Võrgufarmakoloogia uuring Hypericum Japonicum'i molekulaarsete mehhanismide kohta kolestaatilise hepatiidi ravis koos valideerimisega alfa-naftüülisotiotsüanaadi (ANIT) hepatotoksilisuse rotimudelis

Lisateabe saamiseks. kontaktitina.xiang@wecistanche.com

Taust: selle võrgustiku farmakoloogiauuringu eesmärk oli tuvastada aktiivsed ühendid ja molekulaarsed mehhanismid, mis on seotud Hypericum japonicum'i mõjuga kolestaatilisele hepatiidile. Kinnitasime leiud alfa-naftüülisotiotsüanaadi (ANIT) roti hepatotoksilisuse mudelis.

Materjal/meetodid: H.japonicum'i keemilised koostisosad ja sihtmärgid ning varem kolestaatilise hepatiidiga seotud sihtgeenid leiti avalikest andmebaasidest. Võrk konstrueeriti tarkvara Cytoscape 3.7.2 abil ning bioinformaatika avaliku platvormi põhjal analüüsiti andmebaasi STRING ja potentsiaalseid valgufunktsioone. ANIT-i kasutati kolestaatilise hepatiidi esilekutsumiseks rotimudelil, kasutades 36 Sprague-Dawley rotti, ja seda mudelit kasutati sekkumise uurimiseks 3 annusega.kvertsetiin(väike annus, 50 mg/kg; keskmine annus, 100 mg/kg; ja suur annus, 200 mg/kg), H.japonicum'i peamine toimeaine. Seerumi biokeemiliste indeksite tasemeid mõõdeti kaubanduslike komplektidega, ja messenger RNA (mRNA) taset maksa ja mitokondriaalse funktsiooni markerite jaoksüdatiivne stresstuvastati reaalajas pöördtranskriptsiooni-polümeraasi ahelreaktsiooni (RT-PCR) abil.

Tulemused: H. japonicum'i peamised toimeained olid kvertsetiin, kaempferool ja tetrametoksüluteoliin. ja nende peamised sihtmärgid olid prostaglandiini G/H süntaas 2 (PTGS2), B-raku lümfoom-2 (BCL2), kolesterooli7-alfa-hüdroksülaas (CYP7A1) ja farnesoid X retseptor (FXR). Kvertsetiini sekkumine soodustas kolestaatilisest hepatiidist taastumist.

Selle uuringu tulemused toetavad tulevasi uuringuid kvertsetiini, kaempferooli ja kvertsetiini rollide kohta.

Järeldused: tetrametoksüluteoliin inimese maksahaiguste korral ja PTGS2, BCL2, CYP7A1 ja FXR geenide roll kolestaatilise hepatiidi korral.

Märksõnad: kolestaas, intrahepaatiline · Geeni reguleerivad võrgustikud · Hypericum · Meditsiin, traditsiooniline hiina · Farmakoloogia · Kvertsetiin

Taust

Kolestaason kliiniline sündroom, mis hõlmab maksakahjustusi, mis on põhjustatud sapi ebanormaalsest moodustumisest, sekretsioonist ja eritumisest. Kolestaatilised maksahaigused on tihedalt seotud sapphappe sünteesi ja transpordi häiretega ning põhjustavad sageli kolestaatilist maksakahjustust, mis võib lõpuks areneda maksafibroosiks, tsirroosiks ja maksapuudulikkuseks [1,2].

Kolestaas on üks peamisi kolestaatilise hepatiidi ja alfa-naftüülisotiotsüanaadi (ANIT) põhjustatud kolestaasi põhjuseid ning võib lõpuks põhjustada kolestaatilise hepatiidi. ANIT on keemiline toksiin, mida kasutatakse hepatotsellulaarse nekroosi, sapiteede hüperplaasia ja maksafibroosi esilekutsumiseks, mida kasutatakse katseloomamudelites maksakahjustuse või kolestaatilise hepatiidi tekitamiseks. Uuringutes süstiti rottidele intraperitoneaalselt ANIT-i, et replitseerida kolestaatiline hepatiit [3-5]. Maksakahjustuse histopatoloogilised tunnused kolestaasi ajal hõlmavad maksakoe nekroosi, sapiteede proliferatsiooni, hüdroptilisi muutusi,põletikja fibroos. ANIT-indutseeritud kolestaas loomadel näitab maksakahjustuse biomarkerite, nagu alaniini aminotransferaas (ALD), aspartaataminotransferaas (AST), leeliseline fosfataas ja y-glutamiin-üültranspeptidaas (y-GGT) aktiivsust märkimisväärselt.Oksüdatiivne stresson samuti märkimisväärselt suurenenud, mida tõendab reaktiivsete hapnikuliikide kõrge tase, lipiidide peroksüdatsioon, ammendunud glutatiooni reservuaarid ja kudede antioksüdantide vähenemine maksas. Veelgi olulisem on see, et ANIT-indutseeritud loomadel on mitokondriaalse dehüdrogenaasi aktiivsuse pärssimine, mitokondriaalse membraani potentsiaali kokkuvarisemine ja mitokondriaalne turse. ANIT-indutseeritud kolestaatiliste rottide mitokondritel on suurenenud vastuvõtlikkus mitokondriaalse läbilaskvuse ülemineku pooride avanemisele ja ATPaasi aktiivsuse repolarisatsiooni vähenemisele. Järelikult on kolestaatiline hepatiit tihedalt seotud maksafunktsiooni, oksüdatiivse stressi ning mitokondrite struktuuri ja funktsioonidega [6,7].

