3-adrenergiline retseptor kasvajasse infiltreeruvatel lümfotsüütidel säilitab IFN- -sõltuva PD-L1 ekspressiooni ja kahjustab kasvajavastast immuunsust neuroblastoomi korral

Neuroblastoom (NB) on heterogeenne ekstrakraniaalne kasvaja, mis esineb lapsepõlves. NB-kasvajate eripäraks on nende neuroendokriinne võime sekreteerida katehhoolamiine, mis omakorda võib -adrenergiliste retseptorite ligeerimise kaudu mõjutada erinevaid signaaliradu kasvaja mikrokeskkonnas (TME). Varem on näidatud, et 3-adrenergilise retseptori (3- AR) spetsiifiline antagonism NB kasvajarakkudel mõjutas kasvaja kasvu ja progresseerumist. Siin püüdsime NB hiire süngeense mudeliga uurida, kas 3-AR modulatsioon mõjutas peremeesorganismi immuunsüsteemi vastust kasvaja vastu. Tulemused näitasid, et 3-AR antagonism põhjustab immuunvastuse taasaktiveerumist, mis sõltub osaliselt PD-1/PD-L1 signaalitelje osalusest. Tõepoolest, 3- AR-blokaad kasvajasse infiltreeruvatel lümfotsüütidel (TIL-id) vähendas nende võimet sekreteerida IFN-d, mis omakorda vähendas TIL-ide infiltratsioonist põhjustatud PD-L1 ekspressiooni NB kasvajarakkudel. Täiendavad uuringud NB-patsientide genoomianalüüsi abil näitasid, et kõrge ADRB3 geeniekspressioon korreleerub madalama ekspressioonirühmaga võrreldes halvemate kliiniliste tulemustega ja et ADRB3 geeniekspressioon mõjutab erinevaid immuunsüsteemiga seotud radu. Üldiselt näitavad tulemused, et 3-AR NB TME-s on võimeline moduleerima kasvaja ja peremeesorganismi immuunsüsteemi vahelist koostoimet ning selle antagonism tabab mitut kasvajat soodustavat signaaliülekande rada.

Graafiline kokkuvõte

SISSEJUHATUS

Neuroblastoom (NB) on keeruline ja heterogeenne haigus ning kõige levinum esimesel eluaastal diagnoositav vähitüüp. NB on neuroendokriinne kasvaja, mis tekib sümpaatilise närvisüsteemi (SNS) arenemise ajal neuraalharja prekursorrakkudest. See eristav päritolu määrab kasvaja lokaliseerimise, mis tavaliselt esineb neerupealistes ja/või sümpaatilistes ganglionides [1]. NB kliiniline käitumine on väga varieeruv, ulatudes spontaanselt taanduvatest kasvajatest kuni teisteni, mis ei allu kõigile olemasolevatele ravimeetoditele, sealhulgas intensiivne keemiaravi, kirurgia, kiiritusravi, autoloogsete tüvirakkude siirdamine ja retinoidide (13-cis-retinoic) manustamine. hape) [2]. Seetõttu on nende mittereageerivate kasvajate jaoks vaja alternatiivseid terapeutilisi sihtmärke. Immuunkontrollpunkti inhibiitoritel (ICI) põhinev immunoteraapia on mitmete tahkete kasvajate jaoks kõige lootustandvam strateegia [3]. Muuhulgas kahjustab programmeeritud surma ligandi -1/programmeeritud surma-1 (PD-L1/PD-1) signaalitelg efektor-T-rakkude immuunsust ja suurendab kasvajarakkude immuuntaluvust, mängides võtmerolli. rolli kasvajavastaste vastuste nõrgendamisel nii hiire kui ka inimese vähkkasvajate puhul [4, 5]. Kuigi paljudes uuringutes on juba uuritud PD-1/PD-L1 signaaliülekande mehhanisme täiskasvanute vähi korral, on laste kasvajate kohta vähe teada. SNS-i ja immuunsüsteemi vaheline keerukas ristkõne katehhoolamiinide vabanemise ja -adrenergiliste retseptorite signaalide aktiveerimise kaudu on võimeline määrama paljude kasvajate kasvaja progresseerumise saatuse [6]. See võib eriti kehtida NB-patsientide puhul, kelle puhul katehhoolamiinide kõrgenenud tase peegeldab pahaloomulise kasvaja raskust [7]. 3-Adrenergilise retseptori (3-AR) alatüüp tuvastati hiljuti kui vähktõve kriitilise tähtsusega regulaator [8–10]. Eelkõige kutsus selle ekspressioon ja aktiveerimine nii tuumori mikrokeskkonna (TME) kasvaja- kui ka stroomarakkudel esile tuumorieelsed signaaliülekanderajad, mis vastutavad kasvaja progresseerumise eest erinevates prekliinilistes mudelites [11–14]. Siin näitasime NB süngeense hiiremudeliga, et 3-AR kasvajasse infiltreeruvatel lümfotsüütidel (TIL-idel) säilitab kasvajarakkudel IFN- --sõltuva PD-L1 ülesreguleerimise, mis omakorda viib immuunsupressiivne TME, mis vastutab kasvaja põgenemise eest. Lisaks suutis 3-AR antagonism suurendada immuunreaktiivsete CD8+, looduslike tapjarakkude (NK) ja dendriitrakkude (DC) arvu ning vähendada immuunsupressiivsete reguleerivate rakkude arvu. T-rakud (Treg) ja müeloidist pärinevad supressorrakud (MDSC) TME-s. Lisaks näitas Kaplan-Meieri analüüs, et kõrge ADRB3 geeniekspressioon oli seotud NB-patsientide halva ellujäämisega ning erinevate kättesaadavate NB ekspressiooni avalike andmekogumite analüüsid näitasid olulist korrelatsiooni ADRB3 geeniekspressiooni taseme ja geenide vahel, mis on seotud NB-ga seotud signaaliradadega. immuunsüsteemi/kasvaja koostoime.

Cistanche tubulosa-Antitumor eelised

MEETODID

Rakukultuur

Neuro-2A-hiire NB vähirakud saadi ATCC-st (CCL-131) ja neid kasvatati DMEM-is, millele oli lisatud 10% FBS-i, 2 mM L-glutamiini, 100 U·ml-1 penitsilliini ja 100 ui. ug·ml−1 streptomütsiini temperatuuril 37 kraadi veega küllastunud 5% CO2 atmosfääris. Neuro-2a-rakke testiti regulaarselt mükoplasmaga saastumise suhtes.

Kasvaja süngeenne hiiremudel

4 nädala vanused emased NCI A/JCr hiired osteti ettevõttest Charles River Laboratories (Frederick). Neuro-2a-rakud (N2A) implanteeriti subkutaanselt A/J-retsipienthiirtele, süstides 1 × 106 rakku 100 ul PBS-s paremasse külge. Kui N2A rakud moodustasid palpeeritava kasvaja (umbes 8 päeva), alustati ravi. Ravi manustati kaks korda päevas SR59230A (Tocris Bioscience) ja kandja (füsioloogiline lahus) ning 8. ja 12. päeval PD-L1 antikeha (InVivoMAb hiirevastane PD-L1 (B7-xhH1) #BE0101) ravi. , Bio X Cell) ja isotüübi kontroll (InVivoMAb roti IgG2b isotüübi kontroll # BE0090, Bio X Cell). IgG2b isotüübi kontrolli manustamine andis kandjatega samad tulemused, seega on joonistel näidatud ainult kandja seisund. SR59230A manustati 10 mg/kg füsioloogilises lahuses intraperitoneaalselt (ip); 250 µg PD-L1 manustati ip 100 µl InVivoPure™ pH 6,5 lahjenduspuhvris (#IP0065); 250 µg IgG2b isotüübi kontrollhiirt manustati ip 100 µl InVivoPure™ pH 7,0 lahjenduspuhvris (#IP0070). Ravi FTY720-ga (#6176, Tocris Biotechne) manustati annuses 2 mg/kg per os (po) alates 6. päevast. Kasvaja kasvukiirust hinnati kasvaja massi mõõtmise teel kaliibriga ja kasvaja massi maht arvutati mahuna {{ 41}} [(pikkus × laius)2 /2]. Hiired surmati pärast 8-päevast ravi.

Western blot analüüs

Rakud koguti ja lüüsiti proteaasi inhibiitori kokteili sisaldavas RIPA puhvris. Pärast kvantifitseerimist kasutati SDS-PAGE ja WB analüüsi tegemiseks 20 ug koguvalke. PVDF membraane inkubeeriti üleöö primaarsete antikehadega anti-PD-L1 (ab238697, Abcam), fosfo-CREB (ab32096, Abcam), CREB (ab32515, Abcam), p-PKA // (sc- 32968, Santa Cruz Biotechnology), -aktiin (sc-1615, Santa Cruz Biotechnology), 3-AR (ab94506, Abcam) 4 kraadi juures ja seejärel spetsiifiliste sekundaarsete antikehadega 1 tund toatemperatuuril. Antikehade seondumine spetsiifiliste valkudega tuvastati Clarity Western ECL substraadi (Bio-Rad) abil ja kujutised saadi Chemidoc Imaging System (Biorad®) abil. Kvantitatiivsete analüüside tegemiseks kasutati ImageJ tarkvara ja ribade signaali intensiivsust väljendati korduva suurenemisena võrreldes kontrollväärtustega.

