Ksantiini oksüdoreduktaasi aktiivsus trombotsüütide vaeses ja rikkas plasmas kui oksüdatiivse stressi indikaator patsientidel, kes vajavad neeruasendusravi

Abstraktne taust: Ksantiini oksüdoreduktaas(XOR) on hüdroksülaasi ensüüm, mis osaleb puriinide metabolismis. XOR aktiivsus võib varieeruda: homodimeervalgu saab muundada kaheks erinevaks isovormiks XD (antioksüdant) ja XO (prooksüdant). Oksüdatiivne stress ja põletik, mis kaasnevadkrooniline neeruhaigus(CKD), dialüüs ja neerusiirdamine põhjustasid trombotsüütide aktivatsiooni. Käesoleva uuringu eesmärk oli välja selgitada rakendatud neeruasendusravi mõju ksantiini oksidoreduktaasile ja selle isovormi aktiivsusele.

Materjalid ja meetodid: uuringurühma kuulus 117 patsienti, kes jagunesid 4 rühma: hemodialüüsi saavad patsiendid - 30, peritoneaaldialüüsi saavad patsiendid - 30, neerusiirdamisega patsiendid - 27 ja konservatiivne ravi {{5} } patsienti. Kontrollrühm koosnes 30 tervest vabatahtlikust. Tulemused: uuritud rühmades leiti olulisi erinevusi XOR aktiivsuses trombotsüütide vaeses plasmas (PPP) (p{8}},001). PPP-s esines seos kõigi oksidoreduktaasi isovormide neeruasendusravi tüüpide vahel (p<0.001 all isoforms) and XD (p=0.008), XO (p<0.001) in platelet-rich plasma (PRP). A relationship was observed between the activity of all oxidoreductase isoforms in PPP and PRP, the type of renal replacement therapy the duration of dialysis, and the age of patients. Thekroonilise neeruhaiguse põhjuskajastus ka erinevustes XD ja XO aktiivsuses PPP-s.

Järeldused: Kroonilise neeruhaigusega patsientidel kasutatava neeruasendusravi tüüp, patsientide vanus, dialüüsi kestus, kroonilise neeruhaiguse põhjused ja progresseerumisstaadium mõjutavad oluliselt XOR-i ja selle isovormide aktiivsust.

Märksõnad: ksantiini oksüdoreduktaas, trombotsüüdid, neeruasendusravi,Krooniline neeruhaigus, Antioksüdantsed ensüümid

KUI KAUA LÄBIB, ET CISTANCHE TÖÖTAB?

Taust

Ksantiini oksidoreduktaas (XOR) on hüdroksülaasi ensüüm, mis osaleb puriinide metabolismis. See katalüüsib hüpoksantiini oksüdeerumist ksantiiniks ja ksantiini kusihappeks (UA). XOR aktiivsus võib varieeruda: homodimeervalku saab muundada kaheks erinevaks isovormiks. Ksantiindehüdrogenaas (XD) ekspresseerub valdavalt tervetes kudedes ja ksantiinoksüdaas (XO) tekib translatsioonijärgse XD modifikatsiooni, oksüdatsioonitsüsteiini jääkide ja piiratud proteolüüsi teel, mängides vigastuste ajal rakkudes ja kudedes domineerivat rolli [1–3 ]. Nimetatud isovormide tegevused vastanduvad üksteisele [4]. XOR toimib NAD+ juuresolekul dehüdrogenaasina ja molekulaarse hapnikuga oksüdaasina. XOR-i võime kiiresti muutuda antioksüdandist oksüdeerijaks erinevat tüüpi koekahjustuste korral on kiire kaasasündinud immuunvastuse oluline element, mis on kasulik näiteks bakteriaalse või seeninfektsiooni korral [5].

Ksantiindehüdrogenaasi (XDO) ja hapniku reaktsiooni vaheühendid võivad reageerida nii NAD+ kui ka O2-ga, kuid neil on suurem afiinsus NAD+ suhtes [6]. Seda vahepealset isovorm ei ole isoleeritud, kuid selle aktiivsuse määramine hõlbustab XD muundumise jälgimist XO-ks [7].

