Kuidas transformeeriv kasvufaktor B1 (TGF 1) mõjutab neerufibroosi

lisateabe saamiseks:ali.ma@wecistanche.com

Transformeeriva kasvufaktori b1 signaaliülekande pärssimine elavates interstitsiaalsetes rakkudes nõrgendab profibrootilist geeniekspressiooni ja säilitab erütropoetiini tootmise hiirte eksperimentaalse neerufibroosi ajal

Michaela AA Fuchs, Katharina AE Broeker jt.

Neeru fibroosSeda iseloomustab müofibroblastide areng, mis pärinevad residentidest neerudest ja immigreerivatest rakkudest. Müofibroblastide moodustumist ja ekstratsellulaarse maatriksi tootmist neerukahjustuse ajal käivitavad erinevad tsütokiinid. Nende seas,transformeeriv kasvufaktor B1(TGF 1) peetakse keskseks käivitajaksneerufibroos. Leidsime TGF 1 kõrgelt reguleeritud ekspressiooni(transformeeriv kasvufaktor B1)ja TGF retseptor 2 (TGF-R2) mRNA-d neerude interstitsiaalsetes rakkudes eksperimentaalseltfibroos. Siin uurisime TGF 1 (transformeeriv kasvufaktor B1) signaalide edastamine neerude interstitsiaalsetes rakkudes elundi fibroosile, kasutades hiirtel adeniinist põhjustatud nefropaatia ja ühepoolse kusejuha oklusiooni mudeleid. Sel eesmärgil katkestati TGFB1 signaaliülekanne TGF-R2 geeni indutseeritava deletsiooniga interstitsiaalsetes rakkudes, mis ekspresseerivad fibroblasti markeri trombotsüütidest pärinevat kasvufaktori retseptor-B. Profibrootiliste geenide ekspressioon nõrgenes kuni 50 protsenti neerudes, kus puudus TGF-R2 rakkudes, mis olid positiivsed trombotsüütidest pärineva kasvufaktori retseptor-B suhtes. Lisaks takistas TGF-R2 deletsioon erütropoetiini tootmise vähenemist kusejuhaga ligeeritud neerudes. Eelkõige ei muutunud TGF-R2 sihipärase deletsiooniga hiirtel fibroosiga seotud x-silelihase aktiini ekspressioon müofibroblasti markerina ja ekstratsellulaarsete kollageenide ladestumine. Seega viitavad meie leiud TGF 1 võimendavale toimele(transformeeriv kasvufaktor B1)signaaliülekanne interstitsiaalsetes rakkudes, mis aitavad kaasa profibrootilisele geeniekspressioonile ja erütropoetiini tootmise allareguleerimisele, kuid mitte müofibroblastide arenguleneerufibroos.

Klõpsake tsüstanche pulbri tervisele kasulikuks neeruhaiguste korral

Areng ja arengneerufibrooson kroonilise neeruhaiguse tunnus. Tavaliselt peetakse seda ekstratsellulaarse maatriksi (ECM) valkude, nagu kollageenid, fibronektiin või tenastsiinid, suurenenud tootmise ja ladestumise tulemuseks. Jätkuvneerufibroospõhjustab glomerulaar- ja tubulaarsete funktsioonide järkjärgulist langust ning piirab ka neerude endokriinseid funktsioone, mille tulemuseks on erütropoetiini (EPO) ebapiisav tootmine, mis põhjustab aneemiat.-y

Tsütokiinide ja signaalifaktorite hulgas, mis on seotud neeruhaiguste jafibroosprogresseerumine,transformeeriv kasvufaktor 1(TGF 1) on uuritud erinevatel mudelitel.6.0-1 TGF 1(transformeeriv kasvufaktor B1)seondub TGF-retseptoriga 2 (TGF-R2). Heteromeerse kompleksi moodustumine TGF retseptoriga 1 on oluline SMAD signaaliülekandekaskaadi rakusiseseks aktiveerimiseks. i.{4}} Kahjustatud neerudes suurenenud TGF 1 ekspressioon(transformeeriv kasvufaktor B1)On teatatud mRNA-st erinevates neerurakkude tüüpides.1517,19-2lTGF 1 oluline rollneerudfibrooson piiritletud ka järeldustega, et eksogeense TGF 1 manustamine(transformeeriv kasvufaktor B1)võib esile kutsudaneerufibroosja see TGF 1(transformeeriv kasvufaktor B1)antikehad võivad nõrgendada eksperimentaalselt indutseeritudfibroos,10.{1}}Lisaks on Smad2 või 3, TGF-R2 rakusiseste efektorite, geneetiline deletsioon näidanud positiivset mõju rakkude arengule.fibroos.1,1