Kaaskultuur PD-L1 tsütofluorimeetrilise testi jaoks

Kasvajarakud külvati MW24-le (45,000 rakku süvendi kohta) ja 24 tunni pärast kultiveeriti neid koos lümfotsüütidega, mis saadi hiirte TDLN-idest, mida oli eelnevalt töödeldud 2 päeva Vehicle'i või SR59230A (T2) abil. külvi suhe 1:10 (kasvaja/lümfotsüüdid). Kogu inkubatsiooniperioodi (48 h) lõpus eemaldati lümfotsüüdid koos kaaskultuuri söötmega õrna pipeteerimise teel ning kasvajarakud eraldati trüpsiniseerimisega ja märgistati anti-PD-L1 antikehaga (CD274 antikeha {). {17}}, eBioscience™) tsütofluorimeetriliseks kvantifitseerimiseks. Värvitud rakud saadi MACSQuant Analyzer 10 voolutsütomeetriga (Miltenyi Biotec, Gladbach, Saksamaa) ja andmeid töödeldi Flowlogic tarkvaraga (Miltenyi Biotec, Gladbach, Saksamaa).

Kaaskultuur PD-L1 immunofluorestsentsi ja IFN-i kvantifitseerimiseks

Kasvajarakud külvati mikroskoobi objektiklaasidele (20,000 rakku süvendi kohta) Nunc Lab-Teki kambrislaidil 4 ja 24 tunni pärast kultiveeriti neid koos lümfotsüütidega, mis saadi 2 päeva Vehicle'iga ravitud hiirte TDLN-idest. või SR59230A (T2), külvisuhtes 1:10 (kasvaja/lümfotsüüdid). 48 tunni pärast koguti söötmes olevad lümfotsüüdid õrnalt pipeteerides ja visati seejärel tsentrifuugimisega minema; supernatanti kasutati IFN-i kvantifitseerimiseks Luminex xMAP tehnoloogia abil vastavalt tootja juhistele. Lühidalt, IFN-i kvantifitseerimine kaaskultuuri söötmes viidi läbi Bio-Plex Pro Mouse Cytokine IFN-Seti abil (#171G5017M, Bio-Rad) ja andmed koguti MAGPIX Systemiga (Luminex, Texas, USA). Analüüs viidi läbi tarkvara Bio-Plex Manager™ abil (BIO-RAD, California, USA). Selle asemel kasutati PDL1 immunofluorestsentsanalüüsi läbiviimiseks mikroskoobi alusklaasidel olevaid kasvajarakke järgmiselt. Immunofluorestsentsanalüüsi jaoks fikseeriti rakud 3% paraformaldehüüdis PBS-is 20 minutit. Permeabiliseerimiseks lisati 30 minutiks toatemperatuuril lahus, mis sisaldas Tween-20 0,5% PBS-is. Seejärel blokeeriti rakud 3% BSA-s 1 tund ja inkubeeriti primaarse anti-PD-L1 antikehaga (ab238697, Abcam) 2 tundi. Seejärel inkubeeriti slaide pärast pesemist PBS-s 1 tund Alexafluor 488 sekundaarse antikehaga. Pildid saadi fluorestsentsmikroskoobiga (DMi8 - Leica microsystems).

Hiina herb tsitanche taim-kasvajavastane

Lümfotsüütide siRNA elektroporatsioon 1- 2- ja 3-AR vaigistamiseks

TDLN-idest saadud lümfotsüüdid transfekteeriti siRNA-dega selektiivseks 1- (SASI_Mm01_00090154, järjestus: GUGAUCGUGGCCAUCGCCA, Merck), 2- (SASI_Mm{) {5}}, järjestus: CCAAGUUCGAGCGACUACA, Merck) ja 3-AR (SASI_Mm01_00145466, järjestus: CAGUGGACGUGCUCUGUGU, Merck) vaigistamine. Lühidalt, lümfotsüüdid elektroporeeriti siRNA-dega (100 nM), kasutades 4D-Nucleofector X Unit (Lonza) ja P3 Primary Cell 4D-NucleofectorTM X komplekti (V4XP-3024, Lonza). Viidi läbi programm DN-100, mis on spetsiifiline hiire T-rakkude elektroporatsiooni jaoks. Pärast elektroporatsiooni kultiveeriti lümfotsüüte 24 tundi TexMACS söötmes (130-097-196, Miltenyi Biotec) ja seejärel 48 tundi koos N2A kasvajarakkudega, nagu eelnevalt kirjeldatud, PD-L1 kvantifitseerimiseks. -AR-de vaigistamise efektiivsust lümfotsüütides hinnati digitaalse tilga-PCR abil järgmiselt.

Digitaalne tilk-PCR -ARs mRNA kvantifitseerimiseks

RNA pöördtranskribeeriti, kasutades iScript Advanced cDNA Synthesis Kit (Bio-Rad). ddPCR viidi läbi, kasutades ddPCR Supermix for Probes (ei dUTP) (Bio-Rad) vastavalt tootmisjuhistele, QX200 süsteemil (Bio-Rad) ja C1000 Touch Thermal Cycleril (Bio-Rad). Kasutati järgmisi analüüse: Adrb3-FAM (dMmuCPE5088688), Adrb2-FAM (dMmuCPE5089938), Adrb1-FAM (dMmuCPE5100184), Rps18-HEX (dMmuCPE47). ddPCR andmeid analüüsiti tarkvara QuantaSoft™ (versioon 1.7.4, Bio-Rad) abil.

RNA sekveneerimine

Väljalõigatud kasvajad asetati puhvrisse RLT (Qiagen) ja homogeniseeriti mehaaniliselt õrnalt MACS Octo Disssociatoriga (Miltenyi Biotec, Glad bach, Saksamaa), kasutades õrnaid MACS M Tubes (Miltenyi Biotec, Gladbach, Saksamaa). RNA täielik ekstraheerimine viidi läbi komplektiga RNeasy Plus Mini (Qiagen), järgides tootja juhiseid. RNA kvantifitseerimiseks kasutati nii NanoDrop 2000/2000c spektrofotomeetreid (ThermoFisher) kui ka Qubit RNA kõrge tundlikkusega (HS) (ThermoFisher). RNA terviklikkust hinnati, kasutades Agilent RNA 6000 Pico komplekti Agilent Bioanalyzeris ja kõik proovid, mille RNA terviklikkuse arv (RIN) oli alla 6,00, jäeti välja. Raamatukogu ettevalmistamine viidi läbi, kasutades TruSeq Stranded Total RNA Library Prep Gold Kit (Illumina) vastavalt tootja juhistele, esialgse sisendiga 500 ng kogu RNA-d. Raamatukogu kvaliteeti hinnati, kasutades Agilent DNA 7500 komplekti seadmel Agilent Bioanalyzer, millele järgnes raamatukogu kvantifitseerimine, kasutades 1X dsDNA kõrge tundlikkusega (HS) (ThermoFisher). Raamatukogud sekveneeriti NextSeq 550 sekveneerimissüsteemis (Illumina), kasutades NextSeq 500/550 v2.5 (150 tsüklit) suure väljundiga reaktiivikomplekte (Illumina). Jooksud viidi läbi konfiguratsiooniga 2 × 76 bp.

mRNA kvantifitseerimine ja transkriptoomilised analüüsid

Transkriptide kvantifitseerimiseks kasutati kaardistamispõhises režiimis lõhet (v. 1.5.1) ja muskuluse etalontranskriptoomi GRCm38.98. Saadud qf-faile analüüsiti statistikakeelega R. R-is olevate andmete importimiseks kasutati paketti tximport ning AnnotationDbi paketi ja org.Mm.eg.db andmebaasi abil ahendati ärakirjad geenidele. Lõpuks teostasime statistilised analüüsid DESeq2-ga. Tegime ülerikastamise analüüsi (ORA), kasutades paketti ClusterProfiler, et teha päringuid GO: BP andmebaasist koos saadud statistiliste analüüsidega, et tuvastada muutunud rakuradu. Rikastusanalüüsi jaoks geenide valimiseks seadsime log2FC läveks 0.5 (| log2FC|⋝ 0.5) ja kohandatud p-väärtuseks 0.{101} {17}}5. Pärast tulemuste filtreerimist p-väärtusega 0, 05 leidsime 45 statistiliselt dereguleeritud protsessi 15 158 hulgast, mida testiti GO: BP andmebaasiga.

Luminexi tsütokiinide kvantifitseerimine

cistanche tubulosa - parandab immuunsüsteemi

Cistanche Enhance Immunity toodete vaatamiseks klõpsake siin

【Küsi lisa】 E-post:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Hiired surmati pärast 2-päevast töötlemist (T2) kandjatega, SR59230A, PD-L1 ja SR59230A + PD-L1 ning kasvaja mass lõigati kääridega välja ja homogeniseeriti Bio-Plex Cell lüüsi komplekti (BIO-RAD, California) kasutades. , USA) ja õrn MACS Octo Disssociator (Miltenyi Biotec, Saksamaa). Seejärel testiti kasvajalüsaate nende tsütokiinide kontsentratsioonide suhtes Bio-Plex Pro™ testidega (BIO-RAD, California, USA), mis põhinesid Luminex xMAP tehnoloogial. IFN-, TNF-, IL-2, IL-6, IL-10, GM-CSF, IL-1 ja IL-1 tasemed (pg/ml ) mõõdeti vastavalt tootja juhistele. Andmed koguti MAGPIX süsteemiga (Luminex, Texas, USA) ja analüüs viidi läbi tarkvara Bio-Plex Manager™ abil (BIO-RAD, California, USA).

