BATF3 roll Tu9 diferentseerumises ja T-rakkude poolt juhitud L-patoloogiates MuCOsal (1. osa)

Lisateabe saamiseks võtke palun ühendustdavid.wan@wecistanche.com

T helper 9 (T,9) rakud on olulised põletikuliste ja allergiliste haiguste tekkeks. TH9 transkriptsioonivõrk koondab tsütokiinide ja antigeeni esitluse signaale, kuid pole täielikult mõistetav. Siin tuvastasime TNF-i superperekonna liikme TL1A kui hiire ja inimese TH9 diferentseerumise tugevat indutseerijat.Mehhaaniliselt, TL1A indutseeris transkriptsioonifaktorite BATF ja BATF3 ekspressiooni ning hõlbustas nende seondumist //9 promootoriga, mille tulemuseks oli I-9, BATF- ja BATF3-puudujääkide suurenenud sekretsioon ja IL{{6} } sekretsiooni Tμ9 ja Ty9-TL1A polariseerivates tingimustes. In vivo, kasutades T-rakkude ülekande mudelit, näitasime, et TL1A soodustas IL-9-sõltuvat T,9-rakkudest põhjustatud soole- ja kopsupõletikku. Neutraliseerivad IL-9 antikehad nõrgendasid TL1A-st tingitud limaskesta põletikku. Batf3-7T_9-TL1A rakud vähendasid põletikku jatsütokiini ekspressioonin vivo võrreldes WT rakkudega. Meie tulemused näitavad, et TL1A soodustab T_9-rakkude diferentseerumist ja funktsiooni ning määrab BATF3 rolli T-rakkude poolt põhjustatud limaskesta põletikus.

Cistanche kohta lisateabe saamiseks klõpsake siin

SISSEJUHATUS

T-abistaja (T-) rakkude spetsiaalsed alamhulgad mängivad lahutamatut rolli kudede homöostaasi säilitamisel ja limaskestade pindade põletikuliste haiguste tekkimisel. TH9 rakud on hiljuti tuvastatud kui sõltumatu T-rakkude alamhulk, mis toodab peamiselt IL-9, aga ka IL-10 ja IL-21.12 Tμ9 rakke on seostatud mitmete haigustega, sealhulgas allergiliste kopsudega. põletik, eksperimentaalne autoimmuunentsefalomüeliit(EAE), koliit, 3- Hiljuti on TH9 rakkudel olnud parasiitide usside infektsioon ja vähk. on teatatud, et see mängib rolli põletikuliste soolehaiguste (IBD) korral.-9Haavandilise koliidi (UC) patsientidel on suurenenud limaskestade IL-9 pluss T-rakkude ja IL-9 retseptorite (IL) arv -9R) on sooleepiteelis ülesreguleeritud. IL-9 defitsiit pärsib ägeda ja kroonilise haiguse arengutoksasoloonist põhjustatud koliit, mudel, mis jäljendab UC-d. Crohni tõvega (CD) patsientidel on kõrge -8-10 seerumi IL-9 tase korrelatsioonis raske haigusega.

Joonis 1 TL1A suurendab hiire ja inimese TH9 rakkude diferentseerumist. Naiivsed hiire CD4 pluss T-rakud diferentseeriti Ty0- või T9-polariseerivates tingimustes TL1A-ga või ilma 3 päeva jooksul ning ELJSA analüüs ]L-9, IL{{9} } ja IL{10}} sekretsiooni. b Naiivsed inimese CD4 T-rakud (CD4'CD45RACD45ROCD25) eraldati tervete doonorite PBMC-dest ja diferentseeriti TH9-polariseerivates tingimustes TL1A-ga või ilma 3 päeva jooksul. Inimese IL-9 sekretsiooni ELISA analüüs 48 ja 72 tunni pärast. Box-whisker graafik, mis näitab IL-9 kontsentratsiooni kultuuri supernatantides TH9 ja TH9-TL1A-ga töödeldud rakkude puhul. Kastid tähistavad mediaani ning 25. ja 75. protsentiili ning vurrud tähistavad jaotuse minimaalset ja maksimaalset väärtust. N=7-9. Andmed esindavad ühe sõltumatu katse keskmisi ± SD neljast (sõltumatud katsed. *lk< 0.05,***p=""><0.005 determined="" by="" student's="">

