Abstraktne
Eesmärk: see uuring viidi läbi, et kinnitada segataimeekstrakti (MHE) kasutatavust kuivananemisvastane kosmeetikakoostisainet uuridesnaha vananemisvastaneaktiivsus in vitro ja in vivo. Meetodid: Selles uuringus valmistasime MHE ultraheliga ekstraheerimisega, mis sisaldas Forsythiae fructus, Tribuli fructus, Saalomoni pitsat, Siberi ženšenn, Ponciri Fructus ja ženšenn. UurisimeMHE vananemisvastane toime naha fibroblastides. Thevananemisvastane tegevusmäärati I tüüpi kollageeni sünteesi taseme järgi. Maatriksi metalloproteinaasi-1 (MMP1) ja metalloproteinaasi 1 koe inhibiitori (TIMP1) mRNA tasemeid mõõdeti qRT-PCR abil. MMP1 valgu taset hinnati blotanalüüsiga. Naha niiskuse, elastsuse, tekstuuri ja kortsude kliinilised testid viidi läbi kosmeetikatoodetega, mis sisaldasid 1 protsenti MHE-d. Tulemused: MHE indutseeris pro-kollageeni I tüüpi sünteesi ja TIMP1 mRNA ekspressiooni ülesreguleerimise. MHE viis MMP1 mRNA taseme ja valgu taseme allareguleerimiseni. Peale selle, pärast 1% MHE-d sisaldavate kosmeetikatoodete nahale kandmist paranes naha hüdratsioon, elastsus, tekstuur ja varesed 4 nädalat pärast ravi. Järeldus: MHE-l on vananemisvastane toime, soodustades kollageeni sünteesi ja pärssides MMP1 geeniekspressiooni in vitro, ning sellel on nahka parandav toime in vivo. Seetõttu näidati, et MHE on funktsionaalse kosmeetilise koostisosana väärtuslik.
Märksõnad:Nahahooldus, Vananemisvastane, Kortsuvastane, Looduskosmeetika, Taimne ravim
Taimsed toidulisandid Cistanche vananemisvastaseks
Sissejuhatus
Nahk on organ, mis puutub kokku väliskeskkonnaga ja on meie ellujäämiseks ülioluline, toimides esmase barjäärinaväliste rünnakute vastunagu nakkustekitajad ja füüsilised vigastused; Lisaks täidab see mitmeid olulisi füsioloogilisi rolle (Slominski et al., 2004; Vollmer et al., 2018). Vananedes,naha funktsioonhalveneb järk-järgult ultraviolettkiirguse (UV) kiirte, reostuse ja stressi ning naha vananemise ning naharakkude arvu ja naha paksuse vähenemise tõttu tekkivate atroofiliste muutustega (Farage et al., 2013).
Naha vananeminevõib jagada endogeenseks ja eksogeenseks vananemiseks. Endogeenne naha vananemine toimub aja jooksul loomulikult, sõltumata välismõjudest. Naha-epidermaalneristmiku (DEJ) ühtekuuluvus nõrgeneb ja koos diferentseerumisegakeratinotsüütidest väheneb lipiidide moodustumine (Makrantonakiet al., 2007). Teisest küljest põhjustab eksogeenset vananemist välisedtegurid nagu UV-kiired, infrapunakiired (IR), suitsetamine, trahvitolm ja elustiil. Nende hulgas põhjustab fotovananemist UVkiired tungivad läbi naha ning kahjustavad kollageeni ja elastiinipärisnahas. Selles protsessis elastsed kiud ja kollageennaha kiud deformeeruvad, mille tulemuseks on elastsuse vähenemineja longus. Kollageen on rakuvälise struktuuri peamine komponentmaatriksis ja sellel on oluline roll koe funktsiooni määramisel.
Erinevate kollageenitüüpide hulgas moodustab 1. tüüpi kollageen umbes 75-80 protsenti kogu kollageenist (Landau, 2007; Lovell et al., 1987; Mays et al., 1988). Kui nahk puutub kokkuUV-kiired pikka aega, tekivad vabad radikaalid. Need tasutaradikaalid stimuleerivad maatriksi metalloproteinaasi ekspressiooni-1(MMP1), mis soodustab kollageeni lagunemist ja inhibeerib kollageenisüntees, mis vähendab naha elastsust ja põhjustab kortse.Seetõttu, et vältida ja parandada naha kortse, mis on põhjustatudvananedes on vaja välja töötada koostisosa, mis soodustabkollageeni tootmist ning pärsib selle ekspressiooni ja aktiivsustMMP1 (Wlascheket al., 2001).
