Zerumbone, Zingiber Officinale Roscoe troopiline ingveri seskviterpeen, nõrgendab -MSH-indutseeritud melanogeneesi B16F10 rakkudes, 1. osa

Abstraktne:Zerumbone (ZER), Zingiberaceae perekonna aktiivne koostisosa, on näidanud, et sellel on mitmeid bioloogilisi toimeid, nagu põletikuvastane, allergiavastane, antimikroobne ja vähivastane; siiski ei ole seda melanogeensete omaduste suhtes uuritud. Käesolevas uuringus demonstreerime, et ZER ja Zingiber on ametlikud (ZO) ekstraktid, mis nõrgendavad märkimisväärselt melaniini akumulatsiooni melanotsüüte stimuleeriva hormooni (-MSH) poolt stimuleeritud hiire melanogeensetes B16F10 rakkudes. Lisaks sellele, et selgitada molekulaarset mehhanismi, mille abil ZER pärsib melaniini akumulatsiooni, analüüsisime melanogeneesiga seotud transkriptsioonifaktori, mikroftalmiaga seotud transkriptsioonifaktori (MITF) ja selle sihtgeenide, nagu türosinaas, türosinaasiga seotud valk 1, ekspressiooni. TYRP1) ja türosinaasiga seotud valk 2 (TYRP2) B16F10 rakkudes, mida stimuleerib -MSH. Siin leidsime, et ZER inhibeerib melanogeensete geenide MITF-vahendatud ekspressiooni -MSH stimuleerimisel. Lisaks näitasid erinevate zerumbooni ja ZO kontsentratsioonidega töödeldud rakud suurenenud rakuvälise signaaliga reguleeritud kinaaside 1 ja 2 (ERK1/2) fosforüülimist, mis osalevad MITF-i lagunemismehhanismis. ERK1 / 2 farmakoloogiline inhibeerimine U0126 abil muutis piisavalt ZER-i melanogeense toime, mis viitab sellele, et selle melanogeense aktiivsuse jaoks on vaja ERK1 / 2 suurenenud fosforüülimist. Kokkuvõttes näitavad need tulemused, et ZER- ja ZO-ekstrakte saab nende melanogeense toime tõttu kasutada nahka valgendava kosmeetika toimeainetena.

Asjakohaste uuringute kohaselt on tsistanche tavaline ravimtaim, mida tuntakse kui "imerohtu, mis pikendab eluiga". Selle põhikomponent ontsistanosiid, millel on erinevad mõjud naguantioksüdant,põletikuvastaneja immuunfunktsiooni edendamine. Mehhanism vahelcistanchejanaha valgendaminepeitub cistanche antioksüdantses toimesglükosiidid. Inimese nahas sisalduv melaniini toodetakse türosiini oksüdeerumisel, mida katalüüsibtürosinaas, ja oksüdatsioonireaktsioon nõuab hapniku osalemist, seega muutuvad keha hapnikuvabad radikaalid oluliseks melaniini tootmist mõjutavaks teguriks. Tistanche sisaldab tsistanosiidi, mis on antioksüdant ja võib vähendada vabade radikaalide teket organismis, seegamelaniini tootmise pärssimine.

Klõpsake nuppu Kuidas Cistanche'i kasutada

Lisateabe saamiseks:

david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501

Märksõnad:zerumbone; Zingiber officinal Roscoe; melanogenees; MITF; ERK1/2

1. Sissejuhatus

Melanogeneesi, melaniini tootmist epidermise melanotsüütide poolt, stimuleerib melanotsüüte stimuleeriv hormoon (-MSH), mis eritub keratinotsüütidest ultraviolettkiirgusega (UV) kiirgusega [1,2]. Tüvirakkude faktor (SCF) on teine ​​melanogeenne tegur, mis kontrollib rangelt melanotsüütide migratsiooni, proliferatsiooni ja diferentseerumist, et säilitada postnataalne naha melanogeneesi [3]. Mikroftalmiaga seotud transkriptsioonifaktor (MITF), mis on melanogeenne transkriptsioonifaktor, aktiveeritakse cAMP-PKA-CREB (tsükliline adenosiinmonofosfaat-proteiinkinaasi A-cAMP vastuseelementi siduv valk) signaaliraja kaudu pärast -MSH stimulatsiooni melanokortiin 1 retseptori kaudu. (MC1R) epidermise melanotsüütide tsütoplasmaatilistes membraanides [4]. On teada, et mitmed kemikaalid, nagu forskoliin ja IBMX (3-isobutüül-1-metüülksantiin), aktiveerivad cAMP-PKA-CREB signaalirada, mis viib melanogeneesi esilekutsumiseni [5]. Mitmed uuringud on näidanud, et rakuvälise reguleeritud kinaaside 1 ja 2 (ERK1/2), mis osalevad onkogeneesi molekulaarses mehhanismis, pidev aktiveerimine soodustab MITF-i fosforüülimist Ser73 juures ja selle järgnevat lagunemist ubikvitiinist sõltuva proteolüüsi kaudu [6,7 ]. Tõepoolest, U0126, selektiivne ERK1 / 2 raja inhibiitor, suurendab tõepoolest MITF-i ekspressiooni ja türosinaasi aktiivsust, mis põhjustab melaniini tootmist [6]. Stabiliseeritud ja aktiveeritud MITF suurendab melanogeensete geenide, nagu türosinaas, türosinaasiga seotud valk 1 (TYRP1) ja türosinaasiga seotud valk 2 (TYRP2) ekspressiooni. Türosiini muundumist 3,4-dihüdroksüfenüülalaniiniks (L-DOPA), mis on melanogeneesi algetapp, katalüüsib türosinaas. Türosinaasiga seotud valgud (TRP-d) katalüüsivad edasisi oksüdatsiooni- ja tautomerisatsioonireaktsioone [8]. Pärast melaniini sünteesi transporditakse küps melaniin epidermise melanotsüütidest basaalkeratinotsüütide tsütoplasmasse, et kaitsta rakke UV-kiirguse eest [2].

Ebanormaalselt suurenenud melanogenees põhjustab mitut tüüpi nahahaigusi, nagu nahavähk, kloasmid ja tedretäpid [4]; seega on kosmeetikatoodetes kasutatavate toimeainetena tuvastatud väikesed molekulid või looduslikud tooted, mis on suunatud kas türosinaasi katalüütilisele aktiivsusele või melanogeneesi signaaliradade regulaatoritele, sealhulgas ERK1/2 või MITF-vahendatud melanogeensete geenide transkriptsioonile. tööstusele. Mitmeid väikeseid molekule, nagu kojiinhape, arbutiin ja niatsiinamiid, kasutatakse nende melanogeense toime tõttu laialdaselt kosmeetikatoodete koostisainetena. Siiski on aruanded näidanud, et kojichape põhjustab oma genotoksilise toime tõttu mitmeid kõrvaltoimeid, sealhulgas tsütotoksilisust, dermatiiti, nahavähki ja hepatotsellulaarset kartsinoomi [9]. Kuigi karulaugust eraldatud arbutiini on kasutatud hüperpigmentatsioonihäirete raviks, on selle kasutamist kosmeetilise koostisainena viimasel ajal mitmete kõrvalmõjude tõttu piiratud [9]. On teatatud, et niatsiinamiidil on melanogeenne toime ja see toime saavutatakse melanosoomide ülekandumise pärssimisega melanotsüütidest ümbritsevatesse keratinotsüütidesse [10]. Seega on seda kosmeetikatööstuses üldiselt kasutatud nahka valgendava ühendina. Et ületada väljakujunenud nahavalgendusainete piiranguid, millel on mitmeid kõrvaltoimeid, on oluline välja töötada looduslikest allikatest saadud ohutud nahka valgendavad koostisosad. Näiteks -tujaplitsiin, linderanoliid B, 4-butüülresortsinool ja plumbagiin on tuvastatud melanogeensete ühenditena nende türosinaasi inhibeeriva toime tõttu [4,11]. Nobiletiinil, withaferiin A-l, sesamoolil ja chaetotsiinil on melanogeensed omadused, moduleerides signaali vaheühendeid melanogeneesi rajal [11].