Voolutsütomeetriline analüüs

Voolutsütomeetria analüüs viidi läbi kasvajarakkude ja kasvaja mikrokeskkonna immuunrakkude alampopulatsioonidega järgmiselt. Lühidalt, kasvajad homogeniseeriti Tumor dissotsiatsioonikomplekti hiirega (#130-096-730, Miltenyi Biotec) ja kasvajasse infiltreeruvad lümfotsüüdid eraldati rakkude kogususpensioonist, kasutades CD45 (TIL) MicroBeads hiirt (#130-110- 618, Miltenyi Biotec) või CD8 (TIL) MicroBeads hiir (#130-116-478, Miltenyi Biotec) läbi automaatika Pro Separator (Miltenyi Biotec) vastavalt tootja juhistele. Seejärel inkubeeriti rakke ja värviti erinevate sobivalt lahjendatud erinevate fluorokroomiga konjugeeritud antikehade kombinatsioonidega (täiendav tabel 1). Värvitud rakke analüüsiti MACSQuant Analyzer 10 voolutsütomeetriga (Miltenyi Biotec®) ja andmeid töödeldi Flowlogic tarkvara (Miltenyi Biotec®) abil.

Rakkude ja kudede immunofluorestsents

Hiire kasvaja massi immunofluorestsentsanalüüs viidi läbi järgmiselt. Proovid lõigati kiiresti välja, fikseeriti puhverdatud 4% formaldehüüdis 24 tundi ja sisestati parafiini. Proovidest lõigati 5 μm paksused histoloogilised lõigud, deparafineeriti ja keedeti 1 0 min naatriumtsitraatpuhvris (10 mM, pH 6,0; Bio-Optica) antigeeni otsimiseks ja immunovärviti üleöö 4 kraadi juures primaarsega. antikehad (anti-PD-L1, ab238697, Abcam; anti-- 3-AR, ab94506, Abcam; anti-CD4, 14-9766-82, eBioscience; anti-CD8, 14-0808-82, eBioscience; DBH, ab209487, Abcam). Immuunreaktsioon ilmnes, kui inkubeeriti sektsioone sekundaarsete antikehadega Alexa Fluor 488- konjugeeritud IgG või Alexa Fluor 594-konjugeeritud IgG (1:350; Jackson Laboratory). Pärast 4-6-diamidino-2-fenüülindooliga (DAPI) värvimist saadi tüüpilised kujutised mikroskoobiga Olympus BX63, mis oli ühendatud CellSens Dimension Imaging Software versiooniga 1.6 (Olympus). Immunofluorestsentsvärvimist hinnati ImageJ tarkvara (NIH, USA) kaudu, kuna huvipakkuva valgu fluorestsentsi intensiivsus normaliseeriti DAPI väärtustele.

Cistanche tubulosa-Antitumor eelised

Kaplan-Meier ja geenikorrelatsiooni analüüs NB-ga patsientidel

ADRB3 geeni korrelatsioon immuunsüsteemi kontrollpunkti geenidega CD80, CTLA4, CD276, CD226, CD40LG, 4-1BBL ning korrelatsioon NB-ga patsientide üldise (OS) ja sündmustevaba elulemuse (EFS) tõenäosuse ja ARDB3 taseme vahel mRNA ekspressioon viidi läbi, kasutades 649 NB proovi geeniekspressiooni profiili, mis genereeriti 44 K oligonukleotiidi mikrokiipide abil. Profiilid ja kliinilised andmed saadi R2: genoomianalüüsi ja visualiseerimise platvormilt (http://r2.amc.nl), (Kocak, kohandatud ag44kcwolf, n=649 juhtumit). Jaotuse viimast kvartiili kasutati Kaplan-Meieri analüüsis kõrge ja madala ADRB3 geeniekspressiooni ekspressiooni piirväärtusena.

Statistika

Statistiline analüüs viidi läbi GraphPad Prismi (GraphPad, San Diego, CA, USA) abil ühe- või kahesuunalise dispersioonanalüüsi (ANOVA) abil, millele järgnes Bonferroni post-hoc test või paaritu õpilase t-test. In vivo katsete jaoks oli sama loommudeliga tehtud varasemate uuringute kohaselt [12] vaja vähemalt 6 hiirt rühma kohta, et tagada 80% võimsus. Väärtused on esitatud kui keskmine ± SEM. Olulisust peeti siis, kui P oli<0.05 and described in each figure legend. Allocation concealment was performed using a randomization procedure (http:// www.randomizer.org/).

TULEMUSED

3-AR antagonism vähendab PD-L1 ekspressiooni NB-d kandvate A/J hiirte kasvajarakkudes

Hiljutised uuringud näitasid, et PD-1/PD-L1 signaaliülekanne NB-s on oluline mehhanism immuunseire piiramisel ja et PD-L1 ekspressioon korreleerub kasvajamarkerite kõrge tasemega [15, 16]. Võttes arvesse neid ja meie varasemaid andmeid, mis näitavad 3-AR-blokaadi võimet kutsuda esile immuunkompetentne TME melanoomi kandvatel hiirtel [13], mõtlesime, kas NB kasvaja puhul on 3-AR antagonism võib viia immuunvastuse aktiveerumiseni, mis sõltub PD-L1 signaaliülekande osalusest. 3-AR antagonisti SR59230A manustamine NB hiire süngeenses mudelis vähendas kasvaja kasvu suuremal määral kui PD-L1-vastase antikeha mAb (PD-L1) ravi, kuid sünergilist toimet ei täheldatud. kui hiiri raviti mõlema ravimiga (joonis 1A, B). Et uurida, kas SR59230A manustamisega kaasnev kasvajavastane toime põhines osaliselt PD-L1 ekspressiooni modulatsioonil, analüüsisime PD-L1 ekspressioonitaset NB-d kandvate hiirte TME-s. Huvitaval kombel näitasid hiire kasvaja massi immunofluorestsents (joonis 1C) ja Western blot analüüs (joonis 1D), et PD-L1 ekspressioon vähenes 3-AR antagonistiga ravitud hiirte TME-s võrreldes kandja seisundiga. Kuna ulatuslikud kirjandusandmed näitasid, et TME-s on PD-L1 [17–20] peamised allikad lisaks vähirakkudele stroomarakud, nagu antigeeni esitlevad rakud (APC-d) MDSC, DC-d ja makrofaagid [17–20]. uuris, kus TME-s mõjutas 3-AR-blokaadi PD-L1 ekspressioonitase. Tsütofluoromeetriline test näitas, et 3-AR antagonism vähendas PD-L1 ekspressiooni kasvajarakkudes (joonis 1E), suurendades samal ajal selle ekspressioonitaset DC-des ja makrofaagides (joonis 1F, G). MDSC populatsioonis muutusi ei täheldatud (joonis 1H). Need esimesed tulemused näitavad, et 3-AR-blokaad avaldas NB-d kandvate hiirte süngeenses mudelis märkimisväärset kasvajavastast toimet ja et PDL1 antikeha samaaegne manustamine ei kutsunud esile kasvajavastast sünergistlikku toimet. Huvitaval kombel moduleeris 3-AR farmakoloogiline antagonism PDL1 ekspressioonitaset TME-s, mis viitab PD-L1 signaaliülekande osalemisele 3-AR-blokaadi põhjustatud kasvajavastases toimes.

Joonis fig 1 SR59230A ja PD-L1 ravi mõju kasvaja kasvule ja PD-L1 ekspressioonile NB kasvajat kandvatel hiirtel

3-AR antagonism ja PD-L1 manustamine stimuleerivad immuunreaktiivset TME-d NB-s

Selleks et uurida, kas PD-L1 vähenenud ekspressioon, mida täheldati NB kasvajarakkudes pärast 3-AR antagonismi, põhjustas immuunsüsteemi taasaktiveerimise TME-s, hindasime esmalt perforiini arvu PD-1+CD{ {4}} rakud kasvaja massis SR59230A-, PD-L1- või SR59203A + PD-L1--ga töödeldud hiirtel võrreldes kandjaga (joonis 4A, B). Lisaks näitas Ki67 värvimistest trendi, mis viitas CD8+ T-rakkude suurenenud proliferatsioonile 3-AR antagonisti või PD-L1 antikehaga ravitud hiirte NB kasvajates, isegi kui see ei saavutanud olulist erinevused (joonis 4C). Lõpuks näitas tsütokiinide mõõtmine PDL1--ga ravitud hiirte kasvajamassis tsütokiinide suurenenud taset, millel on teadaolevalt kasvajavastane toime, nagu TNF-, IFN- ja IL-6, ning samaaegne immuunsupressiivse tsütokiini IL-10 vähenemine. Üllataval kombel täheldasime 3-AR antagonistiga ravitud NB-d kandvatel hiirtel TNF- ja IL-6 tõusu ning IL-10 taseme langust vastavalt immuunsüsteemi Reaktiivne olek, mida soovitavad T-rakkude omadused, kuid IFN-i tase on vähenenud (joonis 4D). Teistes testitud tsütokiinides (GMCSF, IL-2, IL-1 ja IL-1) olulisi erinevusi ei leitud. Need andmed näitavad koos, et 3-AR antagonism käivitab NB-d kandvate hiirte TME-s peremeesorganismi immuunvastuse, jälgides samu toimeid, mida täheldati pärast PD-L1 antikeha manustamist. Täpsemalt, CD8+ tsütotoksilisi funktsioone tugevdasid nii SR59230A kui ka PD-L1. Kui 3-AR antagonisti manustati koos PD-L1 antikehaga, ei täheldatud sünergilist efekti, mis kinnitab, et 3-AR blokaadi põhjustatud immuunsüsteemi taasaktiveerimine sõltub vähemalt osaliselt PD-L1 signaaliülekandest. raja kaasamine.

