lisateabe saamiseks:ali.ma@wecistanche.com

Vaskulaarse tsellulaadi valgu 1 tuvastamine ja kontrollimine immuunsüsteemiga seotud hubgeenina, mis on seotud diabeetilise neeruhaiguse tubulointerstitsiaalse kahjustusega

Yan Jia et al

ABSTRAKTNE

Diabeetiline neeruhaigus(DKD) on peamine põhjuskrooniline neeruhaigus(CKD) ja lõppstaadiumis neeruhaigus (ESRD), kuid patogenees pole täielikult mõistetav. Tubulointerstitsiaalne vigastus mängib DKD arengus ja progresseerumises kriitilist rolli(Diabeetiline neeruhaigus). Käesoleva uuringu eesmärk oli uurida tubulointerstitsiaalse immuunrakkude infiltratsiooni profiili ja paljastada tubulaarsete rakkude vigastuse ja interstitsiaalse põletiku vahelised mehhanismid DKD korral(Diabeetiline neeruhaigus)bioinformaatika strateegiate kasutamine. Esiteks tuvastas xCelli analüüs immuunrakud, millel on DKD-s olulisi muutusi(Diabeetiline neeruhaigus)tubulointerstitium, sealhulgas ülesreguleeritud CD4 pluss T-rakud, Th2-rakud, CD8-pluss T-rakud, M1-makrofaagid, aktiveeritud dendriitrakud (DC-d) ja tavapärased DC-d, samuti allareguleeritud Tregid. Teiseks tuvastati püroptoos kui rakusurma peamine vorm võrreldes muude programmeeritud rakusurma vormidega. Vaskulaarsete rakkude adhesioonivalk 1 (VCAM1) tuvastati kõrgeima järjestusega hub-geenina. Korrelatsioonianalüüs näitas, et VCAM1 oli oluliselt positiivses korrelatsioonis püroptoosi ja infiltreerunud immuunrakkudega tubulointerstitiumis. VCAM1 ülesreguleerimist DKD tubulointerstitiumis kontrolliti täiendavalt Euroopa neerude cDNA panga kohordis ja täheldati, et see korreleerub negatiivselt glomerulaarfiltratsiooni kiirusega (GFR). Meie in vitro uuring kinnitas VCAM1 ekspressiooni suurenemist HK-2 rakkudes diabeetilistes tingimustes ja disulfiraami poolt põhjustatud püroptoosi pärssimine vähendas VCAM1 ekspressiooni, põletikuliste tsütokiinide vabanemist ja fibroosi. Kokkuvõttes tuvastas meie uuring ülesreguleeritud VCAM1 ekspressiooni neerutuubulite rakkudes, mis võivad interakteeruda infiltreerunud immuunrakkudega, soodustades seega fibroosi. FDA poolt heaks kiidetud ravim disulfiraam võib parandada DKD fibroosi(Diabeetiline neeruhaigus)suunates tubulaarse püroptoosi ja VCAM1 ekspressiooni.

MÄRKSÕNAD:DKD; tubulointerstitium; immuunrakud; püroptoos; VCAM1; disulfiraam

Cistanche saab ravidaDiabeetiline neeruhaigus

Klõpsake neeruhaiguse jaoks Cistanche

Sissejuhatus

Diabeetiline neeruhaigus(DKD), üks sagedasemaid diabeedi tüsistusi, on kroonilise neeruhaiguse (CKD) ja lõppstaadiumis neeruhaiguse (ESRD) peamine põhjus paljudes arenenud ja arengumaades [1,2]. Hiina neeruhaiguste võrgustiku (CK NET) DKD raporti kohaselt(Diabeetiline neeruhaigus)moodustab 26,70 protsenti kõigist kroonilise neeruhaiguse juhtudest ja tekitab suure meditsiinilise ja majandusliku koormuse [2]. DKD patogenees on keeruline ja hõlmab paljusid erinevaid teid. DKD patoloogiliste tunnuste ja patogeneesi selgitamine aitab parandada kliinilist juhtimist ja tuvastada uusi ravieesmärke.