Naha vananemineon tihedalt seotud elukvaliteediga. Kuna nahk on kõige nähtavam organ, teadvustab see meid vananemisprotsessi (Binic et al., 2013). Meditsiini, farmaatsia ja kosmeetika valdkonnas tehakse mitmesuguseid jõupingutusiennetada ja parandada naha vananemist. Thevananemisvastaste koostisosade väljatöötamineon üks olulisemaid vananemisvastaseid strateegiaid.
Oleme ultraheli ekstraheerimisega valmistanud taimeekstrakte, et töötada välja uued vananemisvastased koostisained, mis sisaldavad Forsythiae fructus, Tribuli fructus, Saalomoni pitsat, Siberi ženšenn, Ponciri fructus ja ženšenn.
Erinevate ravi- ja nahatoimetega taimede hulgast valiti välja kuus taimset ravimit. Forsythiae fructus, Forsythia suspense (perekond Oleaceae) kuivatatud vili, tuntud kui Lian QiaoHiinas, salvestati esmakordselt Shennong Bencao Jingis, aprestiižne traditsioonilise hiina meditsiini monograafia (TCM)(Donget al., 2017). Seda on kasutatud kuumpuhastus- jadetoksifitseeriv TCM nakkushaiguste raviks, ntäge nefriit, erüsiipel ja haavandid (Wanget al., 2018). see onkasutatakse laialdaselt kliinikutes ühe ravimi või kombineeritud retseptina.Kaasaegne farmakoloogia on näidanud, et sellel on mitmesuguseidbioaktiivsus, sealhulgas põletikuvastane, antibakteriaalne, antiviiruslik, antioksüdant, kasvajavastane, diabeedivastane, antihüperlipideemiline,antiandrogeenne alopeetsia, oksendamise, vananemisvastane ja anti-rasvumisega seotud tegevused ja neuroprotektiivsed, maksa- javasorelaksantne toime (Donget al., 2017). Lisaks on olnudteatas sellestForsythiae fructuson nahka valgendav, anti-atoopiline dermatiit ja vananemisvastane toime. Taiwani andmetelüleriigiline retseptide andmebaas,Forsythia Fructuson olnudkuuluvad 10 kõige sagedamini kasutatava atoopilise ravimtaime hulkadermatiit (15,9 protsenti), urtikaaria (11.49-13,4 protsenti) ja akne (22,3 protsenti)(Donget al., 2017). Forsythiae fructussisaldab saponiine,flavonoidid,ning alkaloidid ja oleanoolhape, millel on kasulikfarmakoloogiline toime. Lisaks sisaldab see arktigeniini jamatairesinool. Füsioloogiliselt aktiivsete naha koostisosadena on needon türosinaasi inhibiitorid, mis mõjutavad melaniini metabolismipoolt indutseeritud rada - melanotsüüte stimuleeriv hormoon ( -MSH)ja äratavad tähelepanu kosmeetiliste valgendusmaterjalidena(Yang & Choe, 2011).Tribuli fructus, mis on kuivatatud puuviljadTribulus terrestrisL, on teatatud, et sellel on farmakoloogilinetegevused seksuaalfunktsiooni parandamiseks, ennetamiseks ja ravikssüdame-veresoonkonna haigused ning neuroprotektsiooni parandamine jamälu. Sellel on ka diabeedi-, põletiku- jaantioksüdantne toime (Chhatreet al., 2014). Tribuli fructusekstrakt sisaldab suures koguses diosgeniini, tigogeiini, erinevaidsaponiinid jne. Need saponiinid on kõige olulisemad bioaktiivsed ainederinevate bioloogiliste mõjude eest vastutavad komponendid naguafrodisiakumi toime, antihüpertensiivne ja kaitsev toimetoime isheemia-reperfusioonikahjustuse ja vähivastase toime vastu,antibakteriaalne ja seenevastane toime (Chhatreet al., 2014).
