Uudne põletikuline dendriitrakk, mis on rikkalik ja külgneb luupusnefriidiga patsientide neerudes T-rakkudega
Feb 24, 2022
Mehhanismid, mis soodustavad luupusnefriidi (LN) ägenemise ajal lokaalset põletikulist vigastust, on suures osas teadmata. Intrarenaalset põletikku juhtivate peamiste immuunrakkude mõistmine edendab meie teadmisi haiguse patogeneesist ja annab teavet uute ravimite väljatöötamisele LN-i juhtimiseks. Selles uuringus analüüsisimeneerud proliferatiivse LN-ga patsientide biopsiad ja tuvastasid uudse põletikulise dendriitrakkude (infDC) populatsiooni, mis on LN-s tugevalt ekspresseeritudneerud, kuid tervetel inimestel esineb seda minimaalseltneerud.Immuuntranskripti ekspressiooni agnostilise hindamise käigusneerudProliferatiivse LN-ga patsientidest oli isoleeritud glomerulitest kõige sagedamini üleekspresseeritud transkript FCER1G, mis kodeerib Fc retseptori gammaahelat (FcR). Et tuvastada FcR-i ekspresseerivad rakutüübid, mis infifiltreeruvadneerudLN-s tehti uuringuidneerudaktiivse LN-ga patsientide biopsiad, kasutades konfokaalset immunofluorestsentsmikroskoopiat (IF). See näitas, et FcR esineb rikkalikult piirkonna periglomerulaarses (PG) piirkonnasneerudja vähemal määral tubulointerstitiumis (TI). Nende rakkude pinnamarkerite edasine uurimine näitas, et need olid FcR plus , MHC II plus , CD11c plus , CD163 plus , CD5 , DC-SIGN plus , CD64 plus , CD14 plus , CD16 plus , SIRP plus , CD206 , CD68 , CD123 , CD3 ja CD11bV, mis viitab sellele, et rakud olid infDC-d. InfDC-de kvantifitseerimine näitas, et LN-is on infDC-de tase keskmiselt 10-korda kõrgemneerudvõrreldes terveteganeerud. Oluline on see, et IF tuvastas CD3 pluss T-rakud, mis asuvad nende infDC-de kõrval LN-i PG-ruumisneerud,samas kui tervetel on mõlemat rakutüüpi minimaalseltneerud.Seega oleme tuvastanud luupuses varem kirjeldamata alalisvooluneerudmis võivad interakteeruda intrarenaalsete T-rakkudega ja mängida rolli patogeneesisneerukahjustusLN-i põlemise ajal.
Märksõnad:põletikulised dendriitrakud, luupusnefriit, neer, autoimmuunsus, adaptiivne immuunvastus, T-rakud, SLE
SISSEJUHATUS
Lupus nefriit (LN) on süsteemse erütematoosluupuse (SLE) tõsine tüsistus, mis on seotud märkimisväärse haigestumuse ja suremusega. Kuni 30 protsenti LN-ga patsientidest areneb lõppstaadiumisseneeruhaigus(ESKD) (1). Ameerika Ühendriikide Toidu- ja Ravimiameti (FDA) poolt heakskiidetud spetsiifilisi ravimeetodeid LN-i raviks ei ole ja praegused ravimeetodid annavad suboptimaalse ravivastuse ja märkimisväärse tsütotoksilisuse (2). Meie ja teised uurijad oleme uurinud selle molekulaarset patoloogiatneerudaktiivse LN ajal, et paremini mõista selle patogeneesineerukahjustusLN-is ja rajad, mis võivad olla konkreetselt suunatud LN-i raviks.
CISTANCHE PARANDAB NEERU/NEERU FUNKTSIOONI
Transkripti ekspressiooni agnostilise hindamise käigus mikrodissekteeritud laseriganeerudKliinilistest LN-biopsiatest saadud koe põhjal leidsime, et glomerulaarkambris oli kõige rohkem üleekspresseeritud transkriptsioon FCER1G, mis kodeeris Fc retseptori gammaahelat (FcR ). Eeldati, et see transkript peegeldas immuunrakke, mis infifiltreeruvadneerudaktiivse LN ajal ja see töö tehti selleks, et tuvastada rakutüübid, mida esindab üleekspresseeritud FcR . Seega kasutati selles uuringus transkriptoomilisi leide konfokaalse immunofluorestsentsi (IF) uuringute juhtimiseks, et iseloomustada peamisi infifiltreeruvaid immuunrakke.neerudLN-i põlemise ajal. Tuvastasime ainulaadse FcR-i populatsiooni, mis ekspresseerib põletikulist dendriitrakku (infDC), mis asub periglomerulaarses (PG) ruumis ja külgneb CD3 pluss T-rakkudega, mis tähendab potentsiaalset ristkõnet infDC ja T-rakkude populatsioonide vahel.
