon D7F9A, Cell Signaling, Frankfurt am Main, Saksamaa) ja hiire monoklonaalset inimese CCR2-vastast antikeha (kloon 7A7; Abcam, Cambridge, UK), küüliku polüklonaalne inimese vastane nefriinivastane antikeha (Abcam, Cambridge, UK) ja küüliku inimese podotsiinivastane antikeha (Sigma, Saint Louis, MO, USA) vastavalt tootja protokollidele. Kõik biopsiad kaasati podotsüütide CD73 ekspressiooni analüüsi immunohistokeemia abil; CCR2 puhul ebapiisava arvu mittesklerootiliste glomerulitega parafiinilõigud (<5) were="" excluded.="" to="" minimize="" the="" noise,="" antibody="" optimization="" for="" immunohistochemistry="" was="" performed="" using="" control="" (tonsil)="" tissue.="" the="" tissue="" sections="" were="" stained="" with="" dako="" real="" detection="" system="" alkaline="" phosphatase/red="" rabbit/mouse="" kit="" (agilent,="" santa="" clara,="" ca,="" usa)="" and="" avidin/biotin="" blocking="" kit="" (vector="" laboratories,="" burlingame,="" ca,="" usa).="" antigen="" retrieval="" was="" performed="" for="" 20="" min="" using="" dako="" target="" retrieval="" solution="" (equivalent="" citrate="" buffer,="" ph="" 6.0).="" primary="" antibodies="" were="" incubated="" for="" 60="" min="" in="" dako="" antibody="" diluent="" with="" 2%="" dry="" milk="" at="" 37="" ◦="" c="" and="" detected="" using="" the="" dako="" real="" link,="" biotinylated="" secondary="" antibodies="" (included="" in="" the="" kit),="" and="" dako="" real="" streptavidin="" alkaline="" phosphatase="" (ap).="" the="" reaction="" was="" visualized="" by="" a="" red="" chromogen="" (included="" in="" the="" kit).="" the="" slides="" were="" counterstained="" with="" hematoxylin,="" dehydrated,="" mounted="" using="" aquatex="" (merck,="" darmstadt,="" germany)="" and="" cover-slipped.="" for="" immunofluorescence,="" ccr2/cd73="" co-expression="" was="" evaluated="" in="" total="" of="" 22="" podocytes="" from="" all="" podocyte="" lesion="" groups.="" cd73="" was="" stained="" with="" alexa="" flour="" tm="" 488="" tyramide="" superboost="" tm="" kit,="" streptavidin="" (invitrogen,="" thermo="" fisher,="" waltham,="" ma,="" usa)="" using="" secondary="" biotinylated="" anti-mouse="" antibody="" (biotium,="" fremont,="" ca,="" usa).="" secondary="" antibodies="" for="" the="" immunofluorescence="" were="" donkey="" anti-mouse="" cf="" 594="" and="" donkey="" anti-rabbit="" cf="" 594="" (both="" from="" biotium,="" fremont,="" ca,="" usa).="" for="" electron="" microscopy,="" biopsies="" were="" post-fixed="" with="" 1%="" osmium="" tetroxide="" (roth,="" karlsruhe,="" germany),="" embedded="" in="" agar="" 100="" resin="" (agar="" scientific,="" stansted,="" uk),="" cut="" at90nm="" thickness="" andstained="" with1%="" uranylacetate(serva,="" heidelberg,="" germany).="" micro-graphs="" were="" taken="" on="" transmission="" electron="" microscope="" jem-1400="" (joel,="" freising,="">
CISTANCHE PARANDAB NEERU/NEERU FUKTSIOONI
Valgusmikroskoopia ja morfomeetrilised analüüsidKujutiste kogumiseks ja analüüsimiseks kasutati PreciPointi skaneerivat mikroskoopi M8 koos Olympus PlanCN 40 × /0.65 objektiivi ja MicroPointi tarkvaraga (v.5, 2. mai016; PreciPoint, Freising , Saksamaa). Podotsüüdi CD73 pinnaekspressiooni poolkvantitatiivset hindamist immunohistokeemilises värvimises hinnati 0–3 punktide skaalal (0 – ekspressioon puudub; 1 – fokaalne segmentaalne positiivsus (<50% podocytes="" positive="" in=""><50% glomeruli);="" 2—focal="" global="" (="">50 protsenti podotsüütidest on positiivsed<50% glomeruli);="" 3—diffuse="" (any="" percentage="" of="" podocytes="" positive="" in="">50 protsenti glomerulitest). CD73 positiivseid ja negatiivseid podotsüüte analüüsiti CCR2 koekspressiooni suhtes, kasutades intensiivsusel põhinevat poolkvantitatiivset hindamissüsteemi (0 – ekspressioon puudub, 1 – nõrk ekspressioon, 2 – mõõdukas ekspressioon ja 3 – tugev ekspressioon, vastavalt biopsia sisemisele CCR2 positiivsele kontrollile – endoteel ja infiltreeruvad immuunrakud). Hindamise viisid läbi kaks patoloogi (SP ja ZP) sõltumatult pimedal viisil.
Konfokaalne mikroskoopiaPildid CD73 (Alexa Fluor 488), CCR2 (Alexa Fluor 594) ja podotsüütide tuumadest (DAPI) saadi järjestikku Olympus FV1000 mootoriga konfokaalse mikroskoobiga, mis oli varustatud HeNe 594 nm, Argoon 488 nm ja UV-dioodiga 405 nm laser- ja fotokordisti torud (PMT), mida juhib FluoView tarkvara, kasutades 60 × /1,35 UPlanSApo objektiivi. 12-bitised kujutised 512 × 512 pikslise kaadri ja piksli suurusega 0,41 µm ülevaadete jaoks ja 0,10 µm kõrge eraldusvõime jaoks saadi, hoides kõik mikroskoobi sätted konstantsena. Pilte töödeldi ja analüüsiti edasi poolautomaatselt, kasutades ettevõttesiseselt välja töötatud ImageJ makrot (juurdepääsu kuupäev: 15. detsember 2020). Varsti segmenteeriti pildid üksikute podotsüütide jaoks, rakendati lävi ning mõõdeti keskmine intensiivsus, analüüsiti statistiliselt ja joonistati graafik. Kõiki pilte töödeldi konstantsete seadistustega ja kuvati sama pseudovärviga, mis oli ühendatud piltide üksikute kanalite jaoks võrdselt lineaarselt reguleeritud
Statistilised analüüsidStatistilised analüüsid viidi läbi GraphPadPrismv abil. 8.4.3 tarkvara (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA). Kõik andmed on esitatud kui keskmine ± SEM. Statistilised erinevused arvutati paaris või paaritu t-testi ja Pearsoni korrelatsioonianalüüsi abil, nagu näidatud.