Kuigi glomerulaarkahjustus on DKD peamine patoloogiline tunnus(Diabeetiline neeruhaigus)Hiljuti on üha rohkem tõendeid näidanud, et tubulointerstitsiaalne patoloogia [3, 4], nagu tubulaarne atroofia, interstitsiaalne fibroos ja interstitsiaalsed infiltreeruvad immuunrakud, mängivad DKD tekkes ja progresseerumises kriitilist rolli.(Diabeetiline neeruhaigus)[5–7]. Bioinformaatika analüüs on tõhus meetod suurte andmemahtude töötlemiseks ülilühikese aja jooksul ja annab väärtuslikku teavet haiguse kohta. Kuid bioinformaatika uuringud, mis uurivad tubulointerstitsiaalset geeniekspressiooni ja immuunrakkude infiltratsiooni DKD-s, on suhteliselt haruldased.

Uuringu eesmärk oli kirjeldada DKD tunnuseid(Diabeetiline neeruhaigus)tubulointerstitsiaalne immuunrakkude infiltratsioon ja tuvastada mõned peamised immuun- ja põletikulised geenid, et anda uudseid teadmisi DKD patogeneesist ja ravist. Esiteks, DKD tubulointerstitsiaalne mikrokiibi andmestik(Diabeetiline neeruhaigus)laaditi alla andmebaasist Gene Expression Omnibus (GEO). Kasutades xCelli [8], veebipõhist tööriista, mis teostab 64 immuun- ja stromaalse rakutüübi geeniekspressiooniandmete rakutüübi rikastamise analüüsi, uurisime esmalt immuunrakkude infiltratsiooni erinevusi DKD-ga isikute neerukudede vahel.(Diabeetiline neeruhaigus)ja tavalised juhtseadmed. Teiseks skriiniti immuunsüsteemiga seotud diferentsiaalselt ekspresseeritud geenide (DEG-de) loend, mille hulgas identifitseeriti DKD immuunkeskuse geenina kõrgeim geen, vaskulaarse raku adhesioonivalk 1 (VCAM1).(Diabeetiline neeruhaigus). Seejärel saadi GeneCardsist erinevate rakusurma vormidega seotud geenikomplektid ja püroptoosi hinnati rakusurma peamise vormina, kasutades geenikomplekti variatsioonianalüüse (GSVA) ​​ja geenikomplekti rikastamise analüüsi (GSEA). Lisaks näitas korrelatsioonianalüüs, et VCAM1 oli positiivses korrelatsioonis tubulointerstitsiaalse immuunrakkude infiltratsiooni ja püroptoosiga. VCAM1 ülesreguleeritud ekspressiooni DKD tubulointerstitiumis kontrolliti täiendavalt Euroopa neerude cDNA panga (ERCB) kohordis ja täheldati, et see korreleerub negatiivselt neerufunktsiooniga DKD-ga patsientidel. In vitro uuring kinnitas VCAM1 ekspressiooni suurenemist diabeetilistes tingimustes kultiveeritud HK-2 rakkudes ning püroptoosi pärssimine FDA poolt heaks kiidetud ravimi disulfiraami poolt vähendas VCAM1 ekspressiooni, põletikuliste tsütokiinide vabanemist ja fibroosi. Seetõttu võivad tubulaarne püroptoos ja ülesreguleeritud VCAM1 ekspressioon olla DKD immunoteraapia sihtmärgid.

meetodid

Microarray andmed

Inimese geeniekspressiooni andmestik GSE30529 laaditi alla National Center for Biotechnology Information (NCBI) Gene Expression Omnibusist (GEO, andmebaas. GSE30529 (GPL571 [HG U133A_2]) Affymetrix Human Genome U133A 2.0 Array ) koosnes 10 DKD-st(Diabeetiline neeruhaigus)tuubulite proovid ja 12 kontrollproovi

Andmetöötlus

Andmestiku GSE30529 toorandmed laaditi alla ja töödeldi vastavalt Limma ja Oligo paketi abil [9, 10]. Andmetöötlus hõlmas tausta korrigeerimist, normaliseerimist ja avaldise arvutamist. Kui ühe geenisümboliga kaardistati mitu sondi, arvutati sondide keskmine ekspressioonitase ja seda peeti selle geeni geeniekspressioonitasemeks. Sondid, mis ei vastanud geenidele, eemaldati.