MATERJALID JA MEETODID
Eksperimentaalne disainSelle töö eesmärk oli läbi viia transkriptsioonianalüüs ja IF edasineerudLN flflare'is tehtud biopsiad, et tuvastada peamised infifiltreeruvad immuunrakudneerudLN-i flättimise ajal. Viidi läbi transkriptoomiline analüüsneerudbiopsiad, mis saadi LN flflare'is 58 patsiendilt, kellel oli proliferatiivne (klass III/IV ± V) LN aastatel 2007–2013. Arhiivibiopsiaid kasutati pärast kliinilise testimise lõpetamist. Viidi läbi laserhõive mikrodissektsioon (LCM) ning glomerulid ja tubulointerstitium (TI) eraldati eraldi. Implantatsioonieelne elusdoonorneerudbiopsiad (n=10) toimisid tervete kontrollidena (HC) ja neid analüüsiti paralleelselt LN-biopsiatega. Kõiki patsiente ravis sama nefroloog (AM) ja üks kogenud nefropatoloog (VA) lugesneerudbiopsiad. Haigla Fernandezi (Buenos Aires) eetikanõukogu ja Ohio osariigi ülikooli institutsionaalne järelevalvenõukogu kiitsid heaks juhtumi uurimise.neerudbiopsiad.
RNA ekstraheerimine ja analüüs
Transkriptoomiliseks analüüsiks kasutatud biopsiad fikseeriti formaliinis ja parafiiniga (FFPE). Parafiiniplokkidest lõigati igast biopsiast 10 µm lõigud. Pärast deparafiniseerimist eraldati kõik saadaolevad glomerulid ja TI lasermikrodissektsiooniga (PALM MicroBeam, Zeiss Labs, Bernried, Saksamaa), püüti kinni ja digereeriti proteinaas K-ga. DNA eemaldati DNaasi abil. RNA sadestati, ekstraheeriti RNeasy MinElute spin kolonnidega (Qiagen, Redwood City, CA, USA) ja elueeriti RNaasivabas vees. Transkripti ekspressiooni analüüsiti 250 ng ekstraheeritud RNA-st, kasutades NanoString nCounter platvormi ja GX inimese immunoloogia transkriptsioonipaneeli [NanoString Technologies, Seattle, WA, USA; (3–5)]. Inimese immunoloogia paneel v2 koosnes 579 immuunvastuse geenist, 6 positiivsest kontrollgeenist ja 6 negatiivsest kontrollgeenist. Nende geenide täieliku loetelu leiate meie rühma varasemast väljaandest (6). Konfokaalse IF-mikroskoopia jaoks, külmutatudneerudBiopsia kuded neljalt aktiivse IV klassi LN-ga patsiendilt saadi Ohio osariigi nefropatoloogia biorepositooriumist. HC-na kasutati kolme külmutatud nefrektoomia proovi. Nefrektoomia viidi läbi patsientidel, kellel olineeru-rakukartsinoom. Analüüsiks saadud kude lõigati vähikoest eemale. Analüüsiks kasutatud ümbritsev kude näis histoloogilise analüüsi põhjal terve. Kontrollidena kasutati nefrektoomiat, kuna vaja oli külmutatud proove ja meie biohoidlas ei olnud külmutatud siirdatud doonori kudet.
Antikehad
IF-i jaoks kasutatud primaarsed antikehad (Abs) on kõik loetletud täiendavas tabelis 1. Selles uuringus kasutatud antikehad valideeriti IF-i suhtes, kasutades positiivse kontrollina inimese lümfisõlme või inimese maksa (andmeid ei ole näidatud). Kasutatud isotüübi kontrollid on ChromoPure normaalne küüliku IgG, normaalne hiire IgG (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, USA), hiire IgG1κ (BioLegend, San Diego, CA, USA) ja hiire IgG2bκ (Jackson ImmunoResearch). IF-i jaoks kasutatud sekundaarsed antikehad olid kitse F(ab')2 hiirevastane IgG 488 (Jackson ImmunoResearch) ja kitse küülikuvastane IgG 568, kitse küülikuvastane IgG 488 ja kitse küülikuvastane IgG 647 firmalt Invitrogen (Thermo Fisher). Scientific, Waltham, MA, USA).