TH9 rakud eristuvad naiivsetest CD4 pluss T-rakkudest TGF- 1 ja IL-4 juuresolekul. T-raku retseptorist (TCR), TGF- 1 ja IL-4 retseptoritest allavoolu jäävad mitmed transkriptsioonifaktorid, mis on vajalikud TH9 rakkude diferentseerumiseks, sealhulgas IRF4, STAT6, GATA3, PU.1, NF- kB ja põhilise leutsiini tõmblukuga transkriptsioonifaktori ATF-sarnane (BATF).11-15 Siiski ei ole Tμ9 rakkude diferentseerumist juhtivad transkriptsiooniprogrammid ja põletikulised vallandajad ikka veel hästi mõistetavad ning lL{{ on liini määrav tegur. 17}} avaldist pole tuvastatud.

BATF-i transkriptsioonifaktorite perekond koosnebBATF, BATF2jaBATF3ja kuulub transkriptsioonifaktorite perekonda AP-1, mis hõlmavad JUN-i ja FOS-i. BATF-i perekonna transkriptsioonifaktorid koosnevad DNA-d siduvast domeenist ja leutsiini tõmbluku motiivist, kuid neil puudub transaktivatsioonidomeen ja neid kirjeldati algselt AP-1 aktiivsuse negatiivsete regulaatoritena." Kuid hiljutised uuringud on näidanud, et BATF-i perekonnaliikmed interakteeruvad IRF-i transkriptsioonifaktoritega, sealhulgas IRF4 ja IRF8, ning seostuvad AP-1-IRF-i komposiitelementide järjestustega, et reguleerida nende sihtmärkgeene T-rakkudes ja dendriitrakkudes. On näidatud, et BATF on vajalik ka Ty9-rakkude arenguks TH2, TA17 ja Try rakkudena.15,19BATF3 on kirjeldatud CD8a pluss ja CD103 pluss dendriitrakkude arengu kontrolli all hoidmiseks. "2' Vastupidiselt BATF-ile ei ole BATF3 mitteliigset funktsiooni Tu-rakkude arengus kontrollitud. demonstreeriti. Lisaks tuleb veel selgitada ekstratsellulaarsed stiimulid, mis võivad aktiveerida BATF3 rada CD4 pluss Tu rakkudes.

Joonis 2 TL1A reguleerib BATF ja BATF3 ekspressiooni T,9 diferentseerumise ajal üles. TH9 ja TH9-TL1A rakkude transkriptsiooniline profileerimine RNA sekveneerimise abil. Soojuskaart, mis kuvab RNA sekveneerimise andmeid, kasutades 100 suurimat geeni, millel on suurim IQR (kvartiilne vahemik). Soojuskaardist vasakul ja kohal olevad dendrogrammid tähistavad geenide (ridade) ja proovide (veerude) rühmitust. b Naiivsed CD4 pluss T-rakud diferentseeriti 3 päeva jooksul erinevateks TH alamhulkadeks ja Tregideks. BATF-i suhtelist mRNA ekspressiooni analüüsiti PCR-ga. Naiivsed CD4 pluss T-rakud diferentseeriti TH0- või TH9- polariseerivates tingimustes koos TL1A-ga või ilma selleta näidatud ajaperioodide jooksul. BATF-i suhtelise mRNA ekspressiooni PCR-analüüs, BATF-i ja IRF4 kaasvärvimine (ülemine). BATFIRF4 rakkude protsentide kvantitatiivne analüüs (alt).e BATF-i ja IL-i kaasvärvimine-9. fg