TGF-R2 ekspressioonist on teatatud paljudes rakutüüpides, piirates seega globaalse TGF 1 üldise sekkumisega saadud leidude täpset informatiivset väärtust.(transformeeriv kasvufaktor B1)signaalimine. See võib seletada ka mõningaid viimaste aastate vastuolulisi aruandeid.1.1.2 TGF 1(transformeeriv kasvufaktor B1)samuti on teatatud, et see edendabneerud fibroossuurendades makrofaagide infiltratsiooni, mis võivad transdiferentseeruda müofibroblastideks.

Kuid TGF 1 keskne roll(transformeeriv kasvufaktor B1)sisseneerudfibroosvaidlustas hiljuti järeldus, etneerudfibroosei vähene TGF 1 blokeerimisega(transformeeriv kasvufaktor B1)signaaliülekanne rakkudes, mis toodavad aktiivselt maatriksvalke. On hästi teada, et maatriksvalkude suurenenud tootmine tuleneb peamiselt müofibroblastidest, mis võivad transdiferentseeruda mitmest rakutüübist, sealhulgas fibroblastidest, monotsüüdidest, peritsüütidest ning torukujulistest ja endoteelirakkudest.6,10,2-32 need rakutüübid võivad müofibroblastide populatsiooni suhtes varieeruda sõltuvalt katsemudelist. Sellegipoolest on kasvav konsensus selles, et fibroblastid, peritsüüdid ja luuüdist pärinevad rakud on peamised müofibroblastide prekursorid neerudes ja aitavad kaasaneerudfibroossarnases proportsioonis... Hiljutine uuring ka arvukalt rakutüüpe neerudes. kinnitas PDGFR-f rakke kui peamisi müofibroblastide eelkäijaid inimese neerudes. Need PDGFR-f-rakud hõlmavad ka kõiki neerurakke, mis on võimelised tootma EpO-sid,-9

Neer fibrooson seotud neerude vähenenud võimega toota EPO-d.-,3,0 Kuigi selle põhjuseid ei ole selgelt välja selgitatud, arvatakse, et interstitsiaalsete PDGFR-pluss rakkude muundumine müofibroblastideks toimub käsikäes EPO tootmise võime kaotamisega. Pidades silmas interstitsiaalsete PDGFR-B rakkude olulist rolli natiivsete EPO tootjatena ja müofibroblastide prekursoridena, olime huvitatud TGF 1 rolli määratlemisest.(transformeeriv kasvufaktor B1)signaaliülekanne selles rakupopulatsioonis.

Sel eesmärgil genereerisime hiiremudeli tamoksifeeniga indutseeritava TGF-R2 deletsiooniga PDGFR-pluss rakkudes (PDGFR-CeERT7 pluss TGF-R2/, edaspidi nimetatud TGF-R2ko hiired). Pärast TGF-i kustutamist(transformeeriv kasvufaktor)-R2 PDGFR- pluss rakkudes täiskasvanud hiirtel, loomi uuriti kahes katsemudelisneerudfibroos: ühepoolne kusejuha oklusioon (UUO) ja adeniinist põhjustatud nefropaatia (AN). Adeniinist põhjustatud nefropaatia on kroonilise kahjustuse mudel, millel on tugevad paralleelid inimese kristallidest põhjustatud patoloogiatega, samas kui UUO on mehaanilise stressi ägeda kahjustuse mudel.2933,42- Väga spetsiifilise RNAskoobi in situ hübridisatsioonimeetodi kasutamine võimaldas kolokaliseerida siht- ja marker-mRNA-sid kuni üherakulise eraldusvõimeni. Nendes patoloogilistes mudelites uuriti TGFB-R2 deletsiooni mõju PDGFR-frakkudes d-silelihase aktiini (a-SMA) kui müofibroblastide moodustumise markeri ekspressioonile. Lisaks uurisime ECM-i profibrootilist geeniekspressiooni ja ladestumist. Neerude võime toota EPO-d eksperimentaalsetes olekutesneerud fibrooshinnati plasma EPO taseme ja EPO mRNA-d ekspresseerivate rakkude arvu ja lokaliseerimisega kahjustatud neerudes.