Joonis 2 SR59230A ja PD-L1 stimuleerivad immuunreaktiivset TME-d NB-s

Joonis 3 Immuunsuse kontrollpunktide ekspressioon lümfotsüütidel TME-s ja TDLN-des pärast 3-AR antagonismi ja PD-L1 manustamist

Joonis 4 3-AR-blokaad käivitab CD8 funktsioonid ja reguleerib immuuntsütokiinide sekretsiooni TME-s.

3-AR kasvajasse infiltreeruvatel lümfotsüütidel moduleerib IFN sekretsiooni ja mõjutab PD-L1 ekspressiooni NB kasvajarakkudel

PD-L1 ekspressiooni kasvajarakkudel võivad esile kutsuda mitmed tegurid, kuid muu hulgas on TNF- ja IFN- peamised tsütokiinid, mis on võimelised suurendama PD-L1 taset erinevates kasvajates [23]. 3-AR/PD-L1 ristkõne aluseks oleva signaali edasiseks selgitamiseks meie NB kasvajamudelis testisime esmalt in vitro PD-L1 ekspressiooni N2A kasvajarakkudel pärast TNF- ja IFN-ravi. Tulemused näitasid, et PD-L1 ekspressioon oli ülesreguleeritud NB-rakkudes, mida töödeldi 48 tundi IFN-ga, kuid mitte TNF-ga. Veelgi enam, N2A kasvajarakkude eeltöötlemine 3-AR antagonistiga SR59230A ei suutnud tühistada IFN-ravi põhjustatud suurenenud PDL1 ekspressiooni (joonis 5A). Arvestades, et kirjanduse andmetel tunnistati TIL-id IFN-i peamise rakulise allikana adaptiivse immuunvastuse ajal [24] ja et meie tulemused näitasid, et 3-AR modulatsioon N2A kasvajarakkudel ei mõjutanud IFN- -sõltuvat PD -L1 ekspressiooni, mõtlesime, kas 3-AR modulatsioon TIL-idel põhjustas muutunud IFN-sekretsiooni, mis omakorda mõjutas PD-L1 ekspressiooni kasvajarakkudel. Meie hüpoteesi tõestamiseks eraldati vehiikuliga või SR59230A-ga töödeldud NB-d kandvate hiirte TDLN-idest saadud lümfotsüüdid ja kultiveeriti neid koos kasvajarakkudega. Immunofluorestsents- ja voolutsütomeetria analüüs kinnitas, et 3- AR antagonistiga ravitud NB-d kandvatelt hiirtelt kogutud lümfotsüüdid vähendasid nende võimet vallandada PD-L1 ekspressiooni N2A rakkudel võrreldes töötlemata lümfotsüütidega (joonis 5B, D). Lisaks kinnitas IFN-taseme mõõtmine kaaskultuurisöötmes, et SR50230A-ga töödeldud hiirtelt kogutud lümfotsüüdid kaotasid osaliselt oma võime IFN-i sekreteerida, kui neid kasvatati koos NB kasvajarakkudega (joonis 5C). Juba on näidatud, et 3-AR võib olla seotud Gs-valguga mitmes koes ja selle aktiveerimine viib cAMP/PKA signaaliraja aktiveerumiseni [25]. Samal ajal tõestasid uuringud tsüklilise AMP-le reageeriva elemendi sidumise (CREB) kriitilist rolli IFN-i positiivse transkriptsiooniregulaatorina T-rakkudes [25–27]. Nendest vaatlustest lähtudes analüüsisime, kas cAMP/PKA/CREB signaalirada oli seotud 3-AR-sõltuva IFN-sekretsiooniga TIL-ides. Tulemused näitasid, et 3-AR-antagonism CD8+ TIL-ide suhtes vähendas PKA /PKA subühikute ja CREB fosforüülimist, mis viis IFN-i ekspressiooni vähenemiseni CD8+ TIL-ides (täiendav joonis 1A , B). Need tulemused kinnitasid, et 3-AR on võimeline alal hoidma IFN-transkriptsiooni NB TIL-ides, käivitades cAMP/PKA/CREB signaaliraja. Teisest küljest vähenes immunosupressiivne tsütokiin IL-10 SR59230A-ga ravitud hiirte Tregis võrreldes kandjaga (täiendav joonis 1C), mis kinnitab NB TME immuunreaktiivsust pärast ravi 3-AR antagonistiga. NB-d kandvatest hiirtest. Et kinnitada SR59230A antagonismi selektiivset toimet 3-AR alatüübile, viisime läbi kaaskultuuri testi lümfotsüütidega, mis olid summutatud siRNA-dega 1-, 2- ja 3-AR jaoks. alatüübid. Tulemused näitasid, et 3-AR jaoks vaigistatud lümfotsüüdid -AR alatüüpide hulgas kaotasid kontrollseisundiga võrreldes osaliselt võime indutseerida PD-L1 ekspressiooni N2A kasvajarakkudel (joonis 5E ja täiendav joonis 1D). Lisaks kinnitati 3-AR valgu ekspressiooni NB-d kandvate hiirte hiire lümfotsüütidel TDLN-idest saadud lümfotsüütide Western blot analüüsiga (täiendav joonis 2A) ning CD4+ ja CD{{ immunofluorestsentsiga. 90}} T-rakud, mis on värvitud 3-AR jaoks kasvaja massilõikudel (täiendav joonis 2B). Varem näitasime, et 3- AR spetsiifiline antagonism N2A kasvajarakkudele SR59230A poolt inhibeeris NB kasvu ja kasvaja progresseerumist, lülitudes tüvirakkudelt kasvajarakkude diferentseerumisomadustele [12]. Siin vihjasid meie tulemused, et 3-AR antagonisti manustamise kasvajavastane toime põhines ka TIL-ide 3-AR signaalide modulatsioonil, mis omakorda tõi kaasa kasvajavastaste immuunvastuste taaselustamise. Seetõttu manustati oma väitekirja kinnitamiseks in vivo FTY720, et ohjeldada T-rakke TDLN-des ja vähendada nende infiltratsiooni kasvaja massi. FTY720 on sfingosiin 1-fosfaadi (S1P) analoog ja selle manustamine kutsub esile S1P retseptori internaliseerumise ja lagunemise, takistades seega lümfotsüütide lümfisõlmedest väljumist [28]. Nagu eeldati, vähendas FTY720 eelravi 3-AR antagonisti manustamisest tingitud kasvajavastast toimet (joonis 5F–H). Et kinnitada FTY720 tõhusust T-rakkude ohjeldamisel TDLN-ides, mõõtsime pärast kaheksapäevast (T8) ravi T-rakkude arvu TDLN-des. Tulemused näitasid, et nii CD4+ kui ka CD8+ rakkude arv suurenes eelnevalt FTY720-ga töödeldud hiirte TDLN-ides võrreldes töötlemata hiirtega (kandja) (täiendav joonis 2C). Vastavalt meie ja teistele varasematele tulemustele, mis näitavad, et S1P signaaliülekanne on NB kasvajarakkude ellujäämise jaoks ülioluline [12, 29], suutis ravi ainult FTY720-ga oluliselt vähendada kasvaja kasvu (joonis 5F–H). Vehiiklitest ja SR59230A-ga töödeldud hiirtest eraldatud NB kasvaja masside RNA sekveneerimise analüüs tuvastas 5607 geeni, millest 267 olid erinevalt ekspresseeritud geenid (DEG), 127 olid ülesreguleeritud ja 140 allareguleeritud SR59230A-ga töödeldud kasvajates (joonis 6A). Täpsemalt, mitmed statistiliselt erinevalt ekspresseeritud geenid kuulusid immuunsüsteemiga seotud radadesse vastavalt GO: BP andmebaasile (joonis 6B). Veelgi enam, PD-L1 mRNA (CD274 geen) allareguleerimine SR59230A-ga töödeldud kasvajas võrreldes kandja seisundiga ja erinevate teiste immuunsüsteemiga seotud protsessides osalevate geenide ülesreguleerimine (joonis 6C) kinnitas korrelatsiooni 3-AR ja valgu tasemel täheldatud immuunkontrollpunkt PD-L1. Lõpuks kinnitas diferentsiaalne geeniekspressiooni analüüs avalikus andmekogumis (GSE14880 GEO arhiivist), mis koosnes 34 NB-dest mõjutatud patsiendist, et ADRB3 madala ekspressiooniga NB kasvaja massid näitasid immuunvastuste, T-rakkude aktivatsiooni ja immuunefektori positiivset regulatsiooni. radu võrreldes kasvaja massiga kõrge ADRB3 tasemega (joonis 6D). Tuleb märkida, et kuigi erinevate vähivormide korral vabanevad katehhoolamiinid vähiga seotud neuronite kaudu või jõuavad kasvajasse lihtsalt vereringe kaudu, siis NB-s tekib katehhoolamiinide ja nende metaboliitide (HVA, VMA, dopamiin) liigne tase, mis on selle pahaloomulise kasvaja ainulaadne tunnus. teisest allikast. Tõepoolest, NB-rakkude omapärase päritolu tõttu (närviharja defektsetest sümpaatilistest neuronite diferentseerumisrakkudest) on need kasvajad tavaliselt võimelised katehhoolamiine ise sekreteerima. Tõepoolest, meie NB hiire mudelis näitas kasvaja masside immunofluorestsents, et NB kasvajarakud olid positiivsed dopamiini hüdroksülaasi (DBH) suhtes (täiendav joonis 3A), mis on norepinefriini sünteesi eest vastutav ensüüm, sõltumata 3- AR ekspressioon kasvajal või selle antagonismil. Kokkuvõttes rõhutavad need andmed adrenergilise signaalimise otsustavat rolli erinevate bioloogiliste protsesside reguleerimisel, mis on seotud peremeesorganismi immuunsüsteemi ja kasvaja mikrokeskkonna vahelise interaktsiooniga NB kasvajates. Kasvajavastased toimed, mida täheldati pärast 3-AR antagonisti manustamist meie hiire süngeense mudeli korral, põhinevad vähemalt osaliselt kasvaja massi infiltreeruvatel lümfotsüütidel ekspresseeritud 3-AR moduleerimisel. Täpsemalt näitasime, et 3-AR selektiivne blokeerimine TIL-idel vähendas IFN-i sekretsiooni, mis omakorda vähendas PD-L1 ekspressiooni NB kasvajarakkudel, soodustades immuunreaktiivset TME-d.

