eeKeel
Kodu / Teadmised / Sisu

Teadmised

CAR-neutrofiilide vahendatud kasvaja mikrokeskkonnale reageerivate nanoravimite kohaletoimetamine glioblastoomi kemoimmunoteraapia jaoks

Nov 27, 2023

Glioblastoom (GBM) on üks agressiivsemaid ja surmavamaid tahkeid kasvajaid inimestel. Kuigi tõhusaid ravimeid, nagu tekkivad kimäärsed antigeeniretseptorid (CAR) -T-rakud ja kemoteraapiad, on välja töötatud erinevate vähivormide raviks, on nende efektiivsust GBM-ravis takistanud suuresti hematoentsefaalbarjäär ja hematoentsefaal-kasvaja barjäärid. Inimese neutrofiilid ületavad tõhusalt füsioloogilisi barjääre ja näitavad efektori immuunsust patogeenide vastu, kuid primaarsete neutrofiilide lühike eluiga ja resistentsus genoomi redigeerimise suhtes on piiranud nende laialdast kasutamist immunoteraapias. Siin konstrueerime geneetiliselt inimese pluripotentsed tüvirakud CRISPR/Cas{4}}vahendatud geeniga, et ekspresseerida erinevaid GBM-vastaseid CAR konstrukte T-spetsiifiliste CD3ζ või neutrofiilide spetsiifiliste signaalidomeenidega. Parima kasvajavastase toimega CAR-neutrofiilid toodetakse selleks, et spetsiifiliselt ja mitteinvasiivselt manustada ja vabastada kasvaja mikrokeskkonnale reageerivaid nanoravimeid, mis on suunatud GBM-ile, ilma et oleks vaja kasvajakohtades täiendavat põletikku esile kutsuda. Sellel kombineeritud kemoimmunoteraapial on suurepärane ja spetsiifiline GBM-vastane toime, see vähendab sihtmärgist väljapoole suunatud ravimite manustamist ja pikendab emaste kasvajaga hiirte eluiga. Üheskoos on see biomimeetiline CAR-neutrofiilide ravimite kohaletoimetamise süsteem ohutu, tõhus ja mitmekülgne platvorm GBM-i ja võib-olla ka muude laastavate haiguste raviks.


effects of cistance-antitumor

Cistanche tubulosa-Antitumor eelised

Glioblastoomi (GBM) iseloomustab kõrge suremus, lühike eluiga ja halb prognoos koos suure kordumise tendentsiga1,2. Nii operatsiooni kui ka kemoravimite terapeutilist efektiivsust takistavad peamiselt peen aju struktuur ja füsioloogiline hematoentsefaalbarjäär (BBB) ​​või hematoentsefaal-kasvaja barjäär (BBTB)3–5. Eriti keeruline on ravimite kohaletoimetamine kesknärvisüsteemi (KNS) ajukasvajate raviks:<1% of administered nanoparticle dose is found to be delivered to a solid tumor based on 376 published datasets6, and 0.8% delivered to brain cancer7. Due to their native capacity to migrate towards inflamed sites, traverse BBB/BBTB, and infiltrate solid tumors, mouse neutrophil-mediated delivery of nanoparticulated chemo drugs has been investigated to enhance targeted drug delivery to the brain tumors for improved therapeutic efficacy8–10. However, an invasive surgical resection of the tumor or tumor microenvironment priming is needed to induce additional inflammation for neutrophil recruitment before neutrophil/chemotherapeutic administration, leading to limited neutrophil recruitment in tumor sites beyond the inflamed surgical margin11. Furthermore, neutrophil-delivered chemotherapeutics were primarily enriched in the spleen, but not in the targeted brain of tumor-bearing mice. While necrosis was not observed in the major organs of experimental mice, there are still concerns regarding off-target tissue toxicity or even systemic toxicity in patients12. Previous studies also focused on mouse neutrophils. The feasibility and safety of using human neutrophils in drug delivery remain elusive since neutrophils have a short lifespan and are prone to apoptosis ex vivo. In addition, massive neutrophil extraction from pre-surgical patients for drug loading may lead to neutropenia or other risks. Thus, a safe and effective human neutrophil-mediated biomimetic drug delivery system that utilizes the natural chemo-attractive GBM microenvironment is urgently needed.

Neutrofiilide kaasasündinud immuunsust ja plastilisust erinevate vähivormide, sealhulgas GBM vastu, uuriti vähem kui nende kasutamist rakukandjatena ravimite kohaletoimetamisel 8–10. Veres ringlevad neutrofiilid on hüpoksilise kasvaja mikrokeskkonna (TME) koduks, kus neist saavad heterogeensed kasvajaga seotud neutrofiilid (TAN), mis on immunosupressiivse TME oluline komponent, mis aitab kaasa vähi progresseerumisele ja terapeutilisele resistentsusele 12, 17. Sarnaselt makrofaagidele leiti hüpoksilises TME18–21-s TAN-ide kasvajavastaseid N1 ja kasvajaeelseid N2 fenotüüpe. Neutrofiilide otseseks sihtimiseks on välja töötatud mitmesuguseid terapeutilisi strateegiaid, keskendudes neutrofiilide vähenemisele või inhibeerimisele12, 22, mille tulemuseks on mitmed kliinilised uuringud (nt CCR5 inhibiitor Maravirok dokumendis NCT03274804). Seega võib töötlemata neutrofiilide otsene kasutamine nanokandjana kujutada endast täiendavat riski vähipatsientidele, kelle puhul võib ravimitega kaubitsevad neutrofiilid TME-s ümber programmeerida immunosupressiivsele kasvajaeelsele N2 fenotüübile pärast tuumorikohtadesse sattumist 13, 23. Lisaks tuleks uurida ja suurendada naiivsete neutrofiilide sisemist kasvajavastast toimet, et saavutada optimaalne terapeutiline efektiivsus, kui seda kasutatakse ravimikandjana koos kemoterapeutikumidega.

Desert ginseng—Improve immunity

Cistanche tubulosa eelised- tugevdada immuunsüsteemi

Kimäärse antigeeni retseptori (CAR) modifikatsioon on oluliselt suurendanud immuun-T või looduslike tapjarakkude (NK) kasvajavastast toimet 24–27. Nende efektiivsus tahkete kasvajate korral on siiski piiratud osaliselt nende suhteliselt madala kaubitsemise ja kasvaja läbitungimise võime tõttu. Füsioloogilise BBB ja BBTB olemasolu takistab veelgi nende uute ravimite efektiivsust GBM-i vastu ajus. Spekuleerisime, et CAR-tehnoloogia ja väga liikuvate neutrofiilide kombinatsioon võib säilitada nende kasvajavastase N1 fenotüübi ja anda suurepärase terapeutilise efektiivsuse GBM-i ravis. Primaarsed neutrofiilid on lühiealised ja resistentsed genoomi redigeerimise suhtes28, piirates nende kasutamist CAR-i suunatud immunoteraapias. Inimese pluripotentsed tüvirakud (hPSC-d), mis on geenide redigeerimisele paremini ligipääsetavad ja suudavad massiliselt neutrofiilideks diferentseeruda, võivad pakkuda piiramatut kvaliteetsete CAR-neutrofiilide allikat sihipäraseks immunoteraapiaks keemiliselt määratletud ksenovabades tingimustes29. Neutrofiilid fagotsüteerivad eelistatavalt ka krobelise või pika pinnaga mikroobseid patogeene, nagu S. aureus ja E. coli30, mida tuleks neutrofiilide poolt vahendatud ravimite kohaletoimetamisel nanoosakeste kujundamisel arvesse võtta. Tõepoolest, Safari et al. teatas hiljuti intravenoosselt manustatud piklike osakeste eelistatud fagotsütoosist ilma keerulise pinna modifitseerimiseta tsirkuleerivate neutrofiilide kaudu30. Selline lihtne ja bioinspireeritud disain ravimiga laetud nanoosakestes võib maksimeerida ravimi laadimist neutrofiilides ja võimaldada ravimite terapeutilisel tasemel kohaletoimetamist sihtkohtadesse.

In this work, we design and screen four anti-GBM chlorotoxin (CLTX)-CAR constructs with T or neutrophil-specific signaling domains by knocking them into the AAVS1 safe harbor locus of hPSCs via CRISPR/Cas9-mediated homologous recombination and identified an optimized CAR, composed of a 36-amino acid GBM-targeting CLTX peptide27, a CD4 transmembrane domain and a CD3ζ intracellular domain, for neutrophil-mediated tumor-killing. The resulting stable CAR-expressing hPSCs are then differentiated into CAR-neutrophils, which sustain an anti-tumor N1 phenotype and exhibit enhanced anti GBM activities under the hypoxic tumor microenvironment. A biode gradable mesoporous organic silica nanoparticle with a rough surface (R-SiO2) is synthesized and employed to load hypoxia-activated prodrug tirapazamine (TPZ) or clinical chemo-drug temozolomide (TMZ) and JNJ-64619187 (a potent PRMT5 inhibitor under clinical trial NCT03573310) into hPSC-derived CAR-neutrophils, which are unharmed by the nanoparticulated cargo and retain the inherent physiological properties of naïve neutrophils. CAR-neutrophils loaded with drug-containing SiO2 nanoparticles display superior anti-tumor activities against GBM, possibly due to a combination of CAR-enhanced direct cytolysis and chemotherapeutic-mediated tumor killing via cellular uptake and glutathione (GSH)-induced degradation of nanoparticles within the targeted tumor cells. In an in situ GBM xenograft model, hPSC-derived CAR-neutrophils precisely and effectively deliver TPZ-loaded SiO2 nanoparticles to the brain tumors without invasive surgical resection for amplified inflammation, significantly inhibiting tumor growth, and prolonging animal survival, representing a targeted and efficacious combinatory chemoimmunotherapy. Notably, Si content measurement suggests that>20% manustatud nanoravimitest viiakse ajukasvajatesse CAR-i neutrofiilide poolt, võrreldes 1% vabade nanoravimitega. Kokkuvõttes on meie biomimeetiline CAR-neutrofiilide ravimite manustamissüsteem ohutu, tõhus ja mitmekülgne platvorm GBM-i ja muude laastavate haiguste raviks.

effects of cistance-antitumor (2)

Cistanche tubulosa-Antitumor eelised

Tulemused

Neutrofiil-spetsiifiliste CAR-struktuuride sõelumine kasvajavastase toime suurendamiseks

To engineer CAR-neutrophils for targeted drug delivery to brain tumors (Fig. 1a–b), we first designed and tested 4 different CAR structures optimized for anti-tumor activities of hPSC-neutrophils. All CAR structures shared the same extracellular granulocyte-macrophage colony-stimulating factor receptor (GM-CSFR) signal peptide (SP), glioblastoma-targeting domain CLTX27, and IgG4 hinge29 (Fig. 2a). CAR #1 is a first-generation T cell-specific CAR that uses the CD4 transmembrane (TM) domain and CD3ζ intracellular signaling domain. CAR #2, CAR #3, and CAR #4 differ from CAR #1 in using a transmembrane domain from neutrophil-specific CD32a (or FcγRIIA), a single-chain transmembrane receptor that is highly expressed in neutrophils (30,000 to 60,000 molecules/cell31) and critical for neutrophil activation31–34. CAR #3 and CAR #4 also include an Fc domain γ-chain of CD32a, which relies on a highly conserved immunoreceptor tyrosine based activation motif (ITAM) to express and signal in neutrophils. Notably, CAR #3 contains a combo signaling domain by fusing CD32aITAM to the CD3ζ intracellular domain. Since primary neutrophils are short-lived and resistant to genome editing, we engineered human pluripotent stem cells (hPSCs) with these different CARs to achieve stable and universal immune receptor expression on differentiated neutrophils by knocking CAR constructs into the AAVS1 safe harbor locus via CRISPR/Cas9-mediated homology-directed repair (Fig. 2b). After nucleofection, single cell-derived hPSC clones were isolated and screened with puromycin for about two weeks. Genotyping identified successfully targeted hPSCs with an average CAR knock-in efficiency of >90% ja suurem osa sihitud kloonidest on heterosügootsed (täiendav joonis 1a–d). CAR ekspressiooni konstrueeritud hPSC-del kinnitas täiendavalt RT-PCR ja CLTX-IgG4 voolutsütomeetria analüüs (täiendav joonis 1e–g). Nagu oodatud, säilitasid CAR-d ekspresseerivad hPSC-d pluripotentsete markerite, sealhulgas OCT4, SSEA4 ja SOX2 kõrge ekspressioonitaseme (täiendav joonis 1f).

