Diclinanona Calycina (Annonaceae) koorest pärit bensüülitud dihüdroflavoonid ja isokinoliinist saadud alkaloidid ja nende tsütotoksilisus

Lisateabe saamiseks võtke ühendusttina.xiang@wecistanche.com

Abstraktne: Diclinanona calycina RE Fries, tuntud kui "enviro", on Annonaceae perekonda kuuluv liik, mis on Brasiilias endeemiline. Meie käimasolevate Annonaceae Amazonase taimede bioaktiivsete ühendite otsimisel uuriti D.calycina koort klassikalise kromatograafia meetodil, mis andis kolmteist ühendit (alkaloidid ja flavonoidid), mida kirjeldati esmakordselt nii D. calycina kui ka perekonna Diclinanona puhul. Nende eraldatud ühendite struktuur määrati kindlaks ulatusliku analüüsiga, kasutades 1D/2D-NMR spektroskoopiat koos MS-ga. Eraldatud alkaloidid kuulusid alamklassidesse: lihtne isokinoliin, thali online (1); aporfiin, anonain (2);oksoaporfiin, liriodeniin (3); bensüültetrahüdroisokinoliinid, (S)-(pluss)-retikuliin (4); dehüdrooksonorretikuliin (3,4-dihüdro-7-hüdroksü-6-metoksü-1-isokinolinüül)(3-hüdroksü-4-metoksüfenüül)metanoon)(5 );( pluss )-1S,2R-retikuliin-Ng-oksiid (6); ja (pluss )-1S,2S-retikuliin-N-oksiid (7);tetrahüdroprotoberberiin, koreksimiin (8); ja paviin, bisnorarrgemoniin (9). Samal ajal kuiflavonoididkuuluvad bensüülitud hulkadihüdroflavoonid, isorhamnetiin (10), dichamanetin (11) ning uvarinooli (12) ja isouvarinooli (13) segu. Ühendit 5 kirjeldatakse kirjanduses esmakordselt kui looduslikku toodet. Peamiste eraldatud ühendite tsütotoksilist aktiivsust hinnati vähi ja mittevähiliste rakuliinide suhtes. Testitud ühenditest saadi kõige lootustandvamad tulemused bensüülitud dihüdroflavoonide dichamanetiini (10) ning uvarinooli (12) ja isouvarinooli (13) segu puhul, millel oli mõõdukas tsütotoksiline toime testitud aine suhtes.vähirakkread(<20.0 ug·ml-)="" and="" low="" cytotoxicity="" against="" the="" non-cancerous="" cell="" line="" mrc-5(="">25.0 ug·mL-I). Dichamanetiinil (11) ilmnes tsütotoksiline toime HL-60 ja HCT116 vastu, IC50 väärtused olid 15,78 ug·mL-I (33,70 umol·LI) ja 18,99 ug∶mL- (40,56 umol). L-), samal ajal kui uvarinooli (12) ja isouvarinooli (13) segu näitas tsütotoksilist toimet HL-60 (IC5 väärtusega 9,74 ug.mL-1) ja HCT116 (IC50) vastu. väärtus 17,31 ug. mL-I. Neid tsütotoksilisi toimeid võib seostada ühe või mitme hüdroksübensüülrühma olemasoluga nendes molekulides, samuti positsiooniga, milles need rühmad on seotud. Retikuliini, anoniini ja liriodeniini tsütotoksiline toime on varem kindlaks tehtud, kusjuures liriodeniin on kõige tugevam ühend.

Märksõnad: Diclinanona calycina; alkaloidid ja bensüülitud dihüdroflavoonid; tsütotoksiline aktiivsus

Klõpsake toodete kohta lisateabe saamiseks

1. Sissejuhatus

Annonaceae on suur troopiliste ja subtroopiliste puude ja põõsaste perekond, kuhu kuulub umbes 112 perekonda ja 2440 liiki [1]. Mitmed liigid on tuntud oma söödavate viljade ja raviomaduste poolest ]2]. Eelnev fütokeemiline uurimine mõnede Annonaceae liikidega viis erinevate sekundaarsete metaboliitide klasside, nagu monoterpeenid, diterpeenid, triterpeenid, lignaanid, isoleerimise ja iseloomustamiseni.flavonoidid, asaroonist pärinevad fenüülpropanoidid, atsetogeniinid ja peamiselt tüüpilised isokinoliinist pärinevad alkaloidid [3-7]. Mõned neist Annonaceae liikidest eraldatud sekundaarsetel metaboliitidel avaldasid olulist bioloogilist toimet, nagu põletikuvastased ja ureaasi inhibeerivad omadused [8,9], trüpanotsiidid [10,11], leishmanitsiidsed [11,12], malaariavastased omadused [4,13]. , antimikroobne [4,14,15], antioksüdantne ja antireumaatiline toime [9,15] ning eriti tsütotoksiline toime inimese erinevate kasvajarakuliinide vastu [4,6,11,16-21].

Kuigi perekonda Annonaceae peetakse primitiivseks ja hästi uuritud perekonnaks, on selle liigiga tehtud vähe fütokeemilisi ja/või farmakoloogilisi uuringuid[3]. Fütokeemilised ja/või farmakoloogilised uuringud on keskendunud peamiselt perekondadesse Annona, Asimina ja Cananga kuuluvatele liikidele nende suure majandusliku tähtsuse tõttu ning teatud liikidele perekondadest Duguetia, Guatteria ja Xylopia[5]. Vaatamata fütokeemiliste ja farmakoloogiliste uuringute suurele kasvule viimase 20 aasta jooksul, on uuritud liikide arv paljude tunnustatud liikide suhtes endiselt väga väike. Praegu on Web of Science'i, Scopuse ja SciFinderi teaduslike andmebaaside andmetel ainult umbes 15 protsendil kirjeldatud Annonaceae liikidest vastavad fütokeemilised ja/või farmakoloogilised uuringud.

Väheuuritud liikide hulgas on perekonda Diclinanona Diels kuuluvad liigid. See perekond kuulub Annonoideae alamperekonda Annoneae hõimu ja esineb ainult troopilises Lõuna-Ameerikas (peamiselt Amazonase piirkonnas). See on perekond, mis koosneb ainult kolmest liigist, Diclinanona calycina(Diels)RE Fries Diclinanona matogrossensis Maas ja Diclinanona tessmannii Diels, mis esinevad puudena [22-24].D.calycina (sünonüüm Xulopia calycina Diels) on 8 to 30 m kõrgune puu, tuntud kui "envireira" ja "enviro", on levinud kogu Amazonase jõgikonnas Brasiilias, Peruus ja Venezuelas [23]. D.calycina sarnaneb pealiskaudselt Xylopiale oma piklike ja kitsaste kroonlehtedega õite poolest, kuid teistmoodi on ta puitunud, eraldumatute, kerajate ja paksuseinaliste monokarpide poolest [23,24].