Joonis 5 3-AR TIL-idel säilitab IFN- -sõltuva PD-L1 ekspressiooni NB kasvajarakkudes. A

ADRB3 geeniekspressioon korreleerub NB patsientide halva prognoosiga

Mõned uuringud viitasid sellele, et {{0}}AR mRNA ja/või valk on üleekspresseeritud ja mõnel juhul korrelatsioonis neoplastilise proliferatsiooni ja transformatsiooniga inimese erinevates vähivormides [10, 30–32]. Sellest tulenevalt näitasid meie NB süngeense hiiremudeliga saadud prekliinilised tulemused, et 3-AR signaalimine võib toetada erinevaid kasvaja kasvu soodustavaid protsesse. Seetõttu, et testida, kas ADRB3 geeniekspressioon korreleerub NB patsientide ellujäämisega, teostasime Kaplan-Meieri analüüsi platvormi R2: genoomika analüüsi ja visualiseerimise platvormi (http://r2.amc.nl) kaudu, kasutades Kocaki andmebaasi, mis sisaldab täielik teave 649 NB patsiendi kliiniliste andmete kohta. Tulemused näitasid, et ADRB3 geeniekspressioon oli NB-ga patsientidel seotud halbade tulemustega. ADRB3 geeni kõrge ekspressioon oli tõepoolest oluliselt seotud vähenenud sündmustevaba (p=3.2e−05) (joonis 7A) ja üldise elulemusega (p=8.4e−0,5) ( Joonis 7B) NB patsientidest. Lisaks näitas mõnede kohortide geenide korrelatsioonianalüüs positiivset korrelatsiooni ADRB3 ja immuunsüsteemi inhibeerivate kontrollpunktide (nt CD80, CTLA4 ja CD276) geenide vahel ning negatiivset korrelatsiooni immuunsüsteemi aktiveerivate immuunkontrollpunktide (nt CD266) geenidega. CD40 ligand (CD40LG) ja 4-1BB ligand (4-1BBL) (joonis 7C). Üldiselt näitavad saadud andmed ADRB3 geeniekspressiooni negatiivset korrelatsiooni NB-patsientide tulemustega ning kinnitavad ja tugevdavad 3-AR rolli molekulaarse mängijana, mis on võimeline summutama kasvajavastaseid immuunvastuseid, mõjutades mitut immuunkontrolli punkti. signalisatsiooniteed.

ARUTELU

Alates selle omapärasest neurogeensest päritolust iseloomustab NB kasvaja seisundit kõrge katehhoolamiini metaboliitide tase [7, 33]. Eelmises töös spekuleerisime, et katehhoolamiini vabanemine TME-s võib -AR-de aktiveerimise kaudu olla suunatud vähirakkudele, käivitades NB-vähi kasvu ja pahaloomuliste kasvajate edasisuunalise ahela. Tõepoolest, eksperimentaalsed andmed näitasid, et 3-AR ekspresseeritakse erinevatel NB kasvaja rakuliinidel ja patsientide biopsiatel ning et selle moduleerimine mõjutas oluliselt kasvaja kasvu NB süngeenses hiiremudelis [12]. Lisaks -AR-ide ekspressioonile kasvajarakkudel on laialt teada, et -AR-id paiknevad enamiku TME rakkude, sealhulgas immuunrakkude pinnal, ja et katehhoolamiinide ligeerimine -AR-idega immuunrakkudes reguleerib nii kaasasündinud kui ka adaptiivset immuunsust. [34]. Tuleb märkida, et kuigi füsioloogilistes tingimustes soodustab immuunsüsteemi moduleerimine adrenergiliste signaalide kaudu normaalset immuunvastust, võib muutunud protsesside korral SNS/katehhoolamiinide/-AR-de pikaajaline stimulatsioon avaldada kahjulikku mõju erinevatele immuunrakkudele, sealhulgas lümfotsüütidele [35, 36 ]. Nendes muutunud tingimustes soodustab adrenergiliste signaalide pidev stimuleerimine patoloogilisi protsesse ja muu hulgas vähi progresseerumist [37]. Eelnimetatud tähelepanekutest lähtudes on meie uuringu eesmärk uurida, kas 3-AR-antagonismi põhjustatud kasvajavastane toime NB-kasvajate puhul võib osaliselt tugineda kasvajavastase immuunsuse taaselustamisele ja kas see võib hõlmata immuunsüsteemi kontrollpunktide signaaliradade moduleerimine. Prekliinilised uuringud viitavad sellele, et PD-L1 ekspressioon metastaatilises NB-s kujutab endast otsustavat mehhanismi immuunseire piiramisel [15] ning kombineeritud immunoteraapia PD-L1/PD-vastaste-1 ja CD4-vastaste antikehadega ravib süngeenset dissemineerunud NB-d [15]. 38]. Hiljuti hinnati PD-L1 ekspressiooni mitmetes lastekasvajates ja ennekõike seostati PD-L1 värvimist NB-ga patsientide madalama elulemusega [16, 39]. Lisaks näidati, et PD-L1-positiivsed kasvajad paiknesid neerupealises sagedamini kui PD-L1-negatiivsed kasvajad ning katehhoolamiini metaboliidid (NSE, VMA ja HVA) kaldusid kõrgem PD-L1-positiivses rühmas kui PD-L1-negatiivses rühmas [16].