MEETODID

Loomad

TGF-R2lo hiired genereeriti PDGFR-cexr2 hiirte (tamoksifeeniga indutseeritav Cre rekombinaasi ekspressioon PDGFR-promootori kontrolli all; JAX-i varu nr 029684) ja loxP-frangiga TGF6- mikri ristamise teel. R2 alleelid (IAX lao nr 012603) C57BJ/6 ja 129S1/SvmJ segataustal."Linemise jälgimiseks konstrueeris topeltfluorestsentsreporter mT/mG(B6129(G)-Gt(ROSA)26Sorm4AcCTB-dromute.IGFLm; JAX varu #007676) aretati TGF-R2ko hiirtele. Genotüpiseerimisel kasutati tabelis 1 loetletud praimereid. Kontrollloomadena kasutati Cre suhtes negatiivseid pesakonnakaaslasi. Loomi peeti standardse näriliste toiduga (0,6% NaCl; Ssniff) ja vaba juurdepääs kraaniveele.Kõik loomkatsed viidi läbi vastavalt USA riikliku tervishoiuinstituudi poolt avaldatud ja kohaliku eetikakomitee poolt heaks kiidetud laboriloomade hooldamise ja kasutamise juhendile.

Tamoksifeeni ravi

Cre rekombinatsioon kutsuti esile 400 mg tamoksifeentsitraati kilogrammi kohta (A115T00404, Sniff) sisaldava dieediga 4 nädala jooksul, millele järgnes 3-nädalane periood standardse toiduga. Floxed TGF-R2 geeni ekstsisioon kinnitati polümeraasi ahelreaktsiooniga,

Adeniinist põhjustatud nefropaatia

Adeniinist põhjustatudfibroostekkis täiskasvanud hiirtel. Pärast ravi tamoksifeeniga ja sellele järgnenud puhkeperioodi toideti isastele hiirtele 3 nädala jooksul pidevalt adeniini sisaldavat dieeti (0,2 protsenti). Katsed viidi läbi täpselt 3 nädala pärast (3-nädal adeniin).

In situ hübridisatsioon RNAskoobi abil

MRNA ekspressiooni lokaliseerimist uuriti RNAscope Multiplex Fluorescent v2 komplektiga (Advanced Cell Diagnostics ACD) vastavalt tootja juhistele. Neerud fikseeriti perfusiooniga 10-protsendilise neutraalse puhverdatud formaliini lahusega, dehüdreeriti etanooliseerias ja sisestati parafiini. Hübridisatsioonisignaalid tuvastati 5- μm kudede settimisel, kasutades TSA Plus fluorofoore Cy3 ja Cy5 (PerkinElmer). Viilud paigaldati ProLong Gold Antifade Mountant'iga (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) ja vaadati Axio Observer Z1 mikroskoobiga (Zeiss). Positiivsed ja negatiivsed kontrollid lisati rutiinselt. RNAsape sondid on loetletud tabelis 2

Tabel 1|Hiirte genotüpiseerimiseks kasutatud praimerijärjestused

TULEMUSED

TGF 1(transformeeriv kasvufaktor B1)ja TGF(transformeeriv kasvufaktor)-R2 ekspressioon interstitsiaalsetes rakkudes suureneb eksperimentaalse neeruhaiguse ajal

TGFB1 ja TGFB-R2 mRNA ekspressiooni lokaliseerimine neerudes põhitingimustes ja katse ajalfibroosviidi läbi RNAscope in situ hübridisatsiooniga. Põhitingimustes tuvastati TGFB-R2 mRNA ekspressioon tubulointerstitsiaalsetes PDGFR-B rakkudes kõigis neerutsoonides ja glomerulaarsetes mesangiaalrakkudes (joonis 1, vasakul). TGF-R2 tuvastati ka proksimaalsetes tuubulites; ekspressioon teistes torukujulistes segmentides oli madalam (täiendavad joonised S1 ja S2).

