Abrus Precatorius leheekstrakt pöörab hormonaalse (insuliin, GLP-1 ja glükagooni) ja ensümaatilise (-amülaas/-glükosidaas) modulatsiooni kaudu ümber alloksaani/nikotiinamiidi põhjustatud suhkurtõve rottidel, 1. osa

Palun võtke ühendustoscar.xiao@wecistanche.comrohkem informatsiooni

Taust

Abrus precatoriust kasutatakse rahvameditsiinis kõigis Afro-Aasia piirkondades maailmas. Abrus precatorius leaf ekstrakti (APLE) varasemad glükoosisisaldust alandavad ja pankreast kaitsvad toimed kinnitati katseliselt STZ/nikotiinamiidi indutseeritud diabeetilistel rottidel; diabeedivastase toime ja pankrease kaitse mehhanism jäi siiski teadmata. Eesmärk. See uuring selgitas APLE diabeedivastaseid mehhanisme ja pankrease kaitsvat toimet diabeetilistel rottidel. Materjalid ja meetodid. APLE valmistati etanooli/Soxhleti ekstraheerimismeetodil. Fenoolide ja flavonoidide üldsisaldus kvantifitseeriti kalorimeetriliselt pärast esialgset fütokeemilist sõeluuringut. Suhkurtõbi (DM) tuvastati mõlemast soost täiskasvanud Sprague-Dawley rottidel (kaaluga 120-180 g) igapäevase järjestikuse nikotiinamiidi süstimisega (48 mg/kg; ip) jaAlloksaan(120 mg/kg; ip) 7 päeva jooksul. Välja arvatud kontrollrotid, kelle veresuhkru tase tühja kõhuga (FBG) oli 4,60 mmol/L, on rottidel stabiilne FBG (16-21 mmol/L) 7 päevapärast nikotiinamiidi/Alloksaansüstimist peeti diabeetikuteks ja need määrati juhuslikult ümber ühte järgmistest rühmadest (mudel, APLE (vastavalt 100, 200 ja 400 mg/kg; PO) ja metformiin (300 mg/kg; PO)) ning neid raviti iga päev 18 päeva jooksul . Kehakaalu ja FBG-d mõõdeti iga 72 tunni järel 18 päeva jooksul. 18. päeval ohverdasid rotid sügavuse allanesteesia; elundid (neer, maks, pankreas ja põrn) eraldati ja kaaluti. Veri koguti seerumi insuliini, glükagooni ja (LP-1 sisalduse hindamiseks, kasutades rotispetsiifilist ELSA komplekti.' Pankreas töödeldi, lõigati ja värviti H&E-ga histoloogiliseks uuringuks. APLE mõjuensümaatilinehinnati alfa (a)-amülaasi ja -glükosidaasi aktiivsust. APLE antioksüdantseid ja vabu radikaale püüdvaid omadusi hinnati standardsete meetoditega. Tulemused. APLE vähendas annusest sõltuvalt esialgset FBG-d 68,67%, 31,07% ja 4,39% võrreldes mudeliga (4,34%) ja metformiiniga (43,63%). APLE (100 mg/kg) ravi taastas mudeliga võrreldes kaalulanguse. APLE suurendas seerumi insuliini ja GLP-d,{14}} kuid vähendas seerumi glükagooni võrreldes mudeliga. APLE suurendas mudeliga võrreldes nii pankrease saarekeste arvu kui ka keskmist ristlõikepindala (×10 kraadi um'). APLE põhjustas akarboosi suhtes kontsentratsioonist sõltuva -amülaasi ja -glükosidaasi inhibeerimise. APLE eemaldas kontsentratsioonist olenevalt DPPH ja lämmastikoksiidi (NO) radikaalid ning näitas standarditega võrreldes suurenenud rauasisaldust vähendavat antioksüdantide võimet (FRAC). Järeldus. APLE diabeedivastast toimet vahendab insuliini ja GLP{21}} pöördvõrdeline moduleerimine glükagooniga, c-amülaasi ja -glükosidaasi mittekonkureeriv inhibeerimine, vabade radikaalide eemaldamine ja kahjustatud/nekroapoptoosiga pankrease rakkude taastumine.