cistanche tubulosa - parandab immuunsüsteemi

Need tõendid viitasid PD-1/PD-L1 signaalitelje võimele kontrollida tuumori immuunsüsteemi põgenemist primaarses ja metastaatilises NB-s, kuid nad ei uurinud täpseid PD-1/PD- aluseks olevaid mehhanisme. L1 signalisatsiooni reguleerimine. Uurimaks, kas 3-AR modulatsioon võib mõjutada PD-L1 ekspressiooni NB-s ja sellest tulenevat immuunreaktiivsust TME-s, ravisime süngeensete N2A NB rakkudega nakatatud A/J hiiri 3- AR antagonist SR59230A, PD-L1 monoklonaalne antikeha (PD-L1) või nende kombinatsioon. Esiteks täheldasime, et 3-AR antagonism suutis vähendada NB kasvaja kasvu ja samaaegselt vähendada PD-L1 ekspressiooni NB-d kandvate hiirte TME-s. Voolutsütomeetria näitas, et SR59230A-ga töödeldud hiirte kasvaja massis täheldatud PD-L1 vähenenud kogus peegeldas enamasti kasvajarakkude vähenenud ekspressiooni. Vastupidiselt oli PD-L1 ekspressioon DC-del ja makrofaagidel ülesreguleeritud. Mitmed teaduslikud tõendid on omistatud PD-L1-le, mis paikneb nii kasvajarakkudel kui ka APC-del, võime pärssida T-rakkude aktivatsiooni, takistades osaliselt tõhusat immuunreaktsiooni kasvaja vastu [40]. Hiljutised uuringud näitasid aga, et antigeeni omastamise ja kasvaja antigeenide T-rakkudele ristesitlemise ajal, mis on adaptiivse immuunsuse oluline samm, reguleerivad DC-d ja makrofaagid PD-L1 üles, piirates seega T-rakkude liigset aktivatsiooni ja kaitstes neid tsütotoksilise toime eest. T-rakud [41, 42]. Seetõttu oletasime, et PD-L1 vähenenud ekspressioon kasvajarakkudel ja sellega kaasnev APC-de suurenemine SR59230A-ga töödeldud kasvaja massis peegeldas tõenäoliselt immuunsüsteemi taastumist TME-s. Tulemused kinnitasid kasvajasse infiltreeruvate immuunreaktiivsete rakkude (NK, DC-d ja CD8+) arvu suurenemist ning kasvajasse infiltreeruvate immuunsupressiivsete rakkude (Treg ja MDSC) vähenemist. Immuunsuse kontrollpunkti PD-1 ekspressioonianalüüs TIL-idel näitas oluliselt suurenenud PD-1+CD4+ ja PD- 1+CD8+ T-rakkude arvu TDLN-ides kasvaja varane arengustaadium (T2) ja PD-1+CD8+ kasvajas pärast 8-päevast (T8) SR59230A, PD-L1 või nende kombineeritud ravi võrreldes kontrolliga. Kasvutrendi täheldati ka TIM3 või LAG3 jaoks värvitud CD4+ T-rakkude arvus SR59230A, PD-L1 ravi ja nende kombinatsiooni saanud kasvajates, kuid need ei saavutanud statistilist olulisust. TIM3 või LAG3 jaoks värvitud CD8+ T-rakkude puhul täheldasime selle asemel suurt varieeruvust. Kuigi mõned kirjandusandmed viitavad sellele, et PD-1, LAG-3 ja TIM-3 ekspresseerivad T-rakud on kurnatud ja tal on talitlushäired [43–45], siis teised näitasid, et need immuunsüsteemi kontrollpunktid, eriti PD -1, on ka pärast aktiveerimist ja efektor-T-rakkude diferentseerumist ülesreguleeritud [46–48] ning seetõttu ei peegelda ekspressioon iseenesest ammendatud olekut, pigem tuvastavad need markerid autoloogse kasvaja-reaktiivse repertuaari, mis infiltreerub erinevatesse kasvajatesse [46–46– 49]. Kokkuvõttes kinnitasid meie kasvajamudeli põhjalikumad uuringud, et 3-AR-antagonism kui ravi PD-L1-vastase mAb-ga käivitas CD tsütotoksilised funktsioonid8+, mida näitab PD suurenenud arv. Perforiini või gransüüm B suhtes värvitud 1+CD8+ rakud, mis kinnitab, et kasvaja massis leitud PD1+ TIL-id on funktsionaalselt aktiivsed. On näidatud, et CD8+ tsütotoksiliste T-rakkude kõrge infiltratsioon kasvajasse on korrelatsioonis positiivse prognoosiga patsientidel, kellel on mitmed pahaloomulised kasvajad, sealhulgas melanoomi-, pea- ja kaela-, rinna-, kolorektaal-, munasarja-, eesnäärme- ja muud kasvajad [50]. NB-s näitas hiljutine uuring, et kasvajasse infiltreeruvate T-rakkudega rikastatud kasvajatel oli parem kliiniline tulemus, sõltumata teistest kasvaja staadiumis kasutatavatest praegustest näitajatest [51]. Veelgi enam, hiljutised leiud näitasid, et DC- ja NK-rakkude esinemine kasvaja massis on positiivses korrelatsioonis nii T-rakkude infiltratsiooni kui ka NB-patsientide positiivse kliinilise tulemusega [52]. Kõik need kliinilised tõendid on kooskõlas meie prekliiniliste tulemustega, mille kohaselt NK, DC ja CD{89}} T-rakkudega rikastatud TME, mida täheldati pärast 3- AR antagonismi või PD-L1 manustamist, oli funktsionaalselt võimeline kontrollida NB kasvaja kasvu. Peremeesorganismi immuunsüsteemi kasvajavastase väljakutse põhiaspektiks on erinevate tsütokiinide vabanemine TME-s, mis võivad säilitada või tuhmuda kasvajavastaseid toimeid. Tsütokiinide mõõtmine kasvajas kinnitas SR59230A- ja PD-L1--ga ravitud hiirte seisundit, mis nihkus immuunreaktiivse TME suunas. Kuigi kasvajavastaste tsütokiinide hulgas tõusid nii TNF- kui ka IL{101}} tasemed, langes IFN-i tase 3-AR antagonistiga ravitud hiirte kasvaja massis. Sellest tähelepanekust lähtudes oletasime, et 3-AR-signaali moduleerimine kasvajasse infiltreeruvatel T-rakkudel, eriti CD-l{107}} ja CD-l8+, võib põhjustada muutunud IFN-i. sekretsiooni, mis omakorda mõjutas PD-L1 ekspressiooni kasvajarakkudel. Tulemused kinnitasid meie hüpoteesi. TIL-ide selektiivne 3-AR antagonism muutis need rakud PD-L1 ekspressiooni esilekutsumisel NB kasvajarakkudel IFN-i muutunud sekretsiooni tõttu ebaefektiivseks ja takistas de facto adaptiivse immuunresistentsuse teket. TME-s korraldab IFN nii kasvajaeelseid kui ka kasvajavastaseid immuunvastuseid, toimides tsütotoksilise tsütokiinina koos gransüüm B ja perforiiniga, et tabada kasvajarakke, kuid käivitades ka inhibeerivate immuunkontrollpunktide sünteesi, stimuleerides seega immuunsupressiivseid mehhanisme [53]. See IFN-i bimodaalne roll vastupidiste mõjude tekitamisel sõltub keerulistest mehhanismidest, mida pole veel täielikult mõistetud, kuid eritunud IFN-i kogus näib olevat määrav selle tsütokiini poolt põhjustatud toimete määratlemisel [54]. Sellest lähtuvalt oletame, et meie mudelis soodustas IFN-i vähenenud kogus, mille põhjustas 3- AR antagonism TIL-idele, immuunvastuseid võrreldes kontrollseisundiga, kus krooniline kokkupuude IFN-ga sunnib rohkem immuunsupressiivseid mehhanisme. -AR alatüüpide hulgas näib 2-AR olevat kõige enam ekspresseeritud mitmesuguste immuunrakkude pinnal. Siiski tuleb märkida, et 3-AR-i, viimast tuvastatud liiget -AR-idest, on seni kõige vähem uuritud. Seetõttu, et kinnitada, et SR59230A manustamine blokeeris peamiselt 3-AR alatüüpi, uurisime ja kinnitasime esmalt 3-AR valgu ekspressiooni TDLN-de lümfotsüütidel ja kasvajasse infiltreeruvatel T-rakkudel. Näitasime 3-AR valgu ekspressiooni kasvajasse infiltreeruvas CD4+ ja CD8+ ning seejärel selektiivsete 1-, 2- ja {{ 140}}AR-ide vaigistamisel kinnitasime lümfotsüütidel paikneva 3-AR alatüübi silmapaistvat rolli IFN- -sõltuva PD-L1 ekspressiooni kontrollimisel NB kasvajarakkudel. Tuleb märkida, et ulatuslikud andmed erinevate kudede ja rakumudelite kohta on näidanud, et kuigi 1- ja 2-AR-id on mõlemad vastuvõtlikumad homoloogse desensibiliseerimise nähtusele pärast pikaajalist kokkupuudet endogeensete katehhoolamiinidega, on {{147} }AR-alatüüpi ei leitud olevat ja kui mõnes lahtris siiski toimus 3-AR-de desensibiliseerimine, oli see vähem väljendunud kui 1- ja 2-AR-de [ 55]. Seejärel oletame, et NB kasvaja puhul, mida iseloomustab krooniline kokkupuude katehhoolamiinidega, võib TIL-ide 2-AR-alatüüp, mis on füsioloogiliselt kõige enam väljendunud, pärast desensibiliseerimist alluda, ja vastupidi, 3-AR teenib keskset rolli katehhoolamiinide poolt indutseeritud kasvajaeelsete mõjude vahendamisel. Inimestel 3- AR-ekspressiooni kasvajaeelse kalde uurimiseks viisime lõpuks läbi 649 NB-patsiendi geneetilise analüüsi, kasutades avatud juurdepääsu R2: genoomika analüüsi ja visualiseerimise platvormi. Kõrge ADRB3 geeniekspressioon korreleerus NB patsientide halvima kliinilise tulemusega (üldine ja sündmustevaba elulemus) võrreldes madalama ekspressiooniga; lisaks positiivne ADRB3 geeni korrelatsioon erinevate immuunsupressiivsete kontrollpunktidega, nagu CD80, CTLA4 ja B7-}H3 (CD276), ning negatiivne korrelatsioon immuunsüsteemi aktiveerivate kontrollpunktidega, nagu CD266, CD40LG ja 4-1 BBL kinnitas 3-AR negatiivset rolli immuunreaktiivsuse keerulises reguleerimises NB-s. Eelkõige ADRB3 geeniekspressiooni positiivne korrelatsioon immuunsupressiivsete kontrollpunktidega, nagu CD276, NB-ga seotud molekul, mida leidub mittereageerivates NB variantides ja millel on kaitsev roll NK-rakkude poolt vahendatud lüüsi eest [56, 57], või CTLA4-ga, mille inhibeerimine ei olnud NB-s kasvajavastaste T-rakkude tapmise suurendamisel üleliigne [58], tõi esile 3-AR signaaliülekande võime säilitada erinevaid mehhanisme, mis soodustavad kasvaja immuunsüsteemi põgenemist. Võime oletada, et korrelatsioon kõrge ADRB3 geeniekspressiooni ja erinevate immuunkontrollpunktide suurenenud ekspressiooni vahel võib tugineda 3-AR võimele säilitada neid mehhanisme, mille üleaktiveerimine soodustab kasvajaresistentsuse teket, näiteks krooniline kokkupuude mõne promootoriga. -põletikulised tsütokiinid. Varased uuringud kontrollpunktide inhibeerimise kohta NB-s ei ole alati olnud edukad. Täpsemalt, nii prekliinilistes uuringumudelites kui ka inimestel, näitasid mitut ICI-d kasutavate terapeutiliste strateegiate paremad vastused sellele, et erinevate immuunkontrollpunktide sihtimine kujutab endast NB-s mitte-ülemäärast tõhusat kasvajavastast lähenemisviisi [58, 59]. Seejärel võib erinevate immunosupressiivsete radade sihtimine olla parim ravivõimalus, et vältida ühesuunalise ravi kasvajaresistentsust. Mitme ravimi manustamine on aga raskete kõrvaltoimete ja toksilisuse tõttu alati problemaatiline ega ole alati andnud soovitud tulemusi. Seetõttu on uute immuun-onkoloogia lähenemisviiside väljatöötamiseks vaja sügavamaid teadmisi TME immuunvastase kompleksse võrgu reguleerimisega seotud molekulaarsetest mehhanismidest. Selles kontekstis viitavad esitatud tulemused sellele, et 3-AR-i sihtimine NB TME-s võib kujutada endast võimalikku lähenemisviisi mitme mitteliigse kasvajaeelse signaaliraja tabamiseks. Eelkõige, mõjutades nii peremeesorganismi immuunsüsteemi, eemaldades immuunkontrollpunktide koostööst põhjustatud barjääri, kui ka kasvajarakkude ellujäämist soodustavaid teid, võib 3-AR-antagonism kujutada endast paljutõotavat strateegiat koos loodetavasti ka terapeutilise toimega. potentsiaal NB pahaloomuliste kasvajate all kannatavatele patsientidele. Veel on vaja rohkem uuringuid, et süvendada täiendavaid mehhanisme, mis on aluseks peremeesorganismi immuunsüsteemi ja NB kasvaja vastasmõju keerulisele interaktsioonile. Sellegipoolest väärib meie täheldatu valguses arvessevõtmist NB kasvajate TME -adrenergilise signaalimise uuring.