De novo CAR-neutrofiilide tootmiseks diferentseeriti CAR-i ekspresseerivad hPSC-d esmalt multipotentseteks vereloome ja seejärel müeloidseteks eellasrakkudeks, kasutades staadiumispetsiifilist tsütokiiniravi35 (joonis 2c). G-CSF ja retinoehappe agonisti AM580 hilisem kasutamine soodustas tugevat neutrofiilide tootmist36. Sarnaselt nende kolleegidega perifeerses veres (PB), olid hPSC-st saadud CLTX-CAR neutrofiilidel tüüpiline neutrofiilide morfoloogia ja pinnamarkerid CD16, CD11b, MPO, CD15, CD66b ja CD18 (täiendav joonis 2). Järgmisena määrasime CAR ekspressiooni mõju hPSC-st pärinevate neutrofiilide kasvajavastasele tsütotoksilisusele, kultiveerides neid koos glioblastoomi (GBM) U87MG rakkudega in vitro. Ootuspäraselt näitasid hPSC-st pärinevad CLTX-CAR neutrofiilid võrreldes PB neutrofiilidega paremat kasvajat tapavat võimet (joonis 2d), mis on kooskõlas varasemate tähelepanekutega CLTX CAR-T rakkudes27. Nende erinevate CAR-de hulgas vahendas CAR #1 hPSC-neutrofiilides paremat kasvajat hävitavat toimet. Nimelt on -ahelapõhine CAR #4 kõige vähem efektiivne neutrofiilide poolt vahendatud kasvaja tapmise vallandamiseks, mis võib olla tingitud ITAM-i madalamast koopiast kui ζ-subühikus ja rakupinnal olevate CAR-de madalamast ekspressioonist28. Neutrofiilid vabastavad sihtrakkude tapmiseks tsütotoksilisi reaktiivseid hapniku liike (ROS) ja tuumori nekroosifaktorit (TNF-). ROS-i ja TNF- (joonised 2e, f) tootmine erinevatest neutrofiilidest langes hästi kokku nende suurenenud tsütolüüsiga. Ootuspäraselt jäi ROS-i ja TNF-produktsioon erinevatest neutrofiilidest pärast kultiveerimist normaalsete SVG p12 gliiarakkudega sama madalaks kui negatiivses kontrollrühmas (täiendav joonis 3a, b). Lisaks täheldati CAR-neutrofiilide suurenenud kasvajavastast tsütotoksilisust ainult koos inkubeerimisel GBM-rakkudega, sealhulgas U87MG, esmased täiskasvanud GBM43 ja laste SJ-GBM2 rakud (täiendav joonis 3c), mis näitab meie CLTX kõrget spetsiifilisust. - AUTO. Nimelt oli CAR-neutrofiilidel kõrge biosobivus normaalsete SVG p12 gliiarakkude, hPSC-de ja hPSC-st pärinevate rakkudega (täiendav joonis 3d), mis on kooskõlas varasema tähelepanekuga, et inaktiveeritud primaarsed neutrofiilid ei tapa terveid rakke16. Ühiselt näitasid hPSC-st pärinevad CAR-neutrofiilid, eriti CD3ζ-d kandvad CAR-neutrofiilid, suurenenud kasvajavastast tsütotoksilisust ja tekitasid in vitro rohkem ROS-i ja TNF-i, tõstes esile nende potentsiaali sihipärases immunoteraapias.

Fig. 1 | Schematic of enhanced anti-glioblastoma efficacy using combinatory immunotherapy of CAR-neutrophils and tumor microenvironment responsive nano-drugs. Human pluripotent stem cells were engineered with CARs and differentiated into CAR-neutrophils that are loaded with rough silica nanoparticles (SiO2 NPs) containing hypoxia-targeting tirapazamine (TPZ) or other drugs, as a dual immunochemotherapy. b Systemically administered CAR-neutrophil@R-SiO2- TPZ NPs first attack external normoxic tumor cells by forming immunological synapses and kill tumor cells via phagocytosis. After apoptosis, CAR-neutrophils could then release R-SiO2-TPZ NPs, which are overtaken by tumor cells. Afterward, nano-prodrugs respond to the hypoxic tumor microenvironment and effectively kill tumor cells. TEOS tetraethyl orthosilicate, BTES bis[3-(triethoxysilyl) propyl] tetrasulfide, TPZ tirapazamine, BTZ benzotriazinyl.


Joonis 1|Suurenenud glioblastoomivastase efektiivsuse skeem, kasutades CAR-neutrofiilide ja kasvaja mikrokeskkonnale reageerivate nanoravimite kombineeritud immunoteraapiat. Inimese pluripotentsed tüvirakud konstrueeriti CAR-idega ja diferentseeriti CAR-neutrofiilideks, mis on topelt-immunokemoteraapiana laetud töötlemata ränidioksiidi nanoosakestega (SiO2 NP-d), mis sisaldavad hüpoksiale suunatud tirapasamiini (TPZ) või muid ravimeid. b Süsteemselt manustatud CAR-neutrofil@R-SiO2- TPZ NP-d ründavad esmalt väliseid normoksilisi kasvajarakke, moodustades immunoloogilisi sünapse ja tapavad kasvajarakud fagotsütoosi teel. Pärast apoptoosi võivad CAR-neutrofiilid vabastada R-SiO2-TPZ NP-d, mille kasvajarakud ületavad. Seejärel reageerivad nano-eelravimid hüpoksilise kasvaja mikrokeskkonnale ja tapavad tõhusalt kasvajarakke. TEOS-tetraetüülortosilikaat, BTES-bis[3-(trietoksüsilüül)propüül]tetrasulfiid, TPZ tirapasamiin, BTZ-bensotriasinüül.

CAR-neutrofiilid säilitasid immunosupressiivses kasvaja mikrokeskkonnas parema kasvajavastase toime

Sarnaselt makrofaagidele leiti immunosupressiivses kasvaja mikrokeskkonnas kasvajaga seotud neutrofiilide kasvajavastaseid N1 ja kasvajaeelseid N2 fenotüüpe17. Kasvajaeelsed N2 neutrofiilid mängivad olulist rolli kasvaja angiogeneesis, metastaasides ja immunosupressioonis, kuid selle rakutüübi terapeutiline sihtimine on olnud keeruline.

Süsteemse ammendumise strateegia asemel hindasime siin CAR-tehnoloogia potentsiaali neutrofiilide kasvajavastase fenotüübi säilitamisel. CAR hPSC-st pärinevaid ja PB neutrofiile töödeldi hüpoksiaga (3% O2) ja TGF-ga, mis aitavad kaasa kasvaja mikrokeskkonna immunosupressioonile37, 38, et hinnata nende püsivat kasvajat tapvat aktiivsust. Kui PB neutrofiilidel oli immunosupressiivsetes tingimustes märkimisväärselt vähenenud tsütolüüs GBM-rakkude vastu, siis CAR-neutrofiilid säilitasid suure kasvajat tapava toime (täiendav joonis 4a). Sarnased tähelepanekud tehti ka immunosupressiivsetes ja normaalsetes tingimustes PB- või CAR-neutrofiilide TNF-i vabanemise ja ROS-i tekke kohta (täiendav joonis 4b, c). Neutrofiilide fenotüübi edasiseks kinnitamiseks hüpoksilistes ja TGF-i tingimustes mõõtsime N1--spetsiifilise iNOS-i ja N2- N2--spetsiifilise arginaasi ekspressiooni isoleeritud neutrofiilidel voolutsütomeetria abil (täiendav joonis 1). 4d–f). Võrreldes normoksiaga vähendasid immunosupressiivne hüpoksia ja TGF märkimisväärselt iNOS-i ekspressioonitasemeid ja suurendasid arginaasi taset PB-neutrofiilides, samas kui CAR-neutrofiilid säilitasid iNOS-i kõrge ekspressioonitaseme. Varasemad uuringud näitavad, et Syk-Erki signaaliraja aktiveerimine viib ROS-i tootmiseni 39–42. Seetõttu tuvastasime ja võrdlesime Syk-Erki aktivatsiooni modifitseerimata neutrofiilides ja CAR-neutrofiilides ning meie tulemused näitasid Syk-Erki raja oluliselt suuremat aktivatsiooni hüpoksia all olevates CAR-neutrofiilides (täiendav joonis 5a–d), mis võib püsida. CAR-neutrofiilide muutumatu ROS tootmine hüpoksia all. Kokkuvõttes säilitasid CAR-neutrofiilid kasvajavastase fenotüübi ja säilitasid kõrge kasvajavastase toime kasvaja mikrokeskkonda jäljendavates tingimustes in vitro, tõstes esile nende potentsiaali sihipärases immunoteraapias.

Fig. 2 | Screening neutrophil-specific chimeric antigen receptor (CAR) structures with enhanced neutrophil-mediated anti-tumor activities. a Schematic of various CAR structures. b Schematic of CAR #1 construct and targeted knock-in strategy at the AAVS1 safe harbor locus of human pluripotent stem cells (hPSCs). The vertical arrow indicates the AAVS1 targeting sgRNA. Red and blue horizontal arrows indicate primers for assaying targeting efficiency and homozygosity, respectively. HDR: homologous recombination repair. c Schematic of optimized neutrophil differentiation from hPSCs under chemically defined conditions. d Cytotoxicity assays against U87MG glioblastoma cells were performed at different ratios of neutrophil-to-tumor target using indicated neutrophils. Data are represented as mean ± SD of five independent biological replicates, two-tailed Student's t-test. Reactive oxygen species (ROS) generation (e) and ELISA analysis of TNFα release (f) from different neutrophils after coculturing with U87MG cells were determined. n = 5 biologically independent samples. The data are represented as mean ± SD, two-tailed Student's t-test. Source data are provided as a Source Data file.


