Aspergillus Oryzae ja Aspergillus Cristatusega kääritatud riisikojide metaboliitide profileerimine ja vananemisvastane toime: võrdlev uuring

Abstraktne:RiisKoji, mida kasutatakse fermentatsiooni eeliste maksimeerimiseks starterina, toodab mitmekülgseid lõpptooteid sõltuvalt kasutatavatest inokulaadimikroobidest. Siin teostasime metaboliitide profileerimisevõrrelda riisikojikääritatud kahe olulise niitja seenega,Aspergillus oryzaejaA. cristatus, 8 päevaks. Mitmemõõtmelised analüüsid näitasid primaarsete ja sekundaarsete metaboliitide erinevaid mustreid neis kahesKoji. Riisi koji kääritatud koosA. oryzae(RAO) näitassuurenenud -glükosidaasi aktiivsus ja suurem suhkruderivaatide sisaldus kui koos kääritatugaA. cristatus (RAC). RAC näitastäiustatud -glükosidaasi aktiivsus ja suurenenud flavonoidide sisaldus jalüsofosfolipiidid, võrreldes RAO-ga. Üldiselt viimases kääritamisetapis (8 päeva)antioksüdanttegevused ja vananemisvastased toimedolid RAC-is kõrgemad kui RAO-s, mis vastab the suurenenudmetaboliididnagu näiteksflavonoididja auroglautsiini derivaadid RAC-is. See võrdlev metaboolnelähenemist saab rakendadatootmise optimeerimineja kvaliteedikontrolli analüüsidkojitooted.

Märksõnad: riisikoji; mikroob; tahkes olekus kääritamine;vananemisvastane toime; antioksüdantne aktiivsus

Cistanche vananemisvastase toime kohta lisateabe saamiseks klõpsake siin

1. Sissejuhatus

Tuhandete aastate pikkuse ajalooga kääritamist tunnustatakse üha enam kui toiduainete toiteväärtuse ja bioaktiivsuse suurendamise meetodit, lisaks nende töötlemisele ja säilitamisele [1]. Rice koji valmistatakse tahkis kääritamise teel, kasutades aurutatud riisiterasid, mis on nakatatud mikroorganismidega, et eritada ensüüme ja toota kasulikke metaboliite. Viimastel aastatel on erinevad katsed luua õrnaid kääritamistingimusi, mis on viinud kääritamise tõhususe ja toidu parema maitseomadusteni [2,3]. Tänu oma eelistele leiab riisikoji rakendusi sellistes tööstusvaldkondades nagu kääritatud toidud ja joogid ning kosmeetika [4–6].

Reaktiivsed hapniku liigid(ROS) tekitatakse tingimustel of oksüdatiivne stressja need on aeroobse ainevahetuse kõrvalsaadused. Needvabad radikaalidvõib esile kutsuda biomolekulide lagunemise, mille tulemuseks on oksüdatiivsed kahjustused, nagu põletik ja naha vananemisprotsessi kiirendamine [7]. Tasakaalu loomiseks ROS-i tootmise ja eliminatsiooni vahel mängivad antioksüdantidena tuntud ROS-püüdurid olulist rolli oksüdatiivse stressi leevendamisel ja neid saadakse peamiselt looduslikest allikatest [8]. Need vabad radikaalid osalevad vananemisprotsessis ja nende eemaldamine looduslikest allikatest pärinevate antioksüdantide kaudu on vananemise edasilükkamisel ülioluline [9]. Viimastel aastatel on paljudes uuringutes teatatud, et riisikoji võib fermentatsioonisubstraadi parandamise kaudu suurendada tooraine potentsiaalset antioksüdantset toimet [10,11].