Varasemad uuringud D. calycinaga käsitlevad ainult farmakoloogilisi uuringuid. Esimeses uuringus kirjeldatakse metanooli-, kloroformi- ja vesiekstraktide antimikroobse toime uurimist mikroorganismide Mycobacterium smegmatis, Escherichia coli, Streptococcus sanguis, Streptococcus oralis, Staphylococcus aureus ja Candida albicans [25]fusiooni meetodil. Teises kirjeldatakse orgaaniliste (diklorometaan: metanool 1:1) ja vesiekstraktide antimikroobse toime uurimist mikroorganismi Enterococcus faecalis vastu, kasutades mikrolahjenduspuljongi analüüsi (MDBA) ja ketta difusioonianalüüsi (DDA)[26]. Seega, meie pideva Amazonase vihmametsade Annonaceae bioaktiivsete looduslike toodete otsimisel oli selle uuringu eesmärk uurida D.calycina koore fütokeemilisi ja farmakoloogilisi omadusi. Selles aruandes on kolmteist ühendit (üheksa alkaloidi ja neli bensüülituddihüdroflavoonid) isoleeriti ja tuvastati esimest korda D.calycina, aga ka perekonnas Diclinanona. Lisaks uuriti peamiste ühendite tsütotoksilisust B16-F10, HepG2, K562 ja HL{{ 4}} kasvaja rakuliinid, kasutades Alamar blue testi.

2. Tulemused ja arutelu

2.1.Ühendite struktuurne selgitamine

Olles avastanud Dragendorffi reaktiivi abil metanooliekstraktis lämmastikku sisaldavate ühendite olemasolu, töödeldi seda happe-alusega vastavalt Costa jt metoodikale. [12] mille tulemuseks on alkaloidsed ja neutraalsed fraktsioonid. Alkaloidfraktsioonis, mis allutati kromatograafilisele analüüsile, täheldati lämmastikku sisaldavate ühendite suurt kontsentratsiooni. Jaotises Ekstraheerimine ja eraldamine kirjeldatud järjestikuste kromatograafiliste eraldamiste tulemusel eraldati ja tuvastati kolmteist keemilist koostisosa (1-13, joonis 1), üheksa isokinoliinist saadud alkaloidi 1-9 ja neli bensüülitud dihüdroflavooni. 10-13. Nende eraldatud ühendite struktuurid (joonis 1) määrati kindlaks ulatusliku analüüsiga, kasutades 1D- ja 2D-NMR-spektroskoopiat koos MS-ga (täiendavad andmed), samuti võrdlust kirjanduse andmetega.

Ühend 5 saadi pruuni amorfse pulbrina ja osutus positiivseks Dragendorffi reagendi suhtes. See näitas protoneeritud molekuli m/z328 [M pluss H]' juures LR-ESI(pluss)MS-is, mis ühildus molekulaarse valemiga C18H1NO5. Ühendi 5 'H ja 13C-NMR spektrid (tabel 1) olid kooskõlas retikuliini (4)[27 omadega, välja arvatud lämmastikuga seotud metüülrühma (CH3-N) ja signaali puudumine. metiinrühm positsioonis 1, mis asendati signaaliga δc 165,1 juures imiinrühma tüüpilises 13C-NMR spektris, mis on konjugeeritud karbonüülrühmaga bc 192,8 juures. 'H-NMR spektris kolm allavälja vesinikku δH 6,88 (1H,d, J=8,4 Hz, H-5'）, 5H7,57 (1H,d, J{{33}) }.0Hz, H-2') ja δH 7,60(1H, dd, J=8.4 ja 2,0 Hz, H-6'） , näitas ABX-ühendussüsteemi olemasolu. Kaks singlettsignaali 6H 6,90 (1H,s, H-8) ja 6,71 (1H, s, H-5) juures näitasid 1,2,4,5-tetraasendatud fenüültsükli olemasolu. Lisaks näitas H-NMR spekter 5 ka signaale kahe metoksürühma kohta, mis resoneerisid bH 3,93 (3H, s) ja 6H 3,95 (3H, s), ning signaale kahe metüleenrühma kohta, mis resoneerisid δμ 2,79 (2H,t), J=7,8 Hz） ja 6H 3,89(2H,t,/=7.8 Hz), omistatud vastavalt H-4-le ja H-3-le (tabel 1) . Need andmed näitasid, et alkaloidil 5 on bensüültetrahüdroisokinoliini karkass [28-30].

Need rühmad loodi kahe- ja kolmesidemelise 'H-13 korrelatsioonikaardi alusel HMBC-NMR katsest (joonis 2 ja tabel 1). See analüüs näitas, et vesiniku δH 3,89 (H-3) juures oli kolmeribaline 'H-13C korrelatsioon süsinikudega 6c130.1 (4a) ja δc165 juures. {42}}(C-1) ja kahe sidemega lH-13C korrelatsioon süsinikuga atδc 25,4(C-4), mis kinnitab imiinrühma olemasolu molekulis. Teisest küljest näitasid signaalid δH 7,57 （H-2'） ja δH 7,60（H-6'） kolmesideme lH-13C korrelatsiooni süsinikudega δc 124,3（ C-6'）,5c 151,4（C-4'）ja δc192,8（C-7） ja 5c116,0（C-2'）,6c 151,4 (C-4') ja c 192,8 (C-7'), mis moodustab molekulis karbonüülrühma (joonis 2 ja tabel 1). Seetõttu on nende NMR andmete põhjal ühend 5

loodi bensüültetrahüdroisokinoliini alkaloidina 34-dihüdro-7-hüdroksü-6-metoksü-1-isokinolinüül)(3-hüdroksü-4-metoksüfenüül)metanoon, mis nimetatakse dehüdrooksonorretikuliiniks. Seda alkaloidi kirjeldatakse kirjanduses esmakordselt kui looduslikku toodet. Selle esimest ja ainsat ülestähendust kirjeldasid Dörnyei jt. aastal 1982 【31】 sünteetilise päritoluga tootena. Ainult 'H-NMR andmeid kirjeldatakse teatud määramata kordustega. Seega määrati kõigi 1H- ja 13C-NMR keemiliste nihete täielikud määrangud ühe sidemega (HSOC) ning kahe ja kolme sidemega (HMBC)' H-13C-NMR korrelatsioonikatsetega ning neid kirjeldati Tabel 1.