TL1A. f IL-9 ja BATF tüüpiline intratsellulaarne värvumine 48 h.g juures SagedusBATFfIL-9 pluss T-rakuderistatakse Ty9 ja T9-TL1A tingimustes. Vahendid on näidatud. Iga sümbol tähistab individuaalset doonorit. N=4. h Suhtelist Batf3 mRNA ekspressiooni hiire erinevates Th alamhulkades ja Tregides analüüsiti qPCR.I abil. Suhteline Batf3 mRNA ekspressioon näidatud ajahetkedel. j BATF3 ja IL tüüpiline kaasvärvimine-9. k SagedusBATF3IL-9 pluss T-rakuderistatakse Ty9 ja TH9-TL1A tingimustes. Vahendid on näidatud. Iga sümbol tähistab individuaalset katset. N=3. Im Naive inimese CD4 pluss T-rakud diferentseeriti T,{6}}polariseerivates tingimustes TL1A-ga või ilma. I IL-9 ja BATF3 tüüpiline rakusisene värvimine 48 tunni pärast. m TH9 ja TH9-TL1A tingimustes diferentseeritud BATF3L-9 pluss T-rakkude sagedus. Vahendid on näidatud. Iga sümbol tähistab individuaalset doonorit. N=4. Andmed esindavad ühe sõltumatu katse keskmisi ± SD kahest (a) või vähemalt kolmest (bd. i. k) sõltumatust katsest.*n<0.05. n=""><0.01.***n <="" 0.005="" as="" determined="" by="" student's="">

Hiljuti näitasime, et TL1A, TNF-i superperekonna liige, mis mängib olulist rolli immuunvahendatud haiguste, sealhulgas IBD korral, indutseerib IL-9 sekretsiooni Tu17 rakkudes. "Lisaks näitas hiljutine väljaanne, et TL1A soodustab oma retseptori DR3 kaudu TA9 diferentseerumist.IL-2-jaSTAT5-sõltuvad, kuid PU.{0}} ja STAT6-sõltumatud mehhanismid allergilise kopsupõletiku korral.2' Kuid TL1A poolt indutseeritud transkriptsiooniprogrammid ja TL1A-indutseeritud TH9 rakkude patogeensus soolepõletiku ja IBD korral on veel selgitamata selgitatud.

Siin demonstreerime, et TL1A soodustab inimese ja hiire TH9 rakkude diferentseerumist uudse signaaliraja kaudu. Me määratleme BATF3 kui uudset transkriptsiooni regulaatorit Tp9 rakkude diferentseerimiseks. TL1A viib kromatiini ümberkujunemiseni lI9 lookuses ja teerajajate transkriptsioonifaktorite IRF4 ja BATF värbamiseni, mis on IL-9 transkriptsioonilise aktiveerimise olulised komponendid, ning BATF3 värbamist 9 promootori konserveeritud piirkondadesse. Lisaks reguleerib TL1A BATF-i ja BATF3 ekspressiooni STAT6-sõltuval viisil. BATF- ja Batf3-puudulik T-9- ja TL1A-indutseeritud TH9(T-9-TL1A ) rakkude IL-9 tootmine on häiritud.TH9-TL1Arakud on in vivo väga põletikueelsed, kui need viiakse üle Ragi-7-hiirtele, millest ilmneb soolestiku ja kopsude tõsine limaskestapõletik, mida nõrgenes töötlemine neutraliseerivate IL-9 antikehadega. Batf3-/TH9-TL1A rakkude ülekandmine Rag1-7hiirtele vähendab oluliselt limaskesta põletikku ja tsütokiinide tootmist võrreldes WT TH9-TL1A rakkudega. Meie andmed näitavad TL1A ja BATF3 uudset rolli patogeensete efektor-T,9 rakkude väljatöötamisel ja tuvastavad selle signaaliraja potentsiaalse terapeutilise sihtmärgina T_9- põhjustatud patoloogiate, sealhulgas IBD ja allergilise kopsuhaiguse korral.