CISTANCHE PARANDAB NEERU-/NEERUHAIGUST
ImmunofluorestsentsKülmutatud nefrektoomia ja LNneerudbiopsiad lõigati (5 µm slaidi kohta), fikseeriti 4% paraformaldehüüdfosfaatpuhverdatud soolalahuses (PBS) 15 minutiks toatemperatuuril ja pesti PBS-iga (0,02% naatriumasiidiga). Sektsioonid blokeeriti 5-protsendilise piimaga PBS-is, millele järgnes inkubeerimine primaarse Ab-ga üleöö. Pärast kolme 1-tunnist pesemist PBS-iga inkubeeriti sektsioone fluorestseeruvalt märgistatud sekundaarsete Ab-dega veel tund aega toatemperatuuril ja tuumad värviti DAPI-ga (100 ng/ml) 10 minutit. Seejärel paigaldati sektsioonid Prolong Goldiga (Invitrogen) katteklaaside alla. Kontroll-Ab viitab isotüübi Ab-de loendile koos nende vastavate sekundaarsete Ab-dega. Pildid saadi Olympus FluoView 1000 laserskaneeriva konfokaalse mikroskoobi abil (Olympus Corp., Tokyo, Jaapan) spektraaltuvastussüsteemiga flfluorokroomide (FV1000 spektrid) eraldamiseks koos toatemperatuuril ×60 õlikümblusläätsega.
Kvantitatiivne mikroskoopiaInfDC ekspressioonitase LN-s ja HC-sneerudkvantifitseeriti piltidelt, mis värviti infDC jaoks, kasutades anti-CD163. CD163 koguintensiivsus, mis põhineb infDC ekspressioonil, arvutati ImageJ tarkvara abil (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA). CD163 intensiivsus saadi pärast tausta fluorestsentsi lahutamist isotüübist ja sekundaarsetest Ab-värvitud kujutistest ning infDC-st lähtuvate roheliste pikslite pindala ja keskmise fluorestsentsi intensiivsuse mõõtmist, kasutades CD163 antikeha, nagu varem kirjeldatud (7).
Statistiline analüüsTranskriptoomilise analüüsi jaoks esitatakse kirjeldav statistika keskmise ± standardhälbe või protsendina. Kliiniliste muutujate jaoks kasutati vastavalt vajadusele t-teste, ANOVA või Wilcoxoni auaste summa teste. Kategooriliste kliiniliste muutujate jaoks kasutati Fisheri täpset testi. Nanostringi andmete puhul normaliseeriti töötlemata loendused positiivsete spike-in kontrollidega ja seejärel muudeti log2. Tehnilise eelarvamuse vähendamiseks filtreeriti välja geenid, mille ekspressioonitase oli madalam kui keskmine pluss kaks standardhälvet negatiivsetest kontrollidest. Ülejäänud transkriptidele rakendati kvantiilne normaliseerimine (522 glomerulite ja 502 TI jaoks). Glomerulaarproove analüüsiti TI proovidest eraldi. Diferentsiaalse ekspressiooni, glomerulaarse ja TI transkripti ekspressiooni määramiseks LN-stneerudvõrreldi kontrollidega. A 1.5-kordne muutus ja p < 0.05="" olid="" vajalikud="" selleks,="" et="" transkripti="" saaks="" lugeda="" erinevalt="" väljendatuks.="" konfokaalse="" mikroskoopia="" statistilise="" analüüsi="" jaoks="" kasutati="" kahe="" rühma="" võrdlemiseks="" kahesabalist="" studenti="" t-testi="" ja="" p="">< 0,05="" peeti="" oluliseks.="" kõik="" analüüsid="" viidi="" läbi,="" kasutades="" origin="" pro="" versiooni="" 2020="" (originlab="" corp.,="" northampton,="" ma,="">
TULEMUSED
Neeru biopsiate transkriptoomiline analüüs LN-i ägenemise ajal näitab FCER1G olulist üleekspressiooni Glomeruli- ja TI-s LN-i ägenemise korralTegime glomerulitest eraldatud RNA ja TI transkriptoomilise analüüsi, kasutades LCM-ineerudbiopsiad, mis saadi proliferatiivse LN flflare (n=58) korral. Implantatsioonieelne elusdoonorneeru siirdaminebiopsiaid kasutati HC-dena (n {0}}). 579 immuuntranskripti transkriptoomiline analüüs näitas, et FCER1G on kõige olulisemalt üleekspresseeritud glomerulaarne transkript [Kolmumuutus (FC): 3,6, p-väärtus (p): 1E-10], kuid oli ka TI-s oluliselt üleekspresseeritud (FC: 1.7, p=0.001) LN-i fläre juures (joonis 1 ja täiendav tabel 2) võrreldes HC-ga. Lisaks korreleerus FCER1G ekspressioon NIH histoloogilise haiguse aktiivsuse indeksiga (r=−0,43, p=0,01).