Joonis 2|Tugevdatud neutrofiilide poolt vahendatud kasvajavastase toimega neutrofiilide spetsiifiliste kimäärsete antigeeniretseptorite (CAR) struktuuride sõelumine. CAR erinevate struktuuride skeem. b CAR #1 konstruktsiooni skeem ja sihitud sisselülitamise strateegia inimese pluripotentsete tüvirakkude (hPSC) AAVS1 ohutu sadama lookuses. Vertikaalne nool näitab sgRNA-d sihtivat AAVS1-d. Punased ja sinised horisontaalsed nooled tähistavad praimereid sihtimise efektiivsuse ja homosügootsuse testimiseks. HDR: homoloogse rekombinatsiooni parandamine. c Skeem neutrofiilide optimeeritud diferentseerumisest hPSC-dest keemiliselt määratletud tingimustes. d Tsütotoksilisuse testid U87MG glioblastoomirakkude suhtes viidi läbi neutrofiilide ja kasvaja sihtmärgi erinevatel suhetel, kasutades näidatud neutrofiile. Andmed on esitatud viie sõltumatu bioloogilise korduse keskmisena ± SD, kahepoolse Studenti t-testiga. Määrati reaktiivsete hapnikuliikide (ROS) genereerimine (e) ja TNF vabanemise ELISA analüüs (f) erinevatest neutrofiilidest pärast U87MG rakkudega kultiveerimist. n=5 bioloogiliselt sõltumatut proovi. Andmed on esitatud keskmisena ± SD, kahepoolse Studenti t-testiga. Lähteandmed esitatakse lähteandmete failina.

Tirapasamiini (TPZ) sisaldavate SiO2 nanoosakestega laetud hPSC CAR-neutrofiilide valmistamine ja iseloomustamine

PB neutrofiile on kasutatud rakuliste kandjatena pildistamis- ja terapeutiliste ravimite manustamiseks ajukasvajatesse 8–10, kuigi neutrofiilide sihipärane infiltratsioon nõuab kirurgilist või valgusest põhjustatud põletikku ja ravimi sihtmärgiväline kohaletoimetamine võib tekitada muret11. CAR-neutrofiilide kasvajavastase toime edasiseks parandamiseks valmistasime krobelise või sileda pinnaga ränidioksiidi nanoosakesed (SiO 2- NP), et laadida neutrofiilidesse kemoterapeutilisi või kiiritusravimeid. Transmissioonelektronmikroskoobi (TEM) kujutised näitasid, et mõlemad SiO2 nanoosakesed olid hästi hajutatud ja neil oli ühtlase suurusega sfääriline morfoloogia (joonis 3a, täiendav joonis 6a). Koostise jaotuse analüüs skaneeriva TEM-i (STEM) ja energia hajutatud röntgenspektroskoopia (EDS) abil näitas, et väävli (S) element oli ühtlaselt jaotunud tervetes töötlemata SiO2 nanoosakestes (R-SiO2) (joonis 3b). Lämmastiku (N2) adsorptsiooni-desorptsiooni isoterme ja vastavat pooride suuruse jaotuse analüüsi kasutades mõõdeti R- ja SSiO2 NP-de pooride suuruseks vastavalt 25 nm ja 35 nm (joonis 3c, täiendav joonis 6b). Arvestades suurt pindala ja suurt pooride suurust, saab terapeutilisi ravimeid tõhusalt laadida nii R- kui ka S-SiO2 NP-desse, nagu näiteks hüpoksiale reageeriv eelravim tirapasamiin (TPZ) (joonis 3d, täiendav joonis 6c) . Pärast TPZ laadimist ei täheldatud olulisi muutusi R-SiO 2- TPZ hajuvuses, morfoloogias ja suuruses, kasutades TEM-i ja dünaamilist valguse hajumise analüüsi (täiendav joonis 6d, e). R-SiO2 NP-desse lisatud tetrasulfiidsidemed on tundlikud redutseerivate keskkondade suhtes ja kasvajarakkudes sisalduva suure koguse glutatiooni (GSH) toimel võivad need kiiresti laguneda43. Järgmisena määrasime R-SiO2-TPZ NP-de GSH-le reageeriva lagunemise 10 mM, 1 mM ja 10 μM GSH juuresolekul, mis olid samad, mis vähirakkude, normaalsete rakkude ja rakuvälise keskkonna rakusisesed tingimused43. 10 mM GSH-ga töötlemisel hävis R-SiO2-TPZ NP-de esialgne sfääriline struktuur 24 tunni pärast tõsiselt (täiendav joonis 6f, g). Nanoosakesed lagunesid 48 tunni pärast täielikult väikesteks prahtideks, mille tulemuseks oli TPZ vabanemine GSH-le reageerival viisil (joonis 3e). R-SiO2 NP-de praht ei põhjustanud in vitro testitud rakkudele olulist tsütotoksilisust (täiendav joonis 6h), mis näitab R-SiO2 NP-de suhtelist ohutust.

Desert ginseng—Improve immunity (2)

cistanche tubulosa - parandab immuunsüsteemi

Cistanche Enhance Immunity toodete vaatamiseks klõpsake siin

【Küsi lisa】 E-post:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Järgmisena hindasime SiO2-TPZ NP-de kasutamise teostatavust terapeutiliste ravimite laadimiseks CAR-neutrofiilidesse kombineeritud kemoimmunoteraapiana, et saavutada suurem terapeutiline efektiivsus. Pärast tsentrifuugimist mõõtsime fluorestsentsmikroskoobi ja voolutsütomeetria analüüsi abil SiO2-TPZ NP-de rakkude omastamist neutrofiilide poolt (joonis 3f, g) ning tuvastasime R-SiO2-TPZ NP-de märkimisväärsema omastamise rakkudes kui S-SiO2- TPZ NP-d neutrofiilide poolt. Raku Si sisaldus neutrofiilides mõõdeti vastavalt 11,3 ja 19,1 ng Si/ug valku sileda ja töötlemata SiO2 NPs@TPZ (joonis 3h) induktiivsidestatud plasma massispektromeetria (ICP-MS) abil. Arvestades nende suurt laadimisvõimet neutrofiilides, kasutati järgnevates katsetes R-SiO2 – TPZ NP-sid. Seejärel püüdsime pärast R-SiO2 – TPZ NP-de laadimist testida CAR neutrofiilide füsioloogilisi funktsioone. CAR-neutrofiilide rakkude elujõulisuses (joonis 3i, täiendav joonis 6i), transwelli migratsioonivõimes (joonis 3j), kemotaksis ja vastavas kiiruses (joonis 3k, l) ei täheldatud muutusi enne või pärast R-SiO2 laadimist. -TPZ NP-d, mis näitavad nende suurt biosobivust. Viidi läbi ka ajast sõltuv nanoravimite laadimise analüüs ja maksimaalne laadimissisaldus saavutati 1 tund pärast raku-NP inkubeerimist (täiendav joonis 7a). Rohkem kui 95% CAR-neutrofiilidest laaditi edukalt R-SiO2-TPZ NP-dega (täiendav joonis 7b). Põletikulise molekuli stimuleerimisel adhesiooni ja migratsioonifunktsiooni vahendava neutrofiilide pinnavalgu CD11b ekspressioonitase ei muutunud CAR-neutrofiilidel koos R-SiO2-TPZ laadimisega või ilma (täiendav joonis 7c, d). Aktiivsetest neutrofiilidest vabanevad superoksiid või reaktiivsed hapniku liigid (ROS), et tappa mikroobid ja kasvajarakud44. Ootuspäraselt suurenes ROS-i teke CAR-neutrofiilide poolt märkimisväärselt pärast ravi N-Formüülmetioniin-leutsüül-fenüülalaniiniga (fMLP) ning olulisi erinevusi CAR-neutrofiilide ROS-i tootmises ei täheldatud enne ja pärast R-SiO laadimist2- TPZ (joonis 3m). Kokkuvõttes näitasid meie andmed, et R-SiO2-TPZ-ga laetud CAR-neutrofiilid säilitasid metsiktüüpi neutrofiilide füsioloogilise aktiivsuse ja võisid aktiivselt migreeruda põletikuliste stiimulite suunas, tõstes esile nende potentsiaali sihipärases vähi kemoimmunoteraapias.

R-SiO2-TPZ nanoosakestega laetud CAR-neutrofiilid tapavad tõhusalt glioblastoomirakke

Järgmisena hindasime R-SiO2-TPZ mõju CAR-neutrofiilide kasvajat tapavale võimele. Intiimne efektori ja sihtmärgi interaktsioon oli neutrofiilide poolt vahendatud tsütolüüsi eeltingimus. Ootuspäraselt moodustas CAR-neutrofils@R-SiO2-TPZ 2 tunni jooksul kasvajarakkudega immuunsünapsid ja nende efektor-sihtmärgi interaktsioonide arv oli sarnane ravimivabade CAR-neutrofiilidega (joonis 4a, täiendav joonis 8). . Nimelt ei leitud jälgitavaid koostoimeid CAR-neutrofils@RSiO2-TPZ ja mittevähiliste somaatiliste rakkude vahel (täiendav joonis 8), mis toob esile CLTX-CAR spetsiifilisuse ajukasvajate vastu. Lisaks vabanesid R-SiO2-TPZ NP-d neutrofiilidest söötmesse (täiendav joonis 9a, b) 12 tundi pärast kooskultuuri ja sisenesid ülejäänud kasvajarakkudesse (joonis 4a). 24 tundi pärast SiO2-TPZ NP-ga laetud CAR-neutrofiilide koosinkubeerimist kasvajarakkudega sisaldas kuni 95% kasvajarakkudest R-SiO2-TPZ NP-sid (joonis 4a, täiendav joonis 9c), mis näitab edukat tulemust. transpordikaskaad, mis hõlmab kandjaneutrofiile, mis avaldavad oma efektorrakkude funktsiooni ja läbivad apoptoosi, vabastades seeläbi passiivselt R-SiO2 – TPZ NP-d sihtkasvajarakkudesse45. Samuti kinnitasime eelravimi TPZ hüpoksilist reageerimisvõimet ja tsütotoksilisust kasvajarakkudes TPZ-st genereeritud radikaalide elektronparamagnetilise resonantsi (EPR) spektroskoopia analüüsiga (täiendav joonis 9d) ja kasvaja TOPRO-3 voolutsütomeetria analüüsiga. rakud (täiendav joonis 9e) hüpoksia ja normoksia all. R-SiO2-TPZ NP-ga koormatud CAR-neutrofiilide tsütolüüsi määramiseks rakendasime in vitro normoksia-hüpoksia kasvaja taaskäivitamise mudeli (joonis 4b). 24 tundi pärast normoksilist kooskultuuri ilmnes R-SiO2-TPZ NP-dega või mitte samasugust kasvajavastast tsütotoksilisust CAR-neutrofiilidel (joonis 4c) ja mõlemad olid kõrgemad kui R-ga koormatud PB-neutrofiilidel. -SiO2-TPZ NP-d või mitte ja R-SiO2- TPZ NP-d üksi. Suurenenud tsütotoksilisus on peamiselt tingitud neutrofiilide suurenenud kasvajale suunatud võimest pärast CAR-i konstrueerimist. Pärast täiendavat 12 ja 24-h hüpoksilist kooskultuuri kasvajarakkudega näitasid R-SiO2-TPZ NP-ga laetud CAR-neutrofiilid teiste rühmadega võrreldes paremat kasvajavastast võimet (joonis 4d, e). Lisaks näitasid R-SiO2-TPZ NP-dega laetud CAR-neutrofiilid suurepärast tsütolüüsi uuesti külvatud värskete kasvajarakkude vastu (joonis 4f), mis näitab vabanenud R-SiO2-TPZ kasvajavastast võimet. nanoosakesed pärast neutrofiilide apoptoosi.