Ühendid 6 ja 7 identifitseeriti kui bensüültetrahüdroisokinoliini alkaloidid (pluss )-1S,2R-retikuliin-N-oksiid ja (pluss)-1S,2S-retikuliin-N-oksiid. Nende alkaloidide H-NMR andmeid võrreldi andmetega, mida on kirjeldanud Lee et al. [28]kasutades sama deutereeritud lahustit (CD3OD) ja täheldati mõningaid ebakõlasid (tabel 1), peamiselt seoses H-1, H-8 ja H, C-NO. Kirjanduses ei ole nende alkaloidide kohta kirjeldatud 13C-NMR andmeid. Piiratud 1H- ja 13C-NMR-andmete ning nende molekulide puhul täheldatud ebaselguste põhjal viidi läbi 'H- ja 13C-1D- ja 2D-NMR-katsed, et määrata nende õiged määramised ja kordused.

Mõlema isomeeri 6 ja 7 vesiniku H{{0}} ja H-1 õige asend määrati kindlaks HMBC kolme sideme 'H-13C korrelatsioonikaardi põhjal. -NMR-katse (joonis 2). Isomeeri 6 analüüs näitas, et vesinik δH 5,78 (H-8) juures näitas kolme sideme 'H-13C korrelatsiooni süsinikuga temperatuuril 6c 79,8 (C-1), δc120 .6(4a) ja δc 149,4 （C-6）, samas kui vesinik δH 4,13 （H-1) näitas kolmesideme 'H-13C korrelatsiooni süsinikudega c 60,7（C-3）,6c 115,7（C-8）, δc 120,6（C-4a） ja 131,2（C-1'）, luues seega vesiniku H-8 ja H-1 õiged positsioonid isomeeri 6 jaoks. Seda omistamist saab veelgi kinnitada vesiniku analüüsiga δH 6,76（H-5), mis näitas kolm sidet H-13C korrelatsioon süsinikudega δc 27,0 °C-4), δc 127,1 °C-8a） ja δc 145,7 °C-7） (Joonis 2). Isomeeri 7 analüüs näitas, et vesinik δH 6,30 (H-8) juures näitas kolme sidet 'H-13korrelatsiooni süsinikuga δc 79,4（C-1）, δc 122,8） 4a） ja δc 148,9 （C-6）, samas kui vesinik δH 4,46 （H-1） näitas kolme sidemega H-13C korrelatsiooni süsinikuga temperatuuril δc 62,9 （ {82}}）,5c 115,5（C-8）, bc 122,8（C-4a） ja 131,4（C-1'）, määrates seega vesinike H õiged asukohad -8 ja H-1 isomeeri 7 jaoks. Seda omistamist kinnitas ka vesiniku analüüs δH 6,71 （H-5）, mis näitas kolme sideme lH{100}}C korrelatsioonid süsinikudega δc26,3 (C-4), δc 126,9 (C-8a) ja 6c 146,1 (C{110}}) juures (joonis 2). NOESY katse viidi läbi ka isomeeride 6 ja 7 õige stereokeemia kindlakstegemiseks. Selles katses näitas H-1（δH 4,13） ja H, CN(5 3.15) tugev NOE korrelatsioon -hapniku orientatsioon isomeeris 6. Teisest küljest ei leitud 2D-NOESY katses 7, mis näitab hapniku orientatsiooni isomeeris 7 (joonis 2). Need väikesed erinevused nende isomeeride keemilistes nihetes on selgelt täheldatavad hapniku ja positsioonide poolt mõjutatud lämmastiku stereokeemia tõttu. Ühendite 6 ja 7 kohta saadud 'H- ja 13C-NMR andmete võrdlus lähedase struktuuriga molekulide, nagu heksapetaliin A ja heksapetaliin B [30] andmetega, toetab tabelis 1 kirjeldatud andmeid ilma ühemõttelisuseta.

Ühendid 1-4 ja 8-13 identifitseeriti kui talifoliin (1) [32], anonaiin (2) [33] liriodeniin (3) [10,34], (S)-( pluss )-retikuliin ( 4)[27], koreksimiin (8) [34,35], bisnorargemoniin (9)[36], isohamanetiin (10) [37], dichamanetin (11) [37] ning uvarinooli (12) ja isouvarinooli segu (13) [37] nende spektroskoopiliste profiilide ja kirjanduses leiduvate väärtustega võrdlemise põhjal. lH- ja 13C 1D ja 2D-NMR spektrid, samuti kõigi eraldatud ühendite massispektrid on saadaval lisamaterjalidena.

Kemofeneetilisest (uus termin taimede kemosüstemaatika / taimede kemotaksonoomia jaoks) on oluline märkida, et C-bensüülitud flavanoonid ja C-bensüülitud dihüdrokalkoonid on eritüüpi flavonoidid, mis on saadud tuntud flavanooni pinotsembriinist. ja neid on kirjeldatud eelkõige Annonaceae perekonda kuuluvate Uoaria liikide puhul [3,38-42]. Nende ühendite esinemine D. calycinas viitab tihedale kemofeneetilisele seosele Uoariaga. Teisest küljest tuleks selle kemofeneetilise seose kinnitamiseks läbi viia täiendavaid uuringuid taime teiste osade ja ka teiste Diclinanona liikidega. Flavanoonid ja kalkoonid on laialt levinud kõrgemates taimedes, kuid bensüülrühmade lisamine on üsna haruldane ja näib piirduvat Annonaceae perekonnaga Uoaria [3,39-42] ja nüüd perekonnaga Diclinanona. Bensüülrühmad tekivad arvatavasti C6-C1 rajast, kuid o-hüdroksüfunktsionaalsus on ebatavaline. Asendajate puudumist B-tsüklis kõigis neis Uoaria ja Diclinanona flavonoidides võib seostada eelmise tähelepanekuga Popowia cauliflora flavonoidide kohta [38].

Selles töös isoleeritud ja kirjeldatud isokinoliinist saadud alkaloidid on juba registreeritud mitmetes Annonaceae liikides erinevates perekondades. Mõnda neist, nagu liriodeniini ja anonaiini, peetakse kemofeneetilisteks markeriteks ning nende alkaloidide olemasolu D.calycinas tugevdab veelgi nende kemofeneetiliste markerite seost perekonnas Annonaceae [5-7,15,20,27, 33-35,43].