Neeru FcR ekspresseerub tugevalt LN-i ägenemise ajal ja piirdub periglomerulaarse piirkonnagaFCER1G-d ekspresseeriva immuunraku iseloomustamiseks analüüsisime FCER1G-ga kodeeritud valku, Fc retseptori gammaahelat [FcR; (8)] inimese LN-s ja HC-sneerudkoe IF-mikroskoopilise analüüsiga, kasutades spetsiifilist antikeha. IF-analüüs näitas, et FcR ekspresseerub minimaalselt glomerulites (identifitseeritud podotsüütide markeri sünaptopodiiniga), kuid ekspresseerub rikkalikult LN flflare biopsiate PG ja TI piirkondades. FcR-i ekspresseerivatel rakkudel näis mikroskoopiliselt olevat tüüpiline rakuline infifiltraat PG piirkonnas (joonis 2). IF-analüüs näitas, et LN-i põlemise ajal laieneb PG-piirkond rakulise infifiltraadi olemasolu tõttu, samas kui PG-piirkond on õhuke ja ilma raku infifiltratsioonita HC-s, nagu on näha joonise 2 ühendatud piltidel.
ja täiendav joonis 4. Kõige tähtsam on see, et me nägime FcR-i nõrka kuni nulli ekspressiooni LN-is ja HC-s, kasutades samaaegselt töödeldud isotüübi antikehade kontrolle (andmeid pole näidatud). Need andmed toetavad transkriptoomilisi leide, et FCER1G kodeerib FcR-i ja on proliferatiivses LN flflare'is rikkalikult üleekspresseeritud.
Makrofaagimarkerid CD11b ja CD68 ei kolokaliseerunud inimese LN-neeru FcR-ga
Tuginedes varasematele interstitsiaalsete leukotsüütide kirjeldustele LN-s (9–11), ennustasime, et FcR-i ekspresseeriv rakk on makrofaag. Värvisime kahekordselt biopsia sektsioone FcR-vastaste antikehadega FcR antikehadega makrofaagimarkerite CD68, CD206 ja CD11b vastu. Ootamatult M2-spetsiifiliste makrofaagimarkerite, CD11b ja CD206 värvimine [(12); andmeid pole näidatud], näitas LN-s nõrka kuni nulli ekspressioonineerud.Samal ajal näitas panmakrofaagi marker CD68 (13) glomerulaarset ekspressiooni; seega viitab sellele, et M1 makrofaage leiti peamiselt glomerulites. Kuid CD68 värvimine ei langenud kokku FcR-i PG ja TI värvimisega (joonis 3). Need andmed näitavad, et FcR-i ekspresseerivad rakudneerudei ole makrofaagid. Kuigi CD206, CD68 ja CD11b vastased antikehad andsid LN-s nõrga või üldse mitte signaalineerud, värvisid nad Kupfffferi rakud terve inimese maksas tugevalt, kinnitades antikehade usaldusväärsust ja spetsiifilisust [(14); andmeid ei kuvata].
FcR, mis on kolokaliseeritud tavapärase dendriitrakkude markeriga CD11c ja MHCII-ga LN-neerus
Et teha kindlaks, kas FcR-i ekspresseeriv rakk oli dendriitrakk (DC), viidi läbi kolmevärviline IF-mikroskoopia, kasutades lisaks teised müeloidrakud. Kvalitatiivne analüüs näitas, et FcR ekspressioon (märgistati FcR-vastase antikehaga, millele järgnes Alexa-594 värviga konjugeeritud sekundaarne antikeha (Invitrogen), mis näitas konfokaalses mikroskoopias punast emissioonivärvi) kolokaliseeriti nii CD11c kui ka MHCII-ga. CD11c/MHCII märgistati CD11c/MHC II antikehaga, millele järgnes Alexa-488 värviga konjugeeritud sekundaarne antikeha (Invitrogen), mis näitas konfokaalses mikroskoopias rohelist emissioonivärvi (joonis 4). Kolokaliseerimine andis tulemuseks kollase värvuse, mis peegeldas nii flfluorestseeruva FcR (punane) kui ka CD11c / MHCII (roheline) olemasolu, mis esinevad samaaegselt samas asukohas / rakus XY dimensioonis (joonis 4). CD11c värvimismuster ühtis FcR-ga (joonis 4) PG ja TI piirkonnas ning kumbki antikeha ei värvunud glomerulites. Kooskõlas CD11c-ga värvus MHCII (joonis 4, alumine rida) tugevalt ka PG-s, kolokaliseerudes FcR-ga. Kuid lisaks tugevale PG värvimisele näitas MHCII ka nõrka värvumist glomeruli sees, mis viitab nõrga MHCII ekspresseeriva glomerulaarraku olemasolule, mis võib olla müeloidrakk.