Teised koostisosad on furostanool ja spirostanoolsaponiinid, polüsahhariidid, flavonoidglükosiidid, alkaloidid ja amiidid. Lisaks on see efektiivne atoopilise dermatiidi vastu rottidel ja sellel on põletikuvastane toime (Chhatre et al., 2014). On teatatud, et Tribuli fructus ekstrakti vananemisvastane toime suurendab I tüüpi prokollageeni ja elastiini tootmist HS68 rakkudes, soodustab adipotsüütide lipiidide kogunemist ning lõppkokkuvõttes parandab naha kortse ja elastsust (Kim et al., 2016). ). Siberi ženšenn (Acanthopanax senticosus) on Oga perekonda kuuluv lehtpõõsas koos ženšenni ja metsiku ženšenniga. Siberi ženšennil on palju sarnasusi ženšenniga ja seda kasutatakse taimse ravimina insuldi, kõrge vererõhu ja diabeedi korral. Siberi ženšenni ekstrakti on idamaade meditsiinis kasutatud pikka aega ning farmakoloogilisi ja füsioloogilisi tulemusi on erinevates uuringutes kuni viimase ajani kajastatud. Siberi ženšenni komponendid, mida on seni tuvastatud, hõlmavad eleuthero pooli A, B, C, D, E, I, K, L ja M ning seesamiini, chiisanosiid, kofeiinhapet, klorogeenhapet, kampesterooli, vitamiine ja mineraalaineid (Park et al., 2010).
See sisaldab triterpenoidseid saponiine, lignaane, kumariine jaflavonoidid, mille hulgas peetakse kõige aktiivsemateks komponentideks fenoolseid ühendeid (Huang et al., 2011). Siberi ženšenni ekstrakti efektiivsuse kohta nahal on palju teateid.Kortsudevastane toime,antioksüdantne toime,kollageeni süntees, ja on teatatud kollagenaasi inhibeerivast toimest fotovananemise vastu (Park et al., 2010). On teatatud, et Siberi ženšenni ekstrakt reguleerib IV tüüpi kollageeni sünteesi, mõjutades epidermise tüvirakkude proliferatsioonivõimet ja paksendades epidermist (Choi et al., 2016). Saalomoni hüljes on Polygonatum odoratum (sünonüüm: P.officinale) risoom, millel on toniseeriv toime ja mida idamaade meditsiinis kasutatakse südamepuudulikkuse ja diabeedi raviks. Saalomoni pitser on tsükli- ja köhavastane; see leevendab südame pingeid ning on diureetikum, energiat andev, hüpoglükeemiline, rahustav ja toonik; seda kasutatakse kopsuhaiguste, sealhulgas tuberkuloosi ja seedetrakti häirete raviks (Haroon et al., 2012). Lisaks kasutatakse seda laialdaselt verehaiguste ravis; sellel on kasulik mõju neerukanalitele ja see hoiab ära hallide juuste, nägemisprobleemide, peapöörituse ja sõrmuse. See on närvide toonik ja seda kasutatakse diabeedi ravis (Haroon et al., 2012). Saalomoni tihendil on kõrge fenoolisisaldus ja antioksüdantne toime. Saalomoni tihendist pärinevad homoisoflavanoonid pärsivad täiustatud glükosüülimise lõpp-produktide moodustumist. Saalomoni pitser on näidanud tugevat soolestiku immuunsüsteemi reguleerivat aktiivsust ja võimet kutsuda esile osteoklastide diferentseerumist ja lektiini poolt indutseeritud apoptoosi. P. odoratum leheekstrakti puhul on näitena toodud haavade paranemise funktsioon (Fathi et al., 2014). Ponciri fructus immatures on sugukonda Rutaceae kuuluva Poncirus trifoliata Rafinesque valmimata vili (Jung et al., 2016). Hiljuti on teatatud põletikuvastastest ja ülitundlikkusevastastest toimetest ning on teatatud, et rasvamuda ekstrakti toime kutsub esile vähirakkude apoptoosi (Lee et al., 2008). Ponciri fructus on teadaolevalt tõhus atoopilise dermatiidi ravis. Ponciri fructus ekstrakti nahale kandmisel on teatatud selle toimest atoopiliste dermatiidide vastu, nagu epidermaalne hüperkeratoos, nahaturse