Naha ekstratsellulaarne maatriks (ECM) koosneb kollageeni- ja elastiinikiududest, mis soodustavad naha elastsust, et taastada ja säilitada selle algne kuju ja olek [12]. Naha ECM-i hävimine on vananemise näitaja. See tekib kollageeni lagundava maatriksi metalloproteinaasi-1 (MMP-1), mida tuntakse ka kollagenaasina, ülesreguleerimise tõttu. Seetõttu sagenevad uuringud erinevate fütokemikaalide kohta, mis võivad aeglustada naha vananemisprotsessi, stimuleerides kollageeni ja elastiini sünteesi ning inhibeerides MMP-1 [13–16]. Seo jt. näitas, et kääritatud riisikliid mõjutavad naha fibroblastide kollageeni, põletikufaktorit (IL-a) ja MMP-d -1 [17]. Seetõttu on erinevatel riisis leiduvatel ühenditel, nagu flavonoidid ja fenoolhapped, antioksüdantne toime ning fermenteeritud riisikoji võib UV-kiirguse toimel naha fotovananemist leevendada [18]. Aspergillus, fifilamentne seen, on tüüpiline inokulaadimikroob, mis toodab paljusid kasulikke metaboliite, nagu lihtsuhkrud, rasvhapped ja aminohapped Aasias asuvast kojist. Eelkõige on Aspergillus oryzae kõige levinum koji tootmisel kasutatav mikroorganism, kuna sellel on tagatud ohutus ja erinevad ensüümid, nagu amülaas, proteaas ja peptidaas [19].

Aspergillus cristatust kasutatakse tee kääritamisel, nagu Fuzhuani telliste tee, mis sisaldab probiootikume ja kaitseb UVB-indutseeritud fotovananemise eest [20,21]. Samuti on teatatud, et see suurendab mitmesuguste muude toorainete antioksüdantset aktiivsust [22, 23]. Praegu tehakse üha enam jõupingutusi fermentatsioonikäivitajate kvaliteedi parandamiseks [4,24]. Varasemad uuringud on näidanud Aspergilluse ja Bacilluse võrdlevat metaboolset uuringut, mida kasutatakse laialdaselt riisikoji puhul [25]. Samas on vähe teavet metaboolsete erinevuste kohta samade perekondade, kuid erinevate seeneliikide vahel. Optimaalsete mikroobide väljavalimiseks, mida saab turule tuua tervise edendamiseks koos nutratseutiliste ja kosmeetiliste rakendustega, on vaja igakülgset arusaamist erinevate inokulaadimikroobide metabolismist, võrreldes nende bioaktiivsust ja metaboliite.

Selles uuringus profileerisime erinevate Aspergillus spp.-ga kääritatud riisi koji metaboliite. (A. cristatus ja A. oryzae) metaboolika osas, et võrrelda kahe fifilamentse seente metabolismi. Mõõtsime ka ensüümide aktiivsust, antioksüdantide aktiivsust ja naha vananemisvastaste tegurite (kollageeni, elastiini ja MMP-1) RNA ekspressiooni, et neid kahte kojit võrrelda. Lisaks viisime läbi korrelatsioonianalüüsi, et soovitada potentsiaalseid metaboliite, mis aitavad kaasa antioksüdantsele aktiivsusele ja naha vananemisvastasele toimele. MS-põhise metaboliitide profiilide põhjalik analüüs kahe koji inokulaadi võrdlemiseks tuvastas seose ensüümi aktiivsuse, metaboloomide ja bioaktiivsuse vahel. Siin esitame üldise metaboolse oleku kavandi, mis on korrelatsioonis kahe erineva koji inokulaadi bioaktiivsusega.