Tasub mainida, et Zidorni [44] järgi on kemofeneetilised uuringud määratletud kui uuringud, mille eesmärk on kirjeldada spetsiifiliste sekundaarsete metaboliitide massiivi antud taksonis, nagu on juba täheldatud mitmetes avaldatud töödes [5-7,15,20 ,27,33-35,43-46]. Seega aitavad kemofeneetilised uuringud kaasa taksonite feneetilisele kirjeldamisele sarnaselt anatoomiliste, morfoloogiliste ja karioloogiliste lähenemisviisidega, mida on juba tunnistatud suure tähtsusega "looduslike" süsteemide loomisel ja mis on jätkuvalt äärmiselt olulised. klassifitseeritud organismide kirjeldamine kaasaegsete molekulaarsete meetodite abil [44].

2.2. Tsütotoksiline analüüs

Eraldatud ühendite (tabel 2), välja arvatud ühendite 2, 3, 5 ja 8 (nende madala saagise tõttu), in vitro tsütotoksilist aktiivsust hinnati võrreldesvähirakkliinid HL-60 (inimese promüelotsüütiline leukeemia), MCF-7 (inimese rinna adenokartsinoom), HepG2 (inimese hepatotsellulaarne kartsinoom), HCT116 (inimese käärsoole kartsinoom) ja mittevähkkasvaja rakuliin MRC{{5} }(inimese kopsufibroblast), kasutades Alamar Blue testi pärast 72-tunnist inkubeerimist.

Among the compounds evaluated (Table2), the most promising results were verified for benzylated dihydroflavones dichamanetin (10), and the mixture of uvarinol (12)and isouvarinol (13), which showed moderate cytotoxic activity against the tested cancer cell lines and low cytotoxicity against the non-cancerous cell line MRC-5(>25.0 ug.mL-1). Dichamanetiinil (11) ilmnes tsütotoksiline toime HL-60 ja HCT116 vastu, IC50 väärtused olid 15,78 ug·mL-1（33,70 μmol·L-1) ja vastavalt 18,99 ug·mL-1（40,56 umol.L-1）. Uvarinooli (12) ja isouvarinooli (13) segu avaldas tsütotoksilist toimet HL-60 (ICs0 väärtusega 9,74 ug∶mL-1) ja HCT116, ICs0 väärtusega 17,31 ug∶mL{ {30}}. Bensüülitud dihüdroflavoonidest näitas ainult isorhamnetiin (10) tsütotoksilist toimet HepG2 suhtes IC50 väärtusega 19,79 ug:mL -1 (54,65 umol.L-1). Kirjanduse andmetel on bensüülitud dihüdroflavoonid kirjeldatud tsütotoksiliste omadustega [39-42]. Selles töös kirjeldatutest kirjeldatakse isorhamnetiini (10), dichamanetiini (11) ja uvarinooli (12) tsütotoksiliste omadustega inimese ninaneelu kartsinoomi (KB) ja P-388 lümfotsütaarse leukeemia kasvaja rakuliinide suhtes. (PS) IC50 väärtustega vastavalt 5,3 ja 4,1, 4,8 ja 1,8 ning 5,9 ja 9,7, ug.mL-1 [39,40]. Need erinevad aktiivsused võivad olla tingitud ühe või mitme hüdroksübensüülrühma olemasolust molekulides, samuti positsioonist, milles need rühmad on seotud. Selle tähelepaneku kinnitamiseks on aga vaja täiendavat uurimist.

Menezes jt ​​on hiljuti kirjeldanud isokinoliinist pärinevate alkaloidide anoniini (2), liri-adeniini (3) ja (S)-(pluss)-retikuliini (4) tsütotoksilist toimet in vitro. }}], Souza jt. [6] ja Costa jt. [43] rõhuasetusega liriodeniinil, mis näitas tugevat tsütotoksilist toimet vähirakuliinide B{{10}}F10 (hiire melanoom), HepG2 (inimese hepatotsellulaarne kartsinoom), HL{{13 }} (inimese promüelotsüütiline leukeemia) ja K562 (inimese krooniline müelotsüütleukeemia), mille IC5s0 väärtused olid alla 10,0 μmol.L-1【43】. Anonaine näitas mõõdukat aktiivsust B16-F10, HepG2, HL60 vastu ja K562, mille IC50 väärtused olid madalad kui 19,0 umol.L-1[20]. (S)-(pluss )-Retikuliin näitas mõõdukat toimet ainult HepG2 suhtes, IC50 väärtused olid 15,35 µmol L-1【 6,20】.

3. Materjalid ja meetodid

3.1. Üldised katseprotseduurid

Optilised pöörded metanoolis (MeOH) registreeriti P{{0}} polarimeetriga (Jasco, Tokyo, Jaapan) 589 nm juures. 1D ja 2D NMR katsed saadi CDCl-s. (kloroform-d) või CDCl pluss CD, OD (metanool-du ja CD, COCD3 (atsetoon-d6) tilk 298 K juures AVANCE I HD NMR spektromeetril (Bruker, Billerica, MA, USA), mis töötab temperatuuril 11,75 T (käsi 13C vastavalt sagedustel 500 ja 125 MHz) ning Bruker AVANCE I 600 NMR spektromeetril, mis töötab 14,1 T('H ja13Cat 60{ {63}} ja vastavalt 150 MHz). Kõik lH- ja 13C-NMR keemilised nihked (δ) on esitatud ppm-des tetrametüülsilaani signaali suhtes 0.00 ppm sisemise võrdlusena ja sidestuskonstandid (D) on antud Hz. NMR spektromeeter oli varustatud 5- mm mitmetuumalise pöördtuvastussondiga (1D ja 2D NMR katsed), millel oli z-gradient. Üks side (HSQC) ja kaks ja kolme sidemega (HMBC)1H-13C-NMR korrelatsioonikatsed optimeeriti keskmise sidestuskonstandi JcH ja LRJ (cH vastavalt 140 ja 8 Hz) jaoks. Madala eraldusvõimega massispektromeetria (LC-MS) analüüsi jaoks eraldatud ühendite proovid resuspendeeriti metanoolis (HPLC puhtusaste), moodustades k lahuseid (1 mg·mL{40}}). Põhilahuste alikvoodid (5 uL) lahjendati täiendavalt 5 ug·mL-ni ja analüüsiti otsese infusiooni teel kolmekordse kvadrupooli massispektromeetrisse, mudel TSO Quantum Access (Thermo Scientific, San Jose, CA, USA), mis oli varustatud elektropihustusionisatsiooniga. (ESI) või atmosfäärirõhu keemilise ionisatsiooni (APCI) allikad. ESI-MS tingimused: pihustuspinge, 5 kV; mantligaas, 10 suvalist ühikut (arb); abigaas, 5arb;puhastusgaas,0arb;kapillaar temp, 250 kraadi ; kapillaarpinge, 40 V;toru lääts, 70 V;massivahemik, m/z 100 kuni 1000.APCI-MS tingimused: tühjendusvool, 5 μA; aurusti temperatuur, 350 kraadi; mantligaasi rõhk, 25 suvaline ühik (arb); ioonpühkimisgaasi rõhk,0,0 arb; lisagaasi rõhk, 10 arb; kapillaartemperatuur, 250 kraadi C; toru objektiivi nihe, 70 V; skimmeri nihe, 0 V; massivahemik, m/z 100 kuni 1000. Kokkupõrkegaasina kasutati argooni ja MS/MS spektrid saadi, kasutades kokkupõrkeenergiat vahemikus 25 kuni 30 eV. Kolonnkromatograafias (CC) kasutati silikageeli 60 (Sigma-Aldrich, San Luis, MO, USA, 70-230 võrk), silikageeli 60 F254 (Macherey-Nagel, Düren, Saksamaa, 0,25 mm, alumiinium) kasutati analüütiliseks ja preparatiivseks õhekihikromatograafiaga (PTLC) (Macherey-Nagel, 1,00 mm, klaas). Ühendid visualiseeriti eksponeerimisega UV254/365 valguses, pihustades p-anisaldehüüdreagendiga, millele järgnes kuumutamine kuumutusplaadil ja pihustades Dragendorffi reaktiivi.