Praegu kasutatakse haiguste raviks vaid väheseid ravimeid, näiteks ursodeoksükoolhapet (UCDA).kolestaas[8,9]; kuid neil ravimitel on puudusi, sealhulgas halb ravivastus, kõrvaltoimed ja vähene ravisoostumus. Traditsioonilisel hiina meditsiinil on aga pikk ajalugu ja rikkalik kliiniline kogemus maksahaiguste, nagu intrahepaatiline kolestaas, ravimisel. Hypericum japonicum on taime Hypericum japonicum Thunb kuivatatud täishein. ex Murray'd, tuntud ka kui Di-er-Cao või Tian-ji-Huang, on kollatõve ravis kasutatud Qingi dünastia ajast peale. H. japonicumil on kuumuse eemaldamise, niiskuse eemaldamise, maksa rahustamise ja sapipõie tugevdamise funktsioonid ning seda kasutatakse tavaliselt niiske kuumuse kollatõve kliinilises ravis [10]. H. japonicum'i keemiline koostis sisaldab flavonoide, lantanoide, kromoonglükosiide, floroglütsinooli derivaate ja laktoone. Flavonoididest on hepatoprotektiivse toimega koostisained kvertsitriin, isokvertsitriin ja kvertsetiin-7-O- -l-ramnosiid [11]. Ning Wang jt näitasid, et H.japonicum'i vesiekstraktidel, sealhulgas kvertsetiinil, isokvertsetiinil ja kvertsetiinil, on hepatotoksiline ja kolestaasivastane toime süsiniktetrakloriidist põhjustatud hepatiidi ja ANIT-indutseeritud kolestaasi katseloomadele [12]. Siiski on H. japonicum'i mehhanismid ja sihtmärgid intrahepaatilise kolestaasi ravis endiselt ebaselged.

Selles uuringus ühendati võrgufarmakoloogia ja farmakoloogilised katsed. Esiteks tuvastati in silico H.japonicumi peamised aktiivsed komponendid ja sihtmärgid ning neid kasutati komponent-sihtvõrgu loomiseks[13,14]. Viidi läbi sihtgeenide funktsionaalse rikastamise analüüsid, et uurida võimalikke terapeutilisi mehhanisme kolestaatilise hepatiidi ravis. Seejärel kasutati ANIT-i poolt indutseeritud kolestaatilise hepatiidi rotimudelit, et paljastada mehhanismid, mis on aluseks H.japonicum'i toimele kolestaatilise hepatiidi ravis ja selle kaitsva toime kohta maksale. Täpsemalt uurisime mitokondriaalse membraani potentsiaali, hepatotsüütide apoptoosi, intrahepaatilise sapphappe homöostaasi reguleerimist ja muid teid.