Seejärel teostasime kasvajarakkudel RNA sekveneerimise (RNA-seq) analüüsi, et selgitada välja võimalik molekulaarne mehhanism, mis on CAR ekspressiooni ja R-SiO2-TPZ NP-de poolt tugevdatud neutrofiilide kasvajavastase tsütolüüsi aluseks. Geeniekspressiooni analüüs näitas, et võrreldes kontroll- ja R-SiO2-TPZ NP-dega vähendasid R-SiO2-TPZ NP-dega või ilma nendeta CAR-neutrofiilid oluliselt tsütoplasma ja membraanigeenide ekspressiooni kasvajarakkudes ( Täiendav joonis 10a, joonis 4g), mis toetavad veelgi nende kasvajarakkude fagotsütoosi kokultuuri ajal. Kui kõik katserühmad suurendasid kasvajarakkudes rakulist oksüdatiivset stressi, siis R-SiO2-TPZ-ga koormatud CAR-neutrofiilid edestasid teisi rühmi oksüdatiivse stressi signaaliülekande vallandamiseks. Lisaks soodustasid R-SiO2-TPZ-ga laetud CAR-neutrofiilid märkimisväärselt apoptoosi ja vähendasid kasvajarakkude proliferatsiooni. R-SiO2-TPZ-ga laetud CAR-neutrofiilide suurenenud kasvajavastase toime paremaks mõistmiseks kasutasime fagotsütoosi inhibiitorit tsütokalasiin D ja reaktiivse hapniku liigi (ROS) püüdjat N-atsetüültsüsteiini (NAC) ja ROS inhibiitor GSK2795039 kasvaja-neutrofiilide kokultuurile. Kasvajarakkude tsütolüüs CAR-neutrofiilide poolt vähenes oluliselt 5 µM tsütokalasiin D, 5 mM NAC ja 100 nM GSK2795039 (täiendav joonis 10b, c), mis näitab fagotsütoosi ja ROS-i silmapaistvat rolli CAR-i vahendatud kasvajarakkudes. tapmine. Ülejäänud 40%-50% kasvajarakkude lüüs neutrofiilide ja NAC või GSK2795039 juuresolekul näitab ROS-sõltumatu mehhanismi osalust neutrofiilide poolt vahendatud kasvaja tapmises, mis väärib edasist uurimist.

Fig. 3 | Preparation and characterization of hPSC CAR-neutrophils loaded with tirapazamine (TPZ)-containing SiO2 nanoparticles. a–e Transmission electron microscope (TEM) (a) and energy dispersive spectroscopy (EDS) elemental mapping images (b) of rough SiO2 nanoparticles are shown. c Nitrogen adsorption-desorption isotherm of rough SiO2 nanoparticles along with Barrett-JoynerHalenda (BJH) pore size distribution plot is shown. Biological triplicates were performed independently. TPZ loading content in SiO2 nanoparticles (d) and glutathione (GSH)--responsive TPZ release (e) were measured at the indicated time. n = 3 biologically independent samples. One-way analysis of variance (ANOVA) for (e). Fluorescence images (f) and flow cytometry analysis (g) of neutrophils loaded with smooth and rough SiO2-TPZ. Biological triplicates were performed independently. h Cellular SiO2 content in hPSC-derived CAR-neutrophils was measured. n = 5 biologically independent samples, two-tailed Student's t-test. Cellular viability (i), n = 3 biologically independent samples, transmigration (j), n = 5 biologically independent samples, chemoattraction abilities (k, l), n = 20 biologically independent samples, and ROS generation ability (m) of hPSC-derived CAR-neutrophils loaded with or without rough SiO2-TPZ were shown, n = 5 biologically independent samples, two-tailed Student's t-test. PMA: phorbol myristate acetate. All data in this figure are represented as mean ± SD. Source data are provided as a Source Data file.


Joonis 3|Tirapasamiini (TPZ) sisaldavate SiO2 nanoosakestega laetud hPSC CAR-neutrofiilide valmistamine ja iseloomustamine. a–e Näidatud on töötlemata SiO2 nanoosakeste ülekandeelektronmikroskoobi (TEM) (a) ja energia hajutava spektroskoopia (EDS) elementide kaardistamise kujutised (b). c Kuvatakse töötlemata SiO2 nanoosakeste lämmastiku adsorptsiooni-desorptsiooni isoterm koos Barrett-JoynerHalenda (BJH) pooride suuruse jaotusgraafikuga. Bioloogilised kolmikproovid viidi läbi iseseisvalt. Näidatud ajal mõõdeti TPZ laadimissisaldus SiO2 nanoosakestes (d) ja glutatiooni (GSH) --tundlik TPZ vabanemine (e). n=3 bioloogiliselt sõltumatut proovi. Ühesuunaline dispersioonanalüüs (ANOVA) punkti e jaoks. Sileda ja kareda SiO2-TPZ-ga koormatud neutrofiilide fluorestsentskujutised (f) ja voolutsütomeetria analüüs (g). Bioloogilised kolmikproovid viidi läbi iseseisvalt. h Mõõdeti raku SiO2 sisaldus hPSC-st saadud CAR-neutrofiilides. n=5 bioloogiliselt sõltumatud proovid, kaheosaline Studenti t-test. Rakkude elujõulisus (i), n=3 bioloogiliselt sõltumatut proovi, transmigratsioon (j), n=5 bioloogiliselt sõltumatut proovi, kemoatraktsioonivõime (k, l), n=20 bioloogiliselt sõltumatut proovi ja Näidati hPSC-st tuletatud CAR-neutrofiilide ROS-i genereerimisvõimet (m), mis olid laetud töötlemata SiO2-TPZ-ga või ilma, n=5 bioloogiliselt sõltumatut proovi, kahepoolse Studenti t-testi. PMA: forbolmüristaatatsetaat. Kõik sellel joonisel olevad andmed on esitatud keskmisena ± SD. Lähteandmed esitatakse lähteandmete failina.

Nanoravimitega laetud CAR-neutrofiilide funktsionaalne hindamine, kasutades biomimeetilisi glioblastoomimudeleid in vitro

R-SiO2-TPZ NP-ga laetud CAR-neutrofiilide aktiivsuse edasiseks hindamiseks rakendasime inimese aju mikrovaskulaarsete endoteelirakkude abil transwell-põhise hematoentsefaalbarjääri (BBB) ​​kasvaja mudeli (joonis 5a, täiendav joonis 1). 11a). Ootuspäraselt näitasid R-SiO2-TPZ NP-ga laetud CAR-neutrofiilid suurepärast transmigratsioonivõimet in vitro BBB mudelis (joonis 5b), tappes tõhusalt sihitud kasvajarakud pärast transmigratsiooni nii normoksilistes kui ka hüpoksilistes tingimustes (joonis 5c). , d) ja vabastades rohkem põletikulisi tsütokiine (joonis 5e), mis võivad meelitada teisi efektorrakke kasvajarakke tapma. Lisaks ei mõjutanud CAR-neutrofiilid oluliselt endoteelirakkude elujõulisust pärast transmigratsiooni (täiendav joonis 11b). R-SiO2-TPZ NP-ga laetud CAR-neutrofiilid säilitasid teise transmigratsioonikatse ajal suurepärase transmigratsioonivõime (joonis 5f) ja parema kasvajavastase toime võrreldes teiste rühmadega (joonis 5g). Seejärel kasutati R-SiO2-TPZ NP-ga laetud CAR-neutrofiilide tuumori läbitungimisvõime hindamiseks kolmemõõtmelist (3D) kasvaja sferoidmudelit (joonis 5h). CAR-neutrofiilid migreerusid järk-järgult kasvaja sferoidi keskpunkti suunas ja jaotusid sferoidis ühtlaselt pärast 8-tunnist inkubeerimist (joonis 5i). Täheldati CAR-i neutrofiilide ja R-SiO2-TPZ NP-de suurt kooslokaliseerumist (täiendav joonis 12a–c), mis näitab, et R-SiO2-TPZ NP-d olid CAR-is stabiilselt kapseldatud. -neutrofiilid kasvaja infiltratsiooni ajal enne nende tsütolüüsi. Ilma neutrofiilide poolt vahendatud kohaletoimetamiseta leiti R-SiO2-TPZ NP-sid ainult kasvaja sferoidide väliskihis. Võrreldes R-SiO2-TPZ NP-de ja CAR-neutrofiilidega, näitasid R-SiO2-TPZ NP-ga laetud CAR-neutrofiilid 3D-kasvaja mudelis paremat kasvajavastast tsütolüüsi (joonis 5j). CAR-neutrofiilid@R-SiO2 NP-sid saab kasutada ka teiste ravimite, sealhulgas kliinilise temosolomiidi (TMZ) ja JNJ{55}} viimiseks 3D-kasvaja mudelitesse ja tõhusalt GBM-rakkude tapmiseks (täiendav joonis 12d–f). Kokkuvõttes näitasid kombineeritud CAR-neutrofiilid ja nanoravimid suurepärast kasvajavastast toimet biomimeetilistes kasvajate mikrokeskkonnas, mis jäljendasid in vitro tingimusi, tuues esile kombineeritud neutrofiilidel põhineva kemoimmunoteraapia terapeutilise potentsiaali.

Desert ginseng—Improve immunity (9)

cistanche tubulosa - parandab immuunsüsteemi

CAR neutrofiilide poolt manustatud R-SiO2-TPZ nanoosakeste jaotus in vivo

In addition to improving the direct tumor-killing ability, we hypothesize that CAR engineering of hPSC-neutrophils will significantly enhance their targeted delivery of therapeutic drugs without additional surgery- or light-induced inflammation11. To test this hypothesis, we employed a mouse xenograft model of glioblastoma and an in vivo imaging system to determine the trafficking and biodistribution of R-SiO2-TPZ NP-loaded CAR-neutrophils. We fluorescently labeled SiO2 NPs with a near-infrared dye Cyanine 5 (Cy5) and then performed fluorescence imaging 3 h and 24 h after systemic administration (Fig. 6a). Three hours after intravenous injection, R-SiO2-TPZ NPs traveled to the whole body of tumor-bearing mice and emitted strong fluorescence with or without neutrophil-mediated delivery (Fig. 6b). CAR-neutrophil-delivered R-SiO2-TPZ NPs accumulated in the brain tumor site within 24 h, whereas free R-SiO2-TPZ NPs were still evenly distributed across the whole body (Fig. 6b). To further quantify the biodistribution of R-SiO2-TPZ NPs in various organs, inductively coupled plasma-optical emission spectrometry (ICP-OES) analysis of Si content was performed on the harvested organs 24 h post-injection. CAR neutrophil-delivered R-SiO2-TPZ NPs were significantly enriched in the mouse brain (Fig. 6c), although a low-level delivery to the liver and spleen was observed. Si content measurement also demonstrated that >20% manustatud nanoravimitest toimetasid ajukasvajatesse CAR-neutrofiilid, võrreldes 1% vabade nanoravimitega, mis on kooskõlas varasemate aruannetega6. R-SiO2-TPZ NP-de sihipärane toimetamine peremeesajusse läbi BBB CAR-neutrofiilide poolt kinnitati ka histoloogilise analüüsiga (joonis 6d). Vastupidi, ainult R-SiO2-TPZ NP-d kogunesid peamiselt maksas ja põrnas. Meie andmed näitasid ühiselt R-SiO2-TPZ NP-de paremat sihipärast kohaletoimetamist CAR neutrofiilide poolt, ilma et oleks vaja tuumori kohas täiendavat põletikku esile kutsuda, rõhutades neutrofiilidel põhineva kemoimmunoteraapia teostatavust ja ohutust vähiravis.