Joonis 6 NB kasvaja massi transkriptoomilised analüüsid kinnitavad 3-AR silmapaistvat rolli immuunsüsteemiga seotud protsesside mõjutamisel

Joonis 7 Kaplan-Meieri ellujäämise analüüs ja immuunsüsteemi kontrollpunktide korrelatsioon ADRB3 geeniekspressiooniga NB patsientidel.

VIITED

1. Cheung NK, Dyer MA. Neuroblastoom: arengubioloogia, vähi genoomika ja immunoteraapia. Nat Rev Vähk. 2013;13:397–411.

2. Matthay KK, Maris JM, Gudrun S, Nakagawara A, Mackal CL, Diller L jt. Neuroblastoom. Nat Rev Dis Prim. 2016; 2:16078.

3. Darvin P, Toor SM, Nair SN, Elkord E. Immune kontrollpunkti inhibiitorid: hiljutised edusammud ja potentsiaalsed biomarkerid. Exp Mol Med. 2018;50:1–11.

4. Pardoll DM. Immuunsuse kontrollpunktide blokeerimine vähi immunoteraapias. Nat Rev Vähk. 2012;12:252–64.

5. Zou W, Wolchok JD, Chen L. PD-L1 (B7-H1) ja PD-1 raja blokaad vähiravis: mehhanismid, vastuse biomarkerid ja kombinatsioonid. Sci Transl Med. 2016;8:328rv4.

6. Cole SW, Sood AK. Molekulaarsed rajad: beeta-adrenergiline signaalimine vähi korral. Clin Cancer Res. 2012;18:1201–6.

7. Strenger V, Kerlb R, Dornbusch HJ, Ladenstein R, Ambros PF, Ambros IM jt. Uriini katehhoolamiinide diagnostiline ja prognostiline mõju neuroblastoomiga patsientidele. Laste verevähk. 2007;48:504–9.

8. Huang XE, Hamajima N, Saito T, Matsuo K, Mizutani M, Iwata H jt. Beeta2- ja beeta3-adrenergiliste retseptorite geenide polümorfismide võimalik seos vastuvõtlikkusega rinnavähile. Breast Cancer Res. 2001;3:264–9.

9. Babol K, Przybylowska K, Lukaszek M, Pertynski T, Blasiak J. Seos Trp64Arg polümorfismi beeta3-adrenergilise retseptori geenis ning endomeetriumi vähi ja rasvumise vahel. J Exp Clin Cancer Res. 2004; 23:669–74.

10. Perrone MG, Notarnicola M, Caruso MG, Tutino V, Scilimati A. Beeta3-adrenergilise retseptori mRNA ülesreguleerimine inimese käärsoolevähi korral: esialgne uuring. Onkoloogia. 2008;75:224–9.

11. Magnon C, Hall SJ, Lin J, Xue X, Gerber L, Freedland SJ jt. Autonoomne närvide areng aitab kaasa eesnäärmevähi progresseerumisele. Teadus. 2013;341:1236361.

12. Bruno G, Cencetti F, Pini A, Tondo A, Cuzzubbo D, Fontana F jt. beeta3- adrenoretseptori blokaad vähendab kasvaja kasvu ja suurendab neuroblastoomi neuronite diferentseerumist SK2/S1P2 modulatsiooni kaudu. Onkogeen. 2020;39:368–84.

13. Calvani M, Bruno G, Dal Monte M, Nassini R, Fontana F, Casini A jt. beeta3 -Adrenotseptor kui potentsiaalne immunosupressor melanoomi korral. Br J Pharm. 2019;176:2509–24.

14. Dal Monte M, Casini G, Filippi L, Nicchia MG, Svelto M, Bagnoli P. Beeta3-adrenergiliste retseptorite funktsionaalne osalus melanoomi kasvus ja vaskularisatsioonis. J Mol Med. 2013;91:1407–19.

15. Dondero A, Pastorino F, Della Chiesa M, Corrias MV, Morandi F, Pistoia V jt. PDL1 ekspressioon metastaatilise neuroblastoomi korral kui lisamehhanism immuunseire piiramiseks. Onkoimmunoloogia. 2016;5:e1064578.

16. Zuo S, Sho M, Sawai T, Kanehiro H, Maeda K, Yoshida M jt. PD-L1 ekspressiooni ja kasvajasse infiltreeruvate lümfotsüütide potentsiaalne roll neuroblastoomil. Pediatr Surg Int. 2020;36:137–43.

17. Keir ME, Butte MJ, Feeman GJ, Sharpe AH. PD-1 ja selle ligandid taluvuses ja immuunsuses. Annu Rev Immunol. 2008;26:677–704.

18. Curiel TJ, Wei S, Dong H, Alvarez X, Cheng P, Mottram P jt. B7-H1 blokaad parandab müeloidsete dendriitrakkude poolt vahendatud kasvajavastast immuunsust. Nat Med. 2003;9:562–7.

19. Wu K, Kryczek I, Cheng L, Zou W, Welling TH. CD8+ T-rakkude Kupfferi rakkude supressiooni inimese hepatotsellulaarse kartsinoomi korral vahendavad B7-H1/programmeeritud surm-1 interaktsioonid. Cancer Res. 2009;69:8067–75.

20. Kuang DM, Zhao Q, Peng C, Xu J, Zhang JP, Wu C jt. Aktiveeritud monotsüüdid hepatotsellulaarse kartsinoomi peritumoraalses stroomas soodustavad immuunsüsteemi privileege ja haiguse progresseerumist PD-L1 kaudu. J Exp Med. 2009;206:1327–37.

21. Rotte A, Jin JY, Lemaire V. Immuunsuse kontrollpunktide mehaaniline ülevaade, et toetada nende kombinatsioonide ratsionaalset kavandamist vähi immunoteraapias. Ann Oncol. 2018;29:71–83.

22. Dammeijer F, van Gulijk M, Mulder EE, Lukkes M, Klaase L, van den Bosch T jt. PD-1/PD-L1 kontrollpunkt piirab T-rakkude immuunsust kasvajat tühjendavates lümfisõlmedes. Vähirakk. 2020;38:685–700. e8.

23. Cha JH, Chan LC, Li CW, Hsu JL, Hung MC. Mehhanismid, mis kontrollivad PD-L1 ekspressiooni vähis. Mol Cell. 2019;76:359–70.