Lisateabe saamiseks klõpsake siin

1. Sissejuhatus

Suhkurtõbi (DM) on üks metaboolsetest sündroomidest, mida iseloomustab krooniline hüperglükeemia, mis kulmineerub glükoosi metabolismi düsregulatsiooniga, mis on sekundaarne pankrease rakkude talitlushäirete tõttu [1]. Patoloogiliselt on DM tingitud glükoosi metabolismi vigadest, mis on tingitud pankrease rakkude funktsioonide defektidest, mis põhjustavad kas insuliinipuudulikkust (1. tüüpi DM) või insuliiniresistentsust (2. tüüpi DM). DM-i tavalisteks sümptomiteks on polüfaagia, polüdipsia, ähmane nägemine, krooniline kehakaalu langus, gastroparees ja polüuuria [2]. Aja jooksul suurendab lahendamata hüperglükeemia DM mikrovaskulaarsete tüsistuste, nagu diabeetiline nefropaatia, diabeetiline retinopaatia ja diabeetiline neuropaatia, riski [2]. Need tüsistused tekivad ulatusliku oksüdatiivse stressi ja lipiidide tõttuperoksüdatsioonmis on glükoosi ja bioloogiliste molekulide vaheliste reaktsioonide kõrvalproduktid [3]. Bioloogiliste molekulide, nagu DNA, valkude ja lipiidide ulatuslik glükosüülimine viib ebastabiilsete biokeemiliste vaheühendite tekkeni, mis on reaktiivsete hapnikuliikide (ROS) ja lämmastikuliikide (RNS) allikad. ROS ja RNS on oksüdeerivate ja peroksüdatiivsete reaktsioonide peamised tõukejõud. erinevates rakkudes ja kudedes [3].

Epidemioloogiliselt on teatatud, et DM mõjutab üle 387 miljoni inimese kogu maailmas [4]. See esialgne hinnang kasvab 2035. aastaks prognooside kohaselt 592 miljonini [5]. Algselt arvati, et DM tekib täiskasvanueas, kuid nüüd on näidatud, et see ei sõltu vanusest, mis näitab selgelt ohu tohutut suurust. DM globaalsele tervisele.

Cistanche võib parandada immuunsust

Tavaliselt hõlmab DM (tüüp 1 ja 2) ravi diabeedivastaste ainete kasutamist, mis on rühmitatud mitteinsuliinideks (sealhulgas biguaniidid (nt metformiin), sulfonüüluuread (nt glüburiid), SGLT-2 inhibiitorid (nt dapagliflosiin), sapphappe sekvestrandid (nt kolesevelaam), amüliini mimeetikum (nt pramlintiid), dopamiini-2 agonist (nt bromokriptiin), DPP-4 inhibiitorid (nt sitagliptiin), GLP{{5} }}RA-de (nt eksenatiid), tiasolidiindiooni (nt rosiglitasoon) ja -glükosidaasi inhibiitorite (nt akarboos ja vogliboos)) ja insuliini (nt humaaninsuliin ja selle analoogid) ravi [6]. Tavapärased diabeedivastased ravimeetodid on osutunud tõhusaks hoolimata asjaolust, et mõnede nende kasutamine on kulukas ja võib olla seotud tõsiste kõrvaltoimetega[7]. Kulud, kõrvalmõjud ja üldine arvamus, et tavapärased uimastid on sünteetilised ja seetõttu ohtlikud võrreldes taimsete ravimitega, mida peetakse "looduslikeks" ja suhteliselt ohututeks, on aidanud kaasa uuele huvile ürtide ja ravimtaimede kasutamise vastu. tooted inimeste haiguste, sealhulgas DM[8,9] raviks. See paradigma on üsna levinud maailma vaesemates troopilistes riikides, kus enamik inimesi tugineb oma esmaste tervishoiuvajaduste rahuldamiseks taimsetele ravimitele [8]. Samuti võib see tõenäoliselt kinnitada tavapärast väidet, et ürtide kasutamine on eelnenud kaasaegsele meditsiinile ja et looduslikud tooted on jätkuvalt mallid uute ravimite[10], sealhulgas diabeedivastaste ainete farmatseutilise sünteesi jaoks. Oluline on see, et neid ravimtaimi ja ravimtaimedest saadud ravimeetodeid kasutatakse täiendava ravina viisil, mis peegeldab enamiku maailma Afro-Aasia piirkondade kohalike kogukondade uskumuste süsteeme ja etnobotaanilist pärandit. Näiteks paljud ravimtaimed, millel on etnobotaanilised väited suhkurtõve raviks, nagu Chrysobalanus orbicularis[11], Spondias mombin ja Mangifera indica[12], Sesamum indicum [13] ja Bryophyllum pinnatum [14], on kõik näidanud -amülaasi ja -glükosidaasi inhibeerivad toimed, mida peetakse glükeemilise kontrolli jaoks ülioluliseks. Vastuseks uuele huvile ürtide ja ravimtaimedest saadud toodete kasutamise vastu täiendava või alternatiivse ravina on Maailma Terviseorganisatsioon (WHO) koos teiste huvirühmadega soovitanud kaasata kohalikke ravisüsteeme, eriti taimseid ravimeid. vaesemate riikide tervishoiusüsteemid [15]. See soovitus on tinginud vajaduse kontrollida tervisealaseid väiteid ravimtaimede kohta, mida kohalikud inimesed tavaliselt inimeste haiguste raviks kasutavad[16,17]. Huvitav on see, et Abrus pre-catorius, mida tavaliselt nimetatakse "herneherneks", on ravimtaim, mida kasutatakse laialdaselt paljude kultuuride rahvameditsiinis üle maailma Afro-Aasia piirkondade inimeste haiguste raviks[18-20]. Mitmed aruanded on rõhutanud Abrus precatorius lehtede traditsioonilist kasutamist suhkurtõve ravis ja ravis[21-23]. Märkimisväärne on see, et Abrus precatorius lehtede ekstraktid on näidanud tõhusust suhkurtõve [1] ja rinnavähi [24], kahe inimese haiguse vastu, mis on oluliselt kaasa aidanud ülemaailmsele haiguskoormusele [25]. Paljud uuringud on õigustanud Abrus precatorius'e etnofarmakoloogilisi kasutusi ja muid meditsiinilisi väiteid, demonstreerides eksperimentaalselt selle bioloogilisi omadusi, sealhulgas vabade radikaalide eemaldamist [26], renokaitset [27], neurokaitset [28], immunomoduleerivat[19], põletikuvastast toimet. [29], lipotoksilisuse vastane [30] ja trombotsüütide agregatsioonivastane toime [31], et mainida vaid proovi.