Materjalid ja meetodid

Kemikaalid ja reaktiivid

H. japonicum Thunb. endine Murray osteti ettevõttelt Kangmei Pharmaceutical Co., Ltd. (Puning, Hiina); -naftüülisotiotsüanaat (ANIT, 98 protsenti) osteti ettevõttelt Shanghai Macklin Biochemical Co., Ltd. (Shanghai, Hiina);kvertsetiin(>98.0%)and ursodeoxycholic acid (UCDA,>98 protsenti osteti ettevõttelt Dalian Melone Biology Technology Co., Ltd. (Dalian, Hiina). Oliiviõli osteti firmalt Sigma Aldrich Trading Co., Ltd. (Shanghai, Hiina). Malondialdehüüdi (MDA), superoksiiddismutaasi (SOD), otsese bilirubiini (DBI), üldbilirubiini (TBIL), üldsapphappe (TBA), ALT ja AST analüüsikomplektid ning glutatioonperoksidaasi (GSH-Px) komplektid osteti ettevõttest. Nanjing Jianchengi bioinseneriinstituut (Nanjing, Hiina). Bio-Rad DC valguanalüüsi reaktiivi pakend osteti ettevõttest Bio-Rad Laboratories (CA, USA). HyPure molekulaarbioloogia kvaliteediga vesi, FastStart Universal SYBR Green Master mix (Rox) ja RevertAid First Strand cDNA sünteesikomplekt osteti firmalt Thermo Fisher. Scientific Co., Ltd. (Shanghai, Hiina). Praimerid PTGS2, B-raku lümfoomi-2(BCL2), kolesterooli 7-alfa-hüdroksülaasi (CYP7A1), farnesoidi X retseptori (FXR), interleukiini-1 beeta(L{{) vastu 13}}B) ja kasvaja nekroosifaktor-alfa (TNF-o) osteti ettevõttelt Service bio Technology Co., Ltd. (Wuhan, Hiina). Kõik muud kemikaalid ja reaktiivid olid analüütilise kvaliteediga või kõrgemad ning osteti kaubanduslikest allikatest.

Loomad

Isased Sprague-Dawley rotid kaaluga 180–220 g osteti Southami Meditsiiniülikooli katseloomade keskusest (SCXK(YUE)2018-0085). Rotte hoiti ad libitum toidu ja veega puurides ning neid aklimatiseeriti laboris 1 nädal enne iga katset. Kõik loomi ja hooldust hõlmavad protseduurid kiitis heaks Guangzhou Meditsiiniülikooli õppe- ja uurimisosakonna inim- ja loomasubjektide kasutamise komitee. Looma tunnistuse number oli 44002100016560.

H.japonicum'i komponentide ja sihtmärkide sõelumine

Võttes otsingusõnaks "Di-er-cao", otsisime traditsioonilise hiina meditsiini süsteemide farmakoloogia andmebaasist H.japonicumi keemilisi koostisosi ja nendega seotud sihtmärke, mis on väärtuslik platvorm Hiina taimsete ravimite süsteemsete farmakoloogiliste uuringute jaoks. ravimite, sihtmärkide ja haiguste vaheliste võrgustike suhete andmebaas [15]. Sihtmärkidele vastavad geeninimed saadi UniPorti teabebaasi abil, mis on keskne keskus valkude funktsionaalse teabe kogumiseks[16]. Organism valiti "inimeseks".

Terapeutilise sihtmärgi ennustamine ja võrgu loomine

"Kolestaatiline hepatiit" kasutati märksõnana kolestaatilise hepatiidi valgu sihtmärkide ja vastavate geeninimede saamiseks GeneCardsi andmebaasis, mis kaevandab ja integreerib automaatselt inimese geenikeskse teabe arvukatest andmeallikatest [17]. Kolestaatilise hepatiidi terapeutilisteks sihtmärkideks valiti sihtmärgid "kingitustega 230". H.japonicum'i potentsiaalsete sihtmärkide saamiseks kolestaatilise hepatiidi raviks lõigati ravimi sihtmärgid ja haiguse sihtmärgid vastavalt "geeninimele". Component-target võrgu konstrueerimiseks kasutati tarkvara Cytoscape 3.7.2 [18] ja võrgu topoloogia parameetrite analüüsimiseks võrguanalüsaatori funktsiooni.

Sihtvalgu interaktsiooni analüüs

H.japonicum'i ja kolestaatilise hepatiidi ristumisobjektid imporditi Stringi andmebaasi, mis võib paljastada otseseid (füüsilisi) ja kaudseid (funktsionaalseid) valgu-valgu interaktsioone (PPI) [19]. Kõrge usaldusväärsusega (0.9) sõelumise tingimusena, eemaldades isoleeritud sihtmärgid ja määratledes liigi inimesena, loodi PPI-võrk. Pärast ülaltoodud andmete importimist Cytoscape'i kasutati PPI võrgu peamiste regulatiivsete sihtmärkide analüüsimiseks cytoHubba pistikprogrammis Maximal Clique Centrality (MCC) analüüsimeetodit.