3.2.Taimne materjal

Käesoleva uurimise käigus koguti D.calycina botaaniline materjal (koor) 27. mail 2017 Adolpho Ducke'i kaitsealal (geograafilised koordinaadid: 02 kraad 53'36,1 S ja 59 kraad 58'28,9" W), Manaus, Amazonase osariik Universidade Federal do Amazonase (DB/UFAM) bioloogiaosakonna taimetaksonomist prof dr Antonio Carlos Webber, Brasiilias. Kviitungi näidis number 10 810 deponeeriti DB/UFAMi herbaariumis. juurdepääs (näidis) registreeriti süsteemis Sistema Nacional de Gestao do Patrimonio Genetico e do Conhecimento Tradicional Associado (SISGEN) kirjega A70EDCD.

3.3. Ekstraheerimine ja isoleerimine

D.calycina koort kuivatati algul toatemperatuuril 24 tundi, seejärel kuivatati õhuringlusega ahjus 48 tundi temperatuuril 40 kraadi ning seejärel pulbristati neljanoalises veskis (Marconi, Piracicaba, SP , Brasiilia), et saada pulbriline materjal (1340 g). Seejärel viidi läbi põhjalik leotamine heksaaniga (8 × 4 l), millele järgnes MeOH (8 × 4 l). Saadud ekstraktiivsed lahused kontsentreeriti rootoraurustis alandatud rõhul ({10}} kraadi), et saada vastavalt heksaani (24,85 g) ja MeOH (199,43 g) ekstraktid.

Dragendorffi reagendiga tehtud TLC analüüs näitas, et MeOH ekstraktis on palju alkaloide. Seetõttu ekstraheeriti MeOH ekstrakti alikvoot (188,3{9}} g) algselt happe-aluse ekstraktiga, et saada alkaloidsed (5,46 g) ja neutraalsed (4,47 g) fraktsioonid. Seejärel viidi osa alkaloidfraktsioonist (5{56}}g) silikageeli kromatograafilisele kolonnile (CC), mida oli eelnevalt töödeldud 10% NaHC03 lahusega [12], elueerides heksaaniga (100%), heksaan-CHCl, (90:10,80:20,70:30,60:40,50:50,40:60,30:70,20:80 ja 10:90,maht/o), CH2Cl2 (100 protsenti), CH2Cl 2-EtOAc(90:10,80:20,70:30,60:40,50:50,40:60,30:70,20:80 ja 10:90,0/u), EtOAc (100 protsenti), EtOAc-MeOH (95:05, 90:10,85:05, 80:10,75:25, 70:30,60:40, 50:50,40:60, 30:70,20 :80 ja 10:90, v/o) ja lõpuks MeOH, mis annab 250 fraktsiooni (igaüks 30 ml). Pärast TLC hindamist, kasutades CH2Cl2-MeOH segu vahekorras 95:05, 90:10, 85:15 ja 80:20 eluentsüsteemina (v/o) ühendati sarnased proovid, et saada 16 fraktsiooni (F1 kuni F16).

Fraktsioon F5 (181,2 mg) algsest CC-st, mida elueeriti heksaan-CH,Cl2-ga (50:50 kuni 10:90, maht/o), töödeldi uue silikageeliga CC, kasutades ülaltoodud metoodikat, elueerides heksaani (100%) ja heksaaniga. -CH, Cl2 (90:10,80:20,70:30,60:40,50:50,40:60,30:70,20:80 ja 10:90,maht/o), CH,Cl ,(100 protsenti ), CHCl2-EtOAc(90:10,80:20,70:30,60:40,50:50,40:60,30:70,20:80 ja 10:90 o/), EtOAc (100 protsenti), EtOAc-MeOH (85:15, 70:30, 50:50, 30:70 ja 15:85, /o) ja MeOH (100 protsenti), mis annab 118 fraktsiooni ( igaüks 15 ml), mis ühendati 12 alamfraktsiooniks (F5.1 kuni F5.12), vastavalt TLC analüüsi hindamisele, kasutades CH2Cl2-MeOH segu vahekorras 95:05 ja 90:10. Subfraktsioon F5. .1 (28,9 mg), mis oli elueeritud heksaaniga (100 protsenti), viidi läbi preparatiivne TLC, mida elueeriti CH,Cl-MeOH-ga (95:05, maht/maht, kaks elueerimist), saades 2 (1,4 mg) ja 3 (1,7 mg), vastavalt. Alamfraktsioonid F5.4 (21,5 mg) elueeriti heksaaniga-CH, C(80:20, vo), F5.5 (16,7 mg) elueeriti heksaan-CH,Cl-ga (80:20,70:30,60; 40 ja 50:50). ,v/) ja F5.6 (15,4 mg), mis oli elueeritud heksaani-CHCl2-ga (50:50, 40:60 ja 30:70, v/o), ühendati (53,6 mg) ja elueeriti ka preparatiivse TLC-ga. CH,Cl-MeOH-ga (95:05, v/u, kaks elueerimist), saades ühendi 3 (8,9 mg).