Varem demonstreeriti APLE glükoosisisaldust alandavat ja pankreast kaitsvat toimet STZ/nikotiinamiidi poolt indutseeritud diabeetilistel rottidel, et kinnitada selle kasutamist diabeedivastase rahvameditsiinina Ghana läänepiirkonna kohalike elanike poolt [1]. APLE glükoosisisaldust langetava ja pankrease kaitsva toime aluseks olev mehhanism jäi aga halvasti välja selgitatuks. Praegu on APLE glükoosisisaldust langetava ja pankrease kaitsva toime aluseks olevad mehhanismid, nagu insuliini, glükagooni ja GLP{8}} moduleerimine, -amülaasi ja -glükosidaasi ensümaatilise aktiivsuse pärssimine, vabade radikaalide eemaldamine ja taastumine. pankrease rakkude kahjustusi ja nekro-apoptoosi demonstreeriti in vivo ja in vitro.

2. Materjalid ja meetodid

2.1. Ravimid ja kemikaalid. Alloksaanmonohüdraat (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA), nikotiinamiid (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA), akarboos (LGM Pharma, USA), metformiin (Bristol laboratories Ltd.) , gallushape (Merck KGaA, USA), rutiin (Acros organics, USA), askorbiinhape (Carl Roth, Saksamaa), kvertsetiin (Alfa Aesar, UK), p-nitrofenüülglükopüranosiid (pNPG) (BBI Biotech, Hiina), Rott Uuringus kasutati insuliini ELISA komplekti, roti glükagooni-ELISA komplekti ja roti GLP{6}} ELSA komplekti (Wuxi Donglin Sci & Tech Development Co.Ltd, Hiina). Kõik teised uuringus kasutatud lahustid ja kemikaalid olid analüütilise kvaliteediga.

2.2. Abrus precatorius lehtede kogumine, identifitseerimine ja autentimine. A. precatorius'e värsked lehed koguti Sefwi Asawinso'A' (Bibiani-Ahwiaso-Bekwai piirkond, lääneregioon, Ghana) harimata põllumaadelt. Lehed tuvastas ja kinnitas kvalifitseeritud botaanik Cape Coasti ülikooli bioloogiateaduste kooli herbaariumiüksuses, kuhu deponeeriti vautšeri proov (CC3366), nagu varem teatatud [1].

2.3. Abrus precatorius leheekstrakti (APLE) valmistamine. APLE valmistati vastavalt eelmisele meetodile [1]. Lühidalt, varjus kuivatatud A. precatorius lehed jahvatati mehaaniliselt peeneks pulbriks. Pulbristatud lehti hoiti enne kasutamist õhukindlates plastmahutites. 120 g pulbristatud lehti leotati 48 tundi 700 ml etanoolis ja kaeti marliga. Segu segati vähemalt 3 korda päevas. Teisel päeval filtriti segu läbi Buchneri lehtrisse paigutatud filterpaberi. Filtraat eraldati veevannile paigaldatud pöördaurustiga. Pärast etanooli eemaldamist rotaatoraurustiga kuivatati saadud tumerohelist siirupilaadset vedelikku eksikaatoris mitu nädalat, jättes järele tumerohelise tahke ekstrakti. Ekstrakt märgistati ja säilitati enne kasutamist eksikaatoris. APLE valmistati pidevalt ette, et saada kõigi katsete jaoks piisavalt koguseid.

2.4. APLE fütokeemiline sõelumine. APLE-d skriiniti fütoühendite olemasolu suhtes, nagu eelnevalt teatatud [1]. 2.5.Üldfenoolisisalduse (TPC) määramine APLE-s. Üldine fenoolisisaldus APLE-s määrati, kasutades Folin Ciocalteu reaktiivimeetodit, nagu eelnevalt kirjeldatud [32], väikeste muudatustega. Lahjendatud kontsentratsioon APLE (250 µl 1 mg/ml) segati 750 µl Folin Ciocalteu reagendiga (1:10 lahjendust veega) ja 750 µl 7% Na, CO. Seejärel lisati segud mahuni 5 ml destilleeritud veega ja inkubeeriti destilleeritud veega. toatemperatuuril 2 tundi värvi arendamiseks. Seejärel mõõdeti neeldumist lainepikkusel 765 nm, kasutades spektrofotomeetrit (UV-vis, T70 PG Instruments). Pärast standardse gallushappe (0-300 ug/mL) kõvera valmistamist ekstrapoleeriti APLE TPC gallushappe kalibreerimiskõveralt ja väljendati gallushappe ekvivalendina (GAE). Kõik katsed viidi läbi kolmes eksemplaris.