Sihtfunktsiooni ja raja rikastamise analüüs

Sihtvalgu geenide bioloogiliste protsesside ja signaaliradade paremaks mõistmiseks sisestati H. japonicum'i kolestaatilise hepatiidi ravi eesmärgid Metascape'i, võimsasse geeniannotatsiooni analüüsivahendisse[20]. Liik piirdus inimestega ja P<0.01 was="" set="" as="" the="" significance="" threshold.="" gene="" ontology="" (go)="" functional="" annotation="" and="" kyoto="" encyclopedia="" of="" genes="" and="" genomes="" (kegg)pathway="" enrichment="" analyses="" were="" carried="" out,="" and="" the="" first="" 20="" cluster="" analysis="" results="" were="" drawn="" into="" a="" bar="" chart="" for="" visual="" processing="" using="" the="" omicshare="" tools,="" a="" free="" online="" platform="" for="" data="" analysis="" and="" detailed="" implementation="" process,="" as="" shown="" in="" figure="">

Kvertsetiini terapeutiline toime ANIT-indutseeritud roti kolestaatilisele hepatiidile

36 isast Sprague-Dawley rotti jagati juhuslikult 6 rühma (n =6 rühma kohta): rühm sai lokaalselt tühja kandjat 7 päeva ja ip süsti oliiviõli (2 ml/kg kehakaalu kohta) 5. päeval. ; Rühm II sai suuliselt tühja vehiikulit 7 päeva; II rühma raviti suukaudselt UCDA-ga (50 mg/kg kehamassi kohta) 7 päeva; V rühma raviti suukaudselt suurtes annustes kvertsetiiniga (Que H; 200 mg/kg kehakaalu kohta) 7 päeva; V rühma raviti suukaudselt keskmise annusega kvertsetiiniga (QueM; 100 mg/kg kehamassi kohta) 7 päeva; ja VI rühma raviti 7 päeva suukaudselt madala annusega kvertsetiiniga (Quel, 50 mg/kg kehamassi kohta). Rottidele rühmas Il-VIl manustati ANIT-oliiviõli lahust (100 mg/kg, ip, 2 ml/kg kehakaalu kohta) 2 tundi pärast UCDA või kvertsetiini manustamist 5. päeval. Mudel- ja kontrollrühmi raviti suukaudselt tühja lahusti iga päev [21,22].

Nelikümmend kaheksa tundi pärast viimast ANIT-i manustamist surmati loomad anesteesiaga ip süstimise teel (100 mg/kg pentobarbitaali). Biokeemiliseks hindamiseks koguti veri kõhuaordist. Maks võeti kohe välja ja kaaluti. Suur osa maksast külmutati vedelas lämmastikus ja ülejäänud kude fikseeriti 4-protsendilises paraformaldehüüdis, töödeldi ja sisestati parafiini histoloogiliseks uurimiseks pärast hematoksüliini ja eosiini (H&E) värvimist. Maksakahjustusi hinnati ALT, AST, DBIL, TBIL, TBA ja andy-GGT tasemete põhjal, kasutades Chemray 240 automaatset biokeemilist analüsaatorit (Rayto Life and Analytical Sciences Co., Ltd., Shenzhen, Hiina). MDA, GSH-Px ja SOD tasemeid hinnati kaubanduslike komplektide abil vastavalt tootja juhistele ning histoloogiline hindamine ja punktide määramine viidi läbi standardsete kriteeriumide kohaselt patoloogi poolt, kes oli uuringu suhtes pime. Reaalajas pöördtranskriptsiooni-polümeraasi ahelreaktsiooni (RT-PCR) analüüsi jaoks külmutati maksakude kiiresti vedelas lämmastikus ja säilitati kuni analüüsimiseni -80 kraadi juures.

PTGS2, BCL2, CYP7A1, FXR, Il-1 ja TNF-mRNA analüüs RT-PCR abil

kogu RNA ekstraheeriti maksa kudedest, kasutades TRlzolit vastavalt tootja juhistele (Service bio, Wuhan, Hiina). Kogu RNA (10 μLl) pöördtranskribeeriti cDNA-ks. PCR reaktsioonid (20 ul) GAPDH, PTGS2, BCL2, CYP7A1, FXR, TNF- ja IL-1 jaoks sisaldasid 2 μL cDNA ,2 μL 2,5 μM praimerit, 10 μLgPCR segu ja 6 μL ddH,O. Reaktsioone inkubeeriti 65 kraadi juures 10 minutit, seejärel 42 kraadi juures 60 minutit ja lõpetati 72 kraadi juures 15 minutit. PCR praimeri järjestused on loetletud tabelis 1. RT-PCR reaktsioonid viidi läbi järgmiselt: eeltsükli etapp 95 °C juures 10 minutit, millele järgnes 40 denaturiseerimistsüklit temperatuuril 95 °C 30 sekundit ja anniilimine 60 °C juures. 60 s. Sulamiskõver oli 65 kraadist 95 kraadini tõusukiirusega 0,3 kraadi C/15 s. Fluorestsentsi mõõdeti iga lõõmutamisetapi lõpus ja PCR-produktide spetsiifilisuse kinnitamiseks jälgiti sulamiskõveraid. 2-一CT meetodit kasutati PTGS2, BCL2, CYP7A1, FXR, IL-1B ja TNF-mRNA mRNA ekspressioonitasemete määramiseks võrreldes kontrollgeeniga GAPDH.