Tabel 2|RNAskoobi sondid, mida kasutatakse in situ hübridiseerimiseks

TGFb1(transformeeriv kasvufaktor B1)mRNA lokaliseeriti interstitsiaalsetes PDGFR-bþ rakkudes kõigis neerutsoonides ja glomerulaarsetes mesangiaalrakkudes (joonis 1). Tubulid tundusid TGFb1 mRNA suhtes negatiivsed. See tähendab, et PDGFR-pluss rakud on TGF 1 peamine ekspressioonikoht(transformeeriv kasvufaktor B1)neerudes põhitingimustes.

Tabel 3|Kvantitatiivse polümeraasi ahelreaktsiooni jaoks kasutatavad praimerijärjestused

Pärast 3-nädalast adeniinidieeti (AN) või 5-päevast UUO-d on neerude TGF 1(transformeeriv kasvufaktor B1)ja TGF-R2 mRNA ekspressioonitasemed olid kontrollhiirtel tugevalt tõusnud (joonis 2).

TGF 1 suurenenud ekspressioon(transformeeriv kasvufaktor B1)ja TGF-R2 pärast AN-i või UUO-d lokaliseeriti RNAskoobi abil. Rakutüübispetsiifiliste markerite kolokaliseerimise abil saime tuvastada neerurakkude tüübid, mis näitavad TGF-R2 ülesreguleerimist neerukahjustuse ajal (joonis 3; täiendavad joonised S2 ja S3). AN-is suurenes TGF-R2 mRNA ekspressioon interstitsiaalses PDGFR-s tugevalt. pluss rakud fibrootilistes piirkondades (joonis 3a). Kõrgenenud TGF-R2 ekspressiooniga kahjustatud tuubulid ilmnesid lamenenud epiteeliga ja neid ümbritsesid tugeva TGF-R2 ja TGF 1 PDGFR-pluss rakud.(transformeeriv kasvufaktor B1)mRNA signaalid (joonis 3a ja c, nooled; täiendav joonis S2). Suurenenud TGF-R2 signaalidega tuubulid näitasid de novo TGF 1(transformeeriv kasvufaktor B1)mRNA ekspressioon (joonis 3c; täiendav joonis S3).

UUO neerudes tuvastati TGF-R2 mRNA suurenenud signaalid ülejäänud välimise medulla (joonis 3b) ja ajukoore interstitsiaalsetes rakkudes (täiendav joonis S2). Need PDGFR-pluss rakud näitasid ka suurenenud signaale TGF 1 jaoks(transformeeriv kasvufaktor B1)(Joonis 3d).

Kokkuvõttes viitasid need leiud TGF 1 tugevale aktiveerimisele(transformeeriv kasvufaktor B1)signaaliülekanne interstitsiaalsete PDGFR-pluss rakkude ja kahjustatud tuubulite vahel eksperimentaalse neerukahjustuse ajal.

Joonis 1|(vasakul) transformeeriva kasvufaktori b retseptori 2 (TGFb-R2) ja (paremal) transformeeriva kasvufaktori b1 (TGFb1) mRNA põhiekspressioon metsiktüüpi hiirte neerulõikudel.

TGF-R2 indutseeritav deletsioon PDGFR-pluss rakkudes nõrgendab profibrootilist geeniekspressiooni eksperimentaalse neeruhaiguse ajal

Analüüsida TGF 1 asjakohasust(transformeeriv kasvufaktor B1)PDGFR-pluss rakkude funktsiooni signaali edastamiseks uurisime täiskasvanud TGF-R2ko hiiri. TGF 1 põhiekspressioon(transformeeriv kasvufaktor B1)ei muutunud pärast TGF-R2 kustutamist neeru interstitsiaalsetes rakkudes (joonis 2). TGF-R2 mRNA ekspressioon vähenes märkimisväärselt knockout loomadel (joonis 2). Jääkekspressioon oli tingitud TGF-R2 tubulaarsest ekspressioonist (joonis 1). Neeru morfoloogia ei olnud TGF-R2ko hiirtel erinev kuni 8 nädala jooksul pärast TGF-R2 deletsiooni.

Täheldatud TGF-R2 ekspressiooni suurenemine AN ja UUO ajal vähenes oluliselt TGF -R2ko neerudes võrreldes kontrollneerudega (joonis 2). TGF 1(transformeeriv kasvufaktor B1)ekspressioon vähenes märkimisväärselt alles pärast AN-i.