FcR ei kolokaliseerunud plasmatsütoidse dendriitrakkude markeriga CD123, vaid kolokaliseerus monotsüütidest pärineva dendriitrakkude markeriga DC-SIGN
Et teha kindlaks, milline FcR-i ekspresseeriva DC alamhulk leitakse PG piirkonnas LN-i fluflare'i ajal, värviti biopsiakude CD123 jaoks, mis on plasmatsütoidse DC (pDC) spetsiifiline marker (16, 17). CD123 pluss rakke leiti TI piirkonnas (joonis 5, ülemine rida), kuid need puudusid LN glomerulites ja PG piirkonnasneerud. CD123 pluss rakud olid hõredad ja CD123 värvimine TI-s ei ühtinud FcR värvimisega. See viitab sellele, et intrarenaalne FcR-i ekspresseeriv DC LN-s ei ole pDC. Signaali reguleeriva valgu alfa (SIRP) ekspressioon on kolokaliseerunud FcR-ga (joonis 5, keskmine rida), mis viitab sellele, et PG DC-d ei ole müeloidsed tavapärased 1. tüüpi DC-d (cDC1) (16). Ülejäänud võimalused olid, et PG DC-d on müeloidsed tavapärased 2. tüüpi DC-d (cDC-d2) või monotsüütidest pärinevad DC-d (moDC-d). Nende DC alamhulkade eristamiseks hinnati DC-SIGN ekspressiooni, mis on moDC-dele spetsiifiline marker. DC-SIGN on kolokaliseerunud FcR-ga PG piirkonnas (joonis 5, alumine paneel), mis viitab sellele, et PG DC on moDC.
FcR kolokaliseeriti CD64, CD16 ja CD14-ga neeru periglomerulaarses piirkonnas ja kinnitas, et DC-d
Leitud LN-stNeerat Flare Are moDCs Kinnitamaks, et FcR-i ekspresseerivad DC-d on moDC-d, iseloomustati neid täiendavalt, hinnates täiendavate rakupinna markerite olemasolu, mis teadaolevalt esinevad moDC-s, sealhulgas CD64, CD16 ja CD14. Kõik need markerid leiti LN-stneerudkude ja kolokaliseeriti FcR-ga (täiendav joonis 1).
Varem tuvastatud tsirkuleeriva infDC markeriga CD163 ja CD163 kolokaliseeritud FcR ekspressioon on LN-i põlemisel üleekspresseeritud
Seejärel viidi läbi CD163 kolokalisatsioonianalüüs koos FcR-ga, et teha kindlaks, kas siin nähtud moDC populatsioon võib olla hiljuti kirjeldatud tsirkuleeriv infDC (18). Joonis 6 kinnitab CD163 kolokalisatsiooni (roheline) koos FcR-ga (punane) PG piirkonnas (joonis 6A) ja TI-ga (joonis 6B), mis viitab tugevalt sellele, et moDC alamhulk esinebneerudLN flflare'i ajal on tõepoolest infDC-d. Kuna infDC-d ei väljenda CD5 (18), siisneerudkude värviti CD5 jaoks. Kuigi CD5-ekspresseerivad rakud olid olemasneerud, ei asunud nad PG piirkonna läheduses ega kolokaliseerunud FcR-ga (täiendav joonis 2), mis viitab sellele, et neil infDC-del puudub CD5 ekspressioon. LN ja HC infDC erinevuse kvantifitseerimiseksneerud, infDC kvantifitseeriti, mõõtes CD163 ekspressiooni pindala pärast CD163-vastase monoklonaalse antikehaga värvimist ja CD163 keskmist fluorestsentsi intensiivsust. Kasutades 16 glomerulaarpilti 4 LN flflare'istneerudja 18 glomerulaarset pilti kolmest HC-stneerud, leidsime LN neerudes 9- kuni 21- korda kõrgema infDC taseme võrreldes HC-ga (joonis 6C). Kuna varem on näidatud, et infDC-d ekspresseerivad CD11b (19, 20), analüüsisime täiendavalt inimese LN-ineerudroti inimese CD11b-vastase mAb-ga (kloon M1/70) koos CD163-vastase antikehaga. Kooskõlas selle käsikirja varasemate leidudega (joonis 3) andis kloon M1/70 infDC-des nõrga-nulli signaali (täiendav joonis 3).
