Naatriumtiosulfaadiga täiendatud UW lahus kaitseb neerutransplantaate pikaajalise külma isheemia-reperfusioonikahjustuse eest süngeense neerusiirdamise hiiremudelis

Kontakt: ali.ma@wecistanche.com

Max Y. Zhang et al

Cistanche tubulosa takistabneerudhaigus, klõpsake siin, et saadatooted ja Cistanche Nz

ABSTRAKTNE

Sissejuhatus:Külma isheemia-reperfusioonikahjustus (IRI) on vältimatu sündmus, mis suurendab siirdamisjärgseid tüsistusi. Oleme varem näidanud, et Wisconsini ülikooli (UW) lahuse täiendamine FDA poolt heakskiitmata vesiniksulfiidi (H2S) doonormolekulidega vähendab külma IRI-d ja parandab siirdamise järel neerutransplantaadi funktsiooni. Käesolevas uuringus uuritakse, kas FDA poolt heaks kiidetud H2S doonormolekulil, naatriumtiosulfaadil (STS) on sama või parem toime süngeense ortotoopilise roti kliiniliselt olulises mudelis.neerudsiirdamine.

Meetod:Kolmekümnele Lewise rotile tehti kahepoolne nefrektoomia, millele järgnes vasaku roti süngeenne ortotoopiline siirdamineneerudpärast 24-tunnist säilitamist kas UW või UW plus STS lahuses temperatuuril 4 ◦C. Rotte jälgiti kuni 14. siirdamisjärgse päevani ja surmati neerufunktsiooni (uriini eritumine, seerumi kreatiniinisisaldus ja vere uurea lämmastik) hindamiseks.Neerlõigud värviti H&E, TUNEL, CD68 ja müeloperoksidaasiga (MPO), et tuvastada ägedat tubulaarset nekroosi (ATN), apoptoosi, makrofaagide infiltratsiooni ja neutrofiilide infiltratsiooni.

Tulemus:UW pluss STS-siirikud näitasid siirdamise järgselt oluliselt paranenud siiriku funktsiooni, kusjuures retsipientide elulemus paranes võrreldes UW-siirikutega (p < {0}},05).="" histopatoloogiline="" uuring="" näitas="" oluliselt="" vähenenud="" atn-i,="" apoptoosi,="" makrofaagide="" ja="" neutrofiilide="" infiltratsiooni="" ning="" põletikueelsete="" ja="" pro-apoptootiliste="" geenide="" allareguleerimist="" uw="" pluss="" sts-siirikutes="" võrreldes="" uw-siirikutega="" (p=""><>

Järeldus:Näitame esimest korda, et neerutransplantaatide säilitamine STS-iga täiendatud UW lahuses kaitseb pikaajalise külma IRI eest, pärssides apoptootilisi ja põletikulisi radu ning parandades seeläbi siiriku funktsiooni ja pikendades retsipiendi ellujäämist. See võib kujutada endast uudset kliiniliselt rakendatavat ravistrateegiat, et minimeerida pikaajalise külma IRI kahjulikku kliinilist tulemust.neerudsiirdamine.

Märksõnad:Naatriumtiosulfaat (STS) Isheemia-reperfusioonikahjustus (IRI) Staatiline külmhoone (SCS)Neersiirdamine Siiriku ja retsipiendi ellujäämine

1. Sissejuhatus

Neersiirdamine on lõppstaadiumis optimaalne ravineerudneeru-haigus (ESRD). Võrreldes dialüüsiga,neerudsiirdamine on parem, kuna see pakub paremat elukvaliteeti ja annab märkimisväärse ellujäämise eelise koos selle kulutasuvusega [1–3]. Doonori neerude hankimine on aga oma olemuselt seotud isheemia-reperfusioonikahjustusega (IRI), mis on paratamatu tagajärg verevoolu lakkamisest ja sellele järgnevast taastumisest transplantatsiooni ajal [4]. Praegune strateegia siirdamisest põhjustatud IRI leevendamiseks on neerutransplantaatide staatiline külmhoidla (SCS) standardsetes säilituslahustes, näiteks Wisconsini ülikooli (UW) lahuses jääl temperatuuril 4 ◦C siirdamiseelsel perioodil [5]. Siiski on näidatud, et pikaajaline SCS on seotud suurenenud rakusurma, põletiku ja muude kahjustavate rakuliste ja molekulaarsete sündmustega, mis lõppkokkuvõttes põhjustavad siiriku hilinenud funktsiooni (DGF), ägeda tubulaarse nekroosi (ATN) ja transplantaadi vähenemise esinemissageduse suurenemist. ellujäämine [6–10]. Lisaks võtavad paljud siirdamiskeskused vastu pikaajaliste külmade isheemiliste perioodidega neerutransplantaadid, mis aitavad kaasa üldisele koekahjustusele, et pidada sammu ülemaailmselt kasvava ESRD esinemissageduse ja üha suureneva siirdamise ootenimekirjas olevate patsientide arvuga. SCS-le järgneb reperfusioon, kui soe hapnikuga rikastatud veri taastatakse külma isheemilisse transplantaati. Reperfusiooni, mis on isheemilise kahjustuse efektorfaas, iseloomustab suurenenud koekahjustus [11–13].