Statistiline analüüs

Kõik andmed väljendati kui keskmine ± standardhälve (SD). Statistiline analüüs viidi läbi GraphPad Prism 8 abil.

3.0(GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA). Andmeid analüüsiti ühesuunalise dispersioonanalüüsi (ANOVA) abil, millele järgnes Dunnetti test.P<0.05 was="" considered="" statistically="">

Tulemused

H.japonicum'i komponendid ja sihtmärgid

H. japonicum'i komponentide täielikuks uurimiseks ei seadnud me skriiningukriteeriumideks farmakokineetilisi parameetreid, nagu suukaudne biosaadavus ja ravimisarnasus. TCMSP andmebaasi kaudu saadi 49 H. japonicum'i aktiivset komponenti ja 499 vastavat sihtmärki. Pärast duplikaatide eemaldamist ja nimede parandamist Uniproti poolt säilitati 269 sihtmärki. H.japonicum'i aktiivsed komponendid ja parameetrite teave on toodud tabelis 2.

H.japonicum'i eesmärgid kolestaatilise hepatiidi ravis

GeneCardsi andmebaasis skriiniti 682 kolestaatilise hepatiidi sihtmärki. Lõpuks saadi 93 sihtmärki, mis võivad olla seotud kolestaatilise hepatiidi H. japonicum'i raviga, ületades aktiivsete komponentide ja haiguse sihtmärgid (joonis 2).

Liitsihtvõrk

H. japonicum'i komponent-sihtvõrk kolestaatilise hepatiidi ravis koosnes 115 sõlmest ja 175 servast, kusjuures 22 kuusnurkset sõlme esindasid aktiivseid komponente ja 93 V-kujulist sõlme tähistasid sihtmärke (joonis 3).

Sõlmede suurus ja läbipaistvus määrati vastavalt kraadile. Mida suurem on kraadi väärtus, seda suurem on sõlm ja mida tumedam on värv, seda suurem on ühenduvus ja tähtsus. Nagu tulemused näitavad, oli H. japonicum mitmekomponendiline ja mitme sihtmärgi toime; see tähendab, et 1 ühend interakteerub mitme sihtmärgiga ja erinevad ühendid interakteeruvad sama sihtmärgiga. Võrgu topoloogia parameetrite (nt aste, vahekaugus ja lähedus) järgi olid peamised aktiivsed komponendid kvertsetiin, kaempferool ja tet-rametoksüluteoliin (tabel 3) ning põhisihtmärgid PTGS2, lämmastikoksiidi süntaas (NOS3), peroksisoomi proliferatiivne aktiveeritud retseptor gamma (PPARG), dipeptidüülpeptidaas V (DPP4), BCL2 ja TNF (tabel 4).

PPI võrk

93 ravimi-haiguse ristumisobjekti koostoimet analüüsiti andmebaasi STRING abil. Määrati kõrge usaldusväärsus (0.9), eraldatud sihtmärgid peideti ja saadi 81 sihtmärgi ja 299 interaktsioonilingiga PPI-võrk (joonis 4A). Rakendades cytoHubba MCC algoritmi, olid PPI võrgu 10 peamist reguleerivat sihtmärki TNF, IL6, IL1B, CXCL8, IL10, CCL2, ICAM1, NFKB1, NFKBIA ja MYC (joonis 4B).

Sihtfunktsiooni ja raja rikastamine

Terapeutiliste sihtmärkide GO funktsionaalse annotatsiooni ja KEGG raja rikastamise analüüsid viidi läbi, kasutades Metascape'i. Kokku saadi 1899 GO eset, sealhulgas 41 üksust raku koostise, 105 üksust molekulaarse funktsiooni kohta ja 1753 eset bioloogilise protsessi kohta. Peamised bioloogilised protsessid ja rakukomponendid, milles H. japonicum osales, hõlmasid vastuseid lipopolüsahhariidile, tsütokiinide vahendatud signaaliülekannet, apoptootilist signaaliülekannet, membraaniparve (joonis 5A, 5B) ja molekulaarseid funktsioone, sealhulgas tsütokiini retseptoriga seondumist, transkriptsioonifaktori sidumist ja seriini -tüüpi endopeptidaasi aktiivsus (joonis 5C). Kokku analüüsiti 146 KEGG signaaliülekande rada, millest kõige tähelepanuväärsemad olid AGE-RAGE ja TNF signaalirajad ning B-hepatiit, arginiini biosüntees ja sapi sekretsioon. (Joonis 5D).