2.6. Flavonoidide üldsisalduse (TFC) määramine APLE-s. Flavonoidide kogusisaldust APLE-s mõõdeti eelnevalt kirjeldatud meetodil [33] mõne muudatusega. Lühidalt, 500 μl Abrus precatorius taimeekstrakti (1 mg/mL), mis oli valmistatud 50% etanoolis, segati 500 μL 10% alumiiniumkloriidiga (AlCl,.6H,O) ja 1500 μl 10% naatriumatsetaadiga (ONAC). ,.3H,O). Reaktsioonisegu inkubeeriti toatemperatuuril 40 minutit ja neeldumist mõõdeti 415 nm juures, kasutades spektrofotomeetrit (UV-vis, T70 PG Instruments). Pärast standardse rutiini (0-250 ug/mL) kalibreerimiskõvera valmistamist ekstrapoleeriti APLE TFC rutiini kalibreerimiskõveralt ja väljendati rutiini ekvivalendina (RE). Kõik katsed viidi läbi kolmes eksemplaris.

2.7. Eetiline heakskiit. Kõik loomi hõlmavad protokollid vaatas algselt läbi ja kiitis heaks Kwame Nkrumahi teaduse ja tehnoloogia ülikooli (KNUST) institutsionaalse loomkatsete ülevaatuse nõukogu (FPPS/PCOL/006/2019). Samuti viidi läbi katsed rottidega vastavalt Euroopa Liidu direktiividele (2010/63/EL) loomade kasutamise ja hooldamise kohta teaduslikes katsetes. Loomade kannatusi ja loomade arvu vähendati nii palju kui võimalik, et järgida 3R (Refinement, Replacement, and Reduction) soovitusi [34].

2.8. Katseloomade omandamine ja hooldamine. Terved 7-8-nädalased täiskasvanud mõlemast soost Sprague-Dawley rotid (kaaluga 120–180 g) osteti Ghana ülikooli Noguchi meditsiiniuuringute instituudist (NMRI). Hiljem transporditi rotid Ghanasse Cape Coasti ülikooli biomeditsiiniteaduste osakonna loomamajja. Rotid peeti roostevabast terasest puurides (34 cm × 47 cm × 18 cm), kus allapanuks olid kuivad puidulaastud, neid toideti tavalise näriliste toiduga (GAFCO, TEMA) ja neil oli piiramatu juurdepääs veele. Rotte hoiti ümbritseva keskkonna temperatuuri, niiskuse ja normaalse pimeduse/valguse tsükli tingimustes. Kuid neid tingimusi muudeti, et need vastaksid mõne katse spetsiifilistele nõuetele. Enne katsetes kasutamist lasti rottidel nendes ümbritsevates ja laboratoorsetes tingimustes üle kahe nädala harjuda.

2.9. Alloksaanist/nikotiinamiidist põhjustatud suhkurtõve tuvastamine rottidel. Eksperimentaalne suhkurtõbi tuvastati üleöö tühja kõhuga normoglükeemilistel täiskasvanud Sprague-Dawley rottidel vastavalt eelnevalt kirjeldatud meetodile [1, 35], mõningate modifikatsioonidega. Lühidalt, rottidele süstiti järjestikku nikotiinamiidi (48 mg/kg; IP), mis oli lahustatud tavalises soolalahuses ja hoiti jääl; seejärel, 15 minutit hiljem, manustati rottidele iga päev 7 päeva jooksul alloksaani (120 mg/kg; ip) 100 mM tsitraatpuhvri (pH 4,5) lahuses. Seejärel manustati rottidele 5% glükoosi (5 ml/kg; PO) lahust iga päev 7 päeva jooksul. Hüperglükeemia tekkimise kinnitamiseks rottidel koguti üleöö paastunud rottidelt verd 3-7 päeva pärast alloksaani/nikotiinamiidi manustamist. ja 5 protsenti glükoosiravi sabaotsa amputatsiooni meetodil. Rottide sabad pühiti esmalt puhtaks steriilse puuvillaga, mis oli kastetud 10% etanooli. Tühja kõhu veresuhkru taset (FBG) mõõdeti URIT G26 glükomeetriga (URIT Medical Electronic Co., Ltd.).

