Interleukiini (IL) uus roll fibroosi korral

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Ⅰ osa: tuuma IL-33 piirab fibroblastide varajast muundumist rakuväliseks maatriksit sekreteerivaks fenotüübiks

FrancescaGatti, Sobuj Mia, Clara Hammarström jt.

Interleukiin(IL)-33 on tsütokiin, mis näib vahendavatfibroossignaalides oma retseptori ST2 (IL(Interleukiin)-33R/ILiRL1). Siiski on see ka valk, mis pärast sünteesi sorteeritakse raku tuumaks, kus see näib mõjutavat kromatiini voltimist. Siin kirjeldame tuuma-IL-i uudset rolli(Interleukiin)-33 fibroblastide fenotüübi reguleerimisel hiirelneerudfibroosmille põhjuseks on ühepoolne kusejuha obstruktsioon. IL-i transkriptsiooniline profileerimine(Interleukiin)-33-puudulikud neerud näitasid 24 tundi pärast ligeerimist fibrogeensete geenide suurenenud ekspressiooni ja rakuvälise maatriksi moodustumise ja ümberkujundamisega seotud geenikomplektide rikastumist. Need muutused põhinesid IL-i rakusisestel toimetel(Interleukiin)-33, kuna neid ei paljundatud L.33 neutraliseeriva antikehaga töötlemisel, mis hoiab ära IL-i(Interleukiin)-33R/ST2L retseptori signaaliülekannet ega täheldatud neid ka L-33R/ST2-puudulike neerude puhul. lL-33 rakusisese funktsiooni edasiseks uurimiseks koostasime inimese fibroblastide transkriptsiooniprofiilid, jälgides, et IL-33 katkestamine moonutas transkriptsiooniprofiili põletikulisest müofibroblasti fenotüübi suunas, mis kajastub COL3Al kõrgemates tasemetes. , COL5A1 ja transgeliini valk, samuti IL6, CXCL8, CLL7 ja CCL8 madalamad ekspressioonitasemed. Kokkuvõttes näitavad meie tulemused, et tuuma IL(Interleukiin)-33 fibroblastides summutab esialgset profibrootilist vastust, kuni püsivad stiimulid, nagu UUO jõustab, võivad selle kaitsemehhanismi alistada.

Interleukiin-33 (IL-33/IL(Interleukiin)1F1l) on liigeinterleukiin-1 superperekond, mis on pälvinud märkimisväärset tähelepanu kui oletatav vahendajafibroosarengut. Suure osa sellest huvist suurendas korduvate IL-i süstide jälgimine(Interleukiin)-33, mis toimib transmembraanse retseptori ST2 (IL(Interleukiin)33RJ/IL(Interleukiin)1RL1), indutseeritud nahalefibroosja jälgides, et IL(Interleukiin)-33-puudus vähendas oluliselt süsiniktetrakloriidist põhjustatud maksafibroos. Tõepoolest, IL(Interleukiin)-33 võib reklaamidafibroosprofibrootilise IL-i tekitamisega(Interleukiin)-13 2. tüüpi kaasasündinud lümfoidrakkudest (ILC2) ja T-abistaja 2-lümfotsüütidest.

Neerude interstitsiaalnefibroosja parenhümaalsete tubulaarsete rakkude kadu on krooniliste neeruhaiguste tavalised lõpptulemused ja head haiguse progresseerumise ennustajad. Kahest erinevast hiiremudelist genereeritud praegused andmed toetavad hüpoteesi, et IL(Interleukiin)-33 aitab kaasa ka neerupatoloogialefibroos: ühepoolse kusejuha obstruktsiooni (UUO) korral teatasid Chen jt parenhüümi kadu vähenemisest ja epiteeli suurenenud proliferatsioonist mõlemas IL-is(Interleukiin)-33- ja ST2-puudulikud hiired' ning neeruisheemia-reperfusiooni korral Liang et al. näitas, et IL inhibeerimine(Interleukiin)-33 signaalimine lahustuva IL(Interleukiin)-33 retseptor (sST2) samuti vähenenudfibroos.