CAR-neutrofiilide ja R-SiO2-TPZ nanoosakeste kombineeritud kemoimmunoteraapial oli suurepärane glioblastoomivastane toime in vivo

R-SiO2-TPZ NP-ga laetud CAR-neutrofiilide terapeutilise efektiivsuse määramiseks loodi NOD.Cg-RAG1tm1MomIL2rgtm1Wjl/SzJ (NRG) hiirtel glioblastoomi in situ ksenotransplantaadi mudel, kasutades lutsiferaasi ekspresseerivaid U87MG rakke. Kasvajat kandvatele hiirtele manustati intravenoosselt 5 × 106 neutrofiili kord nädalas (joonis 7a) ning peremeesorganismide kasvajakoormus mõõdeti ja kvantifitseeriti (joonis 7b, c). Võrreldes PBS-i või PB-neutrofiilidega töödeldud hiirtega aeglustas ravi CAR-neutrofiilide ja CAR-neutrofiilide R-SiO2-TPZ NP-dega tõhusalt kasvaja kasvu. CAR neutrofiilid @R-SiO2 – TPZ NP-d näitasid palju kõrgemat kasvajavastast tsütotoksilisust kui ühelgi teisel katserühmal. Vastupidi, PB-neutrofiilid soodustasid märkimisväärselt tuumori kasvu ajus, mille tulemuseks oli kasvajaga hiirte surm juba 23. päeval (joonis 7d), mis viitab sellele, et konstrueerimata neutrofiilid võivad kujutada endast lisariske. Järgmisena mõõtsime inimese tsütokiini vabanemist erinevate katseliste hiirerühmade plasmas (joonis 7e). Kõik mitte-PBS-i katserühmad tootsid 5. kuni 26. päevani plasmas tuvastatavat TNF-i ja IL{28}}, mis viitab inimese neutrofiilide aktiveerumisele kasvaja stimuleerimisel. Kooskõlas täheldatud suurema kasvaja kasvukiirusega vabastasid modifitseerimata neutrofiilid järk-järgult rohkem IL-6 ja TNF-i, mis võib põhjustada patsientidel tsütokiinide vabanemise sündroomi ja nõuda põhjalikumaid ohutusuuringuid IL-6 blokaatoritega46,47 . Nimelt näitasid CAR-neutrofiilid@RSiO2-TPZ NP-d hilisematel ajahetkedel (päev 19 ja 26) vähenenud tsütokiinide tootmisvõimet, mis viitab potentsiaalselt madalale tsütokiini vabanemise sündroomi riskile patsientidel, keda raviti CAR-neutrofiilidel põhineva kemoimmunoteraapiaga. Kombineerivate CAR-neutrofiilide ja R-SiO2-TPZ NP-de biosobivust hinnati iganädalase kehakaalu mõõtmise ja hiirte peamiste organite patoloogiliste muutuste jälgimise teel. CAR-neutrofiilide@R-SiO2-TPZ NP-ga töödeldud hiirte ja teiste katserühmade vahel ei täheldatud erinevusi kehakaalus (joonis 7f), mis näitab minimaalset süsteemset toksilisust ja CAR-neutrofiilide R-SiO2-TPZ NP-de suurepärast biosobivust. 28 päeva ravi. Hiirtelt 30. päeval viilutatud peamiste organite histoloogiline analüüs näitas, et CAR-neutrofiilid@R-SiO2-TPZ NP-ga töödeldud hiired ei põhjustanud südames, maksas, põrnas, kopsus ja neerudes märgatavaid kõrvalekaldeid ega elundikahjustusi (täiendav joonis 1). 13), mis kinnitab veelgi kombineeritud CAR-neutrofiilide ja R-SiO2-TPZ NP-de ohutust.

Fig. 4 | CAR-neutrophils loaded with R-SiO2-TPZ nanoparticles effectively kill glioblastoma cells. Representative images of immunological synapses indicated by polarized F-actin accumulation at the interface between CAR-neutrophils and tumor cells at 6, 12, and 24 h were shown. R-SiO2-TPZ nanoparticles released from CAR-neutrophils upon tumor cell phagocytosis were up-taken by tumor cells. Triplicates were performed independently. b Schematic of neutrophil-mediated anti-tumor cytotoxicity assay. Cytotoxicity against U87MG glioblastoma cells was performed at different ratios of neutrophil-to-tumor target using indicated neutrophils at 24 h (c), 36 h (d), 48 h (e), and 72 h (f). n = 3 biologically independent samples. Data are represented as mean ± SD, one-way analysis of variance (ANOVA). g Bulk RNA sequencing analysis was performed on U87MG cells under various conditions. Heatmap shows expression levels of selected cytoplasm, membrane, oxidative stress, apoptosis, and proliferation-related genes in the indicated glioblastoma cells. n = 2 biologically independent samples. Source data are provided as a Source Data file.

Joonis 4|R-SiO2-TPZ nanoosakestega laetud CAR-neutrofiilid tapavad tõhusalt glioblastoomirakke. Näidati immunoloogiliste sünapside tüüpilisi pilte, mida näitas polariseeritud F-aktiini akumulatsioon CAR-neutrofiilide ja kasvajarakkude vahelisel liidesel 6, 12 ja 24 tunni pärast. Kasvajarakkude fagotsütoosi käigus CAR-neutrofiilidest vabanenud R-SiO2-TPZ nanoosakesed võtsid kasvajarakud endasse. Kolm korda tehti iseseisvalt. b Neutrofiilide vahendatud kasvajavastase tsütotoksilisuse testi skeem. Tsütotoksilisus U87MG glioblastoomi rakkude vastu viidi läbi neutrofiilide ja kasvaja sihtmärgi erinevatel suhetel, kasutades näidatud neutrofiile 24 h (c), 36 h (d), 48 h (e) ja 72 h (f). n=3 bioloogiliselt sõltumatut proovi. Andmed on esitatud kui keskmine ± SD, ühesuunaline dispersioonanalüüs (ANOVA). g RNA hulgijärjestusanalüüs viidi läbi U87MG rakkudega erinevates tingimustes. Heatmap näitab valitud tsütoplasma, membraani, oksüdatiivse stressi, apoptoosi ja proliferatsiooniga seotud geenide ekspressioonitasemeid näidatud glioblastoomirakkudes. n=2 bioloogiliselt sõltumatut proovi. Lähteandmed esitatakse lähteandmete failina.

Fig. 5 | Functional evaluation of CAR-neutrophils loaded with R-SiO2-TPZ nanoparticles using biomimetic glioblastoma (GBM) models in vitro. a Schematic of our in vitro tumor model of GBM with blood-brain-barrier (BBB), which is composed of endothelial cells on the cell insert membrane and tumor cells in the bottom of the same transwell. b Transwell migration analysis of neutrophils at 12 h is shown. Anti-GBM cytotoxicity of indicated neutrophils at 24 h (c) and 36 h (d) was measured and quantified. e ELISA analysis of IL-6 and TNFα released from indicated neutrophils at 36 h was performed. f Second migration of different neutrophils at 48 h is shown. g Anti-GBM cytotoxicity of indicated neutrophils at 60 h was measured and quantified. h–j Schematic of neutrophil-infiltrated three-dimensional (3D) tumor model in vitro was shown in (h). Representative fluorescent images of infiltrated neutrophils in the 3D tumor models were shown. DAPI was used to stain the cell nuclear and CD45 was used to stain neutrophils. Scale bars, 200 μm. Biological triplicates were performed independently. j The corresponding tumor-killing ability of indicated neutrophils was measured and quanti- fied using a cytotoxicity kit. Data are represented as mean ± SD of five independent biological replicates, one-way analysis of variance (ANOVA). Source data are provided as a Source Data file.


Joonis 5|R-SiO2-TPZ nanoosakestega laetud CAR-neutrofiilide funktsionaalne hindamine biomimeetiliste glioblastoomi (GBM) mudelite abil in vitro. skeem meie GBM-i in vitro kasvajamudelist koos vere-aju barjääriga (BBB), mis koosneb endoteelirakkudest raku sisestusmembraanil ja kasvajarakkudest sama transwelli põhjas. b Näidatud on neutrofiilide transwell-migratsioonianalüüs 12 tunni pärast. Mõõdeti ja kvantifitseeriti näidatud neutrofiilide GBM-vastane tsütotoksilisus 24 h (c) ja 36 h (d). Viidi läbi ELISA analüüs näidatud neutrofiilidest 36 tunni pärast vabanenud IL-6 ja TNF kohta. f Näidatakse erinevate neutrofiilide teist migratsiooni 48 tunni pärast. g Näidatud neutrofiilide anti-GBM tsütotoksilisus 60 tunni pärast mõõdeti ja kvantifitseeriti. h – j Neutrofiilidega infiltreeritud kolmemõõtmelise (3D) kasvaja mudeli skeem in vitro on näidatud punktis h. Näidati 3D-kasvaja mudelites infiltreerunud neutrofiilide tüüpilisi fluorestseeruvaid pilte. DAPI-d kasutati raku tuuma värvimiseks ja CD45 kasutati neutrofiilide värvimiseks. Skaalavardad, 200 μm. Bioloogilised kolmikproovid viidi läbi iseseisvalt. j Näidatud neutrofiilide vastavat kasvajat tapavat võimet mõõdeti ja kvantifitseeriti tsütotoksilisuse komplekti abil. Andmed on esitatud viie sõltumatu bioloogilise korduse keskmisena ± SD, ühesuunaline dispersioonanalüüs (ANOVA). Lähteandmed esitatakse lähteandmete failina.

Kui CAR-neutrofil@R-SiO2-TPZ NP-d aeglustasid ksenotransplantaadi hiirtel oluliselt kasvaja kasvu, siis erinevus loomade ellujäämises CAR-neutrofiilide, SiO2-TPZ NP-de ja CAR-neutrofiilide@R-SiO2-TPZ NP-de katserühmades on ebaoluline (p > 0,05), mis on tõenäoliselt tingitud lühiajaliste neutrofiilide surmast rakkude ettevalmistamise ja süstimise ajal. Järgmisena keskendusime nendele kolmele rühmale ja otsustasime, kas rakkude ettevalmistamise aja vähendamine ning CAR-neutrofiilide ja nanoravimite suuremad annused muudaksid loomade ellujäämist (joonis 7g). Süsteemselt 6-kordsel manustamisel ületasid CAR-neutrofiili@R-SiO2-TPZ NP-d ülejäänud kahte rühma kasvajaga hiirte eluea pikendamisel (joonis 7h), samas kui loomade ellujäämise erinevus CAR-neutrofiilide ja SiO2-rühmades TPZ NP-d jäid tähtsusetuks. Kuigi nende kahe sõltumatu loomuuringu vahel täheldati R-SiO2- TPZ rühma sarnast elulemuskõverat, vähenes rakkude isoleerimisel ja süstimiseks ettevalmistamisel kulunud aeg kokku ~4 tunnilt 1 tunnini esimese 4 neutrofiili jooksul. annused parandasid loomade ellujäämist CAR-neutrofiilide rühmas enne 32. päeva. Meie andmed näitasid kollektiivselt neutrofiilide valmistamise ja annuse optimeerimise tähtsust neutrofiilide ravimite tulevastes kliinilistes rakendustes.