Võimalik terapeutiline strateegia külma IRI piiramiseks ajalneerudsiirdamine hõlmab standardse säilituslahuse lisamist vesiniksulfiidiga (H2S), endogeenselt toodetud gaasitransmitteriga, mis on näidanud olulist füsioloogilist rolli vasodilatatsioonis ja raku signaaliülekandes [14–16]. Oleme varem näidanud, et pikaajaline SCS H2S-ga täiendatud UW lahuses vähendab siirdamisest põhjustatud külma IRI-d ja parandab siiriku ellujäämist süngeense ja allogeense neerusiirdamise hiiremudelites [17–19, 41, 42]. Nendes uuringutes kasutatud H2S doonormolekulid ei ole aga kliiniliselt elujõulised. See on viinud kaalumiseni naatriumtiosulfaadi (STS), H2S doonorravimi, mille on heaks kiitnud Toidu- ja Ravimiamet (FDA) kaltsifülaksia raviks ESRD-ga patsientidel, tsisplatiinist põhjustatud toksilisuse ravis vähiravis ja antidoodina. tsüaniidimürgitus [20–23]. Hiljutised uuringud on näidanud, et STS-il on IRI loommudelites kaitsev toime [24–26]. Siiski ei ole selle mõju siirdamisest põhjustatud külma neeru IRI-le teada. Seetõttu uurib käesolev uuring STS-i renoprotektiivset toimet neeru IRI in vitro mudelis ja süngeense ortotoopse neerusiirdamise roti mudelis.

2. Materjalid ja meetodid

2.1. Eksperimentaalne in vitro protokoll

STS-i kaitsva toime hindamiseks neeru IRI ajal kasutati külma hüpoksia ja sooja reoksüdatsioonikahjustuse in vitro mudelit, mis jäljendab rakutingimusi in vivo külma IRI ajal. In vitro katsetes kasutati roti neeru epiteelirakke (NRK{{0}}E rakuliin; ATCC, USA), kuna need rakud on vastuvõtlikud isheemilisele kahjustusele [27] ja nende kasutamine on kooskõlas roti omadega. selle uuringu teise eesmärgi jaoks kasutatud siirdamismudel. Rakke kultiveeriti Dulbecco modifitseeritud kotkasöötmes (DMEM), mis sisaldas 1 0 protsenti veise loote seerumit (FBS), mis inaktiveeriti kuumusega temperatuuril 60 °C 20 minutit ja 1 protsenti penitsilliini/streptomütsiini (P/S). Rakke inkubeeriti normaalsetes kasvutingimustes 37 °C, 21% O2 ja 5% CO2. Kontrollrakud olid tingimustes, mis olid identsed eeleksperimentaalsete rakkudega. Eksperimentaalseid rakke töödeldi kas seerumivaba söötmega (SF), SF pluss 200 nM AP39 või naatriumtiosulfaatpentahüdraadi (STS) erineva kontsentratsiooniga (50 uM, 150 uM, 500 uM, 1 mM) SF-ga, mis saadi STS-i (Seacalphyx® [Seaford Pharmaceuticals Inc, Mississauga, ON, Kanada]) 250 mg/ml süstelahus. Kasutati 200 nM AP39 kontsentratsiooni, kuna varem näitasime, et AP39 on sellel kontsentratsioonil tsütoprotektiivne sama rakuliini vastu sarnases külma IRI mudelis [20]. Seejärel inkubeeriti rakke 24 tundi 10 ◦C juures hüpoksilistes tingimustes (5 protsenti CO2, 0,5 protsenti O2, 95 protsenti N2) HypOxystation H85 hüpoksiakambris (HYPO2YGEN, USA), et tekitada külma isheemiline kahjustus. Kasutati hüpotermilist temperatuuri 10 ◦C, kuna see oli madalaim temperatuur, mida oli võimalik tehnoloogiliselt saavutada, säilitades samal ajal 0,5-protsendilise hapnikuvaeguse taseme. Pärast hüpoksiat asendati katserakke sisaldav sööde kontrollsöötmega ja rakke taashapnistati normaalsetes kasvutingimustes (37 °C, 21% O2 ja 5% CO2) 24 tunni jooksul inkubeerimise teel, et simuleerida reperfusiooni ja sellega seotud vigastusi. Pärast 24-tunnist reoksüdeerimist hinnati rakkude elujõulisust rakkude värvimise teel FITC-konjugeeritud anneksiin-V-ga (FITC-Annexin-V; BioLegend, USA) ja 7-aminoaktinomütsiin D-ga (7-AAD; BioLegend, USA). ), mis mõõdab vastavalt raku apoptoosi ja nekroosi. Rakke analüüsiti voolutsütomeetria abil, kasutades CytoFLEX S (Beckman Coulter, USA). Andmete statistilise analüüsi jaoks sobivaks sihtimiseks kasutati FlowJo versiooni 11 (FlowJo LLC, USA).

2.2. Katseloomad

Kolmkümmend isast Lewise rotti kaaluga 275–300 g ja ostetud Charles Riverist (St. Constant, QC, Kanada) peeti standardtingimustes Western University (London, ON) loomahooldus- ja veterinaarteenistuse asutuses. Loomkatsed kiitis heaks Lääne ülikooli loomade hooldamise ja kasutamise nõukogu protokolli ID-ga 2018–155.