Aruanded, mis on käsitlenud IL-i fibrogeenseid omadusi(Interleukiin)-33 teostatakse ja tõlgendatakse üldiselt, pidades silmas mehhanismi, mille abil IL(Interleukiin)-33, mis vabaneb stressis või kahjustatud rakkudest, seondub oma retseptori rakuvälise domeeniga. Seevastu IL-i sorteerimine.(Interleukiin)-33 raku tuumale pärast sünteesi – ja selle võime mõjutada retseptorist sõltumatut kromatiini voltimist viitab sellele, et IL-33 võib samuti avaldada transkriptsioonifaktorilaadseid, retseptorist sõltumatuid funktsioone, mis on toimeviis, millele on eksperimentaalselt palju vähem tähelepanu pööratud. . Need kaalutlused on seda huvitavamad, kui arvestada asjaolu, et IL-i tuuma lokaliseerimine(Interleukiin)-33 on eluliselt tähtis, nagu näitab surmav, mitteparanev põletik, kui tuuma lokaliseerimise signaal on häiritud.

Peamine rakuline vahendajafibrooson müofibroblast, mis aktiveerituna toimib esmase kollageeni tootva ja kokkutõmbuva koe parandamise rakuna. Müofibroblastidele on iseloomulik a-silelihase aktiini (a-SMAACTA2) ekspressioon, mis võimaldab nende kontraktiilset funktsiooni ja aitab kaasa lihaste hävitavale toimele.fibroosOleme varem näidanud, et tuuma I{0}} indutseeritakse müofibroblastides kiiresti ja tugevalt eksperimentaalse haavade paranemise käigus, maohaavandite ja haavandilise koliidi korral. Tõepoolest, IL-i väljendus(Interleukiin)-33 näib olevat a-SMA-positiivsete müofibroblastide üldine tunnus, kuna seda leidub ka kõhunäärmesfibroosja maksa müofibroblastitaolistes tähtrakkudes. Kokkuvõttes muudavad need leiud huvitavaks küsida, kas IL(Interleukiin)-33 võib omada rolli müofibroblastide funktsiooni ja diferentseerumise reguleerimisel.

Kirjeldame siin tuuma lL-33 uudset rolli müofibroblasti fenotüübi reguleerimisel. IL geneetilise deletsiooni või farmakoloogilise inhibeerimise abil(Interleukiin)-33 UUO mudelis, samuti IL-i ammendumine(Interleukiin)-33 aktiveeritud inimese primaarselt kultiveeritud dermaalsetes fibroblastides näitame, et tuuma IL(Interleukiin)-33 piirab varajast üleminekut täieõiguslikuks müofibroblastiliseks fenotüübiks ja toetab põletikulist fenotüüpi. IL-i ammendumine(Interleukiin)-33 suurendas ekstratsellulaarse maatriksi komponentide COL1Al, COL1A2, COL3A1, COL5A1 ja transgeliini ekspressiooni, kuid inhibeeris põletikueelse tsütokiini IL ekspressiooni(Interleukiin)-6 ja kemokiinid CXCL8 CCL7 ja CCL8. Meie leiud toovad seega kaasa uue vaatenurga IL-33 rolli mõistmiseksfibroosareng ja kudede homöostaas.