TULEMUSED

TL1A suurendab hiire ja inimese Tμ9 rakkude diferentseerumist in vitro Et määrata TL1A mõju TH9 diferentseerumisele, stimuleerisime naiivseid CD4 T-rakke TH9 tingimustes koos TL1A-ga või ilma. TL1A suurendas oluliselt IL-9 sekretsiooni ja I/9 mRNA ekspressiooni (joonis 1a, täiendav joonis 1a). TL1A üksi ei indutseerinud IL-9 sekretsiooni, mis viitab sellele, et TL1A toimib sünergistlikult TGF- 1 ja IL-4-ga, soodustades IL-9 tootmist. T-9-seotud tsütokiinide L-10 ja IL-13 sekretsiooni ja mRNA ekspressiooni suurendas samuti TL1A (joonis 1a, täiendav joonis 1a, b). Kooskõlas varasemate aruannetega näitasid intratsellulaarse IL-9 värvimise aja jooksul läbi viidud katsed mööduvat IL-9 ekspressiooni maksimaalse induktsiooniga T-9 tingimustes 3. päeval ja langust tagasi algtasemele päeval. 5 (täiendav joonis 1b).28,2TL1A indutseeris kogu katsete jooksul oluliselt suurema protsendi IL-9-tootvaid rakke, kusjuures kineetika muutus varasema ja tugevama IL-9 induktsiooni suunas, mis isegi ületas varasel ajahetkel TH9 tingimustes indutseeritud IL-9 produktsiooni maksimumi (täiendav joonis 1b). Samuti täheldasime IL-9 pluss IL-10 pluss rakkude arvu suurenemist TL1A juuresolekul (täiendav joonis 1b). Me ei täheldanud mingit nihet teiste Tu alamhulkade suunas (täiendav joonis 1c). TH9 diferentseerumise suurendamine TL1A poolt sõltus täielikult selle retseptorist DR3 (täiendav joonis 1d). Kokkuvõttes näitavad need andmed, et TL1A sünergiseerub TGF- 1 ja IL-4-ga TA9 diferentseerumisel ja IL-9 tootmisel.

TL1A suurendas oluliselt ka TH9 diferentseerumist antigeenispetsiifilises keskkonnas, kasutades OVA-spetsiifilisi OT-ll rakke (täiendav joonis 1e, f). TL1A ei mõjutanud rakkude proliferatsiooni TH9 diferentseerumise ajal (täiendav joonis 1g), nagu on näidatud mälu CD4 pluss T-rakkude puhul. " Need andmed viitavad sellele, et TL1A võimendas TH9 diferentseerumist ilma proliferatsiooni mõjutamata. Lisaks uurisime IL-9 tootmist rakkudes, mis diferentseeriti Ty9 ja TH9-TL1A tingimustes 3 päeva ja mida taasstimuleeriti anti-CD3/ CD28. Täheldasime IL-9 produktsiooni suurenemist TH9-TL1A rakkudes võrreldes TH9 rakkudega pärast sekundaarset stimulatsiooni, mis suurenes veelgi TL1A juuresolekul (täiendav joonis 1h, i). Need andmed viitavad sellele, et TL1A suurendas ka IL-9 tootmist diferentseerunud TH9 rakkudest. Järgmisena määrasime kindlaks TL1A mõju inimese Tu9 rakkude diferentseerumisele. Naiivsed CD4 pluss T-rakud eraldati tervete doonorite PBMC-st ja stimuleeriti Tu9 tingimustes. Kooskõlas meie andmetega hiire TH9 rakkudest, suurendas TL1A lisamine oluliselt IL-9 sekretsiooni inimese TH9 rakukultuuridest (joonis 1b).

TL1A indutseerib transkriptsioonifaktorite BATF ja BATF3 ekspressiooni TL1A poolt indutseeritud signaaliradade selgitamiseks kasutasime RNA sekveneerimist, et hinnata transkriptoomilist profiili TH9 ja TH9-TL1A rakkudes. TL1A ei muutnud oluliselt TH9 transkriptsiooniprofiili, mis näitab, et TL1A ei muutnud globaalselt TH9 diferentseerumist (andmeid pole näidatud). Siiski ekspresseeriti TH9-TL1A rakkudes erinevalt 219 geeni (joonis 2a, täiendavad tabelid 1 ja 2). Raja rikastamise analüüs tuvastas olulised muutused tsütokiini-tsütokiini retseptori ja JAK-STAT signaaliradadega seotud geenides T,9-TL1A tingimustes (täiendavad tabelid 1 ja 2, andmeid pole näidatud). BATF3 ja mitmed BATF-iga reguleeritud geenid olid T,9-TL1A tingimustes oluliselt ülesreguleeritud (täiendav tabel 3), mis viitab sellele, et transkriptsioonifaktorid BATF3 ja BATF võivad olla seotud TH9-TL1A rakkude diferentseerumisega. On kirjeldatud, et BATF on vajalik Tp17 ja TA9 rakkude arengu kindlakstegemiseks.15, 31-34 -kas TL1A aktiveerib BATF-i perekonnaliikmeid, hindasime esmalt BATF-i ekspressioonitaset erinevates Tu alamhulkades ja tuvastasime tugeva BATF-i mRNA ekspressiooni TH9 ja TH2 rakud (joonis 2b). TL1A suurendas veelgi BATF-i ekspressiooni Tu9 tingimustes, eriti päeval 1, mil TH9 tingimustest üksi ei piisa BATF-i mRNA indutseerimiseks (joonis 2c). Ainuüksi TL1A indutseeris BATF-i mRNA-d sarnasel määral kui Tp9 tingimused (joonis 2c). BATF-i rakusisene värvimine kinnitas, et Ty9-TL1A stimulatsioon suurendas oluliselt BATF pluss rakkude protsenti (joonis 2d). Lisaks suurendas TL1A üksi BATF pluss rakkude protsenti ja mis veelgi olulisem BATF*IRF4 pluss rakkude protsenti võrreldes TH9 tingimustega, mis viitab sellele, et TL1A võib suurendada IRF 4- BATF koostöökomplekside moodustumist (joonis 2d). TH9-TL1A stimulatsioon suurendas ka BATF pluss IL-9 pluss rakkude protsenti (joonis 2e).