Seerumi XOR aktiivsust erinevate haiguste korral on laialdaselt uuritud. Huvi selle ensüümi vastu on tingitud selle toimimise dualismist: võime toota antioksüdante ja teisest küljest reaktiivsete hapnikuliikide loomine. XOR-i aktiivsuse suurenemine esineb selliste patoloogiliste seisundite korral nagu viirushepatiit, nakkuslik mononukleoos, autoimmuunhaigused, kopsupõletik, skisofreenia ja II tüüpi diabeet. XOR aktiivsuse suurenemist täheldatakse ka neeru- või maksa siirdamise järgselt patsientide seerumis [8]. On näidatud, et XOR-i kodeeriv geen võib olla vastutav neerude küpsemise ja adipogeneesi eest neerudes ning võib takistada epiteelirakkude transformatsiooni mesenhümaalseks koeks [9]. Kuid meie parimate teadmiste kohaselt ei ole avaldatud aruandeid, mis uuriksid XOR aktiivsust trombotsüütide vaeses plasmas (PPP) ja trombotsüütide rikkas plasmas (PRP) neeruasendusravi saavatel patsientidel. XOR-i aktiivsuse tähtsus selles patsientide rühmas on seotud trombotsüütide suurenenud aktivatsiooniga, mis on põhjustatud oksüdatiivsest stressist ja põletikust, mis kaasnevad kroonilise neeruhaigusega (CKD), dialüüsi ja neerusiirdamisega. Lisaks kahjustatakse dialüüsi ja elundisiirdamise ajal kudesid ja veresooni ning trombotsüüdid on esimesed rakud, mis jõuavad koekahjustuse kohale, osaledes aktiivselt põletikulise protsessi algfaasis ja paranemises [10].

PRP ja PPP on erineva trombotsüütide kontsentratsiooniga vereplasma fraktsioonid. PRP ja PPP trombotsüütide sisaldus on vastavalt trombotsüütide/ml ja trombotsüütide/ml. PPP ja PRP saadakse inimese täisvere korduval tsentrifuugimisel ja pesemisel erinevatel tsentrifuugikiirustel [11, 12].

PPP-l kui antikoaguleeritud vere tsentrifuugimise kõrvalsaadusel on trombotsüütide kontsentratsioon madalam kui tavalisel verel. PPP peamised komponendid on fibrinogeen, fibronektiin ja trombiin. PPP bioloogilised toimed osalevad hemostaasis ja koagulatsioonis, toimivad rakkude kinnitusvektorina ning soodustavad fibroblastide ja epiteelirakkude mitoosi [13]. Kuigi PPP ei ole trombotsüütides nii kontsentreeritud kui PRP, on näidatud, et PPP võib säilitada ka rakkude kasvu ja ellujäämist. PPP soodustab haavade paranemisega seotud rakufunktsioone ning kiirendab rakkude migratsiooni ja fibroblastide proliferatsiooni [14, 15]. Trombotsüütiderikkas plasmas on rohkem kontsentreeritud vereliistakuid kui tavalises plasmas (ligikaudu 150–400 × 103 rakku/dl). See on üks levinumaid PRP määratlusi kirjanduses [16]. Praeguseks on piiratud uuringud iseloomustanud XOR-i ja selle isovormi aktiivsust trombotsüütide rikkas või halvas plasmas kroonilise neeruhaigusega patsientidel. Tan et al. näitasid reaktiivsete hapnikuliikide (ROS) poolt kahjustatud rakkudest (kroonilise neeruasendusravi korral) XOR isovormide "lekkimist", mis viis ensüümi taseme tõusu plasmas [17]. See mehhanism seletab XOR-i ja selle isovormide madalamat aktiivsust trombotsüütides võrreldes PPP-ga. Seetõttu pakub PPP ja PRP oksüdoreduktaaside aktiivsus suurt huvi, kuna need võivad aidata avastada igapäevaselt toimuvaid rakuprotsesse, sis. Sellised uuringud võivad kaudselt rõhutada ka oksüdatiivse stressi tõsidust selles patsientide rühmas.