Cistanchetubulosatakistabneerudhaigus, proovi saamiseks klõpsake siin

Tulemused

Müofibroblastid on domineerivad IL(Interleukiin)-33-ekspresseerivad rakke hiire UUO-s.Cheni ja tema kolleegide hiljutine uuring teatas IL-i suurenenud ekspressioonist(Interleukiin)-33 ja ST2 4. päeval pärast ühepoolset kusejuha obstruktsiooni. Me lähenesime nende katsele, kogudes neerud 1, 7 ja 21 päeva pärast UUO-d C57BL/6J hiirtel, jälgides pidevat IL-i suurenemist.(Interleukiin)33 mRNA transkripti (joonis 1A) ja tuuma IL-i ekspresseerivate rakkude suurenenud arv(Interleukiin)-33(Joonis 1B). Samuti täheldasime I tüüpi kollageeni transkriptsiooni ja valgu ekspressiooni, mis peegeldas kollageeni arengutfibroos(joonis IC, D). Seejärel analüüsisime IL-i fenotüüpi(Interleukiin)-33-väljendavad lahtreid. Nagu Chen et al., täheldasime, et IL(Interleukiin)-33-2. päeval nähtud rakkude alamhulk koosnes valdavalt a-SMA-positiivsetest müofibroblastidest, kuid me ei leidnud signaali IL-i jaoks(Interleukiin)-33 CD31-positiivsetes endoteelirakkudes ega CD45-positiivsetes leukotsüütides (joonis IE ja joonis S1). Samuti jälgisime IL-i(Interleukiin)-33 hajutatud peritsüütides (punane nooleots joonisel 1A, 21. päeva paneel). PDGFRB, teise müofibroblastide ja peritsüütide markeri paaris-immunovärvimine näitas ulatuslikku kolokalisatsiooni (joonis IE). Lisaks hindasime, kas IL(Interleukiin)33 kolokaliseeriti tuntud fibroblastide aktivatsiooni markeritega, leides, et S100A4 (tuntud ka kui fibroblastispetsiifiline valk, FSP-1) ekspressioon ekspresseeriti pigem kapillaaride ja keskmise suurusega veresoonte endoteelirakkudes (joonis IE). . Sarnaselt leiti VIM/vimentiini valdavalt ka endoteelirakkudes, eriti glomerulites ja keskmise suurusega veresoontes ning IL-is ei ilmnenud selget koosekspressiooni.(Interleukiin).33-positiivsed rakud (joonis 1E). IL-i edasine analüüs(Interleukiin)-33-müofibroblastide ekspressioon 7. päeval näitas, et need paiknesid peamiselt ajukoores ja kortikomedullaarses ristmikus. ja vähem rohkesti medullas ja papillas (joonis 1F).

Joonis 1. Ühepoolne kusejuha obstruktsioon kutsub esile IL(Interleukiin)-33 ekspressioon hiire neerudes.

(A, C) 33 ja Collal suhteline ekspressioon tervete kontrollhiirte (n=2) või võltsoperatsiooniga (n=1) või UUO-ga hiirte neerudes 1, 7 või 21 päeva pärast (n=3 igal ajahetkel). Transkriptsioonitasemed kvantifitseeriti qRT-PCR abil, nagu on üksikasjalikult kirjeldatud jaotises Materjalid ja meetodid. Andmepunktid esindavad üksikuid hiiri. (B, DF) Tüüpilised mikrofotod IL-i jaoks värvitud koelõikudest(Interleukiin)-33 [pruun signaal sisendis (B) ja (F), pruun või sinine signaal sisendis (E)], COL1 (pruun signaal paneelil D), Asma (punane, E, F), CD31 (lilla, E ), PDGFRB (sinine, E), vimentiin (sinine, E) ja S100A4 (lilla, E) tervete kontrollhiirte või hiirte neerudes, kellele on tehtud UUO2 päeva (E), 7 päeva (B, D, F) või 21 päeva (B,D)varem. Paneel (F) näitab neeru erinevaid piirkondi märgistatuna. Skaalaribad=20 μm.

I{0}} geneetiline deletsioon mõjutab UUO fibroosi progresseerumist ebaoluliselt, kuid vahendab kollageeni sünteesi varajast hoogu.Järgmisena hindasime IL-i oletatavat rolli(Interleukiin)-33, võrreldes IL-i neerusulguse vastust(Interleukiin)-33 ja metsiktüüpi hiired. Vastupidiselt Chenile ja kolleegidele, kes teatasid vähenemisestfibroosareng IL-is(Interleukiin)-33-puudulikud hiired, kellele tehti UUO, ei täheldanud me IL-i vahel erinevust(Interleukiin)33--ja WT-hiirtel arenes fibroos 7. või 21. päeval pärast UUO-d I tüüpi kollageeni immunohistokeemilise analüüsi põhjal (joonis 2A, B). Kuid lahkades fibrootilist vastust transkriptsiooni tasemel, hinnates kollageeni transkripte, täheldasime IL-i võrdlemisel varajast, olulist ülesreguleerimist Collali transkriptide kaks korda kõrgemale tasemele ja suundumust Col3al suurenemisele.(Interleukiin)-33-puudulikud ja metsiktüüpi neerud 1. päeval (joonis 2C, D). Seetõttu otsustasime korrata Cheni jt eksperimentaalset disaini. analüüsides ka proove 4. päeval pärast UOO-d ja kaasates ST2-puudulikke hiiri, võrreldes neid IL-ga(Interleukiin)-33-puudulikud ja WT hiired. Need analüüsid näitasid Colla2 olulist suurenemist IL-is(Interleukiin)33-puudulikud neerud võrreldes metsiktüüpi neerudega 4. päeval, kuid ST-2-puudulike neerude arv ei suurenenud (joonis 2E). 4. päeval ei ilmnenud selget erinevust Collar ja Col3al transkripti tasemetes genotüüpide vahel, mis näitab, et mõju nendele geenidele on lühem (andmeid pole näidatud ja joonis 2F).