Lisaks oli inimese TH9 rakkudes oluliselt suurem protsent IL-9- tootvaid rakke, kui neid stimuleeriti TL1A-ga (joonis 2f, g). Märkimisväärne on see, et suurem osa IL-9-tootvatest rakkudest ekspresseeris BATF-i. BATF-i ja IRF4 koosvärvimine näitas, et TL1A lisamine suurendas BATF*IRF4 pluss rakkude protsenti inimese T-9 diferentseerumise ajal (andmeid ei ole näidatud), mis viitab sellele, et IL-9 tootmine paranes. TL1A BATF-i signaaliraja kaudu säilib hiire ja inimese TH9 rakkude vahel. Erinevalt BATF-ist on BATF3 roll TH-rakkude diferentseerumisel vähem määratletud. Oma RNA-seq andmete kinnitamiseks määrasime Batf3 ekspressioonitaseme T-9 rakkudes ja teistes TH alamhulkades ning leidsime, et Batf3 mRNA ekspressioon oli kõrgeim rakkudes T-9, T,1 ja TH2 rakud (joonis 2h). TL1A parandas Batf3 ekspressiooni T-9 tingimustes (joonis 2i). BATF3 rakusisene värvimine kinnitas, et T,9-TL1A stimulatsioon suurendas oluliselt BATF3 pluss IL-9 pluss rakkude protsenti (joonis 2j, k). Inimese T9 rakkudes suurendas TL1A oluliselt BATF3 ekspressiooni pluss IL-9 pluss lahtrid (joonis 2l, m). Sarnaselt BATF-iga ekspresseeris enamik IL{38}}tootvaid rakke BATF3.

Joonis fig 3 TL1A suurendab BATE IRF4 ja BATF3 seondumist //9 promootoriga Ty9 diferentseerumise ajal, a, b Naiivsed hiire CD4 pluss T-rakud diferentseerusid TH0- või Tμ9-polariseerivates tingimustes. või ilma TL1Ata 2 (BATF, IRF4 ja AcH3) või 3 (BATF3) päeva. ChP testid viidi läbi BATF-i, IRF4, BATF3 või AcH3 seondumise suhtes konserveerunud mittekodeerivate järjestustega (CNS) 1 (a) ja KNS0 (b) //9. Andmed esindavad kahe sõltumatu katse ühe sõltumatu katse keskmisi ± SD.*lk<><>< 0.005="" as="" determined="" by="" student's="">

BATF ja BATF3 on TL1A-indutseeritud T_9 diferentseerumisel olulised transkriptsioonifaktorid