ja tsütokiinid. Eelkõige on teatatud sügeluse, nuumrakkude arvu, IgE tootmise ja närvi kasvufaktori ekspressiooni olulisest vähenemisest. Ponciri fructus ekstraktid on näidanud tõhusat põletikuvastast toimet atoopilise dermatiidi vastu ja sügelusevastast toimet, reguleerides immuunmehhanisme. Lisaks on Ponciri fructus ekstrakti suukaudne manustamine teadaolevalt kasulik allergiliste haiguste raviks ja ennetamiseks (Hwang et al., 1997). Ženšenn on laialdaselt kasutatav traditsiooniline taimne ravim, millel on palju funktsioone. Ženšenni on kasutatud selle põletikuvastase, antioksüdantse, kasvajavastase ja vananemisvastase toime tõttu (Choi, 2008; Kim & Ko, 2020). Ženšenni efektiivsuse kohta nahale on tehtud palju uuringuid (He et al., 2018). Nende hulgas on palju teateid saponiinide ja ginsenosiidide kohta, mis on ženšenni tüüpilised koostisosad. Saponiinid on ühendid, mida leidub laialdaselt enamikus taimedes ja need esinevad erineval kujul. Saponiinid võivad kiirendada mitmesuguseid bioloogilisi aktiivsusi, nagu hemolüüs, ning antibakteriaalseid, viirusevastaseid ja antioksüdantseid funktsioone. Lisaks on saponiinidel põletikuvastased omadused, mis võivad vähendada turset ja nahapõletikku. Ginsenosiidid suurendavad interleukiini (IL) -1, ühte põletikulist tsütokiini, mis teadaolevalt soodustab angiogeneesi ja indutseerib veresoonte endoteeli kasvufaktorit ja akumulatsiooninaha põletuskohtades hiirtel. Samuti on teatatud nende toimest makrofaagide eemaldamisel nahahaavadest ja haavade paranemise soodustamisest (Kim et al., 2011).
Selle uuringu eesmärk oli selgitada ravimtaimede segaekstrakti (MHE) naha vananemisvastast toimet in vitro ja in vivo.
meetodid
1. In vitro efektiivsuse hindamine
1) MHE koostamine
Forsythia suspense kuivatatud puuviljad, Tribulus Terrestris L. kuivatatud puuviljad, siberi ženšenn (Acanthopanax senticosus (Eleuthero) Root), Saalomoni hüljes (Polygonatum Officinale risoom ja juur), Poncirus Trifoliata Rafinesque (Panax) vili ostetud kohalikult turult. Traditsioonilise hiina meditsiini (TCM) "Yin-Yangi" ja "viie elemendi" teoorial põhinevad Forsythia suspensa, Tribulus terrestris L. ja Poncirus trifoliata Rafinesque, mis vastavad "Yangile" ning Siberi ženšennile, ženšennile ja Saalomoni pitserile vastavad "Yin" valiti. Kuus ravimtaime jagati taas viiele elemendile (puit, tuli, vesi, metall või kuld ja maa ehk muld) vastavateks tunnusteks. Neid ravimtaimi segati iga elemendi tasakaalu jaoks samas vahekorras ning proportsioonide sobitamiseks kombineeriti teiste elementidega Poncirus trifoliata ja Maale vastav ženšenn (tabel 1). Kuus ravimtaime ekstraheeriti ultraheliga (20 kHz, 2 tundi) 30-protsendilises etanoolis. Pärast pöördaurustiga kontsentreerimist lisati 30% (maht/maht) butüleenglükooli ja lahus lahjendati 1% tahke ainesisaldusega ekstrakti valmistamiseks.
Tabel 1. Maitsetaimede segu
2) Rakukultuurid ja reaktiivid
Inimese primaarsed fibroblastirakud (HDFn) saadi ettevõttest PromoCell (Normal human dermal fibroblasts juvenile foreskin, C-12300; PromoCell, Saksamaa). Rakukultuurid Dulbecco'gamodifitseeritud Eagle'i keskmise kõrge glükoosisisaldusega (DMEM kõrge glükoosisisaldusega, SH30243.01, Hyclone, Cytiva), mis sisaldab 10% (maht/maht) veise loote seerumit (FBS, SH30084.03, Hyclone) ja 1% antibiootikumiantimükootilisi aineid (Anti-anti, 15240-062, Gibco, USA) kultiveeriti 37 kraadi juures 5% CO2 inkubaatoris.