Zerumbone (ZER) on looduslik toode, mis on eraldatud Zingiberaceae perekonda kuuluvate taimede lenduvatest eeterlikest õlidest, nagu Zingiber zerumbet Smith ja Zingiber officinal Roscoe [12]. Mitmed uuringud on näidanud, et ZER-il on lai valik bioloogilisi toimeid, sealhulgas antimikroobne, antioksüdantne, diabeedivastane, vähivastane, põletikuvastane, allergiavastane ja antiangiogeenne toime [12]. Huvitaval kombel on näidatud, et ZER-il on kaitsev toime ultraviolettkiirguse A (UVA) poolt põhjustatud oksüdatiivsete kahjustuste vastu naha keratinotsüütides, kuna see suudab tuumafaktor-E aktiveerimise kaudu eemaldada reaktiivseid hapniku liike (ROS). }seotud tegur-2 (Nrf2) [1,13]. See viitab sellele, et ZER-i saab kasutada funktsionaalse lisandina nahahoolduskosmeetikas. ZER-i toime melanogeensete omaduste üksikasjalikku mehhanismi tuleb siiski veel uurida.

Käesolevas uuringus uuriti ZER ja Zingiber officinal (ZO) ekstrakti pärssivat toimet -MSH-stimuleeritud melanogeneesile ja nende aluseks olevaid mehhanisme. Siin näitame, et ZER pärsib oluliselt -MSH-indutseeritud melanogeneesi, reguleerides üles ERK1 / 2 fosforüülimist ja pärssides melanogeensete geenide MITF-vahendatud ekspressiooni.

2. Tulemused

2.1. Zerumboon (ZER) pärsib -MSH indutseeritud melanogeneesi hiire B16F10 melanoomi rakkudes

Zerumbooni (ZER) melanogeense toime uurimiseks hindasime algselt selle tsütotoksilisust nii B16F10 kui ka HaCaT rakkudes. ZER-i keemiline struktuur on näidatud joonisel 1A. Täheldati, et ZER kontsentratsioonidel üle 20 uM avaldas tugevat tsütotoksilist toimet, samas kui alla 20 uM juures ei näidanud ZER tsütotoksilisust mõlemas rakuliinis (joonis 1B). Järgmisena uurisime ZER-i inhibeerivat toimet melanotsüüte stimuleeriva hormooni (-MSH) poolt indutseeritud melaniini akumulatsioonile ja sekretsioonile B16F10 rakkudes. Näidati, et ZER pärsib tugevalt -MSH-indutseeritud melaniini rakusisest akumulatsiooni ja selle sekretsiooni kultiveerimissöötmesse (joonis 1C, D). Veelgi enam, leidsime, et ZER nõrgendab melanogeneesi tõhusamalt kui 1 mM arbutiin või 0, 2 mM kojiinhape, mis on nahka valgendava kosmeetika tuntud aktiivsed koostisosad (joonis 1D). Et selgitada, kas ZER on piisav melanogeneesi pärssimiseks inimese rakkudes, kasutasime melaniini tootvaid G361 inimese melanoomirakke. Nagu on näidatud joonisel fig 1E, vähendab ZER oluliselt tüvirakufaktori (SCF) poolt indutseeritud rakuvälise ja intratsellulaarse melaniini sisaldust. Need tulemused kinnitavad ZER-i melanogeenset toimet melanogeensetes hiire B16F10 ja inimese G361 rakkudes.

2.2. Zerumboon pärsib melanogeneesi transkriptsioonifaktori, MITF ja selle sihtgeenide ekspressiooni inimese melanoomi G361 rakkudes 

On teatatud, et endoteliin-1 ja SCF-signaalid mängivad melanogeneesis olulist rolli inimese melanotsüütides ja mitmetes melanoomi alatüüpides [3,14–16]. Selles uuringus leidsime, et ZER pärsib melanogeneesi melanogeensetel stiimulitel, -MSH ja SCF, hiire B16F10 ja inimese G361 melanoomirakkudes (joonis 1).

Seega mõõtsime melanogeneesiga seotud geenide ja valkude ekspressioonitasemete muutusi SCF-i stimuleerimisel inimese G361 melanoomirakkudes. Leidsime, et ZER nõrgendab SCF-i indutseeritud MITF-i ja türosinaasi valgu ekspressiooni vastavalt 2–4 tundi ja 24–48 tundi pärast SCF-i stimuleerimist (joonis 2A). Lisaks supresseeriti ZER-ga töödeldud G361 rakkudes melanogeneesiga seotud geenide, nagu MITF, türosinaas ja türosinaasiga seotud valk 1 (TYRP1) geeniekspressiooni (joonis 2B, C). Need tulemused näitasid melanogeneesiga seotud geenide ekspressiooni tippaega SCF-i stimuleerimisel; maksimaalset MITF-i mRNA induktsiooni täheldati 1–2 tunni jooksul ning türosinaasi ja TYRP1 mRNA tasemed saavutasid maksimumi 24–48 tundi pärast SCF-i stimuleerimist.