2.10.Experimental Design. A curative rather than prophylactic treatment approach was adopted in this study, where after the establishment of experimental diabetes mellitus in rats, diabetic rats were subjected to various treatments. Figure 1 shows an outline of experiments carried out in this study. Rats having consistent FBG(11.1 mmol/L or >250 mg/dl) loeti mitmel mõõtmisel suhkurtõveks (hüperglükeemia)[1,35]. Kinnitatud diabeediga rotid jaotati juhuslikult viide rühma. Kontrollrotid ei puutunud kokku alloksaaniga; selle asemel anti neile tavalist soolalahust. Kõiki rühmi raviti 18 päeva jooksul, nagu on näidatud allpool:

Kontroll: tavaline soolalahus (5 ml/rott/päev; po) pluss näriliste sööma pluss vesi

Mudel: nikotiinamiid (48mg/kg ip) pluss alloksaan (120mg/kg;ip) pluss näriliste sööt pluss vesi

Metformiin: nikotiinamiid (48mg/kg; ip) pluss alloksaan (120mg/kg; ip) pluss metformiin (300mg/kg; po) pluss näriliste sööt pluss vesi

APLE (100 mg/kg): nikotiinamiid (48 mg/kg; ip) pluss alloksaan (120mg/kg; ip) pluss APLE (100mg/kg; po) pluss näriliste sööt pluss vesi

APLE (200 mg/kg): nikotiinamiid (48 mg/kg; ip) pluss alloksaan (120mg/kg; ip) pluss APLE (200mg/kg; po) pluss näriliste sööt pluss vesi

APLE (400 mg/kg): nikotiinamiid (48 mg/kg; ip) pluss aloksaan (120 mg/kg; ip) pluss APLE (400 mg/kg pook.) pluss näriliste sööt pluss vesi

2.11. Kehakaalu mõõtmine.Rottide kehakaalu mõõdeti enne kõigi loomkatsete algust. Seejärel mõõdeti kõigi rühmade rottide kehakaalu iga 3 päeva järel 18 päeva jooksul. Annuseid kohandati, et kajastada kehakaalu muutusi iga 3 päeva järel. Lõpuks mõõdeti kõigi rühmade rottide kehakaal enne nende surmamist.

2.12. Vere kogumine, seerumite valmistamine ja elundite eraldamine.Pärast rottide kaalumist 18. päeval surmati rotid sügava kloroformanesteesia all. Vereproovid koguti südame punktsiooniga ja seejärel jaotati märgistatud tühjadesse vakutainer-tuubidesse. Iga rühma tüüpilisi vereproove tsentrifuugiti kiirusel 3000 p/min (Eppendorfi tsentrifuug 5702,4 kraadi) 5 minutit. Seerumite saamiseks koguti supernatant vastavalt märgistatud proovituubidesse. Maks, neeru põrn ja pankreas koguti, kaaluti värskelt ja fikseeriti 10-protsendilises formaliinis.

2.13.Seerumi insuliini, glükagooni ja GLP mõõtmine-1.Seerumi insuliini, glükagooni ja GLP{0}} tasemeid mõõdeti vastavalt roti insuliini ELISA-ga (Wuxi Donglin Sci &Tech Development Co. Ltd, Hiina), roti glükagooni ELISA-ga (Wuxi Donglin Sci & Tech Development Co.Ltd. , Hiina) ja roti GLP-1 ELISA (Wuxi Donglin Sci & Tech Development Co.Ltd., Hiina) rangelt vastavalt tootja juhistele.

2.14. Langerhansi pankrease saarekeste keskmise pindala määramine.Pärast tüüpilise kõhunäärme histoloogilist töötlemist skaneeriti vastavate rühmade mikrofotod, kasutades Amscope MD35 okulaarikaamerat, nagu eelnevalt kirjeldatud [1]. Iga mikrofoto laaditi üles Adobe Photoshop CS6-sse ja asetati seejärel stereoloogilisele ruudustikule. Loendati pankrease saarekeste stroomat katvate ristmike arv. Tüüpilise kõhunäärme Langerhansi pankrease saarekeste ristlõikepindala määrati Cavalieri meetodil ja punktide loendamisel [36]. Ristlõike pindala määrati järgmise valemiga:

kus

A tähistab Langerhansi pankrease saarekeste ristlõikepindala

XP tähistab pankrease saarekeste strooma katvate ristumiskohtade koguarvu

a/p tähistab pindala stereosüsteemi punkti kohta M tähistab lineaarset suurendust.

2.15. Amülaasi ekstraheerimine merisigade kõhunäärmest.Pärast 20 tundi nälgimist ohverdati sügava anesteesia all merisiga ja kõhunääre eemaldati kirurgiliselt. Pankreas lõigati rasvast ja muudest kudedest puhtaks ning pesti kohe naatriumfosfaatpuhvris (pH 7,4). Pärast kõhunäärme kaalumist hoiti seda sügavkülmas 4 kraadi juures. Seejärel homogeniseeriti külmutatud pankreas (1 g pankreast: 5 ml puhver) jääkülma 0,1 M naatriumfosfaatpuhvriga (pH 7,4), kasutades homogenisaatorit (WiseTis HG-15D homogenisaator) ja seejärel tsentrifuugiti. 4400 pööret minutis 30 minutit 4 kraadi juures. Supernatant pipeteeriti eraldi mikrofuugituubidesse ja hoiti sügavkülmas temperatuuril -20 kraadi. Ekstraheeritud ensüümi (-amülaasi) kinnitamiseks võrreldi kaubanduslikult saadavat amülaasi ekstraheeritud ensüümiga (-amülaas), kasutades tärklist ja joodi. Amülaasi aktiivsuse märgiks peetud sinakasmusta värvuse nõrkust või kadumist võrreldi kontrollseadega (ilma ensüümita pluss tärklis pluss jood), kus oli sügav sinakasmust värvus.