Joonis 2. Kollageeni ekspressioon IL-s(Interleukiin)-33-/ja metsiktüüpi neer UUO ajal.

(A, B) Tüüpilised mikrofotod koelõikudest, mis on värvitud COL1 (pruuni) järgi neerudes I-33-- ja WT hiirtelt 7 ja 21 päeva pärast UUO-d. (C, D) Ajakulu, milles võrreldakse Collali ja Col3al-i mRNA transkriptsiooni IL(Interleukiin)-33--ja WT hiired, terved kontrollhiired (n=2), fiktiivselt opereeritud hiired (n=1) ja hiired, kellele tehti UUO1, 7 või 21 päeva varem (n{{ 7}} igal ajahetkel ja iga genotüübi kohta).(E,F) Collali ja Col3al transkriptsiooni võrdlus neerudes IL-st(Interleukiin)-33-,ST2-ja WT hiired 4 päeva pärast valeoperatsiooni (n=5 genotüübi kohta) või UUO(n=10genotüübi kohta). Transkriptsioonitasemed kvantifitseeriti mRNA qRT-PCR abil. Andmepunktid tähistavad üksikuid hiiri, tulbad näitavad keskmisi väärtusi.*lk<><><>

IL(Interleukiin)-33 nõrgendab profibrootiliste geenide ekspressiooni UUO varases faasis.Krae ja Col31 suurenenud ekspressioon 1. päeval (joonis 1 CD) ja Colla2 4. päeval (joonis 2E) IL-s(Interleukiin).33-puudulikud hiired näitasid IL-i rolli(Interleukiin)-33 vigastusele varajases reageerimises. Uurisime seda võimalust, kaasates laiendatud katsesse rohkem loomi, jälgides krae, Colla2 ja Col3al suurenenud transkriptsioonitasemeid IL-is(Interleukiin).-33-puudulikud hiired 1. päeval (joonis 3A–C).

Olles täheldanud, et IL(Interleukiin)-33 hiirte neerukudedes, kelle UUO-d on lokaliseeritud raku tuumades, küsisime järgmiseks, kas IL-is täheldati muutunud geeniekspressiooni(Interleukiin)-33-puudulikud hiired 1. päeval pärast UUO-d olid tingitud muljetavaldava tuuma IL-33 vabanemisest või ekstratsellulaarse IL puudumisest(Interleukiin)-33. Me käsitlesime viimast võimalust, manustades IL-le suunatud neutraliseerivat antikeha(Interleukiin)-33 metsiktüüpi hiirtele enne UUO-d (joonis 3D). See ravi ei reprodutseerinud IL-i fibrogeenset fenotüüpi(Interleukiin)33 mutanti, tugevdades hüpoteesi, et IL-i puudumisel täheldati profibrootilise geeniekspressiooni suurenemist(Interleukiin)-33 oli tingitud pigem tuuma- kui ekstratsellulaarse IL-i puudumisest(Interleukiin)-33.

Joonis 3.IL(Interleukiin)-33 nõrgendab kollageenide ekspressiooni UUO varases faasis.