2.3. Neeru siirdamise mudel

Syngeneic kidney transplantation in Lewis rats was performed to eliminate any confounding effects of immunosuppression. Rats were randomized into treatment groups of UW solution alone (UW) or UW+STS, anesthetized with ketamine (30 mg/kg) via intraperitoneal administration, and maintained under anesthesia with isoflurane during surgery. The left donor kidneys were procured under aseptic condition and flushed with 10 mL of either cold (4 ◦C) UW solution (UW group, n = 8) in a 28-G Angiocath Becton-Dickinson, or cold UW solution supplemented with sodium thiosulfate pentahydrate (150 µM Seacalphyx® [Seaford Pharmaceuticals Inc, Mississauga, ON, Canada]; UW+STS group, n = 6) until venous effluent was clear. Grafts were then subjected to SCS in UW solution at 4◦C with or without STS for 24 h to mimic prolonged cold ischemic time as previously described [13]. Following 24 h of SCS and bilateral nephrectomy in recipients, renal grafts were transplanted orthotopically into the left renal fossa of syngeneic recipient rats using 11–0 Prolene sutures as we previously described [22]. Sham-operated rats (mid-line incision only; n = 5), were used to establish a baseline for survival, histological analysis, BUN, and serum creatinine. Additionally, another subset of rats in the UW+STS group had grafts removed pre-emptively on a postoperative day (POD) 3 (n = 5) for histological comparison with UW grafts of recipients that were sacrificed at this time point. All surgeries were performed by the same microsurgeon with the length of surgery for the recipient being approximately 2–3 h for both UW and UW+STS groups. Graft failure was presumed in animals that required premature sacrifice (severe visible distress and/or >20 protsenti kaalulangus) või surm. Humaanseid lõpp-punkte kontrolliti kaks korda päevas ja kõik rotid surmati CO2-ga kokkupuutel kambris voolukiirusel 40%. Eutanaasia ajal ei olnud kirurgilisi tüsistusi, mis oleksid võinud põhjustada tulemuste erinevusi.

2.4. Neerufunktsiooni analüüs

Pärast neeru siirdamist jälgiti rotte metaboolsetes puurides 14 päeva ja seejärel surmati. Neerufunktsiooni parameetrite (seerumi kreatiniin, vere uurea lämmastik [BUN], uriini osmolaalsus ja uriinieritus) määramiseks koguti POD 3, 5, 7, 10 ja 14 abil vere- ja uriiniproovid. BUN ja seerumi kreatiniinisisaldus pärinesid neerutransplantaadi retsipientidelt ja võltsoperatsiooniga rottidel mõõdeti IDEXX Catalyst One Chemistry Analyzer masinat (Markham, ON). Uriini osmolaalsuse tasemed määrati külmumispunkti osmomeetria abil, kasutades 3320 Osmometer masinat (Advanced Instruments, Norwood, MA) ja võrreldi ettevõtte pakutavate standarditega.

2.5. Histopatoloogiline ja morfomeetriline analüüs

Parafiiniga manustatud neerukuded lõigati 4 µm paksusteks osadeks ja paigaldati histoloogia jaoks mikroskoopilistele objektiklaasidele. Sektsioonid värviti hematoksüliini ja eosiiniga (H&E), terminaalse desoksünukleotidüültransferaasi dUTP hüüdotsa märgistusega (TUNEL), et määrata vastavalt ATN ja apoptoosi aste. Pimeda neerupatoloog määras H&E sektsioonidele ATN-i skoori järgmise skeemi järgi: 1 =<11%, 2="11–24%," 3="25–45%," 4="46–75%," 5="">75 protsenti siirdatud ATN. Neerulõigud värviti ka järgmiste primaarsete antikehadega: neerukahjustuse marker (KIM-1), makrofaagide pinnamarker CD68 ja neutrofiilide spetsiifiline ensüüm müeloperoksidaas (MPO; Abcam®, Toronto, Kanada) ning visualiseeriti sekundaarsete antikehade ja DAB substraadi kromogeen, kasutades Dako Envision Systemi (Dako, Glostrup, Taani) vastavalt tootja protokollile, millele järgnes analüüs Eclipse 90i digitaalse valgusmikroskoobiga (Nikon® Instruments, New York) 10-kordse suurendusega ja kvantifitseerimine ImageJ tarkvaraga v. 1.8 (National Institutes of Health, Bethesda, MD).

2.6. Kvantitatiivne PCR analüüs

Kogu RNA eraldati neerutransplantaadi kudedest, mis saadi POD 3 abil, kasutades RNeasy® Mini Kit'i (Qiagen, Toronto, Kanada) ja pöördtranskribeeriti cDNA-ks, kasutades OneScript® Plus cDNA sünteesikomplekti (ABM, Kanada) koos oligo(dT)12-ga. 18 praimerit vastavalt tootja protokollile. Eraldatud RNA-d ja cDNA-d analüüsiti enne kasutamist nanodropiga (DeNovix DS-11 spektrofotomeeter, Kanada), A260/280 reitingutega vastavalt > 1,95 ja > 1,8. Iga qPCR proovi reaktsioonisegu maht oli 20 µL ja see valmistati vastavalt Blastaq® Green 2X qPCR Master Mix (ABM, Kanada) protokollile ja analüüsiti CFX Connect Real-Time PCR tuvastussüsteemi masinaga (Bio-Rad, Kanada). . Praimerite järjestused kavandati tarkvara Primer-BLAST (NCBI) abil beeta-aktiini, polü(ADP-riboosi) polümeraasi (PARP), gamma-interferooni (IFN-), kasvaja nekroosifaktori alfa (TNF-), interleukiin 6 (IL) vastu. -6), B-raku lümfoom 2 (Bcl-2), Bcl-2- seotud X-valk (BAX), kaspaas 3, BH3 interakteeruv domeeni surma agonist (BID), c-Jun N-terminaalne kinaas 1/2 (JNK1/2), Pparg koaktivaator 1 alfa (PGC-1 ), mitokondrite kompleks I (NDUFB8), mitokondrite kompleks II (SDHB), mitogeeniga aktiveeritud proteiinkinaas 1/2 (ERK1) /2), neutrofiilide želatinaasi lipokaliini (NGAL) ja neerukahjustuse molekuli-1 (KIM-1) geenid. Kõik huvipakkuvad geenid normaliseeriti beeta-aktiini suhtes. Geeniekspressiooni korduvaid muutusi võrreldi võltsoperatsiooniga rottidega ja arvutati ΔΔCt meetodi abil.