Cistanche saab ravidaDiabeetiline neeruhaigus

Immuun- ja stroomarakkude analüüsid

Rakendasime uudset geenisignatuuril põhinevat meetodit xCell [8], et hinnata rakutüübi rikastamise skoori ja määrata infiltreeruvate immuunrakkude profiil DKD-ga patsientide tubulointerstitiumis.(Diabeetiline neeruhaigus). xCell on meetod rakutüübi rikastamise analüüsiks, kasutades ühe proovi geenikomplekti rikastamise analüüsi (ssGSEA), mis arvutab 64 rakutüübi, sealhulgas 34 tüüpi immuunrakkude, 30 tüüpi stroomarakkude ja muude rakkude rikastumisskoorid. See ületab teisi ulatuslikke in silico analüüse (sealhulgas CIBERSORT), hõlmates rohkem tüüpi immuunrakke ja rakendades spillover-kompensatsiooni tehnikat, et vähendada sõltuvust tihedalt seotud rakutüüpide vahel. 34 tüüpi immuunrakke liigitati üheksasse rühma, sealhulgas CD4 pluss T-rakkude alampopulatsioonid, CD8 pluss T-rakkude alampopulatsioonid, gamma delta T-rakud (T δ rakud), NK-rakud, NKT-rakud, B-rakkude alampopulatsioonid, monotsüütide/makrofaagide alampopulatsioonid, dendriitrakkude (DC) alampopulatsioonid ja granulotsüütide alampopulatsioonid.

Geenikomplekti rikastamise analüüsid (GSEA) ja geenikomplekti variatsioonianalüüsid (GSVA)

Kasutades võrdlusgeenide komplektina iseloomulikke geenikomplekte, teostasime DKD vahel geenikomplekti variatsioonianalüüse (GSVA)(Diabeetiline neeruhaigus) and control tissues using the GSVA Bioconductor package [11]. The thresholds were set to enrichment score change > 1.0, p-value < 0.05 and t value >2. Tuvastati nii üles- kui ka allareguleeritud rajad. GSEA viidi läbi GSEA töölauarakendusega [12] ja valetuvastussagedusega (FDR)<0.25 and="" p-value=""><0.05 were="" set="" as="" the="">

Rakusurma ja rikastumisanalüüsi erinevaid vorme esindavate geenikomplektide konstrueerimine

Erinevaid rakusurma vorme esindavad geenikomplektid koostati GeneCardsi andmebaasis (https://www.genecards) otsides märksõnade "püroptoos", "nekroos", "nekroptoos", "apoptoos", "ferroptoos" ja "autofagia" .org/). Valku mittekodeerivad geenid eemaldati. Geenikomplektid on loetletud tabelis S2. Seejärel viidi läbi GSEA töölauarakenduse abil geenikomplekt GSEA, et hinnata rakusurma vormi tubulointerstitiumis. Tegime Pearsoni korrelatsioonianalüüsid, et uurida seost pöördeliste rakusurma radade ja infiltreeruvate immuunrakkude vahel tubulointerstitiumis