(AC) Collal, Colla2 ja Col3al transkriptsioon neerudes IL-st(Interleukiin)-33-/ja WT hiired 1 päev pärast valeoperatsiooni (n=5 genotüübi kohta) või UUO (n=10genotüübi kohta). (D) Col3al-i transkriptsioon anti-IL-ga ravitud WT-hiirte neerudes(Interleukiin)-33, isotüübi kontrollantikehad või vehiikul enne UUO-d. Neerud koguti 24 tundi pärast UUO-d (n=10 ravirühma kohta) või fiktiivset operatsiooni (n=5). Transkriptsioonitasemed kvantifitseeriti qRT-PCR abil. Andmepunktid tähistavad üksikuid hiiri, tulbad näitavad keskmisi väärtusi.**lk<><>

IL-i transkriptsioonianalüüs(Interleukiin)-33-puudulikud neerud näitavad rakuvälise maatriksi ümberkorraldamise ja kollageeni moodustumise profiili.Varase vastuse UUO-le üksikasjalikumaks uurimiseks transkriptsiooniprofiilide abil ekstraheeriti RNA IL-i neerudest(Interleukiin)-33-puudulikud ja metsikut tüüpi hiired 24 tundi pärast UUO-d. Paaripõhist Fisheri lineaarset diskriminanti24 kasutati 5 protsendi (200 geeni) erinevalt ekspresseeritud geeni tuvastamiseks WT ja IL vahel.(Interleukiin)-33-puudulikud neerud, mis näitavad põhikomponentide analüüsis selget genotüüpide eraldumist (joonis 4A). Mitterange lähenemine (lk<0.05,><0.25, and="" fold="" change="">1.3) tuvastas kontrastses IL-s 134 allareguleeritud ja 46 ülesreguleeritud sondi(Interleukiin)33−/− (n=5) versus WT (n=4) (täiendav tabel S1), viimaste hulgas eriti Col1a1, Col1a12 ja Col3a1 ning müofibroblastidega seotud Acta2 (joonis 4B) . Lisaks näitas diferentsiaalselt ekspresseeritud geenide geeniontoloogia analüüs DAVID-i annotatsiooniklastri abil (tabel S2) kollageenide ja proteaasi inhibiitoritega seotud GO-terminite positiivset rikastumist, samuti PDGF-i seondumist ja ECM-retseptori interaktsiooni ning GO-ga seotud negatiivset rikastumist. terminid, mis on seotud oksidoreduktaasi aktiivsuse ja naatriumist sõltumatute anioonide transportijatega.

Joonis 4. Kokkuvõte IL-i transkriptsioonilistest erinevustest(Interleukiin)-33-puudulikud ja metsiktüüpi hiired 24 tundi pärast UUO-d.

(A) 3D-hajumisdiagramm näitab proovide jaotust, mis põhineb 200 geeni põhikomponendi analüüsil. (B) parimate erinevalt ekspresseeritud geenide soojuskaart.

Fibroblasti IL.33 ammendumine soodustab geenisignatuuri, mis on kooskõlas suurenenud rakuvälise maatriksi ladestumisega.IL funktsiooni uurimiseks(Interleukiin)-33dominantses IL-is(Interleukiin)-33-ekspresseerides ummistunud neerude rakupopulatsiooni, kallutasime kultiveeritud inimese fibroblaste müofibroblasti fenotüübi suunas, eksponeerides need IFN-y ja TGF-ga 24 tunniks pärast siRNA-vahendatud I-33 katkestamist. Tõhusat löömist kontrolliti nii valgu kui ka transkripti tasemel (joonis 5A) ning sellega kaasnes profibrootilise COL3A1, COL5A1 ja TAGLN (joonis 5B-D) suurenenud mRNA ja valgu tase. Esialgsed analüüsid näitasid TGF-i osalust ja ajendasid meid transkriptsiooniliselt profileerima ühendatud kultiveeritud inimese fibroblaste, mida on töödeldud siRNA-ga IL-ks(Interleukiin)-33 ja aktiveeritud IFN-y(indutseerida IL(Interleukiin)-33 ekspressioon) või IFN-y ja TGF-B kombinatsiooni abil 24 tunni jooksul. See analüüs tuvastas 64 erinevalt ekspresseeritud geeni, mis on seotud IL-i vähenemisega(Interleukiin)-33(kohandatud lk<0.05 and="" fold="" change="">1.5, joonis 5E), millest 35 olid ühised mõlema tsütokiiniga töötlemise puhul (joonis 5E, F). Lisaks näitas enamik geene mõlemas olukorras sarnaseid suundumusi, isegi kui nad saavutasid valitud diferentsiaalse ekspressiooni läve ainult ühes neist (joonis 5F), mis toetab eeldust, et IL-i pärssimine(Interleukiin)-33 oli mõlemal tingimusel sarnane. Geeni ontoloogia analüüsi jaoks võtsime seetõttu arvesse geene, mida IL ekspresseeris erinevalt(Interleukiin)-33 ammendumine vähemalt ühel tingimusel ja annotatsioonide rühmitamine (tabel S3). Kooskõlas meie leiuga UUO-exposed, IL(Interleukiin)-33-puudulikud neerud, leidsime, et IL pärssimine(Interleukiin)-33 fibroblastides põhjustas kollageeni ja rakuvälise maatriksi komponentidega seotud GO-terminite jaoks rikastatud geenide ekspressiooni suurenemise. Lisaks rikastati I-33 ammendumise tõttu represseeritud geene GO-terminite suhtes, mis olid seotud vastusega põletikulisele stimulatsioonile. Meie andmed koos viitavad sellele, et IL(Interleukiin)-33 ekspressioon fibroblastides pärsib ekstratsellulaarse maatriksi ladestumise ja müofibroblastide aktivatsiooniga seotud transkriptide ülesreguleerimist, samas kui IL toetab teatud määral põletikulisi transkripte(Interleukiin)-33.