Põletikulised dendriitrakud esinesid LN-i ägenemise ajal T-rakkude vahetus läheduses
Lupus nefriitneerudlõigud kaeti T-raku markeriga CD3 ning FcR ja CD163 vastaste antikehadega, et T-rakud ja infDC-d ruumiliselt lokaliseerida. CD3 värvimine infDC markeritega viidi läbi kahel viisil, kasutades kahte erinevat CD3-vastaste antikehade klooni (hiire mAb UCHT1 ja küüliku mAb SP7) ja 2 infDC markerit. CD3 mAb UCHT1 ja anti-FcR värvimine näitas CD3 pluss T-rakkude olemasolu FcR pluss infDC-de kõrval LN PG piirkonnas.neerud(Joonis 7A). Värvimine anti-CD163 pluss CD3 mAb SP7-ga (joonis 7B) kinnitas, et infDC esines inimese LN-s CD3 pluss T-rakkude vahetus läheduses.neerud.Kuigi CD3 värvimine infDC-markeritega näitas mõlema rakutüübi puhul peamiselt diskreetset rohelist ja punast värvumist, kattusid mõnes kohas punane ja roheline värvumine.
ARUTELU Selles uuringus tuvastasime uudse infDC populatsiooni, mis imbus sellesseneerudLN flflare'is. Need infDC-d imbuvad sisse, lokaliseeruvad PG- ja TI-ruumidesse ning nende ekspressioon oli LN-i põlemisel 10-korda suuremneerudvõrreldes HC-dega. Tõendid, et need on uudsed, põhinevad nende pinnamarkeritel, milleks on FcR plus , MHCII plus , CD11c plus , CD163 plus , CD5 , DC-SIGN plus , CD64 plus , CD14 plus , CD16 plus , SIRP plus , CD206 , CD68 , CD123 , CD3 ja CD11bV . Nimelt esinesid need infDC-d lähedal T-rakkudele PG piirkonnasneerudLN põlemise ajal. Selle uurimise tähelepanekuid toetavad varasemad uuringud, mis tuvastasid PG DC infiltratsiooni erinevates eksperimentaalse glomerulonefriidi hiiremudelites (21, 22). Siiski on ebaselge, miks infDC asuvad PG-ruumis. Eelnev kirjandus viitab sellele, etneeru-DC algab glomerulusest ja liigub mesangiumist läbi glomerulaarkimbu ja lümfiteede dreneerivatesse lümfisõlmedesse, et esitada antigeen PG-s olevatele T-rakkudele (23). Sel juhul onneeru-DC võib alata glomerulusest, kuid selleks ajaks, kui LN muutub kliiniliselt ilmseks, on need alalisvoolud juba glomerulusest välja liikunud ja PG ruumi settinud. Seejärel võivad inhibeerivad signaalid vabaneda ja blokeerida tsütokiinid/kemokiinid, mis on vajalikud monotsüütide diferentseerumiseks infDC-ks, selgitades infDC-de puudumist LN glomerulitest biopsia ajal. Alternatiivina on võimalik, et alalisvoolu kemotaktilised faktorid vabanevad otseneeru-torukujulised rakud tõmbavad ligi infiltreeruvat alalisvoolu (24). Me oletame, et mõlemad esinevad vastusena põletikulistele stiimulitele, mille tulemuseks on infDC PG ja TI akumuleerumine LN ajal.
See uurimine näitas, et PG DC ei ole plasmatsütoidsed ega tavapärased DC-d. Varem teatatud monotsüütide markerite CD14, CD64 ja CD16 ekspressioon kinnitas, et need PG DC-d esindavad moDC-d (16, 25, 26). Aktiivse põletiku või infektsiooni taustal nimetatakse moDC-sid infDC-deks (27). Nende moDC-de edasine iseloomustamine näitas ainulaadset infDC populatsiooni, mida inimese LN-s varem ei kirjeldatud. Eelkõige tuvastas hiljutine SLE-ga patsientide perifeerse vere immuunrakkude transkriptoomiline uuring infDC signatuuri, milleks olid CD163 pluss , CD14 pluss ja CD5h , mis on sarnane siin kirjeldatud intrarenaalse infDC populatsiooniga (18). Hiljuti viidi läbi ulatuslik immuunrakkude hindamine, kasutades üherakulist RNA-Seq-dneerudbiopsiad LN flflare'is (28). Selles uuringus tuvastati mitu monotsüütide klastrit, kus üks monotsüütide klaster väljendas CD163 pluss, CD14 pluss, CD16 pluss, CD64 pluss ja DC-SIGN plusssignatuuri, mis sarnaneb siin kirjeldatud infDC-ga. Lisaks arvati, et iseloomustatud monotsüütide suguvõsa on infiltreeruv monotsüütide alamhulk, kuna see ekspresseeriti tervetel inimestel minimaalselt.neerud. Kuigi need IF-uuringud ei anna täpset mõõtmist liini markerite ekspressiooni taseme kohta ja see võib aidata tuvastada monotsüütide alalisvoolu konversiooni dDFOult üleminekuetappe, võimaldavad need leiud iseloomustada ja ruumilist orientatsiooni edasiste kvantitatiivsete uuringute tegemiseks.