2.16. APLE mõju amülaasi ensümaatilisele aktiivsusele.Alfa ( )-amülaasi ensümaatilise aktiivsuse inhibeerimist testiti eelneva meetodi [37] järgi, tehes mõningaid muudatusi. Lühidalt, APLE (125 uL) või akarboosi suurenevates kontsentratsioonides (100-1500 ug/mL) lisati märgistatud katseklaaside komplekti, mis sisaldas 125 uL -amülaasi lahust 20 mM naatriumfosfaatpuhvris (pH 6,9). APLE või akarboosi/amülaasi segu eelinkubeeriti 25 kraadi juures 10 minutit. Seejärel lisati valitud ajavahemike järel 125 uL 1% tärklist (valmistatud 20 mM fosfaatpuhvris, pH =6,9). Reaktsioonisegu inkubeeriti igal juhul 25 kraadi juures 10 minutit. Iga reaktsioon lõpetati teatud ajavahemike järel, lisades 250 uL 3,5-dinitrosalitsüülhappe (DNSA) reaktiivi ja kuumutati veevannis 100 °C juures 5 minutit, seejärel lasti jahtuda toatemperatuurini. Iga reaktsioon viidi destilleeritud veega 2,5 ml-ni ja neeldumist mõõdeti 540 nm juures, kasutades spektrofotomeetrit (UV-vis, T70 PG Instruments). Kontrollseade valmistati ette sama protseduuri abil, välja arvatud see, et amülaasi eelinkubeeriti APLE asemel destilleeritud veega. Alfa()-amülaasi inhibeeriv toime arvutati järgmiselt:

2.17. Amülaasi ensümaatilise aktiivsuse inhibeerimise viis APLE poolt.Amülaasi ensümaatilise aktiivsuse inhibeerimise viis APLE-ga tehti eelmise meetodi [38] kohaselt koos mõningate modifikatsioonidega. Lühidalt, 125 μL APLE (5 mg/ml) eelinkubeeriti esmalt 125 uL -amülaasi lahusega 20 mM fosfaadis 25 kraadi juures 10 minutit märgistatud katseklaasides. Seejärel lisati reaktsioonisegudele 125 uL tärkliselahust erinevates kontsentratsioonides (03-5 mg/mL).

alustada reaktsiooni. Seejärel inkubeeriti reaktsioonisegu 25 kraadi juures 10 minutit, seejärel lisati reaktsiooni peatamiseks 250 uL 3,5-dinitrosalitsüülhappe (DNSA) reagenti. Moodustunud produkti kogust määrati neeldumise mõõtmisega lainepikkusel 540 nm, kasutades spektrofotomeetrit (UV-vis, T70 PG Instruments). Protseduuri korrati kontrolli jaoks, mis loodi -amülaasi eelinkubeerimisega APLE asemel puhvriga. Lineweaver-Burki graafik Michaeles-Menteni krundil tehti Km ja Vmax hindamiseks Graph-Pad prisma versiooniga 8 (Graph Pad Software, San Diego, CA, USA). Amülaasi ensümaatilise aktiivsuse inhibeerimise viis APLE poolt tuletati hinnangulistest Km ja Vmax väärtustest.

2.18. Glükosidaasi ekstraheerimine merisigade peensoolest.-glükosidaasi ekstraheerimine merisigade soolestikust viidi läbi varasema meetodi [39] järgi, mõningate modifikatsioonidega. Lühidalt öeldes näljutati merisigu esmalt 20 tundi ja seejärel ohverdati sügava anesteesia all. Vahetult pimesoole kohal ja vahetult kaksteistsõrmiksoole all asuv peensool eemaldati kirurgiliselt ja loputati enne värskesse puhverlahusesse kastmist põhjalikult jääkülmas 0,02 M naatriumfosfaatpuhvris (pH6,9). Proportsiooniga 1 g soole-ne:5 ml puhvrit homogeniseeriti isoleeritud sool (WiseTis HG-15D homogenisaator, Saksamaa) kiirusel 4400 pööret minutis 10 minutit 2-minutilise katkendliku seisakuga jääl. Homogenaati tsentrifuugiti (Eppendorf 5430R tsentrifuug) 30 minutit 4 kraadi juures ja supernatant koguti õrnalt. Alikvoodid pandi 2 ml krüotuubidesse ja hoiti -20 kraadi juures, et neid kohe katsetes kasutada. Ekstraheeritud ensüümi (-glükosidaasi) kinnitamiseks võrreldi kaubanduslikult saadavat glükosidaasi ekstraheeritud ensüümiga (a-glükosidaasiga), inkubeerides 50 µl 3 mM p-nitrofenüülglükopüranosiidi (pNPG) 25 µl kaubanduslikult saadava või 25-glükosidaasiga. μl ekstraheeritud ensüümi (a-glükosidaas) 25 kraadi juures. Kollase p-nitrofenooli saaduse jälgimist 5 minuti pärast peeti igal juhul -glükosidaasi aktiivsuse kinnituseks.