Joonis 5. Fibroblasti IL-i ammendumine(Interleukiin)-33jõustab geenisignatuuri, mis on kooskõlas suurenenud rakuvälise maatriksi ladestumisega.

IL ekspressioon(Interleukiin)33(A), COL5A1(B), FIBL5(C) ja TGLN(D) ekspressioon IL-ga töödeldud inimese fibroblastides(Interleukiin)-33-spetsiifilist ja segatud siRNA-d mõõdeti gRT-PCR (ülemised paneelid) ja Western blot (alumised paneelid) abil. Tulbad näitavad 4 sõltumatu katse keskmisi väärtusi,*lk<0.05.(e)venn diagram="" comparing="" differential="" expression="" of="" transcripts="" in="" response="" to="" the="" silencing="" of="">(Interleukiin)33 kontroll- ja aktiveeritud rakkude vahel.

(F) Soojuskaart, mis näitab erinevalt ekspresseeritud transkripte vastuseks IL-i siRNA-vaigistamisele(Interleukiin)-33 kontroll- ja aktiveeritud lahtrites.

IL-i ammendumine(Interleukiin)-33 eelistab aktiveeritud fibroblastides müofibroblasti põletikulise fenotüübi asemel.Tuginedes meie tähelepanekule, et I{0}} mõju näib püsivat ja muutub aja jooksul silmatorkavamaks, kuigi IL(Interleukiin)-33 ekspressioon väheneb (joonis S2A, B), siis küsisime järgmiseks, kas IL-i peamine tuumafunktsioon(Interleukiin)-33 võib olla pigem fibroblastide diferentseerumise reguleerimine kui profibrootiliste efektorite otsene reguleerimine. Stimuleerimisel tekivad vaikses olekus fibroblastidel ja teistel mesenhümaalsetel rakkudel põletikulised ja/või kontraktiilsed funktsioonid. Põletikuliste fibroblastide ja kontraktiilsete müofibroblastide vaheline spekter on endiselt halvasti määratletud ja esindab tõenäoliselt pigem libisevat üleminekut kui kahte erinevat fenotüüpi. Hiljutises Ohlundi jt publikatsioonis23 võrreldi vähiga seotud fibroblaste (CAF-e) rahulike pankrease tähtrakkudega, tuvastades põletikulise fenotüübi, mida nimetatakse iCAF-ideks (mida on kasvatatud Transwellsis koos tsütokiini sekreteerivate kasvaja organoididega ja mis ekspresseerivad kõrget ja madalat taset IL(Interleukiin)6 ja SMA, vastavalt [IL(Interleukiin).dPa-SMAl]) ja kontraktiilne müofibroblastiline fenotüüp, myCAF-id (IL)(Interleukiin)6"a-SMA-, kultiveeritud tihedates monokihtides), iCAF-ide ja mvCAF-ide transkriptsiooniprofiil ja võrdlemine tuvastasid iseloomulikud transkriptsiooniprofiilid. Kui põletikulise fenotüübiga fibroblastid (iCAF-id) suurendasid nende ekspressiooniinterleukiinidja kemokiinid, müofibroblastilise fenotüübiga (myCAF-id) iseloomustasid TGF-vastuse geenide ja rakuvälise maatriksi komponentide, sealhulgas kollageenide, suurenenud ekspressioon3. Kasutasime seda andmekogumit allkirjade loendite loomiseks, mis koosnesid fenotüüpide vahel diferentseeritult reguleeritud geenidest ja teostasime