2. Tulemused

2.1. Erinevate Aspergillus spp.-ga fermenteeritud riisi Koji metaboolne profileerimine.

A. cristatus'e või A. oryzae'ga nakatatud riisi koji proovide erinevaid metaboloome võrreldi mitmemõõtmelise analüüsi abil vastavalt GC-MS ja LC-MS andmekogumitele. UHPLC-LTQ-Orbitrap MS/MS-i ja GC-TOF-MS-i põhikomponentanalüüsi (PCA) skoori graafik näitas, et kogu dispersioon oli 40,9 protsenti (PC1, 22,01 protsenti; PC2, 18,89 protsenti) ja 52,88 protsenti (PC1, vastavalt 34,70 protsenti; PC2, 18,18 protsenti (joonis 1A, B). Mõlemad PCA tulemused näitasid, et kääritamise alguspunkt oli kokku pandud, kuid järelikult eristati erinevate inokuleerimisseente poolt vastavalt erinevatele fermentatsiooniaegadele. Osaline vähimruutude diskrimineerimisanalüüs (PLS-DA) selgitas statistilisi mustreid, mis olid samad kui metaboliitide jaotus PCA-s (täiendav joonis S1A, B).

Nagu on näidatud UHPLC-LTQ-Orbitrap-MS/MS analüüsidest saadud PCA-s (joonis 1A), on kaheksandal päeval olulisi erinevusi ja mõlemale kaheksapäevasele proovile viidi läbi ortogonaalne osalise vähimruutude diskrimineerimisanalüüs (OPLS). -DA), mis näitas selget eraldumist OPLS-i komponendi 1 järgi, moodustades 86,11 protsenti andmete dispersioonist (täiendav joonis S1C). 31 metaboliiti valiti UHPLC-LTQ-Orbitrap-MS/MS andmete hulgast, mida peetakse kahe erineva inokulaadimikroobiga fermenteeritud kaheksanda päeva riisikojiside erinevuse peamiseks põhjustajaks, lähtudes nende muutuvast tähtsusest projektsiooniväärtustes (VIP > 1). .{{10}}) ja p-väärtused (p < 0,05) OPLS-DA analüüsist (täiendav tabel S1). Need metaboliidid sisaldasid 2 karboksüülhapet, 5 fenoolhapet, 7 flavonoidi, 2 pika ahelaga rasvhapet, 11 lüsofosfolipiidi ja anc4 hüdrokinooni. Metaboliidid tuvastati esialgselt, võrreldes avaldatud kirjandust (molekulmass, molekulaarvalem, retentsiooniaeg, massifragmentide mustrid ja UV neeldumised) ja ettevõttesisese raamatukogu andmeid.

Joonis 1. Põhikomponentide analüüsi (PCA) skoori graafik (A) UHPLC-LTO-Orbitrap-MS/MS ja (B) GC-TOF-MS andmekomplektidest riisi koi, mis on fermenteeritud Aspergillus cristatus'e või A. oryzne'ga. (täidetud sümbolid , A. cristatus; täitmata sümbolid, A. oryzne, O, 0 päev; , , 2 päeva; V, V, 4 päeva; 6 päeva; , 8 päeva).

2.1.1. Erinevate Aspergillus spp. riisi koji ajalised metaboloomid. Inokuleerimine vastavalt fermentatsiooniajale

Riisi koji metaboolsed teed, mis sõltuvad erinevatest inokuleerimismikroobidest, olid kujutatud soojuskaardiga, et visualiseerida metaboliitide muutumise mustreid vastavalt fermentatsiooniaegadele (joonis 2). Sinise-punase gradiendi värvus tähistab iga metaboliidi keskmist normaliseeritud suhtelist arvukust igas katsetingimustes. Enamiku metaboliitide suundumused A. cristatus'e (RAC) ja A. oryzaeRAO-ga kääritatud riisikojis näitasid fermentatsiooniajaga järk-järgult suurenevat mustrit. Süsivesikute metabolismiga seotud metaboliidid esindasid enamasti suurenevat mustrit, välja arvatud glükoos, ksüloos, sahharoos ja maltoos, mis on suhkrud. Lisaks suurendati fermentatsiooniajaga fenoolhappe flavonoidide ja hüdrokinoonide sisaldust, välja arvatud feruulhape. Rasvhapete hulgas näitas enamik metaboliite suurenevat mustrit, samas kui pimeliinhape näitas langust. Lüsofosfolipiididel esinesid erinevad mustrid erinevate fermentatsiooniaegade ja inokuleerimisseentega.