Fraktsioon F6 (2099,1 mg) algsest CC-st, elueeriti heksaan-CHCl(10:90,v/)), CH2Cl, (100) protsenti) ja CH,Cl2-EtOAc (90:10 kuni 10:90, o/o) allutati uuele silikageeli CC-le, kasutades ülaltoodud metoodikat, elueerides samade lahustisüsteemidega, saades 140 fraktsiooni (30). ml iga). Pärast TLC hindamist, kasutades eluentsüsteemina (o/o) CH2Cl2-MeOH segu vahekorras 95:05, 90:10 ja 85:15, ühendati sarnased proovid, et saada 13 alamfraktsiooni (F6). .1 kuni F6.13). Alamfraktsioon F6.6 (1541,3 mg) allutati uuele silikageeli CC-le, kasutades sama ülaltoodud metoodikat, elueerides samade lahustisüsteemidega, saades 120 fraktsiooni (igaüks 30 ml), mida analüüsiti TLC-ga (kasutades ülaltoodud metoodikat), saades 12 uut. alamfraktsioonid (F6.6.1 kuni F6.6.12). Heksaani-CH,Cl-ga (60:40 ja 50:50, maht/maht) elueeritud alamfraktsioon F6.6.2 (17,0 mg) allutati preparatiivsele TLC-le, mida elueeriti CH2Cl2-MeOH-ga (90:10, v/o, üks elueerimine), mille tulemuseks oli 3 (1,4 mg). Subfraktsioon F6.6.3 (643,3 mg), elueeriti heksaani-CH2Cl2-ga (50:50, 40:60, 30:70, 20:80 ja 10:90). o/v), CH2Cl2 (100 protsenti) ja CH2Cl2-EtOAc (90:10 ja 80:20, o/o) allutati preparatiivsele TLC-le, mida elueeriti CH2Cl2-MeOH-ga (90). :10, vfo, üks elueerimine, saades uue alamfraktsiooni F6.6.3.1 (161,8 mg), millele viidi läbi uus preparatiivne TLC, mida elueeriti EtOAc-MeOH-ga (90:10, v/o, üks elueerimine), saades 4(148,2). mg). Subfraktsioon F6.6.4 (90,2 mg), mida elueeriti CH2Cl2-EtOAc-ga (70:30 ja 60:40, o/o), allutati ettevalmistavale TLC-le, elueeriti CH2Cl-MeOH-ga (90:10, v/o, üks elueerimine), saades vastavalt 1 (1,4 mg) ja 4 (50,1 mg). Subfraktsioon F6.6.5 (83,4 mg), mis oli elueeritud CH,Cl-EtOAc-ga (60:40 ja 50:50, o/o), viidi samuti läbi preparatiivse TLC-ga, mida elueeriti CH,Cl2-MeOH-ga (90:10, ufo, üks elueerimine), mis andis taas vastavalt 1 (1,5 mg) ja 4 (45,5 mg). Subfraktsiooniga F6.6.6 (101,4 mg), mis oli elueeritud CH,Cl2-EtOAc-ga (50:50 ja 40:60, maht/)) teostati ettevalmistav TLC, mida elueeriti CH,Cl-MeOH-ga (90:0). 10, vfo, üks elueerimine), andes 8 (3,4 mg) ja teise alafraktsiooni F6.6.6.1 (48,8 mg). Sellele alafraktsioonile (F6.6.6.1) viidi läbi ettevalmistav TLC, elueeriti algselt EtOAc-MeOH-ga (85). :15, vo, üks elueerimine) ja tagantjärele CHCl-MeOH (90:10, maht/maht, üks elueerimine), mille tulemusena saadi taas ühend 4 (37,4 mg). Selle protseduuri jaoks elueeriti kromatograafiline plaat algselt liikuva faasiga EtOAc-MeOH (85:15, v/o, üks elueerimine). Pärast seda elueerimist kromatograafiline plaat kuivatati lahusti eemaldamiseks ja seejärel elueeriti uuesti liikuva faasiga CH,Cl,-MeOH (90:10,vf,üks elueerimine), saades 4. Subfraktsioon F6.6.7 ( 109,0 mg), elueeriti CH,Cl2-EtOAc-ga (40:60, 30:70, 20:80 ja 10:90, vfo), allutati preparatiivsele TLC-le, elueeriti CH,Cl2-MeOH-ga. (90:10, vo, üks elueerimine), andis teise alamfraktsiooni F6.6.7.1 (24,8 mg), millele viidi läbi uus preparatiivne TLC, mida elueeriti algul EtOAc-MeOH-ga (85:15, v/o, üks elueerimine) ja tagantjärele. CH2Cl2-MeOH (90:10, vfo, üks elueerimine), mille tulemuseks on 9 (11,1 mg). Ühendi 9 jaoks kasutatud eraldamisprotseduur oli sama, mida eelnevalt kirjeldatud 4 puhul. EtOAc-MeOH-ga (60:40 ja 50:50, maht/o) elueeritud alafraktsiooniga F6.6.10 (92,0 mg) viidi läbi preparatiivne TLC, mida elueeriti CH-ga. Cl,-MeOH (90:10, v/o, üks elueerimine), saagis vastavalt 5 (1,7 mg) ja 6 (7,8 mg). Subfraktsioon F6.6.11 (326,0 mg), mida elueeriti EtOAc-MeOH-ga (50:50, 40:60, 30:70, 20:80 ja 10:90, maht/o), allutati ettevalmistavale TLC-le, mida elueeriti CHCl-ga. MeOH (90:10, v/o, üks elueerimine) vastavalt 1 (2,4 mg) ja 7 (12,5 mg).

EtOAc-ga (100 protsenti) ja CHCl2-EtOAc-ga (95:05,90:10,85:15 ja 75:25,ofo) elueeritud fraktsioon F7 (692,4 mg) töödeldi uue silikageeliga. CCkasutatakse sama metoodikat, mida on kirjeldatud esialgse CC puhul samade lahustisüsteemidega, mis annab 110 fraktsiooni (igaüks 30 ml). Pärast TLC hindamist, kasutades CH2Cl2-MeOH segu vahekorras 95:05, 90:10 ja 85 :15 eluentsüsteemina (o/o) ühendati sarnased proovid, saades 12 alamfraktsiooni (F7.1 kuni F7.12).F7.8 (147,4 mg), elueeriti CH,Cl2- EtOAc (50:50, 40:60 ja 30:70, mahuprotsenti) allutati preparatiivsele TLC-le, mida elueeriti CHCl-MeOH-ga (95:05, vfo, üks elueerimine), saades 10 (5,4 mg) ja 11( vastavalt 120,6 mg). F7.9 (144,2 mg), mis oli elueeritud CHCl2-EtOAc-ga (30:70, 20:80 ja 10:90, mahuprotsent), viidi samuti läbi preparatiivse TLC, elueeriti CH,Cl,-MeOH-ga ( 95:05, vo, üks elueerimine), mis andis vastavalt 11 (91,2 mg) ja 12 ja 13 segu (39,4 mg).

talifoliin (1): pruun amorfne pulber;”. H-NMR ja13C-NMR vastavalt kirjandusele [32]; LR-ESI(pluss)-MS [M pluss H]* pluss m/z 208.