3) Rakkude elujõulisuse test (MTT test)
MTT testiga mõõdeti rakkude elujõulisust ja määrati MHE tsütotoksilisus. Rakud külvati 96-süvendiga plaadile tihedusega 5 × 103 rakku süvendi kohta ja kultiveeriti rakukultuuris 24 tundi.tingimused. Seejärel visasime söötme ära, pesti rakke fosfaatpuhverdatud soolalahusega (PBS, 21-040-CV; Corning, USA), asetasime rakud uude seerumivabasse söötmesse jatöödeldi rakke kontsentratsioonidega {{0}}.01, 0.025, {{10}}.05. 0,10, 0,25, 0,50, 0,75 ja 1.{15}} protsenti proovidest ning inkubeeriti rakke 24 ja 48 tundi. Seejärel lisasime 100 μL MTT lahust(0,5 protsenti, 3-(4,5-dimetüültiasool-2-üül)-2,5-difenüül-2H-tetrasooliumbromiid) igale hästi ja inkubeeriti rakke veel 2 tundi. Pärast söötme eemaldamist lisasime 100 μL 100-protsendilist dimetüülsulfoksiidi (DMSO), loksutasime rakke 10 minutit ja mõõtsime neeldumist 590 nm juures mikroplaadilugejaga (Epoch 2 mikroplaadilugeja, BioTek, USA).
4) Pro-kollageeni I tüüpi generatsiooni mõõtmine
I tüüpi prokollageeni kontsentratsioon rakukultuurisöötmes mõõdeti kaubanduslikult saadava ELISA komplekti (Procollagen Type I C-peptide EIA Kit, MK101, TaKaRa) abil.Bio, Jaapan) vastavalt tootja juhistele. Iga proovi analüüsiti kolmes korduses.
5) mRNA ekspressioonitasemete mõõtmine kvantitatiivse abil
Reaalajaline polümeraasi ahelreaktsioon (qRT PCR) Rakud külvati 6-süvendiga plaatidele tihedusega 1 × 105 rakku süvendi kohta. HDFn rakke kultiveeriti 24 tundi; seejärel sünkroniseeriti rakud DMEM kõrge glükoosisisaldusega ilma FBS-ita 24 tundi. Sööde asendati seerumivaba söötmega ja seda töödeldi kontsentratsioonidega 0.05, 0,10, 0,25, 0,5 ja 0,75 protsenti proovidest 24 ja 48 tundi. RNA ekstraheerimine viidi läbi HDFn rakkudega, kasutades RNA ekstraheerimiskomplekti (TaKaRa MiniBEST Universal RNA ekstraheerimiskomplekt, 9767A, Takara Bio, USA) ja proovid puhastati vastavalt tootja protokollidele. Eraldatud RNA (1 ug) sünteesiti cDNA-ks, kasutades TR reagendi komplekti (PrimeScriptTM RT reagendi komplekt koos gDNA kustutuskummiga, RR047A, Takara Bio, USA). Kasutades SYRB Green Realtime PCR Master Mix (Power SYBRTM Green PCR Master Mix, 4367659, Applied BiosystemsTM, USA) ja QuantStudioTM 3 (QuanStudioTM 3 Real-Time PCR instrument, A28132, Thermo Fisher Scientific, USA) reaalajas PCR masinat geeniekspressioonitasemed standarditi majapidamisgeeni glütseraldehüüdi 3-fosfaatdehüdrogenaasi (GAPDH) järgi. Selles uuringus kasutatud praimerid on esitatud tabelis 2. Katsed viidi läbi kahes korduses kolme sõltumatu korduse jaoks. Sulamiskõvera analüüsviidi läbi iga praimerite komplekti jaoks.