Kvertsetiin on kaitstud ANIT-indutseeritud kolestaatilise hepatiidi vastu rottidel

Intrahepaatilise kolestaasi rotimudelis taastas kvertsetiin maksa/kehakaalu suhte kolestaasiga maksakahjustuse korral (joonis 6). Seerumi ALT, AST, DBIL, TBIL, TBA ja Y-GGT, mida kasutati maksarakkude kahjustusega seotud intrahepaatilise sapiteede proliferatsiooni ja kolestaasi hindamiseks, suurenesid mudelrottidel drastiliselt. Seevastu vähendas kvertsetiin annusest sõltuvalt seerumi ALAT, AST, DBIL, TBIL, TBA ja GGT taset. Samamoodi leevendas kvertsetiinravi ANIT-indutseeritud maksa oksüdatiivset stressi, suurendas seerumi SOD ja GSH-Px taset ning alandas MDA taset (joonis 7).

H&E värvimisega tehtud histoloogilised hinnangud andsid otsese tõendi kvertsetiini ennetava ja terapeutilise toime kohta ANIT-indutseeritud intrahepaatilisele kolestaasile. H&E värvimine näitas, et kontrollrühma maksakoel oli normaalne mikrostruktuur, maksa lobulid olid selged ja maksarakkude kaabel oli puhas ja korras, ilma ebanormaalsete morfoloogiliste muutusteta. Seevastu ANIT-iga töödeldud maksaosad näitasid ebamäärast maksasagara struktuuri, maksaväädi häireid, maksa turset, hüpereemiat ja nekroosi (joonis 8A). Kuid kvertsetiin nõrgendas oluliselt maksa mädanemist ja põletikuliste rakkude infiltratsiooni, näidates annuse ja toime suhet. Need tulemused näitasid, et kvertsetiin kaitses ANIT-indutseeritud maksakahjustuse eest, mis tulenes intrahepaatilisest kolestaasist rottidel.

Kvertsetiiniga kaitstud PTGS2, BCL2, CYP7A1, FXR I-1B ja TNF-mRNA ekspressioon

Et täiendavalt hinnata kvertsetiini kaitsvat toimet hepatotsüütidele ANIT-indutseeritud intrahepaatilise kolestaatilise maksakahjustusega rottidel, mõõdeti PTGS2, BCL2, CYP7A1, FXR, IL-1 ja TNF-i mRNA tasemeid RT-PCR abil. Nagu on näidatud joonisel 8B, olid PTGS2, CYP7A1, IL-1 ja TNF-d võrreldes kontrollhiirtega ANIT mudelirühmas ülesreguleeritud, kuid BCL2 ja FXR olid allareguleeritud. Kuid kvertsetiini (annustes 50 100 ja 200 mg/kg) ja UCDA manustamine

vähendas oluliselt PTGS2, CYP7A1, IL-1 ja TNF-mRNA ekspressiooni 44,4 protsenti (P<><><0.05), and=""><0.05), respectively,="" and="" increased="" the="" expression="" of="" bcl2="" and="" fxr="" mrna="" by="" 92.9%="" and=""><0.01), respectively,="" was="" the="" anit="" model="" group.="" these="" results="" showed="" that="" quercetin="" could="" protect="" hepatocytes="" by="" accelerating="" the="" excretion="" and="" transport="" of="" bile="" acids,="" maintaining="" the="" mitochondrial="" membrane="" potential="" of="" hepatocytes,="" and="" inhibiting="">

Arutelu

Ühiselt kasutasime ANIT-indutseeritud rotimudelit, mis näitas, et H.japonicum võib olla kolestaatilise hepatiidi ravimeetod. Võrgufarmakoloogia ja farmakodünaamika katsed selgitasid H. japonicum'i toimet ja molekulaarset mehhanismi kolestaatilise hepatiidi ravis ning andsid teoreetilise aluse ürdi edasiseks uurimiseks ja kliiniliseks kasutamiseks.