BATF-i ja BATF3 rolli edasiseks määratlemiseks viisime läbi kromatiini immunosadestamise (ChIP) testid, et määrata seos kahe Il9 konserveerunud mittekodeeriva järjestusega (Il9 CNS1, CNSO).5 TL1A üksi indutseeris BATF-i II9 CNS1-ga oluliselt suurema seondumise võrreldes TH9 tingimustega. ja TH9-TL1A täiustasid veelgi BATF-i sidumist (joonis 3a). Rohkem ülesvoolu asuvas I/9 kesknärvisüsteemis{13}} suurendas TL1A ka BATF-i seondumist T,9 tingimustes, samas kui TL1A üksi ei avaldanud mõju (joonis 3b). TL1A suurendas IRF4 seondumist Ty9 tingimustes kesknärvisüsteemis 1 ja kesknärvisüsteemis 0 (joonis 3a, b). Huvitav on see, et atsetüülitud histooni 3(AcH3) seondumine CNS1 ja CNSO-ga, mida varem kirjeldati kromatiini remodelleerumise hõlbustamiseks Il9 lookuses TH9 diferentseerumise ajal, paranes ka Ty9-TL1A tingimustes (joonis 3a, b). BATF3 seondumine kesknärvisüsteemi 1-ga oli TH9 rakkudes ülesreguleeritud ja seondumine suurenes veelgi TH9-TL1A tingimustes, samas kui BATF3 ei seondunud KNS0-ga (joonis 3a, andmeid pole näidatud). Need andmed viitavad sellele, et TL1A suurendab BATF, BATF3 ja IFR4 seondumist //9 promootoriga TH9 tingimustes, et indutseerida ll9 ekspressiooni. BATF-i ja BATF3 rollide kinnitamiseks TL1A-sõltuvates ja Batf{49}}T-rakkudes. IL-9, IL-Ty9 diferentseerimine, kasutasime Batf7- a 10 ja IL-13 tootmine oli BATF-/-rakkudes Tμ9 tingimustes tõsiselt häiritud (joonis fig. 4a-d). Kuid TL1A stimulatsioon ületas Ty9 diferentseerumise ajal vähemalt osaliselt BATF-i nõude IL-9 ja IL-13 tootmiseks (joonised 4a, b, d). BATF3 puudumisel vähenes IL-9 indutseerimine oluliselt, eriti Tμ9-TL1A tingimustes (joonised 4e, f, lisajoonis 2a). Vastupidiselt BATF-ile ei olnud BATF3 vajalik. -10 või IL-13 ekspressiooni jaoks (joonis 4g, h, täiendav joonis 2b, c). Signalisatsiooniradade määratlemiseks, mis viivad BATF-i ja BATF3 ülesreguleerimiseni TL1A juuresolekul, kasutasime Stat{ {79}}ja p50-/lahtrid. p50-/TH9 rakkudel oli BATF pluss IRF4t rakkude protsent vähenenud ja BATF pluss IRF4 pluss rakkude protsendi suurenemine TL1A stimulatsiooni all kaotati peaaegu täielikult (täiendav joonis 3a, b). BATF ja Batf3 mRNA ülesreguleerimine T.9 tingimustes oli p50-sõltumatu, samas kui BATF-i ja Batf3 ekspressiooni tugevnemine TH9-TL1A tingimustes oli täielikult p50-sõltuv (täiendav joonis 3c , d). Stat6-/T9 rakkudel oli BATFIRF4 pluss rakkude protsent vähenenud ja nende suurenemine Tμ9-TL1A stimulatsiooni korral kaotati täielikult (täiendav joonis 4a, b). Samamoodi sõltus BATF-i ja Batf3 mRNA ülesreguleerimine täielikult STAT6-st TH9 ja TH{104}}TL1A tingimustes (täiendav joonis 4c, d). Me ei täheldanud BATF-i või BATF3-i puudulikkuse olulist mõju vastavalt Batf3 ja BATF-i ekspressioonile, mis viitab sellele, et kahe transkriptsioonifaktori vahel puudub kompensatsioon (täiendav joonis 5). Need andmed koos viitavad sellele, et BATF ja BATF3 mängivad TL1A juuresolekul T_9 diferentseerumisel olulisi ja erinevaid rolle ning et BATF-i ja BATF3 suurenenud ekspressioon TL1A stimulatsiooni korral sõltub STAT6-st ja kanoonilisest NF-KB rajast. Järgmisena teostasime RNA järjestuse WT ja Batf3-/-Tμ9-TL1A rakkudes. Kokku ekspresseeriti WT ja Batf3-7}Ty9-TL1A rakkudes erinevalt 139 geeni (joonis 4i, täiendav tabel 4). Geeni ontoloogia raja rikastamise analüüs tuvastas olulised muutused geenides, mis on seotud transkriptsiooni, rakkude proliferatsiooni ja rakusisese signaaliülekande reguleerimisega (täiendavad tabelid 5 ja 6). Need tulemused näitavad BATF3 rolli Ty{130}}TL1A rakkude diferentseerumisel. T-9-TL1A rakud on väga patogeensed in vivo TH9-TL1A rakkude patogeensuse määramiseks in vivo kandsime üle ex vivo diferentseeritud CD45.1 pluss Tμ9 või TA9-TL1A rakud Rag{142}}'-hiirteks. Hiirtel, kes said Ty9 rakke, ei tekkinud olulist kaalukaotust (joonis 5a). TH9-TL1A rakke saanud hiired aga kaotasid kaalu ja neil tekkis raskem soolepõletik, eriti peensooles (joonis 5a–c). TA9-TL1A retsipientidel täheldasime ka tõsist kopsupõletikku, mida iseloomustab põletikuliste rakkude peribronhiaalne ja perivaskulaarne rakuline infiltratsioon. Värvimine Alcian Blue perioodilise happe-Schiffiga (AB-PAS) näitas mutsiini tootvate rakkude hüperproliferatsiooni Ty9-TL1A retsipientide hingamisteede epiteelis (täiendav joonis 6a, b). Täheldasime põrna ja lamina propria mononukleaarsete rakkude (LPMC) suuremat rakulisust ning suuremat põrna, MLN ja LPMC CD4 pluss rakkude protsenti ja absoluutarvu TH9-TL1A retsipientidel (joonis 5d, e), mis viitab sellele, et Ty 9-TL1A rakkudel on in vivo suurem proliferatsioonipotentsiaal. Ki67 värvimine kinnitas, et TH9-TL1A retsipientide MLN, põrna ja LPMC rakud on proliferatiivsemad isegi 6 nädalat pärast T-rakkude ülekandmist (joonis 5f). Täheldati TH9-TL1A retsipientide anti-CD3/anti-CD28-restimuleeritud MLN-rakkudes oluliselt suuremat IL-13 ja IL-17 sekretsiooni (joonis 5g), ja oluliselt suurem IL-9 ja IL-13 sekretsioon Ty9-TL1A retsipientide anti-CD3/anti-CD28-restimuleeritud LPMC-s (joonis 5h). Täheldasime põrna ja MLN IL-9 pluss, IL-13 pluss ja IL-17 pluss rakkude suuremat absoluutarvu ning suuremat absoluutarvu MLN, põrna ja LPMC CCR6 pluss ja CD103 pluss T-rakud TH9-TL1A retsipientidel, mis on kooskõlas nende rakkude rolliga limaskestade pindadel (joonis 5i, j). IL-9 on vajalik T#9-TL1A rakkude poolt põhjustatud in vivo põletiku korral Et uurida, kas TH9-TL1A rakkude suurenenud IL-9 tootmine aitas kaasa soole- ja kopsupõletikule, ravisime TH9-TL1A rakke saanud hiiri neutraliseeriva IL-9 või kontrollantikehadega T-rakkude ülekandekatse kestel. Histopatoloogiline analüüs näitas anti-lL{207}}ravi saanud hiirtel oluliselt vähenenud soolepõletikku võrreldes isotüübi kontrollidega (joonis 6a, b). Samuti täheldasime anti-lL{211}}ravi saanud hiirtel nõrgenenud kopsupõletikku peribronhiaalsete infiltraatide vähenemise ja lima tootvate rakkude arvu vähenemisega (täiendav joonis 6c). Rakkude koguarv ja CD4tCD45.1 pluss T-rakkude koguarv MLN-is vähenes anti-IL{217}}-ga töödeldud hiirtel võrreldes isotüübi kontrollidega (joonis 6c). Anti-IL-9-ravi vähendas ka IL-13 ja IL-17 tootmist MLN-is ja põrnas, samas kui IFN-y tootmine ei muutunud (joonis 6d, andmeid pole näidatud). Need andmed näitavad koos, et T-9-TL1A rakud olid tugevad efektorrakud ja põhjustasid in vivo soole- ja kopsupõletikku ning et patogeenne toime oli IL-9-sõltuv.