GSEA tarkvaras geenikomplekti rikastamise analüüsi. Tulemused näitasid, et I-33 inhibeerimine toetas kontraktiilset müofibroblastilist fenotüüpi (myFBL) ja inhibeeris põletikulist fenotüüpi (iFBL) inimese fibroblastides (joonised 6A, B, tabel S4), nõustudes seega meie geeniontoloogia analüüsi tulemustega. . Siinkohal pöörasime tähelepanu IL-le(Interleukiin)6 ja CXCL8, tsütokiinid, mida on pakutud iCAF-ide markeriteks, leides, et kuigi need geenid ei vastanud meie transkriptoomianalüüsi diferentsiaalse ekspressiooni kriteeriumidele, võis pärast IL-i ammendumist tuvastada nende ekspressioonitasemete vähenemine qRT-PCR abil.(Interleukiin)-33(Joonis 6C, D). Põletikuliste vahendajate hulgas, mis leiti olevat meie transkriptoomianalüüsis alareguleeritud (joonis 5F), kinnitasime ka CCL7 ja CCL8 ekspressiooni vähenemist anti-IL-ga töödeldud rakkudes.(Interleukiin)-33 siRNA (joonis 6E, F).

Need tähelepanekud ajendasid meid uurima, kas meie tulemusi saab 1. päeval üle kanda hiire UUO mudelile. Immunohistokeemiline analüüs (Fg.6G) ja kvantifitseerimine (joonis 6H) näitasid IL indutseerimist.(Interleukiin)6-ekspresseerivad rakke metsiktüüpi neerudes, sarnaselt Cheni et al4 tehtud tähelepanekutele transkriptsiooni tasemel. Seevastu täheldasime IL-i märkimisväärselt vähenenud arvu(Interleukiin)-6-positiivsed rakud IL-is(Interleukiin)-33- hiirt, mis on hästi kooskõlas meie in vitro loodud inimese fibroblastide andmetega.

Joonis 6. IL-i ammendumine(Interleukiin)-33 kallutab fibroblaste müofibroblastilise fenotüübi suunas.

(A, B) Geenikomplekti rikastamise analüüs näitas, et rakke töödeldi IL-ga(Interleukiin)-33-Spetsiifilised siRNA-d rikastati positiivselt müofibroblasti (myFBL) versus põletikulise fibroblasti (iFBL) signatuuri suhtes ja negatiivselt põletikulise versus uinuva fibroblasti signatuuri suhtes. (CF) IL-i transkriptsioon(Interleukiin)6(C), IL(Interleukiin)8(D), CCL7(E) ja CCL8(F) IL-ga töödeldud inimese fibroblastides(Interleukiin)33-spetsiifilist või segatud siRNA-d mõõdeti gRT-PCR abil. Iga andmepunkt näitab sõltumatute katsete tehniliste kolmekordsete väärtuste keskmisi väärtusi. (G) Tüüpilised mikrofotod neerulõikudest, mis on kogutud 4 päeva pärast võlts- või UUO-operatsiooni WT-st ja IL-st(Interleukiin)-33-/- hiired ja immunovärvitud IL jaoks(Interleukiin)-6(pruun signaal). Skaalaribad=100 um.(H)Signaali pimendatud kvantifitseerimine, mis loetleb positiivsete rakkude keskmise arvu suure võimsusega nägemisvälja kohta. Üksikud andmepunktid näitavad positiivsete rakkude keskmist arvu ühes hiires, loendades 3 suure võimsusega välja suurima tihedusega piirkondades. *lk<>

OSA Ⅱ saamiseks klõpsa SIIA