Arutelu

Hiire neutrofiilid on tõestatud kui võimsad kandjad, mis võimaldavad tõhusalt toimetada nanoravimid põletikuliste operatsioonijärgsete ajukasvajatega 8, 9. Siiski on inimese neutrofiilide kasutamise teostatavus ja ohutus ravimite kohaletoimetamisel endiselt raskesti mõistetav. Nendes uuringutes terapeutilise kasu saavutamiseks kasutatud hiirte neutrofiilide suur hulk (10 korda suurem kui tsirkuleerivate neutrofiilide koguarv hiirtel11) võib veelgi takistada nende kliinilist translatsiooni, kuna suure hulga neutrofiilide ekstraheerimine vähihaigetelt võib põhjustada neutropeeniat ja poosi. muud riskid. Nende väljakutsete lahendamiseks kasutasime ise uuenevate hPSC-de jõudu piiramatu hulga de novo inimese neutrofiilide saamiseks29. Töötasime välja võimsa bioinspireeritud neutrofiilide vahendatud ravimite kohaletoimetamise süsteemi koos CAR-inseneriga29 ja kasutasime konstrueeritud inimese CAR-neutrofiile silmatorkava kasvajavastase toimega nanokandjana. Karedad SiO2 NP-d toimivad paremini kui siledad SiO NP-d CAR-neutrofiilide kandjate puhul, mis on kooskõlas varasemate tähelepanekutega, et neutrofiilid fagotsüteerivad eelistatavalt töötlemata mikroobseid patogeene30. Teatati, et neutrofiilid soodustavad glioomirakkude proliferatsiooni ja progresseerumist48. Me täheldasime oma loomkatses modifitseerimata neutrofiilide sarnast kasvajaeelset toimet, rõhutades vajadust CCAR-i inseneri või muude neutrofiilide modifikatsioonide järele, et tagada nende ohutus ravimite kohaletoimetamisel ja muudes terapeutilistes rakendustes. Eelkõige sõltub meie CAR-neutrofiilide vahendatud ravimite kohaletoimetamine ainult GBM-i natiivsest kemoatraktiivsest võimest, kuid mitte võimendatud operatsioonijärgsetest põletikulistest signaalidest, mis viitab meie ravimi manustamissüsteemi kõrgele spetsiifilisusele ja terapeutilisele potentsiaalile sügavalt infiltreerunud glioomide likvideerimisel. mida ei saa operatsiooniga eemaldada. Kuna kirurgiline resektsioon ja adjuvantne kemoteraapia/kiiritusravi on GBM12 esmased kliinilised sekkumised, võib kombineeritud ravi CAR-i neutrofiilide nanokandjatega ja kirurgia/kiiritusravi saavutada optimaalse terapeutilise efektiivsuse ja see on edasist uurimist väärt. T- ja NK-rakkudespetsiifilisi CAR-konstrukte on laialdaselt kasutatud T- ja NK-rakkude kasvajavastase toime suurendamiseks, kuid neutrofiilide spetsiifilisi CAR-e, mis parandavad neutrofiilide kasvajavastaseid funktsioone, ei ole kirjeldatud. Varem teatati, et CD4ζ ja CD4 kimäärsed immuunretseptorid suurendavad neutrofiilide tsütolüüsi HIVenv-transfekteeritud rakkude vastu in vitro . Siiski oli lüüsi efektiivsus vaid ~ 10% efektori ja sihtmärgi (E: T) suhtega 10:128. Fc RIIA (CD32a) on madala afiinsusega üheahelaline transmembraanne retseptor monomeerse IgG suhtes, mis ekspresseerub tugevalt neutrofiilides (30,000 kuni 60,000 molekuli raku kohta31) ja selle ligeerimine indutseerib Fc - sõltuvad funktsioonid neutrofiilides, nagu graanulite sisu vabanemine, Ca2+ mobilisatsioon, kasvajavastane tsütotoksilisus ja fagotsütoos49. Arvestades CD32a silmapaistvat rolli neutrofiilide aktiveerimisel ja funktsioneerimisel, kavandasime ja testisime CD32a-põhiseid CAR-konstruktsioone. Kuid meie tulemused näitasid, et CD3ζ vahendab oluliselt paremat tsütolüüsi kui CD32a, kui seda ekspresseeritakse hPSC-st pärinevates neutrofiilides, mis võib osaliselt olla tingitud ITAM-ide kõrgematest koopiatest CD3ζ-s kui CD32a-s: vastavalt kolm ja üks koopia ning kõrgem ekspressioonitase. ζ kui neutrofiilide rakupinnal28. Sarnaselt CD32a-ga on Fc RIII (CD16b) veel üks madala afiinsusega retseptor monomeerse IgG jaoks ja seda ekspresseeritakse palju kõrgemal tasemel kui CD32a neutrofiilidel31. Kuigi CD16b ristsidumine kutsub esile ainult Ca2+ mobilisatsiooni ja degranulatsiooni, kuid mitte fagotsütoosi ja tsütolüüsi neutrofiilides28,50, pakub tulevastes uuringutes siiski huvi CD3ζ- ja CD16b võimete süstemaatiline võrdlus. -CAR-id neutrofiilide kasvajavastaste funktsioonide käivitamisel ja suurendamisel.

imageFig. 6 | In vivo distribution of CAR neutrophil-delivered R-SiO2-TPZ nanoparticles (NPs). a Schematic of intravenously administered Cy5-labeled CAR neutrophil@R-SiO2 NPs and R-SiO2 NPs for in vivo cell tracking study. 5 × 105 luciferase (Luci)-expressing U87MG cells were stereotactically implanted into the right forebrain of NRG mice. After 4 days, mice were intravenously treated with PBS, 5 × 106 Cy5-labeled CAR neutrophil@R-SiO2 NPs and R-SiO2 NPs. b Time-dependent biodistribution of Cy5+ neutrophils in the whole body, brain, and other organs was determined and quantified by fluorescence imaging at the indicated hours. c Biodistribution of CAR neutrophil@R-SiO2 NPs and R-SiO2 NPs in mice at 24 h post-injection was analyzed by inductively coupled plasma-optical emission spectrometry (ICP-OES) based on Si element, and data was expressed as the percentage of injected dose per gram of tissue (%ID/g). n = 5 biologically independent samples. Data are represented as mean ± SD. Source data are provided as a Source Data file. d Representative fluorescence images of CD45 and SiO2 in the indicated glioblastoma xenografts isolated from tumor-bearing mice were shown. Scale bars, 100 μm. Biological triplicates were performed independently.

Joonis 6|CAR-neutrofiilide poolt manustatud R-SiO2-TPZ nanoosakeste (NP-de) in vivo jaotus. intravenoosselt manustatud Cy5-märgistatud CAR neutrofiil@R-SiO2 NP-de ja R-SiO2 NP-de skeem in vivo rakkude jälgimise uuringuks. 5 × 105 lutsiferaasi (Luci) ekspresseerivad U87MG rakud implanteeriti stereotaktiliselt NRG hiirte paremasse eesajusse. 4 päeva pärast raviti hiiri intravenoosselt PBS-iga, 5 × 106 Cy5-märgistatud CAR neutrofiil@R-SiO2 NP-ga ja R-SiO2 NP-ga. b Cy5+ neutrofiilide ajast sõltuv biojaotumine kogu kehas, ajus ja teistes organites määrati ja kvantifitseeriti fluorestsentskujutise abil näidatud tundidel. c CAR neutrofiilide@R-SiO2 NP-de ja R-SiO2 NP-de bioloogilist jaotumist hiirtel 24 tundi pärast süstimist analüüsiti induktiivselt seotud plasma-optilise emissioonispektromeetria (ICP-OES) abil, mis põhines Si elemendil, ja andmed väljendati protsentides. süstitud annusest koe grammi kohta (%ID/g). n=5 bioloogiliselt sõltumatut proovi. Andmed on esitatud kui keskmine ± SD. Lähteandmed esitatakse lähteandmete failina. d Näidati CD45 ja SiO2 tüüpilisi fluorestsentspilte kasvajaga hiirtelt eraldatud glioblastoomi ksenotransplantaatides. Skaalavardad, 100 μm. Bioloogilised kolmikproovid viidi läbi iseseisvalt.

Fig. 7 | In vivo anti-tumor activities of combinatory CAR-neutrophils and R-SiO2-TPZ nanoparticles (NPs) were assessed via intravenous injection. a Schematic of intravenously administered PBS, PB-neutrophils, CAR-neutrophils, and CAR-neutrophil@ R-SiO2-TPZ NPs for in vivo tumor-killing study. 5 × 105 luciferase (Luci)-expressing U87MG cells were stereotactically implanted into the right forebrain of NRG mice. After 4 days, mice were intravenously treated with indicated neutrophils weekly for a month. Time-dependent tumor burden was determined (b) and quantified (c) by bioluminescent imaging (BLI) at the indicated days. Data are mean ± SD for mice in (b) (n = 5), one-way analysis of variance (ANOVA). d Kaplan-Meier curve demonstrating survival of indicated experimental groups (n = 5) was shown. Released human tumor necrosis factor-α (TNFα) and IL-6 in the peripheral blood (e) and body weight (f) of different mouse groups were measured at the indicated days. Data are mean ± SD, n = 5 biologically independent samples. g, h Anti-tumor activity of increased dosage frequencies of CAR-neutrophils and RSiO2-TPZ NPs was assessed. g Schematic of intravenously administered CAR-neutrophils, R-SiO2-TPZ NPs, and CAR-neutrophil@ R-SiO2-TPZ NPs for in vivo tumor killing study. h Kaplan-Meier curve demonstrating survival of indicated experimental groups was shown (n = 5). Kaplan–Meier curves were analyzed by the log-rank test. Source data are provided as a Source Data file.


Joonis 7|Kombinatiivsete CAR-neutrofiilide ja R-SiO2-TPZ nanoosakeste (NP) kasvajavastast toimet in vivo hinnati intravenoosse süstimise teel. Skeem intravenoosselt manustatud PBS-i, PB-neutrofiilide, CAR-neutrofiilide ja CAR-neutrofiilide@R-SiO2-TPZ NP-de kohta in vivo kasvaja tapmise uuringu jaoks. 5 × 105 lutsiferaasi (Luci) ekspresseerivad U87MG rakud implanteeriti stereotaktiliselt NRG hiirte paremasse eesajusse. 4 päeva pärast raviti hiiri intravenoosselt näidustatud neutrofiilidega iga nädal ühe kuu jooksul. Ajast sõltuv kasvajakoormus määrati (b) ja kvantifitseeriti (c) bioluminestsentskujutise (BLI) abil näidatud päevadel. Andmed on keskmised ± SD hiirte kohta punktis b (n=5), ühesuunaline dispersioonanalüüs (ANOVA). d Näidati Kaplan-Meieri kõverat, mis näitab näidatud katserühmade (n=5) ellujäämist. Inimese tuumori nekroosifaktori (TNF ) ja IL-6 vabanemist perifeerses veres (e) ja kehamassi (f) mõõdeti erinevatel hiirerühmadel näidatud päevadel. Andmed on keskmised ± SD, n=5 bioloogiliselt sõltumatut proovi. g, h Hinnati CAR-neutrofiilide ja RSiO2-TPZ NP-de suurenenud annustamissageduste kasvajavastast toimet. g Intravenoosselt manustatud CAR-neutrofiilide, R-SiO2-TPZ NP-de ja CAR-neutrofiil@R-SiO2-TPZ NP-de skeem in vivo kasvaja tapmise uuringuks. h Näidati Kaplan-Meieri kõverat, mis näitab näidatud katserühmade ellujäämist (n=5). Kaplan-Meieri kõveraid analüüsiti log-rank testiga. Lähteandmed esitatakse lähteandmete failina.