Joonis 4 BATF ja BATF3 puuduste mõju TH9 diferentseerumisele. ad Batf7 või WT hiirte naiivsed CD4 T-rakud eristati TH0- või TH9- polariseerivates tingimustes TL1A-ga või ilma 3 päeva jooksul. IL-9 ja IL-10.b intratsellulaarne värvimine.b IL-9 tootmise ELISA analüüs.c IL-10 tootmise ELISA analüüs.d IL{{14} ELISA analüüs. } tootmine. eh Batf3-7-või WT-hiirte naiivsed CD4- ja T-rakud eristati T,9-polariseerivates tingimustes TL1A-ga või ilma 3 päeva jooksul. e IL-9 ja IL-10.f rakusisene värvimine IL-9 tootmise ELISA analüüs. g IL-10 tootmise ELSA analüüs. h IL-13 tootmise ELISA analüüs. I WT ja Batf3′TH9-TL1A rakkude transkriptsiooniline profileerimine RNA sekveneerimise abil. Soojuskaart, mis näitab p-ga erinevalt ekspresseeritud geenide RNA-sekveneerimise andmeid<0.01. the="" dendrograms="" to="" the="" left="" and="" above="" the="" heat="" map="" represent="" the="" clustering="" of="" genes="" (rows)="" and="" samples="" (columns).="" data="" represent="" means±="" sd="" of="" one="" independent="" experiment="" out="" of="" two="" (i)="" or="" three="" (a-h)="" independent=""><0.05,**p <="" 0.01,="" ***p=""><0.005 determined="" by="" student's="">