H. japonicum'i peamised keemilised koostisosad on muu hulgas flavonoidid [23], floroglütsinooli derivaadid ja dipeptiidid [11]. Puthur jt tegid kindlaks, et H.japon-icum atsetooniekstraktide IC50 astsiidirakkudel on 29,30 ug/mL ning nende tulemused näitavad head kasvajavastast toimet in vitro ja et H.japonicum'i metanooliekstraktidel on sünergistlik toime kahjurite vastu, inhibeerides mõningaid võtmeensüüme. Nende katsed näitasid, et H. japonicumil on mitmesugused bioloogilised aktiivsused, mis nõuavad täiendavat uurimist [24,25]. Kaasaegsed farmakoloogilised uuringud on näidanud, et H. ja-ponicum'i ekstraktil on mitmesugused bioloogilised toimed, sealhulgas hepa-toprotektiivne, antioksüdatiivne,põletikuvastane, ja kasvajavastane toime.H.japonicum ja selle põhikomponendid kaitsevad süsiniktetrakloriidist põhjustatud hepatiidi, ANIT-indutseeritud kolestaasi ja pardi hepatiit A viirusevastase aktiivsuse eest ning parandavad maksafunktsiooni ja oksüdatiivseid kahjustusi[12,26]. Isokertsitriin ja kvertsetiin 7-ramnosiid on peamised aktiivsed hepatoprotektiivsed koostisosad [11,27]. Käesolev uuring näitas, et kvertsetiin, H.japonicum'i peamine koostisosa, võib vähendada ANIT-indutseeritud hepatotsüütide degeneratsiooni ja nekroosi ning vähendada maksakahjustuse taset. H&E tulemused kinnitasid veelgi kvertsetiini kaitsvat toimet kolestaatilise hepatiidi vastu.

Käesolevas uuringus ühendasime võrgustiku farmakoloogiauuringud loomfarmakoloogiliste katsetega. Esiteks skriinisime H. japonicum'i peamisi aktiivseid komponente ja sihtmärke kolestaatilise hepatiidi ravis. Seejärel koostasime "komponent-sihtmärgi" võrgu ja analüüsisime sihtmärkide funktsionaalset rikastamist, et uurida selle kolestaatilise hepatiidi vastase terapeutilise toime võimalikku mehhanismi. Lõpuks kontrollisime neid sihtmärke ja molekulaarseid mehhanisme loomkatsete abil. Intrahepaatilise kolestaasi biokeemilised indeksid ja patoloogilised omadused, mida me täheldasime, olid kooskõlas inimeste haigustega, toetades meie kolestaatilise hepatiidi rotimudeli kliinilist tähtsust.

Sapphappe taset seerumis peetakse intrahepaatilise kolestaasi häirete ja nendest tuleneva maksakahjustuse kliinilise diagnoosimise oluliseks tõendiks. Intrahepaatiline kolestaas põhjustab sapi ja maksafunktsiooni normaalse eritumise takistamist

ensüümid, mille tulemuseks on seerumi TBIL, DBIL ja TBA suurenemine, ning näitasime, et kvertsetiin muutis ANIT-indutseeritud sapphappe düsregulatsiooni. Lisaks vähendas kvertsetiin märkimisväärselt AST, ALT ja y-GGT taset seerumis, mis suurenes järsult hepatotsüütide degeneratsiooni ja nekroosi ning hepatotsüütide membraani kahjustuse tõttu.

Lipiidide peroksüdatsioon on ANIT-i põhjustatud kolestaatilise hepatiidi üks olulisi patoloogilisi mehhanisme, mis põhjustab maksarakkude kahjustusi |28-30]. Oksüdatiivse stressi tase kehas peegeldab kolestaatilise hepatiidi raskusastet, mistõttu on lipiidperoksiidi taseme hindamiseks kasutatavad GSH-Px, SOD ja MDA olulised näitajad. Käesolevas uuringus näitas iga kvertsetiini annustamisrühm oluliselt vähenenud MDA-d koos suurenenud SOD ja GSH-Px aktiivsusega. Need tulemused näitasid, et kvertsetiini poolt põhjustatud maksarakkude kahjustuste leevendamine oli seotud vabade radikaalide eemaldamise, lipiidide peroksüdatsiooni pärssimise ja lipiidperoksiidide tootmise vähendamisega.

Võrgufarmakoloogia tulemused näitasid, et H. japonicum'i kolestaatilise hepatiidi ravi peamised asjakohased sihtmärgid on PTGS2, NOS3, PPARG, DPP4, BCL2 ja TNF. Käesolevas uuringus on 5 sihtmärki, PTGS2, BCL2, TNF-, FXR ja CYP7A1. mis on seotud kolestaatilise hepatiidi, maksafibroosi ja maksakahjustusega, valiti molekulaarsel tasemel uuringuteks. PTGS2, tuntud ka kui tsüklooksügenaas 2, on NF-KB raja allavoolu molekul [31,32]. PTGS2 osaleb põletiku tekkes, soodustades rakkude proliferatsiooni, pärssides raku apoptoosi, soodustades angiogeneesi ja pärssides immuunfunktsiooni. TNF- on oluline põletikumediaator, mis osaleb kolestaasi protsessis. Meie uuringus reguleeriti PTGS2, TNF-valgu ja mRNA ekspressioonitasemeid ANIT-indutseeritud kolestaatilise maksakahjustuse mudelrottide maksakudedes, mis viitab sellele, et PTGS2 üleekspressioon võib soodustada ägedat maksakahjustust ja maksakahjustuse teket. kolestaas.