Samuti esitlesime siin modulaarset ja mitmekülgset hPSC neutrofiilide ravimite kohaletoimetamise platvormi, mida võidakse tulevikus ümber kujundada ja häälestada, et toetada teisi neutrofiilidel põhinevaid jõupingutusi teiste inimeste haiguste raviks. Esiteks on CAR-tehnoloogia hPSC-des juurdepääsetavam kui primaarsetes immuun-T-rakkudes ja neutrofiilides. Erinevate CAR-de stabiilse ja homogeense ekspressiooni saavutamiseks on vaja ainult ühekordset genoomi redigeerimist29. Lisaks CLTX CAR-idele konstrueerisime ka stabiilsed hPSC-liinid, mis ekspresseerivad universaalset anti-fluorestseiini (FITC)51 või anti-PD-L1 CAR52, mida mõlemat saab kasutada universaalsete tahke kasvajale suunatud nanokandja CAR-neutrofiilide saamiseks. Neutrofiilide nanokandjate suunamiseks surmaga lõppevate degeneratiivsete haiguste, sealhulgas ajutrauma ja südamefibroosi raviks, saab läbi viia ka muid geneetilisi modifikatsioone, näiteks fibroosi, mis on suunatud anti-FAP CAR-idele53. Lisaks saab CAR-d ekspresseerivaid hPSC-sid kergesti kohandada CAR-T või CAR-NK rakkude tootmiseks29 ning nende immunoteraapiate kombinatsioonid CAR-neutrofiilide nanokandjatega võivad saavutada optimaalse terapeutilise kasvajavastase kasu. Lõpuks on meie bioinspireeritud tuumori glutatioonile (GSH) reageeriv nanoravimite süsteem modulaarne ja mitmekülgne platvorm paljutõotavate kemoterapeutiliste või radioaktiivsete ravimite laadimiseks CAR-neutrofiilidesse ravimite sihipäraseks kohaletoimetamiseks, nagu näiteks kliiniline TMZ, JNJ64619187 ja pro-ravimi TPZ. Tulevased uuringud teiste nanoosakeste testimise kohta võivad anda optimeeritud ravimite koormuse neutrofiilides ja saavutada maksimaalse in vivo terapeutilise efektiivsuse.

Kuigi oleme näidanud CAR-neutrofiilide kasutamise terapeutilist kontseptsiooni kemoravimite spetsiifiliseks ja tõhusaks manustamiseks ajukasvajatesse kogu BBB-s, on selles uuringus mõned piirangud. Esiteks ei pruugi 4-päevasest kasvajarakkude inokuleerimisest piisata kasvajate tuvastamiseks, mis jäljendavad terapeutilise uurimise kliinilist stsenaariumi, ning edaspidine töö erinevate kasvajate inokulatsiooniperioodidega on vajalik, et kokku võtta glioblastoomi arengu ja ravivastuse erinevad etapid erinevates riikides. patsiente 54,55. Teiseks, siin kasutatud immuunpuudulikkusega hiirtel puudub adaptiivne immuunsus ja in vitro toodetud CAR-neutrofiilide ohutuse ja efektiivsuse paremaks hindamiseks on vaja muid terve immuunsüsteemiga prekliinilisi mudeleid, nagu spontaanse glioomiga lemmikloomad56. Vaatamata lühikesele elueale on vaja eelkõige CAR-neutrofiilide sihtmärgivälise toksilisuse profiilide koostamist infundeeritud loomadel koos nanoravimite laadimisega või ilma, sealhulgas tsütokiinide vabanemise sündroom, neurotoksilisus ja CAR-T rakkudes57 täheldatud kasvajaväline toksilisus. neutrofiilidest. Kuigi teostatavad lähenemisviisid, nagu hüpoimmunogeensete universaalsete doonor-hPSC-de konstrueerimine58–61 ja inimese leukotsüütide antigeeni (HLA) homosügootsete hPSC raamatukogude loomine62, on võimaliku transplantaat-peremeeshaiguse (GvHD) riski vältimiseks hõlpsasti kättesaadavad, on prekliinilised loommudelid meie neutrofiilide ravimite translatsioonipotentsiaali hindamiseks on endiselt vaja puutumata immuunsüsteemi. Lõpuks täheldati CAR-neutrofiilide nanoravimite piiratud kasvajavastast tsütotoksilisust ja loomade eluea pikenemist. Seetõttu on CAR-neutrofiilide ravimite maksimaalse kasvajavastase efektiivsuse saavutamiseks oluline tulevikus tõhusamate keemiaravi ravimite või radiosensibilisaatorite ning kombineeritud ravimeetodite uurimine klassikalise CAR-T ja kirurgilise resektsiooniga. Näiteks hiljutine mehhanismipõhise disaini uuring on viinud tõhusama ravimini KL-50, mis ületab omandatud resistentsuse, nagu täheldati kliinilises TMZ ravimis63 ja mida saab seega lisada meie modulaarsesse CAR-neutrofiilide nanoravimite platvormi potentsiaalselt parem terapeutiline efektiivsus. Neutrofiilide säilivusaja pikendamine 5 päevani CLON-G (kaspaaside-lüsosomaalse membraani permeabiliseerimise-oksüdant-nekroptoosi inhibeerimine pluss granulotsüütide kolooniaid stimuleeriv faktor64) ravi ja/või pikemaajalise kontrollitud ravimi vabanemise süsteemi kasutamine CAR-neutrofiilides võib samuti olla võimalik. saavutada püsiv in vivo kasvajavastane efektiivsus pärast neutrofiilide apoptoosi. Kokkuvõttes näitasid meie leiud selgelt, et R-SiO2-TPZ-ga koormatud CAR-neutrofiilid võivad säilitada kasvajavastast N1 fenotüüpi ja tõhusalt tappa kasvajarakke erinevates kasvaja nišilaadsetes tingimustes in vitro. Funktsionaalseid CAR-neutrofiile saab toota ka suurtes kogustes konstrueeritud hPSC-dest, et viia kasvaja mikrokeskkonnale reageerivad nanoravimid täpselt GBM-i sihtmärgiks in vivo, mille tulemuseks on kombineeritud kemoimmunoteraapia, millel on tugev ja spetsiifiline GBM-vastane toime ja minimaalne sihtmärgist väljapoole suunatud ravimite kohaletoimetamine. pikenenud eluiga kasvajaga hiirtel.

Viited

1. Yang F. et al. Glioblastoomi sünergistlik immunoteraapia IL-6 ja CD40 kahekordse sihtimisega. Nat. Commun. 12, 3424 https://doi.org/ 10.1038/s41467-021-23832-3 (2021).

2. Lim, M., Xia, Y., Bettegowda, C. & Weller, M. Glioblastoomi immunoteraapia praegune seis. Nat. Rev. Clin. Oncol. 15, 422–442 (2018).

3. Agliardi, G. et al. Intratumoraalne IL-12 manustamine võimaldab CAR-T-rakkude immunoteraapiat glioblastoomi prekliinilises mudelis. Nat. Commun. https://doi.org/10.1038/s41467-020-20599-x (2021).

4. Németh, T., Sperandio, M. & Mócsai, A. Neutrophils as emerging therapy targets. Nat. Rev. Drug Discov. https://doi.org/10.1038/ s41573-019-0054-z (2020).

5. Subhan, MA & Torchilin, VP Neutrofiilid kui tärkav terapeutiline sihtmärk ja vahend vähiravis. Life Sci. https://doi.org/ 10.1016/j.lfs.2021.119952 (2021).

6. Cheng, YH, He, C., Riviere, JE, Monteiro-Riviere, NA & Lin, Z. Meta-analüüs nanoosakeste kohaletoimetamisest kasvajatesse, kasutades füsioloogiliselt põhinevat farmakokineetilise modelleerimise ja simulatsiooni lähenemisviisi. ACS Nano 14, 3075–3095 (2020).

7. Wilhelm, S. et al. Nanoosakeste kasvajatesse kohaletoimetamise analüüs. Nat. Rev. Mater. 1, 1–12 (2016).

8. Xue, J. et al. Neutrofiilide vahendatud vähivastaste ravimite manustamine operatsioonijärgse pahaloomulise glioomi kordumise pärssimiseks. Nat. Nanotehnoloogia. 12, 692–700 (2017).

9. Wu, M. et al. Põletikuga aktiveeritavate konstrueeritud neutrofiilide MR-pildi jälgimine kirurgiliselt ravitud glioomi sihipäraseks raviks. Nat. Commun. 9, 1–13 (2018).

10. Chu, D., Dong, X., Zhao, Q., Gu, J. & Wang, Z. Tuumori mikrokeskkondade fotosensibiliseerimine parandab nanoterapeutiliste ainete kohaletoimetamist neutrofiilide infiltratsiooni kaudu. Adv. Mater. 29 (2017).

11. Osuka, S. & Van Meir, EG Cancer therapy: Neutrophils traffic in cancer nanodrugs. Nat. Nanotehnoloogia. 12, 616–618 (2017).

12. Lin, YJ, Wei, KC, Chen, PY, Lim, M. & Hwang, TL Neutrofiilide rollid glioomides ja aju metastaasides. Esiosa. Immunol. https://doi.org/10.3389/fimmu.2021.701383 (2021).

13. Fridlender, Z. et al. Kasvajaga seotud neutrofiilide fenotüübi polariseerimine TGF-beeta poolt: "N1" versus "N2" TAN. Vähirakk (2009).

14. Blaisdell, A. et al. Neutrofiilid seisavad vastu emaka epiteeli kantserogeneesile hüpoksiliste kasvajarakkude eemaldamise kaudu. Cancer Cell 28, 785–799 (2015).

15. Mahiddine, K. et al. Kasvaja hüpoksia leevendamine vabastab neutrofiilide kasvajavastase potentsiaali. J. Clin. Invest 130, 389–403 (2020).

16. Yan, J. et al. Inimese polümorfonukleaarsed neutrofiilid tunnevad spetsiifiliselt ära ja tapavad vähirakke. Oncoimmunology 3, e950163 (2014).

17. Jaillon, S. et al. Neutrofiilide mitmekesisus ja plastilisus kasvaja progresseerumisel ja ravis. Nat. Rev. Cancer 20, 485–503 (2020).

18. Li X. et al. Glioomi tüvirakkude uurimise edusammud glioomi immuunmikrokeskkonnas. Esiosa. Pharmacol. https://doi.org/10. 3389/fphar.2021.750857 (2021).

19. Gieryng A., Pszczolkowska, D., Walentynowicz, KA, Rajan, WD & Kaminska, B. Immune microenvironment of gliomas. Lab. Uurige. https://doi.org/10.1038/labinvest.2017.19 (2017).

20. Jung E. et al. Kasvajarakkude plastilisus, heterogeensus ja resistentsus glioomi olulistes mikrokeskkonna niššides. Nat. Commun. https://doi.org/10.1038/s41467-021-21117-3 (2021).