2.3. Zerumboon pärsib melanogeensete geenide ja ensüümide ekspressiooni hiire B16F10 rakkudes

Molekulaarse mehhanismi uurimiseks, mille abil ZER melanogeneesi pärsib, mõõdeti melanogeneesi transkriptsioonifaktori MITF ja selle sihtgeenide, nagu türosinaasiga seotud valk 1 (TYRP1), türosinaas ja türosinaasiga seotud valk 2 (TYRP2) geeniekspressiooni. ZER puudumisel või olemasolul. Kuna melanogeneesiga seotud geenide ekspressiooni tippaeg SCF ja -MSH stimuleerimisel on teada vastavalt inimese G361 (joonis 2) ja hiire B16F10 melanoomirakkudele [4], mõõtsime täiendavalt MITF, türosinaasi, TYRP1 ja TYRP2 ekspressiooni. ZER-iga töödeldud hiire B16F10 melanoomirakkudes pärast 2-tunnist või 48-tunnist inkubeerimist -MSH-ga. Joonis 3A näitab, et ZER on piisav -MSH-indutseeritud MITF, TYRP1, TYRP2 ja türosinaasi ekspressiooni nõrgendamiseks B16F10 rakkudes. Samamoodi vähenesid ZER-ravi korral MITF-i, türosinaasi ja TYRP2 valgu ekspressioonitasemed. Proteiini kinaasi A (PKA) poolt vahendatud CREB fosforüülimine on peamine signaalirada, mis suurendab MITF-i transkriptsiooni tasemel pärast -MSH stimulatsiooni [4]. Seega analüüsisime siin, kas CREB-i vähenenud fosforüülimine ZER-i poolt võib vahendada MITF-i pärssimist. Leidsime, et ZER-ravi ei mõjutanud -MSH-indutseeritud CREB-i fosforüülimist, mis viitab sellele, et ZER pärsib -MSH-indutseeritud MITF-i ekspressiooni sõltumatult PKA-CREB signaaliraja teljest (joonis 3B). Kuna türosinaas on kiirust piirav ensüüm, mis reguleerib melaniini sünteesi [2, 4, 11], analüüsisime täiendavalt rakusisese türosinaasi valgu taset ja selle ensümaatilist aktiivsust arbutiini, kojiinhappe ja ZER-ravi korral. Joonis 3C näitab, et ZER vähendab piisavalt -MSH-indutseeritud türosinaasi valgu taset B16F10 rakkudes. Lisaks näitab joonis 3D, et 10 µM ZER pärsib L-DOPA oksüdatsiooni tõhusamalt kui türosinaasi inhibiitorid, arbutiin ja kojhape, mis viitab sellele, et L-DOPA oksüdatsioon dopakinooniks türosinaasi ensümaatilise aktiivsuse kaudu on ZER-ga töödeldud rakkudes alla surutud. . Need tulemused näitavad, et ZER nõrgendab -MSH-vahendatud melanogeneesi, pärssides MITF-i, melanogeneesiga seotud transkriptsioonifaktori ja selle sihtgeenide geeniekspressiooni.