Berry et al. kirjeldavad ka seda, et ksantiini oksidoreduktaas jaotub maksas, peensooles, piimanäärmes ja endoteelirakkudes. Subtsellulaarsed lokaliseerimismeetodid on näidanud ksantiinoksidoreduktaasi olemasolu nii tsütoplasmas kui ka rakumembraanidel. Samuti näitavad need, et plasma ksantiinoksidoreduktaas võib olla tingitud ksantiinoksidoreduktaasi varjutusest rakumembraanidelt või lekkimisest tsütoplasmast. See on üks põhjusi, miks me testime XOR-i aktiivsust PPP-s ja PRP-s, et eristada ensüümi aktiivsust trombotsüütides ja teistes plasmas sisalduvates vererakkudes [18]. Antioksüdantsete ensüümide aktiivsuse põhjal saame ka kindlaks teha, millist tüüpi neeruasendusravi korral on patsiendil väiksem tõenäosus oksüdatiivse stressi tekkeks. XOR-i kahetise olemuse tõttu võib neeruasendusravi tüüpide ja XOR-isovormide aktiivsuse vahelise seose mõistmine olla väga huvitav ja abiks neeruasendusravi tüübi valikul.

materjalid ja meetodid

Eetiline heakskiit ja nõusolek

Szczecinis asuva Pommeri Meditsiiniülikooli bioeetikakomisjon kiitis läbiviidud uuringu heaks (nr KB−0012/36/11). Kõiki osalejaid, sealhulgas kontrollrühma terveid vabatahtlikke, teavitati uuringu eesmärgist ja ulatusest ning andsid nõusoleku proovide annetamiseks ja saadud andmete avaldamiseks.

Õpperühm

Osalejaid oli 147: 30 tervest vabatahtlikust (NK) koosnev kontrollrühm ja 117 kroonilise neeruhaigusega (CKD) patsienti, kes osalesid Szczecinis asuva Pommeri meditsiiniülikooli nefroloogia, transplanetoloogia ja sisehaiguste kliinikus. Patsiendid jagati saadud ravi alusel 4 rühma: 30 patsienti enne ja pärast hemodialüüsi (HD A ja HD B): 30 patsienti said peritoneaaldialüüsi (PD); 27 patsienti enne ja pärast neerusiirdamist (5–7 päeva pärast operatsiooni) (TE, TE A); 30 patsienti said konservatiivset ravi (KT) (CKD staadium 2–5). Sugu, vanus, dialüüsi kestus, kroonilise neeruhaiguse põhjus ja staadium ning kreatiniini kontsentratsioon test- ja kontrollrühmades on toodud tabelites 1 ja 2.

Näidised

Kõigilt uuringus osalejatelt võeti vereproovid (K2EDTA (8 ml), 3,8% trinaatriumtsitraat (9:1; maht/maht) ja seerum (8 ml)). Hemodialüüsitud patsiendi veri võeti arteriovenoossest fistulist; Kõigi teiste osalejate puhul kasutati perifeerset veenipunktsiooni. Proovid võeti hemodialüüsi saavatelt patsientidelt enne (HD A) ja umbes 10 minutit pärast pumba peatamist (HD B). Siirdatud patsiendi verd koguti enne siirdamist (TE) ja 5–7 päeva pärast operatsiooni (TE A). TE rühma värvatud patsiendid ei kuulunud selles uuringus hemodialüüsi või peritoneaaldialüüsi saavate patsientide rühma. Need olid siirdamiseks kvalifitseeritud patsiendid kogu Poolast. Enamikul neerusiirdamisega patsientidest oli eelnev modeanalüüs. K2EDTA ja hüübinud vereproove tsentrifuugiti kiirusel 2600 p/min 10 minutit 20 kraadi juures, et saada vastavalt plasma ja seerum. Trombotsüütiderikka plasma (PRP) ja trombotsüütide vaese plasma (PPP) saamiseks tsentrifuugiti tsitraadiga kogutud verd tingimustes 1100 pööret minutis 10 minutit 20 kraadi juures. Saadud PRP kanti üle uude katsutisse ja tsentrifuugiti kiirusel 6000 p/min 10 minutit 20 kraadi juures: trombotsüütide vaene plasma (PPP) kanti üle eraldi katseklaasi; trombotsüütide pelletit loputati kaks korda ja suspendeeriti Tyroda puhvris (pH 7,4). Plasma, seerum, PPP ja PRP külmutati -80 kraadi juures kuni analüüside tegemiseni. Hemodialüüsi saavatel patsientidel koguti verd enne hepariini manustamist ja pärast dialüüsi, mis kestis keskmiselt 4–5 tundi (hepariini poolväärtusaeg - 4 h), et kõrvaldada hepariini võimalik mõju XOR aktiivsusele.