2.19. APLE mõju glükosidaasi ensümaatilisele aktiivsusele.APLE ja akarboosi (standardne glükosidaasi inhibiitor) inhibeerivat toimet hinnati eelmise meetodi [40] alusel, tehes mõningaid muudatusi. Lühidalt öeldes kasutati p-nitrofenüülglükopüranoosi (pNPG) (glükosidaasi substraat) valmistamiseks fosfaatpuhvrit (20 mM; pH=6,9). Eraldi katsetes eelinkubeeriti a-glükosidaasi (50 µl) kasvavate kontsentratsioonidega APLE (igal juhul 25 µl), akarboosi või puhvriga igal juhul 10 minutit. Seejärel lisati reaktsiooni alustamiseks kas APLE/a-glükosidaasi või akarboosi/a-glükosidaasi eelinkubeeritud segule 25 uL 3 mM p-nitrofenüülglükopüranosiidi. Reaktsioonisegu inkubeeriti igal juhul 25 kraadi juures 20 minutit. Pärast 20-minutilist inkubeerimist peatati reaktsioon 0,1 M Na,CO (1 ml) lisamisega. Kontroll valmistati, kasutades sama protseduuri, välja arvatud see, et -glükosidaasi eelinkubeeriti APLE või akarboosi asemel puhvriga. Reaktsiooniprodukti (kollase värvusega p-nitrofenool) pärast reaktsiooni lõppemist mõõdeti a-glükosidaasi aktiivsuse määramiseks spektrofotomeetriga (UV-vis, T70 PG Instruments) 405 nm juures. Tulemused väljendati protsendina kontrollist. Igal juhul korrati katseid kolm korda. Glükosidaasi aktiivsuse inhibeerimise protsent (protsent) hinnati järgmise valemi abil:

2.20. APLE glükosidaasi inhibeerimise viis.Glükosidaasi ensümaatilise aktiivsuse inhibeerimise viis APLE poolt viidi läbi vastavalt eelmisele protseduurile [41] koos mõningate modifikatsioonidega. Lühidalt, ühes katseklaasikomplektis eelinkubeeriti täpselt 25 µl 5 mg/ml APLE-d glükosidaasi lahusega (50 µL) 25 kraadi juures 10 minutit. Teises katseklaasikomplektis eelinkubeeriti -glükosidaasi 50 µl 20 mM fosfaatpuhvriga (pH=6,9）). Seejärel lisati mõlemasse katseklaasi komplekti reaktsiooni käivitamiseks 25 uL p-nitrofenüülglükopüranosiidi (PNP) erinevates kontsentratsioonides (03-3,0 mg/mL). Seejärel inkubeeriti reaktsioonisegusid 25 kraadi juures 20 minutit, seejärel lisati reaktsiooni peatamiseks Na, CO (1000 µl). Vabanenud produkti kogus mõõdeti spektrofotomeetriliselt, kasutades p-nitrofenooli standardkõverat ja teisendati reaktsioonikiirusteks (v). Joonistati kahekordne vastastikune graafik (1/v ja 1/S), kus S on substraadi kontsentratsioon. Glükosidaasi aktiivsuse inhibeerimise viis APLE poolt määrati Line Weaver-Burki graafiku analüüsiga.

2.21. 2,2-difenüül-1-pikrüülhüdraasi(DPPH)radikaalide eemaldamise aktiivsuse hinnang.DPPH radikaalide eemaldamise aktiivsus viidi läbi vastavalt eelmisele meetodile [42], mõningate modifikatsioonidega. Lühidalt öeldes valmistati 2 ml reaktsioonisegu, segades metanoolis valmistatud DPPH (1.0 ml 0,135 mM) ja 10 ml erineva kontsentratsiooniga APLE (40, 80, 120, 160). ja 200 ug/ml) või askorbiinhapet. Reaktsioonisegu loksutati tugevalt ja jäeti 30 minutiks toatemperatuurile pimedasse seisma. Neeldumist mõõdeti (UV-vis, T70 PG Instruments) lainepikkusel 517 nm võrreldes tühikatsega. Kõik testid viidi läbi kolmes eksemplaris. Kontrolliks oli võrdne kogus metanooli ja DPPH lahust. DPPH radikaali eemaldamise aktiivsust hinnati järgmise valemi abil:

2.22. Lämmastikoksiidi (NO) radikaalide eemaldamise analüüs.APLE ja standardite radikaali eemaldamise aktiivsust EI hinnati Griess Illosvory reaktsiooni abil, nagu eelnevalt kirjeldatud [43], mõne muudatusega. Lühidalt, Griess Ilosvory reagendis kasutati 5% 1-naftüülamiini asemel 0,1% (w/v) naftüületüleendiamiindivesinikkloriidi. Erinevad kontsentratsioonid