See uudne infDC populatsioon sarnaneb ka varem teatatud infDC-ga, mis pärineb Listeriaga nakatunud hiirte lümfisõlmedest (CD64 pluss CD11c pluss MHCII plus ) (27) ja tsöliaakia soolestiku limaskestalt (29). InfDC-sid on varem kirjeldatud ka reumatoidartriidiga patsientide artriidi sünoviaalvedelikus (20). Kuid LN-is kirjeldatud infDCneeruderineb sünoviaalsest vedelikust infDC; selles, et neil puuduvad makrofaagide markerid CD11b ja CD206, mis esinevad sünoviaalvedelikus infDC. See viitab sellele, et siin kirjeldatud infDC populatsioon erineb vähemalt mõne muu autoimmuunhaiguse korral täheldatud infDC populatsioonist ja võib olla ainulaadneneerudLN-i põlemise ajal. Veelgi enam, varasemad uuringud on tuvastanud FcεRI [(19, 30); identifitseeriti antiFcεRI antikehaga (eBioscience, Inc., San Diego, CA, USA) antikeha sidumissaidi jaoks], mis on parim marker infDC eristamiseks
JOONIS 6|Fc retseptori gamma ahel kolokaliseerub eelnevalt tuvastatud tsirkuleeriva põletikulise dendriitrakkude (infDC) markeriga CD163 ja CD163 ekspressioon on inimese LN-s võrreldes HC-dega üleekspresseeritud. (A) Kolm värvilist IF-pilti, mis esindavad kolme inimese LN-ineerudnäitab CD163 kolokaliseerumist roheliselt JOONIS 6|(esimene), mille FcR on punases (keskel) PG piirkonnas. Teine rida näitab punktiirjoonel esile tõstetud ülemise rea piltide suumitud osa. Kolmas veerg näitab esimese 2 liitumist koos tuumade DIC ja DAPI värvimisega (sinine). (B) Kolm värvilist IF-pilti, mis esindavad kolme inimese LN-ineerudnäitab CD163 kolokaliseerumist roheliselt (esimene) koos FcR-ga punasega (keskel) tubulointerstitsiaalses (TI) piirkonnas. (C) Tulpdiagramm kujutab CD163 ekspressioonil põhinevate infDC-de kvantifitseerimist, kasutades rohelist värvi anti-CD163 värvimisel 18 G kujutisest 3 erinevast HC-st ja 16 glomeruli kujutisest 4 erinevast LN-proovist, kasutades ImageJ tarkvara. CD163 (roheline) pindala üksi (graafik vasakul) ja pindala × keskmine fluorestsentsi intensiivsus (graafik vasakul) mõõdeti ja joonistati keskmise ± SD-ga. Andmeid analüüsiti paaritu t-testiga (ühesabaline) iga mõõtmise abil ja p-väärtused märgiti tulpdiagrammile. JOONIS 7|rida kujutab 3 värvilist IF-pilti, mis esindavad kolme erinevat LN-ineerudnäitab CD3 (pan T-raku marker punasega) olemasolu CD163 kõrval (infDC marker roheliselt), mis on PG piirkonnast tugevalt suurendatud. Alumine rida näitab kahe esimese veeru liidetud kujutisi paremal ja kahe esimese veeru liidetud kujutisi, millele lisandub tuumade DIC ja DAPI värvimine (sinine). makrofaagidest ja cDC-st flflow tsütomeetria abil. Meie uuringud näitavad, et FcR, tsütoplasmaatiline gamma-subühik, mille kaudu toimivad mitmed FcR-id, sealhulgas FcεRI, FcRI, FcRIIIa ja FcRI, samuti muud immuunretseptorid, nagu GPVI, OSCAR ja TREM (8), on usaldusväärne. marker patsiendi biopsiaproovide IF-uuringute jaoks. Tõenäoliselt on infDC LN-isneerudekspresseerivad FcεRI-d, sarnaselt Fc RI ja Fc RIIIa (täiendav joonis 1), kuna FcR olemasolu viitab kaudselt mitme retseptori, sealhulgas FcεRI olemasolule.