2.7. Statistiline analüüs

Kõik statistilised analüüsid viidi läbi GraphPad (La Jolla, CA) Prism statistilise tarkvarapaketi versiooniga 9.0. Elulemusandmeid analüüsiti Kaplan-Meieri ellujäämisanalüüsi ja logaritmi testi abil, samas kui qPCR geeniekspressiooni andmeid analüüsiti paaritu ühesuunalise t-testi abil. Kõiki teisi andmeid analüüsiti ühesuunalise dispersioonanalüüsi (ANOVA) abil, millele järgnes Tukey post-hoc test, et määrata statistilised erinevused rühmade vahel. Statistiline olulisus võeti vastu lk<0.05. values="" are="" presented="" as="" mean="" ±="" standard="" error="" of="" mean="">

3. Tulemused

3.1. STS-iga täiendatud seerumivaba sööde parandab neerutuubulite epiteelirakkude ellujäämist külma hüpoksia / reoksüdatsiooni ajal

Voolutsütomeetria analüüs pärast värvimist apoptoosi ja nekroosi suhtes näitas, et NRK{{0}}E-rakkudel, mida töödeldi SF-ga in vitro külma IRI ajal, oli rakkude elujõulisus oluliselt vähenenud võrreldes kontrollrakkudega (normoksilised) (joonis 1A; p <). 0.05).="" kuigi="" kõik="" katseproovid="" näitasid="" oluliselt="" madalamat="" neerutuubulite="" epiteelirakkude="" elujõulisust="" kui="" normaalsetes="" tingimustes="" kasvatatud="" rakud="" (p="">< 0,05),="" oli="" rakkudel,="" mida="" raviti="" sf-ga,="" millele="" oli="" lisatud="" 150="" µm="" ja="" 500="" µm="" sts,="" oluliselt="" kõrgem="" elujõulisus="" kui="" ravitud="" rakkudel.="" ainult="" sf="" söötmega="" (joonis="" 1a;="" p="">< 0,05),="" mis="" vastas="" märkimisväärselt="" vähenenud="" apoptoosile="" võrreldes="" ainult="" sf="" söötmega="" töödeldud="" rakkudega="" (joonis="" 1b;="" p="">< 0,05).="" lisaks="" näib,="" et="" rakkude="" elujõulisuse="" suurenemine="" ja="" apoptoosi="" vähenemine="" saavutavad="" optimaalse="" taseme="" 150="" um="" ja="" 500="" um="" sts-iga,="" kuna="" suurem="" annus="" muutis="" need="" suundumused="" ümber="" (joonised="" 1a="" ja="">

3.2. UW lahuse täiendamine STS-iga parandab varajast neerutransplantaadi ellujäämist ja funktsiooni

Neerutransplantaatide säilitamine STS-iga täiendatud UW lahuses parandas oluliselt retsipientide elulemust 83-protsendilise elulemusega kuni POD 14-ni (surmamise päev) võrreldes kontrollrühmaga ilma STS-i lisamiseta, mis näitas 12,5-protsendilist elulemust, eriti esimese 3 päeva jooksul (joonis 1). 2A; p < 0.05).="" lisaks="" parandas="" sts-i="" lisamine="" märkimisväärselt="" transplantaadi="" funktsiooni="" varasel="" siirdamisjärgsel="" perioodil,="" võrreldes="" ainult="" uw-raviga.="" seerumi="" kreatiniini-="" ja="" bun-i="" tase="" tõusis="" märkimisväärselt="" nii="" uw="" kui="" ka="" uw="" pluss="" sts="" rühmades="" pod="" 3="" korral,="" mis="" korreleerus="" uriini="" vähenenud="" osmolaalsusega="" võrreldes="" võltsraviga="" (joonised="" 2b,="" c="" ja="" 3a;="" p="">< 0).{25="" }}5).="" seerumi="" kreatiniini-="" ja="" bun-i="" tase="" uw="" pluss="" sts-i="" rühmas="" aga="" langes="" pod="" 3="" korral="" märkimisväärselt="" koos="" uriini="" osmolaalsuse="" suurenemisega="" võrreldes="" uw="" rühmaga="" (joonis="" 2b,="" c="" ja="" 3a;="" p="">< 0,05).="" huvitav="" on="" see,="" et="" seerumi="" kreatiniini="" ja="" bun="" tasemed="" uw="" pluss="" sts="" rühmas="" langesid="" pidevalt="" pod="" 3-lt="" pod="" 14-le="" koos="" suurenenud="" uriini="" osmolaalsusega="" ja="" olid="" võrreldavad="" shami="" omadega="" (joonised="" 2b,="" c="" ja="" 3a).="" samuti="" oli="" uriinieritus="" uw="" pluss="" sts="" rühmas="" esimese="" nelja="" operatsioonijärgse="" päeva="" jooksul="" oluliselt="" suurem="" kui="" uw="" ja="" sham="" rühmades="" (joonis="" 3b;="" p="">< 0,05).="" siiski="" langes="" see="" pidevalt="" algtaseme="" (võlts)="" väärtuse="" suunas="" ja="" oli="" võrreldav="" sham="" pod="" 14="" omaga,="" samas="" kui="" uriinieritus="" uw="" rühmas="" ellujäänud="" rottidel="" jäi="" kõrgemaks="" kui="" pod="" 14="" algväärtus="" (joonis="">