({{{{10}}}}ug/mL) nii APLE-d kui ka standardeid (gallushape ja askorbiinhape), mis olid valmistatud ja valmistatud kuni 167 uL-ni, pandi märgistatud katseklaasidesse ja seejärel 667 uL Lisati 10 mM naatriumnitroprussiidi. Seejärel lisati naatriumfosfaatpuhver (167 ui, pH 7,4) ja segu inkubeeriti 25 kraadi juures 150 minutit. Seejärel lisati 2000 µl sulfaniilhappe reaktiivi (0,33 protsenti 20-protsendilises jää-äädikhappes) ja lasti 5 minutit seista, et diasotiseerimisreaktsioon lõppeks. Lõpuks lisati veel 2000 µl 0,1% naftüületüleendiamiindivesinikkloriidi, segati ja lasti seejärel 30 minutit 25 kraadi juures seista. Nitriti kontsentratsioon mõõdeti (UV-vis, T70 PG Instruments) lainepikkusel 546 nm ja arvutati nitraadi kontrolllahusega, millel ei olnud APPLE/või standardeid, kuid mis sisaldasid kõiki teisi reaktsioonisegu komponente. Pimelahusena kasutati naatriumfosfaatpuhvrit. APLE ja standardite eemaldamisvõime protsent (protsent) arvutati järgmise valemi abil:

kus Ac on kontrolli neelduvus ja At on testi neelduvus (APLE/standard).

2.23. Ferric Redducing Antioxidant Capacity (FRAC) test.FRAC-i analüüsiti eelmise meetodi [44] järgi, vähese modifikatsiooniga. Lühidalt, reaktsioon sisaldas 250uL APLE/standardlahust erineva kontsentratsiooniga (125-200ug/mL), 625 uL naatriumfosfaatpuhvrit (0,2 M pH 6,6 juures). ) ja 625 uL 1-protsendilist kaaliumraudtsüaniidi [K,Fe(CN)] erinevatesse katseklaasidesse. Neid inkubeeriti reaktsiooni lõpuleviimiseks 20 minutit 50 kraadi juures. Seejärel lisati katseklaasidesse 625 uL 10% trikloroäädikhappe (TCA) lahust. Kogu segu tsentrifuugiti kiirusel 3000 p/min 10 minutit, seejärel võeti 1800 uL supernatanti ja segati 1800 µl destilleeritud veega. Seejärel lisati 360 µl 0,1% raudkloriidi (FeCl) lahust ja segati põhjalikult. Lahuse neeldumist mõõdeti 700 nm juures, kasutades spektrofotomeetrit (UV-vis, T70 PG Instruments) reaktsiooni pimekatse suhtes. Tüüpilist tühja lahust, mis sisaldas sama lahuse segu ilma APLE / või kvertsetiinita, inkubeeriti sarnastes tingimustes. Reaktsioonisegu suurenenud neeldumine näitab suurenenud redutseerimisvõimet. Katset korrati kolm korda iga kontsentratsiooniga. FRAC mõõdeti kvertsetiini ekvivalendina (QE).

2.24. IC-de ja EC-de hindamine0 IC ja ECsoof APLE määramiseks koos selle antioksüdandi, vabade radikaalide püüdmise ja amülaasi ja -glükosidaasi ensümaatilist aktiivsust inhibeeriva toimega testiti APLE suurenevaid kontsentratsioone vastavate ainete suhtes. tegevused. Pärast kontsentratsioonide konverteerimist väljalogimiseks joonistati horisontaalteljel vertikaalteljel maksimaalsete aktiivsuste protsenti (antioksüdant, vabade radikaalide eemaldamine ja inhibeeriv toime -amülaasi ja a-glükosidaasi ensümaatilisele aktiivsusele). APLE kontsentratsioon, mis andis 50 protsenti maksimaalsest aktiivsusest (antioksüdant,

vabade radikaalide püüdmine ning inhibeeriv toime -amülaasi ja a-glükosidaasi ensümaatilisele aktiivsusele) määrati graafiliselt, kasutades GraphPad prism versiooni 8 statistilist tarkvara.

2.25. Statistiline analüüs.Saadud andmed esitati kui keskmine ± SD. Statistiline analüüs viidi läbi, kasutades Graph Pad Prism versiooni 8 Windowsi jaoks (Graph Pad Software, San Diego, CA, USA). Rühmade keskmine võrdlus tehti ühesuunalise dispersioonanalüüsi (ANOVA) abil, millele järgnes Tukey mitmekordne võrdlustest. P väiksem või võrdne 0,05 peeti kõigis analüüsides statistiliselt oluliseks.

See artikkel on võetud väljaandest Hindawi BioMed Research International Volume 2021, artikli ID 9920826, 17 lehekülge https://doi.org/10.1155/2021/9920826