CISTANCHE PARANDAB NEERU-/NEERUHAIGUST
CD163 ekspresseeriva intrarenaalse rakutüübi iseloomustamise tähtsust suurendavad meie rühma hiljutised leiud, mis näitavad, et uriini CD163 tase oli aktiivses LN-s märkimisväärselt kõrgem võrreldes ekstrarenaalse SLE või inaktiivse SLE-ga (31). Uriini CD163 korreleerus haiguse tõsiduse ja histoloogilise aktiivsuse indeksiga. Kuigi Mejia jt uuring (31). pakutud CD163 pärineb M2 makrofaagidest, soovitame nüüd, et uriin CD163 pärineb ka infDC-st, toetades ideed, et uriini CD163 on biomarker, mis peegeldab haiguse aktiivsust LN-is.
Nende infDC-de päritolu osas viitab monotsüütide markerite ekspressioon sellele, et infDC-d võivad erineda infiltreerunud monotsüütidest.neerudmitmesuguste autoimmuunsete stiimulite, sealhulgas immuunkomplekside põhjustatud põletiku ajal. Teisest küljest viitab CD163 pluss CD14 pluss infDC-de olemasolu luupuse vereringega patsientidel (18) sellele, et perifeersest vereringest pärinev infDC sisenebneerudLN-is. Samuti on võimalik, et mõlemad mehhanismid arvestavadneeru-infDC-d. Mehhanismid, mille abil infDC interakteeruvad T-rakkudega inimese LN-i ajal, ei ole praegu teada. Kuigi CD3 värvimine koos infDC markeritega näitab peamiselt mõlema rakutüübi diskreetseid populatsioone vahetus läheduses (joonis 7B), on tõendeid ka mõningase kattumise kohta, mis viitab immunoloogilise sünapsi moodustumisele ja interaktsioonidele nende infDC-de ja T-rakkude vahel LN-is.neerud.T-rakud on aga valmis migreeruma sekundaarsetesse lümfoidorganitesse; hiljutine aruanne on näidanud immuunagregaatide olemasolu, mis on organiseeritud tertsiaarsete lümfoidstruktuuridena (TLS) LN ja hiire LN-ga patsientidel.neerudmis sarnanevad geenisignatuuride ja raku koostise poolest lümfisõlmedega (32). See on kooskõlas eelmise aruandega, mis tuvastas LN-s T- ja B-rakkude agregaatidega idukeskused.neerud(33). Arvestades neid leide LN-is infDC-de tuvastamise kontekstisneerudviitab sellele, et PG-s ja TI-s olevad infDC-d võivad olla olulised lokaalse adaptiivse immuunvastuse tegurid LN-neeru sees. Kuigi pole veel selge, kas need T-rakud on resident-T-rakud või praimitud T-rakud, on teada, et infDC-d on mitmesuguste haigusseisundite korral võimelised käivitama peamiste T-abistajarakkude alamhulkade, nimelt Th1, Th2 ja Th17 (20). , 34, 35). Kuigi in vitro uuringud näitavad, et infDC-d osalevad Th17 vastuse algatamises ja säilitamises (19), on täiendavad uuringud uudse LN-i kohta.neer infDC-sid on vaja, kuna põletikuline stiimul ja koe mikrokeskkond määravad infDC funktsiooni in situ (36).
KOKKUVÕTE
Kokkuvõtteks tuvastasime uudse infDC populatsiooni, mida pole LN-is varem kirjeldatudneerud.Need infDC-d asuvad PG piirkonnas ja infiltreeruvate T-rakkude kõrval. Meie leiud koos hiljutise kirjandusega, mis tuvastavad tsirkuleerivat CD163 pluss infDC-d SLE-s ja uriini CD163 kui väärtuslikku haiguse aktiivsuse markerit LN-is, viitavad sellele, et infDC-d ja nende T-raku partnerid võivad olla aktiivse LN-i ajal kohaliku adaptiivse immuunvastuse käivitamisel peamised tegurid. Täiendavad uuringud on vajalikud infDC-de kõrval asuvate T-rakkude alamrühmade määratlemiseks ja mehhanismide mõistmiseks, mille abil PG infDC-d suhtlevad T-rakkudega, et juhtida LN-is kohalikku põletikku.