Ksantiini oksidoreduktaasi aktiivsus trombotsüütide vaeses plasmas ja trombotsüütides

Määramised viidi läbi Perkin Elmer UV/VIS Lambda 40P spektrofotomeetriga. Ekstinktsioonimuutused registreeriti 340 nm (XD) ja 302 nm (XDO, XO) juures 5 minuti jooksul 30 kraadi juures. Ensümaatilist aktiivsust mõõdeti kusihappe ja NADH moodustumisena (A340 ja A302 suurenemine) ning väljendati mU × ml-1 (miljoniühikut milliliitri kohta). Ensümaatiline aktiivsus arvutati, võttes arvesse reaktsiooni esialgseid kiirusi. Kusihappe moodustumist mõõdeti lainepikkusel 302 nm (isovormid XDO ja XO), kuna selle neeldumine on seal endiselt kõrge, samas kui muutused NAD+ kontsentratsioonis ei aita kaasa. Ksantiinoksidoreduktaasi NADH+ H+ isovormide aktiivsuse arvutamiseks kasutati NADH+ H+ ε340=6,22×103 [L∙mol−1 cm−1] ekstinktsioonikoefitsienti: ε302=2.30× 103 [ L∙mol−1 cm−1 ] [7, 19–22].

Tabel 1 Uuringus osalenud hemodialüüsi saavate patsientide (HD), konservatiivselt ravitud peritoneaaldialüüsi (PD), neerusiirdamise (TE) ja kontrollrühma (C) üldomadused (keskmine ± SD)

P * - HD, PD ja CKD rühmade erinevuste statistiline olulisus, kvalitatiivsete muutujate TE ja C täpne Fisheri test; kvantitatiivsete muutujate puhul - ühesuunaline ANOVA ja; P ** - HD, PD ja CKD rühmade erinevuste statistiline olulisus ja TE täpne Fisheri test kvantitatiivsete muutujate kvalitatiivsete muutujate jaoks ühesuunaline ANOVA või; DM - diabeetiline nefropaatia; HA - hüpertensioon; GIK - neeru glomerulaarpõletik; ADPKD - polütsüstiline neeruhaigus, pärilik autosoomne dominantne; NS – statistiliselt olulisi erinevusi pole.

Tabel 2 Hemodialüüsi saavate patsientide (B – enne HD-d, A – pärast), konservatiivselt ravitud peritoneaaldialüüsi (PD) enne ja pärast neerusiirdamist (TE B ja TE A) ning kontrollrühma (NK) üldtunnused. uuring (keskmine ± SD)

P * - HD A, HD B, PD ja CKD rühmade erinevuste statistiline olulisus, kvantitatiivsete muutujate puhul TE ja C - Kruskal Wallise ANOVA, ühesuunaline ANOVA või Studenti t-test P ** - HD A vaheliste erinevuste statistiline olulisus , HD B, PD ja CKD ja TE rühmad Kruskal Wallise ANOVA kvantitatiivsete muutujate või ANOVA ühesuunalise analüüsi jaoks Kt / V - dialüüsi indeks (mahufraktsioon V puhastatud kliirensiga K ajahetkel t) NS statistiliselt olulisi seoseid ei leitud

Statistiline analüüs Jaotuste hindamiseks kasutati KS testi (Kolmogorov-Smirnov), mis mõne muutuja puhul (XD ja XDO isovormide aktiivsus PRP-s) näitas parameetrite mittenormaalset jaotust. Kvantitatiivsete andmete analüüsimiseks kasutati täpseid Fisheri ja Chi-ruut teste. Kasutades Studenti t-testi ja ühemõõtmeliste süsteemide ANOVA analüüsi, hinnati normaaljaotusega muutujate puhul erinevusi seotud (paaritud) ja mitteseotud (paarimata) muutujate vahel. Mittenormaalse jaotusega muutujate puhul viidi läbi Kruskal-Wallise ANOVA analüüs, et hinnata parameetrite erinevusi, samuti Mann-Whitney U mitteparameetriline test paaritute andmete jaoks või Wilcoxoni test paarisandmete jaoks. Uuritud parameetrite vaheliste seoste mitmefaktorilise hindamise määramiseks kasutati lineaarset mitme regressiooni mudelit. Tulemuste statistiline analüüs viidi läbi kasutades Statistica 12 (StatSoft).