Anonain (2): pruun amorfne pulber; 1H-NMR ja13C-NMR vastavalt kirjandusele [33]; LR-ESI(pluss)-MS [M pluss H] pluss m/z 266.

Liriodeniin (3): kollased kristallid (CH,Cl-MeOH 3:1);1H-NMR ja13C-NMR vastavalt kirjandusele [10,34]; LR-ESI(pluss)-MS [M pluss H] pluss m/z 276.

(S)-(pluss )-Retikuliin(4): pruun amorfne pulber; [ ]p25 pluss 71,60 (c 0,05 g/100 ml, MeOH); 1H-NMR ja13C-NMR vastavalt kirjandusele [27;LR-ESI(pluss)-MS [M pluss H] pluss m/z 30.

3,4-dihüdro-7-hüdroksü-6-metoksü-1-isokinolinüül)(3-hüdroksü-4-metoksüfenüül)metanoon (dehüdrooksonorretikuliin)(5 ): pruun amorfne pulber; 'H ja13C-NMR andmed, vt tabel 1; LR-ESI(pluss)-MS [M pluss H] pluss m/z 328.

( pluss ){{0}}S,2R-retikuliin-N-oksiid(6): pruun amorfne pulber; [lp25 pluss 136,4 (c0,146 g/100 ml, MeOH); 1 käsitsi 13C-NMR andmed, vt tabel 1; LR-APCI(pluss)-MS [M pluss H] pluss m/2346

( pluss ){{0}}S,2S-Retikuliin-N-oksiid (7): pruun amorfne pulber; []p25 pluss 394,5 (c 0,03 g/100 ml, MeOH);'H ja13C-NMR andmed, vt tabel 1; LR-APCI(pluss)-MS [M pluss H] pluss m/z346.

Koreksimiin (8): helekollane amorfne pulber;[ ]p25 pluss 201,1(c 0,08g/100mL, MeOH)'H-NMR ja 13C-NMR vastavalt kirjandusele[34,35];LR- ESI(pluss)-MS [M pluss H] pluss m/z 328.

Bisnorargemoniin (9): pruun amorfne pulber; 1H-NMR ja13C-NMR vastavalt kirjandusele [36]; LR-APCI(pluss)-MS [M pluss H] pluss m/z 328.

Isochamanetin (10): helekollane amorfne pulber; [p25-12,4(c 0,5 g/100 ml, MeOH)'H-TMR ja13C-NMR vastavalt kirjandusele [37;LR-APCI(-)-MS [MH]-m/z361.

Dichamanetin (11): kollane amorfne pulber; [ ]D25-10,7 (c 0,5 g/100 ml, MeOH);1H-NMR ja13C-NMR vastavalt kirjandusele [37]; LR-ESI(-)-MS [MH]-m/z467.

Uvarinooli (12) ja isouvarinooli (13) segu: kollane amorfne pulber; H-NMR ja13C-NMR vastavalt kirjandusele [37]; LR-ESI(-)-MS [MH]- m/z 573.

3.4. In vitro tsütotoksiline analüüs

3.4.1. Lahtrid

HL-60 (inimese promüelotsüütiline leukeemia), MCF-7 (inimese rinna adenokartsinoom), HepG2 (inimese hepatotsellulaarne kartsinoom), HCT116 (inimese käärsoole kartsinoom) ja MRC-5 (inimese kopsufibroblast) rakuliinid saadi ettevõttest American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA) ja neid kultiveeriti vastavalt ATCC loomarakukultuuri juhendile. Kõiki rakuliine testiti mükoplasma suhtes, kasutades mükoplasma värvimiskomplekti (Sigma-Aldrich), et kinnitada saastumiseta rakkude kasutamist.

3.4.2. Tsütotoksilisuse test

Tsütotoksilisuse testi jaoks kvantifitseeriti rakkude elujõulisus Alamar blue meetodil, nagu eelnevalt kirjeldatud [{{0}}]. Kõigi katsete jaoks plaaditi rakud 96-süvendiga plaatidele. Keemilised komponendid lahustati dimetüülsulfoksiidis (DMSO, Vetec Ouimica Fina Ltda., Duque de Caxias, RJ, Brasiilia) ja lisati igasse süvendisse ja inkubeeriti 72 tundi. Positiivse kontrollina kasutati doksorubitsiini (doksorubitsiinvesinikkloriid, puhtus 95% või suurem, Laboratory IMA SAIC, Buenos Aires, Argentina). Ravi lõpus kasutati 20 μl resasuriini põhilahust (0,312 mg/mL). Igasse süvendisse lisati (Sigma-Aldrich Co.) Neeldumised lainepikkustel 570 nm ja 600 nm mõõdeti SpectraMax190 mikroplaadilugejaga (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA) Poolinhibeeriv kontsentratsioon (IC50) saadi mittelineaarse regressiooniga. 95-protsendilise usaldusvahemikuga (CI95 protsenti), kasutades tarkvara GraphPad Prism (Intuitive Software for Science; San Diego, CA, USA).

4. Järeldused

D.calycina koore fütokeemiline uurimine viis kolmeteistkümne ühendi (1-13) eraldamiseni ja identifitseerimiseni; üheksa isokinoliinist pärinevat alkaloidi (1-9) ja neliflavonoidid(10-13). Alkaloidid kuuluvad järgmistesse alamklassidesse: lihtne isokinoliin, tali online (1);aporfiin, anonain (2); oksoaporfiin, liriodeniin (3); bensüültetrahüdroisokinoliinid, ( pluss )-retikuliin(4), de hüdrooksonorretikuliin(3,4-dihüdro-7-hüdroksü-6-metoksü-1-isokinolinüül)({{13} }hüdroksü-4-metoksüfenüül)metanoon)(5), 1S,2R-retikuliin-Ng-oksiid(6) ja 1S,2S-retikuliin-N-oksiid (7); tetrahüdroprotoberberiin, koreksimiin (8); ja paviin, bisnorargemoniin (9). Kui flavonoidid kuuluvad bensüülitud dihüdroflavoonide hulka, siis isorhamnetiin (10), dichamanetin (11) ning uvarinooli (12) ja isouvarinooli (13) segu. Eraldatud ühendeid kirjeldatakse esmakordselt nii D.calycina kui ka Diclinanona perekonnas.