Fosforüülitud SMAD3 histoloogiline uuring näitas TGFb-R2ko loomadel transkriptsioonifaktori vähenenud translokatsiooni a-SMAþ interstitsiaalsete rakkude tuuma, mis viitab TGFb1 signaali katkemisele pärast edukat Cre-vahendatud TGFb-R2 deletsiooni (joonis 4).

Joonis 2|Kasvufaktori b1 (TGFb1) ja TGFb retseptori 2 (TGFb-R2) mRNA arvukuse transformeerimine kontrollneerudes ja neerudes koos tamoksifeeniga indutseeritava TGFb-R2 deletsiooniga trombotsüütidest pärinevates kasvufaktori retseptori b-positiivsetes rakkudes (TGFb-R2ko) basaali all ja patoloogilised seisundid.

TGFb-R2 indutseeritav deletsioon PDGFR-bD rakkudes nõrgendab profibrootilist geeniekspressiooni eksperimentaalse neeruhaiguse ajal

ajalfibroos, paraneb maatriksikomponentide tootmine, mis toob kaasa ulatusliku ECM-i ladestumise ja armide moodustumise. TGF 1 võimaliku rolli hindamiseks(transformeeriv kasvufaktor B1)signaaliülekannet PDGFR-Bf-rakkudes maatriksi tootmiseks, võrdlesime fibrootiliste markerite geeniekspressiooni kontroll- ja TGF-R2ko hiirte vahel.

Adeniiniga toitmine ja UUO viisid kontrollneerudes Collali mRNA -25-kordse suurenemiseni. Kui TGF-R2ko neerudes vähenes krae mRNA suurenemine kontrollrühmaga võrreldes -50 protsenti (joonis 5). Adeniiniga toitmine ja UUO tõid kaasa ka kollageeni 3al ja fibronektiini mRNA-de märkimisväärse suurenemise. Mõlema mRNA suurenemine nõrgenes oluliselt ka TGF-R2ko neerudes.

OSA Ⅱ saamiseks klõpsa SIIA

VIITED

1. Schimdf C. Duffield JS. Mechanisms offibroos: peritsüüdi roke. Curr Opin Nephrol Hoertens.2011:20297-305.

2. Neelisetty S, Aford C. Reynalds K et al. Neerudfibroosei vähene transformeeriva kasvufaktori signaali blokeerimisega maatriksit tootvates interstitsiaalsetes rakkudes. Kidney Int. 201588:503-514.

3. Bülow RD, Boor P. Extracellularmatrix inneerufibroos: rohkem kui lihtsalt tellingud. J Histochem Cytochem. 2019;67643-661.

4. Humphreys BD.Neerufibroosi mehhanismid.Annu Rey PhysioL201880: 309-326.

5. Maxwell PH, Ferguson DJP, Nicholls LG jt. Interstitsiaalne reaktsioon neerukahjustuse fibroblastitaolistele rakkudele näitab fenotüübilisi muutusi ja neil on vähenenud erütropoetiini geeniekspressiooni potentsiaal. Kidney Int. 1997;52.{4}}.

6. Souma T, Yamazaki S, MoriguchiT jt. Neeru erütropoetiini tootvate rakkude plastilisus reguleeribfibroos. J Am Soc Nephrol, 2013;24:1599-1616.

7. Babit 儿L, Lin HY. Aneemia mehhanismid CKD.JAm Soc Nephrolis. 2012:23:1631-1634.

8. Eschbach JW, Adamson JW. Lõppstaadiumis neeruhaiguse aneemia (ESRD). Kidney Int. 1985;28:1-5.

9. Broeker KAE, Fuchs MAA, Schrank J et al. Erinevad neerude interstitsiaalsete rakkude alampopulatsioonid toodavad erütropoetiini ja koe hapnikuga varustamist toetavaid tegureid vastusena hüpoksiale in Vivo. Kidney Int. 2020;98:918-931.

10. Falke LL, Gholizadeh S, Goldschmedinq R et al. Müofibroblasti mitmekesine päritolu – mõjuneerufibroos. Nat Rey Nephrol. 2015;11:233-244.

Märkus: ülaltoodud ei ole täielik viidete loend