2.4. Zerumboni melanogeenne toime avaldub ERK1/2 fosforüülimise kaudu

On teada, et proteiinkinaas B (AKT) ja ekstratsellulaarsete signaaliga reguleeritud kinaaside (ERK1/2) aktiveerimine kasvufaktorite või melanogeensete stiimulite poolt pärsib melanogeneesi MITF-i ja selle sihtgeenide ekspressiooni vähenemise kaudu [11]. MITF-i fosforüülimine Ser73-s ja Ser409-s vastusena ERK1/2 signaalirajale soodustab selle proteasoomist sõltuvat lagunemist [17,18]. Seetõttu uurisime, kas ZER reguleerib ERK1 / 2 fosforüülimist B16F10 hiire ja G361 inimese melanoomirakkudes. ZER-ravi ajal täheldati ajast ja annusest sõltuval viisil ERK1/2 (p-ERK1/2), kuid mitte kogu ERK1/2 (T-ERK1/2) fosforüülimise suurenemist (joonis 4A, B). Huvitaval kombel täheldati ERK1 / 2 fosforüülimist kiiresti 10–30 minuti ja 1–2 tunni jooksul pärast ZER-ravi hiire B16F10 ja inimese G361 melanoomirakkudes (joonis 4A). Siiski ei täheldatud ZER-ravi ajal AKT ja MEK fosforüülimist, mis viitab sellele, et ZER-indutseeritud ERK1 / 2 fosforüülimine võib MITF-i pärssida (joonis 4B). Kuna ERK1 / 2 fosforüülimine soodustab MITF-i fosforüülimist ja proteasomaalset lagunemist [17,18], uurisime, kas proteasoomi inhibiitor takistab MITF-i redutseerimist ZER-i poolt. MG132 juuresolekul ei täheldatud MITF-i pärssimist ZER-i poolt, mis kinnitab, et ZER vähendab MITF-i ekspressiooni proteasomaalse lagunemise kaudu (joonis 4C). Järgmisena uurisime, kas ZER fosforüülib MITF-i Ser73 juures, mis on ERK1/2 sihtjääk. Fosforüülitud MITF-i tuvastamiseks eksponeeriti rakud -MSH ja MG132. Siin leidsime, et ZER suurendas märkimisväärselt fosforüülitud MITF-i (Ser73) -MSH ja MG132 juuresolekul (joonis 4D). U0126, selektiivne mitogeen-aktiveeritud proteiinkinaasi (MAPK) inhibiitor [19], kaotas ZER-indutseeritud MITF-i fosforüülimise (joonis 4D). Lisaks ei muutnud ZER ja U0126 MG132 juuresolekul MITF-i valgu kogutaset täisrakulüsaatides (WCL). Need tulemused näitavad, et ERK1/2-vahendatud MITF-i (Ser73) fosforüülimine ja proteasoomide lagunemine on MITF-i ZER-vahendatud pärssimise kriitiline mehhanism. Lisaks näitab joonis 4E, et U0126 taastas ZER-ga töödeldud rakkudes märkimisväärselt vähenenud MITF-valgu taseme. Järjekindlalt taastas U0126 vähenenud intratsellulaarse melaniini sisalduse ZER-i poolt ligikaudu 40 protsendini (joonis 4F), mis viitab sellele, et ZER-i melanogeense toime jaoks on vajalik ERK1 / 2 aktiveerimine.

2.5. Zingiber Offificinale (ZO) ekstraktide melanogeenne toime

ZER on fütokemikaal, mis on saadud mitmest Zingiberaceae perekonna taimeliigist, nagu Zingiber zerumbet ja Zingiber officinal [12]. Seega mõõtsime algselt rakkude elujõulisust ZO ekstrakti puudumisel või juuresolekul B16F10 ja HaCaT rakkudes. Joonis 5A näitab, et ZO ekstraktiga töötlemine ei muutnud rakkude elujõulisust. Lisaks analüüsisime Zingiber officinali (ZO) ekstrakti melanogeenset toimet. Kuna ZER vähendas MITF-i ja selle sihtmärk-melanogeensete geenide ekspressiooni aktiveeritud ERK1 / 2 signaaliraja kaudu (joonised 2 ja 3), kontrollisime, kas ZO ekstrakt pärsib -MSH-indutseeritud MITF-i ja selle melanogeensete valkude ekspressiooni B16F10 rakkudes. Sarnaselt ZER-i melanogeensele toimele vähendas ZO ekstrakt annusest sõltuval viisil oluliselt -MSH-indutseeritud MITF-i, türosinaasi ja TYRP2-d (joonis 5B). Huvitaval kombel suurenes ERK1 / 2 fosforüülimine ka ZO ekstraktiga töödeldud rakkudes (joonis 5B). MITF-i ja selle sihtgeenide, nagu türosinaas, TYRP1 ja TYRP2, ekspressioon vähenes oluliselt 5 µg/µL ZO ekstraktiga töötlemisel (joonis 5C). Lisaks vähenes nii ekstratsellulaarse kui ka rakusisese melaniini sisaldus 5 µg/µL ZO ekstraktiga töötlemisel oluliselt kuni ligikaudu 40 protsendini (joonis 5D). Lisaks täheldati türosinaasi aktiivsuse vähenemist rakkudes, mida töödeldi ZO ekstraktiga (joonis 5E). Need tulemused viitavad sellele, et Zingiber officinal (ZO) ekstrakt pärsib melanogeneesi, nõrgendades MITF-i vahendatud melanogeenset geeniekspressiooni.

Lisateabe saamiseks: david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501