6) Western blot analüüs
Fibroblastirakkude valgulüsaadid ekstraheeriti lüüsipuhvriga (EzRIPA Lysis Kit, WSE-7420; ATTO Corporation, Jaapan). Valkude kvantifitseerimiseks kasutati Bradfordi meetodit.Võrdsed kogused valke segati 5-kordse proovipuhvriga (TLP-102-01, TransLab, Korea) ja denatureeriti 99 kraadi juures 10 minutit. Valgud eraldati 10% SDS-PAGE-ga 150 V juures 150 minutit ja kanti üle PVDF membraanidele (Clear Blot Membrane, 3322546, ATTO Corporation, Jaapan). Membraanid blokeeriti 0,5% veise seerumi albumiiniga (BSA, A4503-10G; Sigma) 1 tund ja pesti Tris-puhverdatud soolalahusega, mis sisaldas Tween-20 (10X TBS koos Tween 30-ga, TR{ {17}}; Biosesang, Korea) kolm korda; membraane inkubeeriti seejärel primaarsete antikehadega MMP-1 (rekombinantne MMP1-vastane antikeha [EP1249Y], ab134184, Abcam, USA), -aktiini (Anti- -Actin (N-tern) ja PA0207 (Abfrontier) , Korea) temperatuuril 4 kraadi üleöö. Pärast loputamist töödeldi membraane sekundaarse antikehana küüliku IgG-mädarõika peroksidaasiga (HRP) (küülikuvastane IgG, HRP-seotud antikeha, #7074; Cell Signaling Technology, USA). 1 tund. Kemiluminestsentsi tuvastamiseks kasutati ECL Prime Western blot tuvastusreagenti (GE Healthcare, USA) ja ATTO WSE-6100 LuminoGraphi (ATTO Corporation, Jaapan). Kvantitatiivseks analüüsiks analüüsiti jäädvustatud pilte rakendusega Image tarkvara (CS analüsaator 4, ATTO Corporation, Jaapan).
7) Statistiline analüüs
Statistiline analüüs viidi läbi GraphPad Prism versiooniga 3.03 Windowsi jaoks (GraphPad Software, USA). Tulemused on esitatud 3 katse keskmisena ± SD. PaarituKasutati Studenti t-testi ja p väärtusi<0.05 were considered statistically significant.
2. In vivo efektiivsuse hindamine
1) Reaktiivid ja kosmeetikatooted
Testtoodeteks olid nahavesi, essentskreem ja silmaümbruskreem; need kreemid sisaldasid tabelis 3 näidatud toimeainena 1 protsenti MHE-d.
2) Inimestest osavõtjad
Kõik vabatahtlikud nõustusid testi eesmärgi ja sisuga ning allkirjastasid enne testi alustamist kirjaliku teadliku nõusoleku vormi. Muid nahahooldustooteid nad kasutada ei tohtinud ning testtooteid kanti näole järjestuses nahk-silmakreem (ainult varesjalgadele)-essentskreem-losjoon. Uuring viidi läbi vastavalt Helsingi deklaratsiooni juhistele ja selle kiitis heaks Korea riikliku bioeetikapoliitika instituudi institutsiooniline ülevaatusnõukogu (#P01-202108-13-001).
3) Tõhususe test
Selles uuringus osales 21 normaalse nahaga naist vanuses 45–55 (keskmine ± SD 50,81±2.86) aastat. Testtooteid kasutati kaks korda päevas (hommikul ja õhtul) 4 nädala jooksul. Osalejad külastasid uurimiskeskust iga 2 nädala tagant ning katsealasid mõõdeti laboris, kus ümbritseva õhu temperatuuri ja suhtelist õhuniiskust hoiti vastavalt 22±2 kraadi ja 50±5 protsenti. Osalejad kohanesid pärast näo pesemist 20 minutit laboris ning hinnati naha hüdratatsiooni, elastsust, tekstuuri ja varesjalgu. Naha hüdratatsiooni mõõdeti seadmega Corneometer® CM825 (C plus K electronic GmbH, Köln, Saksamaa); elastsust mõõdeti seadmega Cutometer® MPA 580 (C plus K electronic GmbH, Köln, Saksamaa) ning tekstuuri ja varesejalad mõõdeti seadmega DermaTOP 3D-HE (EOTECH SAS, prantsuse keel).
4) Naha kõrvaltoimete hindamine
Kõrvaltoimeid kontrolliti igal visiidil küsimustiku ja vaatlusega. Hindamisel liigitati subjektiivseteks parameetriteks sügelus, kipitus, kõdi, põletustunne, kipitustunne,jäikus ja pingutamine ning objektiivsed parameetrid klassifitseeriti erüteemiks, turseks, skaala ja papule.
5) Statistiline analüüs
Andmeid analüüsiti SPSS® tarkvara abil. Ajapunktide vaheliste erinevuste statistiline olulisus määrati kordusmõõtmiste analüüsi abil; p-väärtus<0.05 peeti statistiliselt oluliseks. Muutuse määr ( protsenti ) baasväärtusest arvutati järgmiselt:
Muudatusmäär =((pärast ravi – algtase)/algtase) × 100 protsenti