24. Burke JD, Young HA. IFN-: tsütokiin õigel ajal, on õiges kohas. Semin Immunol. 2019;43:101280.

25. Schena G, Caplan MJ. Kõik, mida olete alati tahtnud 3-AR* kohta teada saada (*, kuid kartnud küsida). Rakud. 2019;8:357.

26. Liu Y, Guo YL, Zhou SJ, Liu F, Du FJ, Zheng XJ jt. CREB on gamma-interferooni positiivne transkriptsiooniregulaator latentse, kuid mitte aktiivse tuberkuloosiinfektsiooni korral. Clin ad Vaccine Immunol. 2010;17:1377–80.

27. Samten B, Townsend JC, Weis SE, Bhoumik A, Klucar P, Shams H jt. CREB, ATF ja AP-1 transkriptsioonifaktorid reguleerivad IFN-gamma sekretsiooni inimese T-rakkude poolt vastusena mükobakteri antigeenile. J Immunol. 2008;181:2056–64.

28. Matloubian M, Lo CG, Cinamon G, Lesneski MJ, Xu Y, Brinkmann V jt. Lümfotsüütide väljumine harknäärest ja perifeersetest lümfoidorganitest sõltub S1P retseptorist 1. Loomus. 2004;427:355–60.

29. Li MH, Hla T, Ferrer F. FTY720 inhibeerib tuumori kasvu ja suurendab topotekaani kasvajat pärssivat toimet neuroblastoomi korral, häirides sfingolipiidide signaaliülekande rada. Laste verevähk. 2013;60:1418–23.

30. Chisholm KM, Chang KW, Truong MT, Kwok S, West RB, Heerema-McKenney AE. beeta-adrenergilise retseptori ekspressioon vaskulaarsetes kasvajates. Mod Pathol. 2012;25:1446–51.

31. Montoya A, Amaya CN, Belmont A, Diab N, Trevino R, Villanueva G jt. Mitteselektiivsete beetablokaatorite kasutamist seostatakse varajases staadiumis rinnavähi korral kasvaja proliferatsiooniindeksite vähenemisega. Oncotarget. 2017;8:6446–60.

32. Rains SL, Amaya CN, Bryan BA. Beeta-adrenergilised retseptorid ekspresseeruvad erinevates vähivormides. Oncoscience. 2017;4:95–105.

33. Verly IR, van Kuilenburg ABP, Abeling NGGM, Goorden SMI, Fiocco M, Vaz FM jt. Katehhoolamiinide profiilid diagnoosimisel: suurenenud diagnostiline tundlikkus ja korrelatsioon bioloogiliste ja kliiniliste tunnustega neuroblastoomiga patsientidel. Eur J Vähk. 2017;72:235–43.

34. Eng JWL, Kokolus KM, Reed CB, Hylander BL, MA WW, Repasky jt. Närvikasvaja mikrokeskkond: adrenergilise stressi mõju vähirakkudele, immuunsupressioon ja immunoterapeutiline reaktsioon. Vähk Immunol Immunother. 2014;63:1115–28.

35. Dhabhar FS, McEwen BS. Äge stress tugevneb, samas kui krooniline stress pärsib rakuvahendatud immuunsust in vivo: potentsiaalne roll leukotsüütide kaubitsemisel. Aju käitumine Immuun. 1997;11:286–306.

36. Dhabhar FS. Stressist põhjustatud immuunfunktsiooni suurendamine – stressihormoonide, leukotsüütide kaubitsemise ja tsütokiinide roll. Aju käitumine Immuun. 2002;16:785–98.

37. Qiao G, Chen M, Bucsek MJ, Repasky EA, Hylander BL. Adrenergiline signaalimine: sihitav kontrollpunkt, mis piirab kasvajavastase immuunvastuse teket. Front Immunol. 2018; 9:164.

38. Rigo V, Emionite L, Daga A, Astigiano S, Corrias MV, Quintarelli C jt. Kombineeritud immunoteraapia anti-PDL-1/PD{-1 ja anti-CD4 antikehadega ravib süngeenset dissemineerunud neuroblastoomi. Sci Rep. 2017;7:14049.

39. Majzner RG, Simon JS, Grosso JF, Martinez D, Pawel BR, Santi M jt. Programmeeritud surma-ligand 1 ekspressiooni ja kasvajaga seotud immuunrakkude hindamine laste vähi kudedes. Vähk. 2017;123:3807–15.

40. Gibbons Johnson RM, Dong H. Programmeeritud surma ligandi 1 (B7-H1) funktsionaalne ekspressioon immuunrakkude ja kasvajarakkude poolt. Front Immunol. 2017;8:961.

41. Peng Q, Qiu X, Zhang Z, Zhang S, Zhang Y, Liang Y jt. PD-L1 dendriitrakkudel nõrgendab T-rakkude aktivatsiooni ja reguleerib vastust immuunkontrollpunkti blokaadile. Nat Commun. 2020;11:4835.

42. Singhal S, Stadanlick J, Annunziata MJ, Rao AS, Bhojnagarwala PS, O'Brien S jt. Inimese kasvajaga seotud monotsüüdid / makrofaagid ja nende T-raku vastuste reguleerimine varajases staadiumis kopsuvähis. Sci Transl Med. 2019;11:eaat1500.

43. Blackburn SD, Shin H, Haining WN, Zou T, Workman CJ, Polley A jt. CD8+ T-rakkude kurnatuse kaasreguleerimine mitme inhibeeriva retseptori poolt kroonilise viirusinfektsiooni ajal. Nat Immunol. 2009;10:29–37.

44. Jin HT, Anderson AC, Tan WG, West EE, Ha SJ, Araki K jt. Tim-3 ja PD-1 koostöö CD8 T-rakkude kurnatuse korral kroonilise viirusinfektsiooni ajal. Proc Natl Acad Sci USA. 2010;107:14733–8.

45. Sakuishi K, Apetoh L, Sullivan JM, Blazar BR, Kuchroo VK, Anderson AC. Tim-3 ja PD-1 radade sihtimine, et pöörata tagasi T-rakkude kurnatus ja taastada kasvajavastane immuunsus. J Exp Med. 2010;207:2187–94.

46. ​​Agata Y, Kawasaki A, Nishimura H, Ishida Y, Tsubata T, Yagita H jt. PD-1 antigeeni ekspressioon hiire stimuleeritud T- ja B-lümfotsüütide pinnal. Int Immunol. 1996;8:765–72.

47. Vibhakar R, Juan G, Traganos F, Darzynkiewicz Z, Finger LR. Inimese programmeeritud surma-1 geeni aktiveerimisest põhjustatud ekspressioon T-lümfotsüütides. Exp Cell Res. 1997;232:25–8.

48. Freeman GJ, Long AJ, Iwai Y, Bourque K, Chernova T, Nishimura H jt. Immunoinhibeeriva retseptori PD-1 kaasamine uue B7 perekonnaliikme poolt põhjustab lümfotsüütide aktivatsiooni negatiivset regulatsiooni. J Exp Med. 2000;192:1027–34.

49. Gros A, Robbins PF, Yao X, Li YF, Turcotte S, Tran E jt. PD-1 tuvastab patsiendispetsiifilise CD8(+) kasvajareaktiivse repertuaari, mis infiltreerub inimese kasvajatesse. J Clin Invest. 2014;124:2246–59.

50. Galon J, Costes A, Sanchez-Cabo F, Kirilovsky A, Mlecnik B, Lagorce-Pagès C jt. Inimese kolorektaalsete kasvajate immuunrakkude tüüp, tihedus ja asukoht ennustavad kliinilisi tulemusi. Teadus. 2006;313:1960–4.

51. Mina M, Boldrini R, Citti A, Rumeenia P, D'Alicandro V, De Ioris M jt. Kasvajasse infiltreeruvad T-lümfotsüüdid parandavad raviresistentse neuroblastoomi kliinilisi tulemusi. Onkoimmunoloogia. 2015;4:e1019981.

52. Melaiu O, Chierici M, Lucarini V, Jurman G, Conti LA, De Vito R jt. Kasvajatesse infiltreeruvate dendriitrakkude ja looduslike tapjarakkude raku- ja geenisignatuurid ennustavad neuroblastoomi prognoosi. Nat Commun. 2020;11:5992.

53. Jorgovanovic D, Song M, Wang L, Zhang Y. IFN-gamma rollid kasvaja progresseerumisel ja taandarengul: ülevaade. Biomark Res. 2020;8:49.

54. Zhang J. Yin ja Yang IFN-gamma koosmõju põletiku ja autoimmuunhaiguste korral. J Clin Invest. 2007;117:871–3.

55. Okeke K, Angers S, Bouvier M, Michel MC. Agonistidest põhjustatud beeta3 -adrenoretseptorite desensibiliseerimine: kus, millal ja kuidas? Br J Pharm. 2019;176:2539–58.

56. Castriconi R, Dondero A, Augugliaro R, Cantoni C, Carnemolla B, Sementa AR jt. 4Ig-B7-H3 identifitseerimine neuroblastoomiga seotud molekulina, millel on kaitsev roll NK-rakkude poolt vahendatud lüüsi eest. Proc Natl Acad Sci USA. 2004;101:12640–5.