3.3. STS-i lisamine UW lahusele leevendab siirdamisest põhjustatud rakusurma pärast neeru siirdamist

POD 3 ja 14 põhjal saadud neerulõigud värviti TUNELiga apoptootilise rakusurma mõõtmiseks ja pimestatud neerupatoloog hindas (joonis 4A). UW rühma neerutransplantaadid näitasid oluliselt kõrgemat apoptootilise rakusurma POD 3 korral, mida näitab kõrgem TUNNELi skoor võrreldes UW pluss STS ja Sham rühmade neerudega (joonis 5A ja b; p < 0.{11}="" }5).="" uw="" pluss="" sts="" rühma="" siirikud="" ei="" erinenud="" oluliselt="" shami="" omadest="" samal="" ajahetkel="" ja="" pod="" 14="" juures="" (joonis="" 4b).="" lisaks,="" kuigi="" nii="" uw="" kui="" ka="" uw="" pluss="" sts="" rühmade="" transplantaadid="" näitasid="" märkimisväärselt="" suurenenud="" atn="" skoore="" pod="" 3="" osas="" võrreldes="" võltsrühmaga="" (joonis="" 5;="" p="">< 0.05),="" uw="" pluss="" sts="" transplantaadid="" näitas="" pod="" 3="" vähenenud="" atn="" skoore="" võrreldes="" uw-ga="" (joonis="" 5;="" p="">< 0,05).="" samuti,="" kuigi="" uw-siirikute="" retsipiendid="" ei="" jäänud="" ellu="" kuni="" pod="" 14-ni="" ja="" seetõttu="" ei="" saanud="" nende="" atn-skoore="" pod="" 14-ga="" määrata,="" jäid="" uw-i="" ja="" sts-transplantaatide="" retsipiendid="" ellu="" kuni="" pod-14-ni,="" kuid="" neil="" oli="" atn-skoori="" märkimisväärselt="" suurenenud="" võrreldes="" võltsrühmaga="" (joonis="" fig.="" 5;="" p=""><>

3.4. STS-ga täiendatud UW lahuses säilitatud neerutransplantaatidel oli pärast neeru siirdamist vähenenud vigastusmarkerid ja põletikuline infiltraat

POD 3 ja 14 põhjal saadud neerulõigud värviti KIM-1-ga, et tuvastada proksimaalne tubulaarkahjustus, samuti CD68 (makrofaagimarker) ja MPO (neutrofiilide marker) ning pimestatud neerupatoloog hindas neid (joonised 6A, 7A, ja C). KIM-1, CD68 ja MPO neerukoe ekspressioon oli POD 3 UW rühmas oluliselt kõrgem kui UW pluss STS ja Sham rühmades (joonised 6B, 7B ja D; p < {{11}="" }.05),="" kuigi="" nende="" markerite="" ekspressioon="" uw="" pluss="" sts-siirikutes="" ei="" erinenud="" oluliselt="" võrreldes="" shamiga="" pod="" 14-l="" (joonised="" 6b,="" 7b="" ja="" d;="" p=""> 0,05).

3.5. STS-i täiendamine UW lahusele pärssis põletikueelsete, pro-apoptootiliste ja mitokondriaalsete geenide ekspressiooni neerudes

Põletikueelsete, pro-apoptootiliste, mitokondritele suunatud ja neerukahjustuse markerite geeniekspressioon määrati qRT-PCR abil siirdatud neerudes, mis saadi POD 3 abil. Põletikueelsete geenide IFN-, TNF- ja IL{{8 }} suurenesid märkimisväärselt UW siirikutes võrreldes UW pluss STS transplantaatidega POD 3-l (joonis 8A; p < 0.05)="" ja="" järgisid="" sama="" mustrit="" proapoptootiliste="" geenide="" parp,="" bax="" puhul="" ,="" kaspaasid-3,="" bid,="" jnk1="" ja="" jnk2="" (joonis="" 8a;="" p="">< 0.05),="" samas="" kui="" anti-apoptootilise="" bcl-2="" ekspressioon="" oli="" uw-s="" veidi="" suurenenud="" pluss="" sts="" rühm="" võrreldes="" uw="" rühmaga,="" kuigi="" see="" tõus="" ei="" saavutanud="" statistilist="" olulisust="" (joonis="" 8a).="" lisaks="" vähenes="" oluliselt="" mitokondriaalsete="" geenide="" pgc-1="" ,="" ndufb8="" (kompleks="" i)="" ja="" sdhb="" (kompleks="" ii)="" ekspressioon="" uw="" transplantaatides="" võrreldes="" uw="" pluss="" sts="" transplantaatidega="" (joonis="" 8b;="" p="">< 0="" .05),="" samas="" kui="" erk1="" ja="" erk2="" avaldiste="" puhul="" täheldati="" vastupidist="" (joonis="" 8b;="" p="">< 0,05).="" veelgi="" enam,="" kim-1="" geeni="" ekspressioon="" uw="" siirikutes="" oli="" oluliselt="" suurenenud="" võrreldes="" uw="" pluss="" sts="" transplantaatidega="" (joonis="" 8c;="" p="">< 0,05),="" samas="" kui="" vähenenud="" ngal="" ekspressioon="" uw="" pluss="" sts="" siirikutes="" ei="" saavutanud="" statistilist="" olulisust="" võrreldes="" sellega="" uw="" siirikud="" (joonis="" 8c;="" p=""> 0,05).

4. Arutelu

Selles uuringus lisatakse standardset säilituslahust STS-iga, mis on kliiniliselt elujõuline FDA poolt heaks kiidetud H2S-doonor, et leevendada siirdamisest põhjustatud külma neeru IRI-d, parandada transplantaadi kvaliteeti ja pikendada retsipiendi ellujäämist. Kasutades neeru IRI in vitro mudelit ja süngeense ortotoopse neerusiirdamise roti mudelit, demonstreerime esimest korda, et UW lahuse täiendamine STS-iga pikaajalise SCS-i ajal kaitseb nii elundeid kui ka.