Joonis 2. Aspergillus cristatus'e või A. oryzae'ga kääritatud riisi koji metaboolsete radade ja metaboliitide suhtelise taseme skeem. Rada kohandati Kyoto geenide ja genoomide entsüklopeedia (KEGG) andmebaasist ja muudeti. Värvilised ruudud tähistavad voltide muutusi (sinine kuni punane), mis on normaliseeritud iga metaboliidi kõigi väärtuste keskmisega.

2.1.2. Suhteline ebavõrdsus eristavate metaboliitide tasemes riisi Koji fermenteeritud A. cristatus või A. oryzae

Nagu on näidatud joonisel fig 2, oli primaarsete ja sekundaarsete metaboliitide sisaldus vastavalt erinevatele inokuleerimisseentele erinev. Glükoosi puhul, mis on süsivesikute ainevahetuse keskus, näitasid A. cristatus koji mustrid langust, samas kui A. one koji näitasid kahanevaid mustreid algses käärimispunktis, kuid suurenesid järk-järgult kuni viimase käärimispunktini. Lisaks olid suhkrualkoholid RAO-s kõrgemad kui RAC-is. Auroglautsiini derivaadid paranesid märkimisväärselt ainult RAC-is, kuna need on ainulaadne pigmendiühend, mida toodab A. cristatus. Lisaks suurenes enamiku flavonoidide RAC-is märkimisväärselt RAO-ga võrreldes, välja arvatud 3,8-dimetüülherbatsetiin. Fenoolhapetest suurendati mõlemas proovis feruulhapet ja bensoehapet, kuid dihüdroksübensoehapet, kofeoüülkiinhapet ja vanillhapet suurendati ainult RAC-is. Lüsofosfolipiidid suurenesid RAC-is, kuid RAO-s täheldati kontrastset tendentsi. Rasvhapetel oli suurem RAO suurenemine kui AC puhul

2.2. Erinevate mikroorganismidega fermenteeritud riisi Koji ensümaatilise tootmise ja bioaktiivsuse võrdlus

RAC ja RAO fenotüüpide võrdlemiseks hindasime ensüümide aktiivsust ja vananemisvastast toimet naharakkudele, antioksüdantset aktiivsust, flavonoidide kogusisaldust (TFC) ja üldfenoolisisaldust (IPC) (joonis 3). Mõlema koji ensüümide tootmine suurenes fermentatsiooniajaga, välja arvatud a-amülaas RAO-s. Huvitaval kombel oli a-glükosidaasi sisaldus RAO-s kaks korda kõrgem kui RAC-is, vastavalt 10,12 ja 3,52 ühikut; seevastu B-glükosidaasi sisaldus oli RAC-s võrra kõrgem kui RAO-s, vastavalt 19.{{20}}5 ühikut ja 5,49 ühikut vastavalt fermentatsiooniaegadele. Mõlema koji funktsionaalne fenotüüp (antioksüdantne aktiivsus ja naha vananemisvastane faktor) näitas, et A. cristatus'ega riisikojil oli viimase fermentatsiooni ajal (8 päeva) kõrgem antioksüdantne aktiivsus ABTS-is, DPPH-s ja FRAP-is 1.{101} Vastavalt {24}}5, 0,40, 0,66 TEAC (Troloxi ekvivalentne antioksüdantne võimsus). Lisaks oli flavonoidide sisaldus RAC-is kõrgem kui RAO, vastavalt 0, 07 NE (naringiini ekvivalent) ja 0, 01 NE. Kusjuures üldfenooli sisaldus oli RAO-s kõrgem kui RAC-is vastavalt 0,32 EGA-ga (ekvivalent gallushape) ja 0,28 EGA-ga. Naha vananemisvastaste tegurite (elastiin, kollageen ja MMP{31}}) tulemused näitasid kääritamise lõppemist. ACRNA ekspressioonitase 7,77 ja 13,76 ning madalam suhteline MMP-1 RNA ekspressioonitase 2,35 võrreldes B-aktiiniga. Vahepeal näitas RAO elastiini ja kollageeni RNA ekspressiooni järkjärgulist suurenemist pärast fermentatsiooni.