Eraldatud ühendite (v.a anonain, liriodeniin, 1,2-dihüdrooksonorretikuliin ja koreksimiin) tsütotoksilist toimet hinnati vähi suhtes (HL-60, MCF-7, HepG2 ja HCT116) ja mittevähi (MRC-5) ​​rakuliinid. Neist kõige lootustandvamaid tulemusi täheldati bensüülitud dihüdroflavoonide dichamanetiini (10) ja

uvarinooli (12) ja isouvarinooli (13) segu, millel oli mõõdukas tsütotoksiline toime testitud vähirakuliinide suhtes ()<20.0μg.ml-1）and low="" cytotoxicity="" against="" the="" non-cancerous="" cell="" line="" mrc-5(="">25.0 ug·mL-'). Dichamanetiinil (11) oli HL-60 ja HCT116 vastane tsütotoksiline toime IC50 väärtustega 15,78 ug·mL-1 (33,70 µmol-L-1) ja 18,99 ug·mL-I (40,99 ug·mL-I) .L-1）, samas kui uvarinooli (12) ja isouvarinooli (13) segu näitas tsütotoksilist toimet HL-60 (IC50 väärtusega 9,74 ug∶mL-I) ja HCT116 (IC50) vastu. väärtus 17,31 ug·mL-1. Neid kasvajarakuliinide tulemusi kirjeldatakse esmakordselt ka bensüülitud dihüdroflavoonide puhul. Varem tehti kindlaks retikuliini, anoniini ja liriodeniini tsütotoksiline toime, milles liriodeniin on kõige tugevam ühend.

Selles töös saadud tulemused näitavad, et Annonaceae perekonna liigid on paljulubavad tsütotoksiliste omadustega bioloogiliselt aktiivsete ühendite allikad ja viitavad nende uurimise jätkamisele teistes bioloogiliste analüüside mudelites.

Viited

1. Couvreur, TLP; Pirie, MD; Chatrou, LW; Saunders, RMK; Su, YCF; Richardson, JE; Erkens, RHJ Õistaimede perekonna Annonaceae varajane evolutsiooniline ajalugu: pidev mitmekesistumine ja boreotroopne geodispersioon. J. Biogeogr. 2011, 38, 664–680. [CrossRef]

2. Corrêa, parlamendiliige Dicionário das Plantas Úteis do Brasil e das Exóticas Cultivadas; IBDF Ministério da Agricultura: Rio de Janeiro, Brasiilia, 1984.

3. Leboeuf, M.; Cave, A.; Bhaumik, PK; Mukherjee, B.; Mukherjee, R. Annonaceae fütokeemia. Phytochemistry 1982, 21, 2783–2813. [CrossRef]

4. Rupprecht, JK; Hui, Y.-H.; McLaughlin, JL Annonaatsed atsetogeniinid: ülevaade. J. Nat. Prod. 1990, 53, 237–278. [CrossRef]

5. Lúcio, ASSC; Almeida, JRGDS; Da-Cunha, EVL; Tavares, JF; Filho, JMB Annonaceae alkaloidid: esinemine ja nende bioloogilise tegevuse kogumik. Raamatus The Alkaloids; Knolker, H.-J., toim.; Elsevier: Amsterdam, Holland, 2015; 5. peatükk; 74. köide, lk 233–409. [CrossRef]

6. Souza, CAS; Nardelli, VB; Paz, WHP; Pinheiro, MLB; Rodrigues, ACBC; Bomfifim, LM; Soares, MBP; Bezerra, DP; Chaar, JS; Koolen, HHF; et al. Asaroonist pärinevad fenüülpropanoidid ja isokinoliinist saadud alkaloidid Duguetia pycnastera (Annonaceae) koorest ja nende tsütotoksilisus. Quim. Nova 2020, 43, 1397–1403. [CrossRef]

7. Araújo, MS; Silva, FMA; Koolen, HHF; Costa, EV Isokinoliinist saadud alkaloidid Guatteria olivacea (Annonaceae) koorest. Biochem. Syst. Ecol. 2020, 92, 104105. [CrossRef]

8. Ngouonpe, AW; Mbobda, ASW; Õnne, GM; Mbiantcha, M.; Tatuedom, OK; Ali, MS; Lateef, M.; Tchouankeu, JC; Kouam, SF Looduslikud tooted ravimtaimest Duguetia staudtii (Annonaceae). Biochem. Syst. Ecol. 2019, 83, 22–25. [CrossRef]

9. Santos, RC; Souza, AV; Andrade-Silva, M.; Cruz, KCV; Kassuya, CAL; Cardoso, CAL; Vieira, MC; Formaggio, ASN Duguetia furfuracea (A. St.-Hil.) Benthi ekstrakti ja ditsentrinooni antioksüdantne, reuma- ja põletikuvastane uurimine. & Konks. f. J. Ethnopharmacol. 2018, 211, 9–16. [CrossRef]

10. Costa, EV; Pinheiro, MLB; Souza, ADL; Barison, A.; Campos, FR; Valdez, RH; Ueda-Nakamura, T.; Dias Filho, BP; Nakamura, CV Annona foetida Mart okstest pärit oksoaporfiini ja pürimidiin- -karboliinalkaloidide trüpanotsiidne toime. (Annonaceae). Molecules 2011, 16, 9714–9720. [CrossRef]

11. Silva, DB; Tulli, ECO; Milita, GCG; Costa-Lotufo, LV; Pessoa, C.; Moraes, MO; Albuquerque, S.; Siqueira, JM Duguetia furaceast eraldatud ekstrakti ja alkaloidide kasvajavastane, trüpanotsiidne ja leishmaniaalne toime. Fütomeditsiin 2009, 16, 1059–1063. [CrossRef] [PubMed]

12. Costa, EV; Pinheiro, MLB; Xavier, CM; Silva, JRA; Amaral, ACF; Souza, ADL; Barison, A.; Campos, FR; Ferreira, AG; Machado, GMC; et al. Pürimidiin- -karboliin ja teised Annona foetida alkaloidid, millel on antileishmaniaalne toime. J. Nat. Prod. 2006, 69, 292–294. [CrossRef]