BATF3 aitab kaasa TH9-TL1A rakkude poolt põhjustatud in vivo põletikule Et teha kindlaks, kas BATF3 mängib rolli Tu9-in vivo põhjustatud patoloogiates, kandsime üle ex vivo diferentseeritud WT või Batf3- /-TA9-TL1A Rag1-/-hiirteks. Hiirtel, kes said Batf3-'-TA9-TL1A rakke, arenevad kopsud oluliselt vähem (joonis 7a, b, täiendav joonis 6e) ja soolepõletiku vähenemise suundumus (histoskoor: 3,6 vs. 1,2) ( joonis 7a). Täheldasime vähenenud rakulisust kopsudes ja LPMC-s ning madalamat MLN-i ja kopsu CD4 pluss T-rakkude protsenti Batf37′-TL1A retsipientidel võrreldes WT TH9-TL1A saajatega (joonis 7c, täiendav joonis 6d). Märkimisväärselt täheldati Batf3'-Ty9-TL1A retsipientide põrnades, MLN-is ja kopsudes väiksemat IL-13 pluss ja IL-17 pluss rakkude protsenti (joonis fig. 7d). Meie andmed näitavad kollektiivselt, et BATF3 mängib rolli IL-9 tootmises ja T#9 arengus in vitro ning Tp9-TL1A-st tingitud limaskesta põletikus in vivo.

Joonis 6 IL-9 on vajalik Ty9-TL1A rakkude poolt põhjustatud in vivo limaskesta põletiku korral. T,9 või Ty9-TL1A rakud süstiti Rgg1-7hiirtele ja hiiri töödeldi kolm korda nädalas anti-IL-9 antikeha või isotüübi kontrolliga. kaksteistsõrmiksool, skaala riba; 200 μm. b Soolestiku histoloogilised skoorid.c MLN-i rakkude koguarv (vasakul), CD45.1 pluss rakkude sagedus (keskel) ja CD45.1 pluss rakkude koguarv (paremal).d IL-i ELISA analüüs{15} }, IL-17 ja IL-13 tootmine MLN-st pärast ex vivo restimulatsiooni anti-CD3 ja anti-CD28-ga. Andmed esindavad kahe sõltumatu katse ühe sõltumatu katse keskmisi ± SD. n=4-5/rühm.*lk<><0.01, as="" determined="" by="" student's="" t-test="" (b)="" or="" mann-whitney="" u="" test="" (c,="">