BCL2 on valk, mis pärsib raku apoptoosi. See hoiab ära rakukomponentide oksüdatiivse kahjustuse ja DNA fragmenteerumise ning reguleerib antioksüdatiivseid radu [33]. Samuti parandab see mitokondriaalse membraani potentsiaali ja pärsib tsütokroom C ja apoptoosi indutseerivate tegurite mitokondriaalset vabanemist, mõjutades rakumembraani transporti, pärssides seeläbi maksarakkude apoptoosi ja muid toimeid [34,35].

FXR on sapphappe retseptor, mis reguleerib sapphappe homöostaasi maksas [36]. See pärsib sapphappe sünteesi kiirust piirava ensüümi CYP7A1 aktiivsust negatiivse tagasiside regulatsiooni kaudu, mida vahendab väike heterodimeerne chaperon, ja vähendab sapphappe sünteesi. Samal ajal võib FXR ülesreguleerida transporterite BSEP ja MRP2 ekspressiooni hepatotsüütide sapijuha külgmembraanil, kiirendades sapphapete eritumist ja transporti, et kaitsta maksarakke [37,38].

Meie tulemused näitasid, et mudelrottidel on ANITi toimel suur hulk koolhappe staasi, mis viib FXR ekspressiooni allareguleerimiseni ja sellest tulenevalt CYP7A1 ekspressiooni suurenemiseni. Samuti põhjustas FXR-i allareguleeritud ekspressioon allavoolu geenide BSEP ja MRP2 ekspressiooni vähenemise, mida see reguleerib. Kvertsetiini sekkumine taastas oluliselt FXR ekspressioonitaseme roti maksa kudedes ja reguleeris selle allavoolu geenide CYP7A1, BSEP ja MRP2 ekspressiooni mudelirühma vastassuunas. Selle uuringu tulemused on kooskõlas varasemate uurimistulemustega.

ANIT-indutseeritud kolestaatilisel hepatiidil on inimesega sarnased biokeemilised ja patoloogilised muutused. Kuid ühe ANIT-ravi patoloogiline protsess oli käesolevas uuringus lühike, piirates uuringuid, mis tavaliselt nõuavad pikemat katseperioodi 48–72 tundi. ANITi mitmekordne vahelduv manustamine aitab sellest puudusest üle. Traditsioonilise hiina meditsiini võrkfarmakoloogia võtab uurimisobjektiks ravimmaterjalides leiduvad keemilised koostised; traditsioonilise hiina meditsiini ravimite efektiivsuses osalevad keemilised ained ei pruugi aga olla üks komponent, sest efektiivne aine võib olla farmakodünaamiliste komponentide rühm. Kuna traditsioonilises hiina meditsiinis on ainete sihtmärgid ja rajad tavaliselt teada, on uute mehhanismide avastamisel piirangud. Tulevikus saab tehisintellekti algoritme kombineerida võrgufarmakoloogiaga, et saada põhjalikumat ja objektiivsemat teavet.

Järeldused

Kokkuvõttes võib H. japonicum aktiivsete koostisosade nagu kvertsetiin abil aktiveerida FXR-i, inhibeerida CYP7A1, vähendada sapphappe sünteesi hepatotsüütides ja suurendada sapphappe ekstrahepaatilist eritumist. Samuti võib see reguleerida BCL2-d, et parandada mitokondriaalse membraani potentsiaali, inhibeerida hepatotsüütide apoptoosi ja reguleerida sapphappe homöostaasi maksas. Lisaks võib see PTGS2, IL-1 ja TNF- ekspressiooni pärssimisega häirida põletikulist vastust. Lühidalt, võrgufarmakoloogilise analüüsi kohaselt on kvertsetiin, kaempferool ja tetrametoksüluteoliin H. japonicum'i peamised toimeained kolestaatilise hepatiidi leevendamisel. Selle uuringu tulemused võivad toetada tulevasi uuringuid kvertsetiini, kaempferooli ja tetra-metoksüluteoliini rolli kohta inimese maksahaigustes ning PTGS2, BCL2, CYP7A1 ja FXR geenide rollide kohta kolestaatilise hepatiidi korral.