Meie in vitro mudeli peamine järeldus on see, et STS-i lisamine seerumivabale söötmele kaitseb neeruepiteelirakke külma hüpoksia ja sooja reoksüdatsioonist põhjustatud apoptoosi eest ning suurendab elujõulisust, mis on kooskõlas meie eelmise uuringuga, kus näitasime mitokondrite kaitsvat toimet. - sihtmärgiks H2S doonorravim AP39 külma neeru IRI in vitro mudelis [20]. Huvitav on see, et kõrgem STS-i kontsentratsioon 1 mM muutis kasulikud mõjud, mis viitab sellele, et STS-il on kahefaasiline doosi-vastuse nähtus, mida nimetatakse hormesiks, mille puhul madalam kontsentratsioon on tsütoprotektiivne, samas kui kõrgem kontsentratsioon on tsütotoksiline. Mitokondriaalne kahjustus on neerude IRI peamine tagajärg, kuna mitokondriaalne läbilaskvus võib pärssida adenosiintrifosfaadi (ATP) tootmist ja suurendada reaktiivsete hapnikuliikide (ROS) moodustumist, mis on koekahjustuse hävitav vahendaja [13]. Hiljuti on välja pakutud, et mitokondrid on STS-i aktiivsuse peamine koht. Teadaolevalt ei tekita STS mitte ainult H2S-i mitokondrites glutatioonist sõltuva redutseerimise ja vastupidi sulfiidi oksüdatsiooniraja kaudu, vaid säilitab ka mitokondriaalse ATP sünteesi, vähendab ROS-i tootmist ja parandab keerulisi ensüümide aktiivsusi elektronide transpordiahelas (ETC) [24]. ,28–30]. Lisaks näitasid hiljutised uuringud, et STS suurendas märkimisväärselt mitokondriaalse biogeneesi ja ATP tootmise positiivse regulaatori PGC-1 ekspressiooni [26], mis on kooskõlas meie in vivo vaatlusega. Need molekulaarsed mehhanismid võivad põhjustada mitokondriaalsete ETC komplekside I ja II (vastavalt NDUFB8 ja SDHB) märkimisväärselt suurenenud ekspressiooni meie neerusiirdamise mudelis, suurendades elulemust ja funktsiooni, nagu on täheldatud STS-iga täiendatud UW lahuses säilitatud neerutransplantaatides.

Meie in vitro tulemuste põhjal otsustasime uurida, kas STS-i kaitsev toime on rakendatav in vivo, kasutades siirdamismudelit, kus külm IRI on siiriku düsfunktsiooni ja suurenenud siirdamisjärgsete tüsistuste peamine põhjus. Meie leiud näitavad, et neerutransplantaatide pikaajaline (24 h) SCS STS-iga täiendatud UW lahuses parandab oluliselt transplantaadi kvaliteeti ja funktsiooni, mida iseloomustab seerumi kreatiniini ja BUN taseme langus, suurem uriinieritus ja pikem retsipientide elulemus võrreldes ainult UW lahuses säilitatud transplantaatidega. . Oluline on märkida, et uriini eritumise vahetu isegi pärast kliinilist neerusiirdamist on kriitiline tulemus, mis määrab, kas siiriku hilinenud funktsiooni (DGF) kõrvaldamiseks on vaja dialüüsi. Seetõttu on meie tähelepanek, et STS suurendab uriinieritust kohe pärast siirdamist ja on võrreldav POD 14 Sham-rühmaga, paljutõotav leid. Täheldatud neerufunktsiooni paranemine pärast STS-iga täiendatud UW lahuses säilitatud transplantaatide siirdamist andis samuti olulise ellujäämise eelise. Kvantitatiivselt pikendas STS-i lisamine siiriku eluiga nii, et 83 protsenti (5/6) rottidest, kes said UW pluss STS-siirte, jäid ellu kuni POD 14-ni (surmamispäev), võrreldes ainult 12,5 protsendiga (1/8) retsipientrottidest. pookoksad, mis on säilitatud UW lahuses ilma STS-i lisamiseta. See käesoleva uuringu järeldus ühtib ka meie eelmise uuringuga, kus ainult 14 protsenti (7-st) siiriku retsipientrottidest säilitati UW lahuses 24 tundi ilma H2S (GYY4137) lisamiseta, elas kuni POD 14 [20]. .

Lisaks neerufunktsiooni parameetrite paranemisele pärssis STS-i lisamine ka neerutransplantaadi apoptoosi ja põletikku, vähendades proapoptootiliste ja põletikku soodustavate geenide ekspressiooni kudedes, reguleerides samal ajal antiapoptootilisi geene ja vähendades CD68-positiivsete makrofaagide ja MPO-positiivsed neutrofiilid, mis kokkuvõttes vähendasid KIM{5}} ekspressiooni ja ATN-i ning lõpuks säilitasid neerude morfoloogia. Need põletikulised tsütokiinid on teadaolevalt rakusurma vahendajad külma IRI ajal [31] ja nende UW pluss STS-siirikute vähenemine on tõenäoliselt tingitud STS-i hästi tuntud omadustest, mis vähendavad endoteeli läbilaskvust veresoonte endoteeli monokihis, nõrgendavad tsütokiinide tootmist. ja kutsuvad esile põletikuvastaste tsütokiinide tootmist [32]. Samuti on meie järeldus, et STS-i lisamine UW-lahusele vähendab põletikueelsete geenide ekspressiooni, ühtib STS-i põletikuvastase aktiivsuse varasema uuringuga, vähendades TNF- ja IL-i -6 taset neuroloogiliste haiguste korral [33]. ,34]. Mehhaaniliselt inaktiveerib STS kaspaasi-3, kinnitudes selle aktiivse saidiga tugevate vesiniksidemete kaudu ja takistades seeläbi loodusliku substraadi juurdepääsu aktiivsele saidile, peatades lõpuks apoptoosi [35]. STS blokeerib ka apoptootilises signaaliülekandes kriitilist rolli mängiva valgu JNK aktiveerimise [35], mis toetab meie järeldust STS-i kaspaasile3 ja JNK-le alareguleeriva toime kohta. Siiski ei saa me kindlaks teha, kas sellised mehhanismid käesolevas uuringus töötavad, kuna me ei teinud nende molekulaarsete mehhanismide uurimiseks täiendavaid katseid.