21. Dunn GP et al. Pahaloomulise glioomi esilekerkivad immunoteraapiad: immunogenoomikast rakuteraapiani. Neuro. Oncol. (2020). https://doi.org/10.1093/neuonc/noaa154

22. Yee PP et al. Neutrofiilide poolt indutseeritud ferroptoos soodustab kasvaja nekroosi glioblastoomi progresseerumisel. Nat. Commun. 11, (2020).

23. Sagiv, JY et al. Fenotüübiline mitmekesisus ja plastilisus tsirkuleerivates neutrofiilide alampopulatsioonides vähi korral. Cell Rep. 10, 562–573 (2015).

24. Li, Y., Hermanson, DL, Moriarity, BS & Kaufman, DS Kimäärsete antigeeni retseptoritega konstrueeritud inimese iPSC-st tuletatud looduslikud tapjarakud suurendavad kasvajavastast toimet. Cell Stem Cell 23, 181–192.e5 (2018).

25. Kim, GB et al. Kõrge afiinsusega mutantsed interleukiini-13 suunatud CAR T-rakud suurendavad klikitavate biolagunevate fluorestseeruvate nanoosakeste kohaletoimetamist glioblastoomi. Bioact. Mater. 5, 624–635 (2020).

26. Nguyen, V. et al. Uus ligandi kohaletoimetamise süsteem IL13R 2 kasvajaga piiratud biomarkeri mitteinvasiivseks visualiseerimiseks ja terapeutiliseks kasutamiseks. Neuro. Oncol. 14, 1239–1253 (2012).

27. Wang D. et al. Klorotoksiini suunatud CAR T-rakud glioblastoomi spetsiifiliseks ja tõhusaks sihtimiseks. Sci. Tõlk. Med. 12, (2020).

28. Roberts, MR et al. Antigeenispetsiifiline tsütolüüs neutrofiilide ja NK-rakkude poolt, mis ekspresseerivad kimäärseid immuunretseptoreid, mis kannavad zeta- või gamma-signaali domeene. J. Immunol. 161, 375–384 (1998).

29. Chang, Y. et al. Inimese pluripotentsetest tüvirakkudest pärinevate kimäärsete antigeeniretseptori neutrofiilide konstrueerimine vähi sihipäraseks immunoteraapiaks. Cell Rep. 40, 111128 (2022).

30. Safari H. et al. Neutrofiilid fagotsüteerivad eelistatavalt piklikke osakesi ägedate põletikuliste haiguste korral selektiivseks sihtimiseks. Sci. Adv. 6 (2020).

31. Wang, Y. & Jönsson, F. Neutrofiilide Fc retseptorite ekspressioon, roll ja reguleerimine. Esiosa. Immunol. https://doi.org/10.3389/fimmu. 2019.01958 (2019).

32. Németh T. jt. Fc retseptori ahela ITAM türosiinide tähtsus neutrofiilide aktiveerimisel ja in vivo autoimmuunses artriidis. Esiosa. Immunol. https://doi.org/10.3389/fimmu.2019.00252 (2019).

33. Neutrofiilide Fc RIIa (CD32) ja Fc RIIIb (CD16) polümorfsete vormide roll inimese IgG1- ja IgG3-opsoniseeritud bakterite ja erütrotsüütide fagotsütoosis. Transfusioon. Med. Rev. https://doi.org/10.1016/ s0887-7963(05)80094-x (1995).

34. Tsuboi, N., Asano, K., Lauterbach, M. & Mayadas, TN Inimese neutrofiilide Fc retseptorid algatavad ja mängivad spetsiifilisi mitteülearuseid rolle antikehade poolt vahendatud põletikulistes haigustes. Immuunsus. https://doi.org/10.1016/j.immuni.2008.04.013 (2008).

35. Chang, Y. et al. Inimese hemogeense endoteeli ja lõplike hematopoeetiliste eellasrakkude keemiliselt määratletud põlvkond. Biomaterials 285, 121569 (2022).

36. Brok-Volchanskaya, VS et al. Funktsionaalsete neutrofiilide tõhus ja kiire genereerimine indutseeritud pluripotentsetest tüvirakkudest, kasutades ETV2-modifitseeritud mRNA-d. Stem Cell Rep. 13, 1099–1110 (2019).

37. Emami Nejad A. et al. Hüpoksia roll kasvaja mikrokeskkonnas ja vähi tüvirakkude arengus: uudne lähenemisviis ravi arendamisele. Cancer Cell Int. https://doi.org/ 10.1186/s12935-020-01719-5 (2021).

38. Lequeux A. et al. Hüpoksilise kasvaja mikrokeskkonna ja kasvajarakkude plastilisuse mõju immuunkontrollpunktide ekspressioonile. Cancer Lett. (2019). https://doi.org/10.1016/j.canlet.2019.05.{6}}. Takano, T., Sada, K. & Yamamura, H. Proteiin-türosiinkinaasi Syk roll oksüdatiivse stressi signaalimises B-rakkudes. Antioksüdandid Redokssignaal. https://doi.org/10.1089/15230860260196335 (2002).

40. Zhang J. et al. ROS ja ROS-vahendatud rakuline signaalimine. Oksüdaat. Med. Kamber. Pikaealisus. https://doi.org/10.1155/2016/4350965 (2016).

41. Kawakami Y. et al. Ras-i aktivatsioonirada, mis sõltub proteiinkinaasi C Syk-fosforüülimisest. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. https://doi.org/10.1073/pnas.1633695100 (2003).

42. Mócsai, A., Ruland, J. & Tybulewicz, VLJ The SYK türosiinkinaas: oluline osaline mitmesugustes bioloogilistes funktsioonides. Nat. Rev. Immunol. https://doi.org/10.1038/nri2765 (2010). 43. Liu B. et al. Kasvaja-mikrokeskkonnale reageeriv nanokomposiit gaasilise vesiniksulfiidi ja trimodaalse täiustatud ensüümidünaamilise teraapia jaoks. Adv. Mater. https://doi.org/10.1002/adma. 202101223 (2021).

44. Nguyen, GT, Green, ER & Mecsas, J. Neutrophils to the ROScue: NADPH oksüdaasi aktiveerimise ja bakterite resistentsuse mehhanismid. Esiosa. Kamber. Nakata. Microbiol. https://doi.org/10.3389/fcimb.2017. 00373 (2017).

45. Che J. et al. Neutrofiilid võimaldavad liposoomide lokaalset ja mitteinvasiivset kohaletoimetamist põletikulistesse skeletilihastesse ja südame isheemiatõvesse. Adv. Mater. 32, (2020).

46. ​​Le, RQ et al. FDA heakskiidu kokkuvõte: totsilizumab kimäärse antigeeni retseptori T-rakkude poolt põhjustatud raske või eluohtliku tsütokiini vabanemise sündroomi raviks. Onkoloog 23, 943–947 (2018).

47. Morris, EC, Neelapu, SS, Giavridis, T. & Sadelain, M. Tsütokiini vabanemise sündroom ja sellega seotud neurotoksilisus vähi immunoteraapias. Nat. Rev. Immunol. 22, 85–96 (2022).

48. Liang, J. et al. Neutrofiilid soodustavad pahaloomulise glioomi fenotüüpi S100A4 kaudu. Clin. Cancer Res. 20, 187–198 (2014).

49. Nagarajan S. et al. Neutrofiilide CD32A ligandi sidumise funktsiooni rakuspetsiifiline, aktiveerimisest sõltuv regulatsioon. Blood https://doi.org/ 10.1182/blood.v95.3.1069.003k14_1069_1077 (2000).

50. Fanger, MW, Shen, L., Graziano, RF & Guyre, PM Inimese IgG Fc retseptorite poolt vahendatud tsütotoksilisus. Immunol. Täna. https:// doi.org/10.1016/0167-5699(89)90234-X (1989).

51. Lee, YG et al. CAR T-rakkude poolt vahendatud tsütokiini vabanemise sündroomi sarnase toksilisuse reguleerimine madala molekulmassiga adapterite abil. Nat. Commun. 10, 2681 (2019).

52. Kagoya, Y. et al. Uus kimäärne antigeeni retseptor, mis sisaldab JAK-STAT signaaliülekande domeeni, vahendab suurepäraseid kasvajavastaseid toimeid. Nat. Med. 24, 352–359 (2018).

53. Aghajanian H. et al. Südamefibroosi sihtimine konstrueeritud T-rakkudega. Loodus. https://doi.org/10.1038/s41586-019-1546-z (2019).

54. Zhang C. et al. ErbB2/HER2-spetsiifilised NK-rakud glioblastoomi sihipäraseks raviks. J. Natl. Cancer Inst. https://doi.org/10.1093/jnci/ djv375 (2016).

55. Akhavan D. et al. CAR T-rakud ajukasvajate jaoks: saadud õppetunnid ja edasine tee. Immunol. Rev. https://doi.org/10.1111/imr.12773 (2019).

56. Omar, NB et al. Ohutus- ja ajutised elulemuse andmed pärast M032, geneetiliselt muundatud onkolüütilise HSV-1, mis ekspresseerib IL-12, intrakraniaalset manustamist sporaadiliste glioomidega lemmikloomakoertele. Neurosurg. Fookus 50, 1–11 (2021).

57. Larson, RC & Maus, MV Hiljutised edusammud ja avastused CAR T-rakkude mehhanismide ja funktsioonide vallas. Nat. Rev. Cancer 21, 145–161 (2021).

58. Wang, B. et al. Hüpoimmunogeensete T-rakkude genereerimine geneetiliselt muundatud allogeensetest inimese indutseeritud pluripotentsetest tüvirakkudest. Nat. Biomed. Eng. 5, 429–440 (2021).

59. Deuse, T. et al. Indutseeritud pluripotentsete tüvirakkude hüpoimmunogeensed derivaadid väldivad immuunsüsteemi äratõukereaktsiooni täielikult immunokompetentsetel allogeensetel retsipientidel. Nat. Biotehnoloogia. 37, 252–258 (2019).

60. Han X. et al. Hüpoimmunogeensete inimese pluripotentsete tüvirakkude genereerimine. https://doi.org/10.1073/pnas.1902566116

61. Kwon YW et al. HLA DR genoomi redigeerimine TALEN-idega inimese iPSC-des andis immuuntolerantseid dendriitrakke. Stem Cells Int. https://doi.org/10.1155/2021/8873383 (2021).

62. Morizane A. et al. MHC sobitamine parandab iPSC-st pärinevate neuronite siirdamist ahvilistele. Nat. Commun. https://doi. org/10.1038/s41467-017-00926-5 (2017).

63. Lin, K. et al. Ravimiresistentse glioomiga selektiivselt suunatud ainete mehhanismipõhine disain. Sci. (80-.) 377, 502–511 (2022).

64. Fan Y. et al. Mitme rakusurma raja sihtimine pikendab säilivusaega ja säilitab inimese ja hiire neutrofiilide funktsiooni vereülekandeks. Sci. Tõlk. Med. 13, (2021).

65. Chang Y. et al. Fluorestseeruvad indikaatorid inimese pluripotentsete tüvirakkude rakutsükli faaside pidevaks ja liinispetsiifiliseks aruandluseks. Biotehnoloogia. Bioeng. bit.27352. https://doi.org/10.1002/bit. 27352 (2020).

66. Jung, J. et al. Inimese lõplike vereloome tüvi- ja eellasrakkude keemiliselt määratletud põlvkond. STAR protokoll. 4, 101953 (2023).

Ju gjithashtu mund të pëlqeni