Joonis 3. Erinevate Aspergillus spp. fermenteeritud riisikoji ensüümide tootmise (A), naha vananemisvastase faktori (B) ja antioksüdantse aktiivsuse, flavonoidide üldsisalduse ja fenooli üldsisalduse (IPC) (C) võrdlus. (must värv, A. cristatus valge värv, A. oryzne). Ensümaatilised aktiivsused on a-amülaasi aktiivsus, B-glükosidaasi aktiivsus ja a-glükosidaasi aktiivsus (A). MRNA suhtelist ekspressioonitaset mõõdetakse järgmiste puhul: kollageen (COL1A1), elastiin (ELN) ja maatriksi metalloproteinaas-1 (MMP-1) ​​(B). Kuvatud antioksüdantsed toimed on ABTS, DPPH radikaalide eemaldamine, FRAP, kogumavonoidisisaldus ja üldfenoolisisaldus (C). Olulised erinevused erinevate inokulatsioonimikroobide vahel tuvastati t-testiga (* p < {{10}},05, ** p < 0,01).

Bioaktiivsusele potentsiaalselt kaasa aidavate metaboliitide määramiseks viidi läbi korrelatsioonianalüüs fermenteeritud koji metaboliitide ja bioaktiivsuse vahel (täiendav joonis S2). Üldiselt näitas Pearsoni korrelatsioonikordaja kaart RAC-i suuremat korrelatsiooni bioaktiivsusega kui RAO. RAC-is näitasid orgaanilised happed, flavonoidid, lüsofosfolipiidid, rasvhapped, hüdrokinoon, suhkru derivaadid kõrget positiivset korrelatsiooni bioaktiivsusega. RAO puhul näitasid orgaanilised happed, flavonoidid ja rasvhapped ning suhkru derivaadid positiivset korrelatsiooni bioaktiivsusega. Metaboliidid, mille Pearsoni korrelatsioonikoefitsiendi väärtus oli kõrgem kui 0,5, on kujutatud võrgukaardil (joonis 4). Mõlemas koji toodetes olid orgaanilised happed, rasvhapped, flavonoidid ja suhkru derivaadid potentsiaalseteks bioaktiivsusteks. . Elastiini RNA ekspressioon oli seotud RAC metaboliitidega, samas kui kollageeni RNA ekspressioon oli seotud RAO metaboliitidega. Lisaks näitas TFC korrelatsiooni RAC-iga. Lisaks olid lüsofosfolipiidid ja hüdrokinoon RAC-i tugevad antioksüdandid.

Joonis 4. Metaboliidid, mille Pearsoni korrelatsioonikoefitsiendi väärtus on suurem kui 0,5, on kujutatud (A) Aspergillus cristatus'e või (B) A. oryzne'ga kääritatud riisikoji võrgukaardil. Kasti sümbolid tähistavad bioaktiivsust (hall värv, antioksüdantne aktiivsus TPC ja TFC; must värv, naha vananemisvastane toime rakule) ja värvilised sümbolid näitavad metaboliite (sama seeria eristusi erineva värvi ja kuju järgi: o, hüdrokinoon: , orgaaniline happed: , rasvhapped, flavonoidid; lüsofosfolipiidid; o, suhkur ja suhkru derivaadid; teadmata).

Küsi lisa:

E-post:wallence.suen@wecistanche.com whatsapp: pluss 86 15292862950