Meie in vitro katse peamiseks piiranguks on meie tehniline väljakutse kasutada praegust standardset säilitustemperatuuri 4 ◦C [36], kuna meie kasutatud 10 ◦C oli madalaim temperatuur, mida oli võimalik tehnoloogiliselt saavutada ilma hüpoksilist keskkonda ohustamata. See on tõeline erinevus raku füsioloogiliste protsesside ja ka säilitusmeetodite osas. Võimalik lahendus on kasutada keemiliselt indutseeritud hüpoksiat kilekotis ja asetada see 4 ◦C külmikusse, et kajastada SCS-i kliinilisi sätteid. Need anaeroobse atmosfääri tekitamise kotid olid aga mõeldud kasutamiseks soojal temperatuuril (21–37 ◦C), kuna hüpoksilist keskkonda esile kutsuvad keemilised ühendid toimivad sellistes tingimustes. Tulevaste uuringute eesmärk peaks olema hüpoksiakambri temperatuuri optimeerimine, et jäljendada kliinilisi SCS-i sätteid. Püsiva temperatuuri 4 ◦C saavutamine ilma hüpoksilist keskkonda kahjustamata võimaldab meil kindlaks teha, kas eksperimentaalses in vitro külma IRI mudelis täheldatud fenotüübid on järjepidevalt ekspresseeritud. Lisaks in vitro katsele pole meie roti siirdamise mudelil ka puudusi. Teostasime süngeense neerusiirdamise (geneetiliselt identsed doonorid ja immunoloogilise ühilduvusega retsipiendid), mis on kliinilises neerusiirdamises rakendatav ainult identsete kaksikute puhul, samas kui enamik kliinilisi neerusiirdamisi on allogeensed (geneetiliselt erinevad doonorid ja retsipiendid). Allogeenne siirdamine sunnib siirdatud retsipiente enne siirdamist läbima immunoloogilised testid, et tuvastada doonori inimese leukotsüütide antigeenid (HLA; molekulid, mis indutseerivad ja reguleerivad immuunvastust), määrata doonorite ja retsipientide immunoloogiline ühilduvus ning vältida elundi äratõukereaktsiooni [37, 38]. Tulevased STS-i kasutavad uuringud peaksid kaaluma allogeenset siirdamist. Veel üks piirav neerusiirdamise mudel on tõsiasi, et keskendusime elusdoonoritele, südamesurma (DCD) doonorite doonorlusest saadud suboptimaalsed transplantaadid on paljudes siirdamiskeskustes kogu maailmas üha tavalisemad doonori neerude allikana [39]. DCD paljastab doonororganid lisaks külmadele isheemilistele aegadele SCS-i ajal ka erinevatele sooja isheemia perioodidele ning seda seostatakse DGF-i suurenenud määra ja transplantaadi vähenenud ellujäämisega võrreldes elusdoonoritega [40]. Seetõttu tuleks tulevastes uuringutes kaaluda DCD neerusiirdamise mudelit, et hinnata STS-i mõju IRI-le selles mudelis.

Kokkuvõttes näitab meie uuring, et standardse säilituslahuse lisamine kliiniliselt elujõulise H2S doonorravimiga neerutransplantaatide pikaajalise SCS-i ajal kaitseb siirdamisest põhjustatud külma neeru IRI eest, parandab transplantaadi üldist kvaliteeti ja funktsiooni ning pikendab siirdatud retsipiendi ellujäämist. Arvestades, et DGF-i risk suureneb pikaajalise külma isheemilise ajaga kliinilises neerusiirdamises, mis tekitab suurt kliinilist muret, annab tähelepanek, et STS kaitseb neerutransplantaadid pikaajalise SCS-i ajal ja takistab DGF-i pärast siirdamist, suure kliinilise lubaduse, mis võib vähendada või ära hoida DGF-i esinemissagedus kliinilises neerusiirdamises lähitulevikus. Seega võib STS-i säilitamislahendustele lisamise tulevane kasu kujutada endast potentsiaalset lahendust sellele käimasolevale probleemile. Üldiselt täiendab see uuring kasvavat kirjandust, mis toetab STS-i ja teiste H2S-doonorite tsütoprotektiivset toimet elundi IRI vastu, eriti parandades transplantaadi tulemusi siirdamisest põhjustatud külma neeru IRI korral. Need strateegiad võivad hõlbustada pikemaajaliste külmade isheemiliste aegadega kokkupuutuvate siirikute kasutamist, mis võib suurendada siirdatavate elundite kogumit.

CRediT autorluse panuse avaldus

Kõik autorid on selle käsikirja esitamisega nõustunud. Huvide konflikt puudub.

Viited

[1] RA Wolfe, VB Ashby, EL Milford jt, Suremuse võrdlus kõigi dialüüsi saavate patsientide, siirdamist ootavate dialüüsi saavate patsientide ja esimese surnukehasiirdamise retsipientide hulgas, New Engl. J. Med. 341 (23) (1999) 1725–1730.

[2] M. Tonelli, N. Wiebe, G. Knoll jt, Süstemaatiline ülevaade: neerusiirdamine võrreldes dialüüsiga kliiniliselt olulistes tulemustes, Am. J. Transpl. 11 (10) (2011) 2093–2109.

[3] MC Cavallo, V. Sepe, F. Conte jt, Cost-effectiveness of neeru transplantation from DCD in Italy, Transplant. Proc. 46 (10) (2014) 3289–3296.

[4] B. Dorweiler, D. Pruefer, TB Andrasi, SM Maksan, W. Schmiedt, A. Neufang, CF Vahl, isheemia-reperfusioonikahjustus, Eur. J. Trauma tekkima. Surg. 33 (6) (2007) 600–612.

[5] EE Guibert, AY Petrenko, CL Balaban, AY Somov, JV Rodriguez, BJ Fuller, Organite säilitamine: praegused kontseptsioonid ja uued strateegiad järgmiseks kümnendiks, Transfus. Med. Heema. 38 (2) (2011) 125–142.

[6] AK Salahudeen, N. Haider, W. May, Külma isheemia ja surnud neeru allograftide vähenenud pikaajaline ellujäämine, Kidney Int. 65 (2) (2004) 713–718.

[7] I. Quiroga, P. McShane, DD Koo jt, Peamised mõjud hilinenud transplantaadi funktsiooni ja külma isheemia ajal neerude allografti ellujäämisele, Nephrol. Helista. Siirdamine. 21 (6) (2006) 1689–1696.

[8] LK Kayler, J. Magliocca, I. Zendejas, TR Srinivas, JD Schold, Impact of cold ischemia time on transplanta survival among ECD transplant recipiens: a paired neeru analysis, Am. J. Siirdamine. 11 (12) (2011) 2647–2656.

[9] MD Doshi, N. Garg, PP Reese, CR Parikh, hilinenud transplantaadi funktsiooniga seotud retsipientide riskifaktorid: paaris neeruanalüüs, Transplantation 91 (6) (2011) 666–671.

[10] A. Debout, Y. Foucher, K. Tr´ebern-Launay et al., Iga täiendav tund külma isheemiaaega suurendab oluliselt siiriku puudulikkuse ja suremuse riski pärast neerusiirdamist, Kidney Int. 87 (2) (2015) 343–349.

[11] A. Kezic, I. Spasojevic, V. Lezaic, M. Bajcetic, Mitochondria-targeted antioxidants: tulevikuperspektiivid neeruisheemia-reperfusioonikahjustuses, Oxid. Med. Rakk Longev. 2016 (2016) 2950503.

[12] TI ​​Peng, MJ Jou, Mitokondriaalse kaltsiumi ülekoormusest põhjustatud oksüdatiivne stress, Ann. NY Acad. Sci. 1201 (2010) 183–188.

[13] W. Jassem, SV Fuggle, M. Rela, DD Koo, ND Heaton, Mitokondrite roll isheemia/reperfusioonikahjustuse korral, Transplantation 73 (4) (2002) 493–499.

[14] PM Snijder, E. van den Berg, M. Whiteman, SJ Bakker, HG Leuvenink, H. van Goor, Emerging role of gasotransmitters in renal transplantation, Am. J. Siirdamine. 13 (12) (2013) 3067–3075.

[15] JT Hancock, M. Whiteman, Vesiniksulfiid ja raku signaalimine: meeskonnamängija või kohtunik? Plant Physiol. Biochem. 78 (2014) 37–42.

[16] W. Zhao, J. Zhang, Y. Lu, R. Wang, H(2)S vasorelaxant effect of H(2)S as a new endogenous gaseous K(ATP) channel opener, EMBO J. 20 (21) (2001) 6008–6016.

[17] I. Lobb, M. Davison, D. Carter jt, Vesiniksulfiidravi leevendab neeru allotransplantaadi isheemia-reperfusioonikahjustust külmhoiustamise ajal ning parandab varajast siirdatud neerufunktsiooni ja ellujäämist pärast allogeenset neerusiirdamist, J. Urol. 194 (6) (2015) 1806–1815.

[18] I. Lobb, A. Mok, Z. Lan, W. Liu, B. Garcia, A. Sener, Täiendav vesiniksulfiid kaitseb siirdatud neerufunktsiooni ja pikendab retsipiendi ellujäämist pärast pikaajalist külma isheemia-reperfusioonikahjustust, leevendades neerutransplantaadi apoptoosi ja põletik, BJU Int. 110 (11 Pt C) (2012) E1187–E1195.

[19] I. Lobb, J. Jiang, D. Lian jt, Vesiniksulfiid kaitseb neerutransplantaadid pikaajalise külma isheemia-reperfusioonikahjustuse eest spetsiifiliste mitokondriaalsete toimingute kaudu, Am. J. Siirdamine. 17 (2) (2017) 341–352.

[20] C. Renard, SW Borron, C. Renaudeau, FJ Baud, Naatriumtiosulfaat ägeda tsüaniidimürgistuse korral: uuring rotimudelil, Ann. Pharm. Fr. 63 (2) (2005) 154–161. [21] N. Laplace, V. Kepenekian, A. Friggeri jt, Naatriumtiosulfaat kaitseb neerukahjustuse eest pärast hüpertermilist intraperitoneaalset kemoteraapiat (HIPEC) tsisplatiiniga, Int. J. Hüperth. 37 (1) (2020) 897–902.