DEG-de analüüs ja immuunkeskuse geenide sõelumine

DEG-d DKD-ga patsientide vahel(Diabeetiline neeruhaigus)ja terved kontrollid tuvastati R-tarkvara Limma paketi [13] abil. Reguleeritud P väärtus<0.05 and="" log="" fold="" change="" (fc)="" ≥="" 1="" were="" set="" as="" the="" thresholds.="" a="" list="" of="" 1793="" immune-related="" genes="" was="" down-loaded="" from="" immport="" shared="" data="" (https://www.="" immport.org/shared/genelists),="" and="" shared="" genes="" from="" the="" two="" datasets="" (degs="" and="" immunerelevant="" gene="" list)="" were="" determined="" by="" constructing="" a="" venn="" diagram="" to="" identify="" immune-related="" hub="" genes.="" an="" analysis="" of="" the="" functional="" interactions="" between="" proteins="" might="" provide="" insights="" into="" the="" mechanisms="" of="" dkd="">(Diabeetiline neeruhaigus). Käesolevas uuringus loodi üheksakümne nelja jagatud geeni valgu-valgu interaktsiooni (PPI) võrgud STRING andmebaasi (https://string-db.org/) abil ja visualiseeriti Cytoscape tarkvaraga (versioon 3.7.1, http ://www.cytoscape.org/). Interaktsiooniskoori, mis oli suurem kui 0,4 (keskmine usaldusväärsus), peeti statistiliselt oluliseks. PPI võrgu jaoturi geenide uurimiseks kasutati CytoHubbat, Cytoscape'i pistikprogrammi [14]. Nende hulgas oli VCAM1 kõrgeim geen. Eespool tuvastatud kolmekümne immuunkeskuse geeni rikastamisanalüüsid viidi läbi veebitööriista Metascape [15] abil. Lisaks tuvastati PPI võrgu domineerivad moodulid Cytoscape tarkvara MCODE pistikprogrammi (versioon 1.4.2, http://apps.cytoscape.org/apps/ MCODE) abil.

VCAM1 kontrollimine ja korrelatsioonianalüüs neerufunktsiooniga

VCAM1 diferentsiaalne ekspressioon DKD-ga patsientide tubulointerstitiumis(Diabeetiline neeruhaigus)valideeriti ERCB kohordis (31 tervet kontrolli ja 17 DKD-ga patsienti). Seejärel kasutasime Nephroseq v5 veebiandmebaasi (http://v5.nephroseq.org), integreeritud andmekaeveplatvormi neeruhaiguste geeniekspressiooni andmekogumite jaoks, et kinnitada korrelatsiooni VCAM1 ekspressiooni ja DKD-ga patsientide kliiniliste tunnuste vahel. Pearsoni korrelatsioonianalüüs ERCB-s. p-väärtus<0.05 was="" considered="" statistically="">

VCAM1 immunofluorestsentsvärvimine

Parafiini neerulõigud patsiendilt, kellel on kliiniliselt diagnoositud DKD(Diabeetiline neeruhaigus)värviti VCAM1-ga. Selle kiitis heaks Pekingi ülikooli esimese haigla uurimiseetika komitee (NR 20171280). Mittespetsiifiline seondumine blokeeriti 3-protsendilise BSA-ga pärast fikseerimist ja kuumtöötlust antigeeni otsimiseks. Seejärel inkubeeriti neerulõike VCAM1 vastase primaarse antikehaga (Abcam, ab134047, 1:200) üleöö temperatuuril 4 °C. Cy3-märgistatud sekundaarne antikeha saadi firmast Jackson ImmunoResearch. Normaalse kontrollina kasutati nefrektoomia proovidest kasvajaga külgnevat neerukude. Tüüpilised kujutised jäädvustati Leica DFC 7000 T kaameraga Leica Application Suite V4.7.1 tarkvara kaudu.

Rakukultuur

Inimese neeru 2 (HK{1}}) rakud, inimese neeru proksimaalne tubulaarne epiteeli rakuliin, kultiveeriti DMEM-is (11885084, Gibco, USA), millele oli lisatud 10 protsenti veise loote seerumit (10099141 C, Gibco, USA) ja 1% penitsilliini/streptomütsiini (10378016, Gibco, USA) 37 kraadi juures 5% CO2-ga. HK-2 rakukahjustuse esilekutsumiseks kasutati kõrget glükoosisisaldust (30 mM D-glükoosi, G8644, Sigma) [16] ja TNF-i (40 ng/ml, 300–01A, PeproTech) [17]. in vitro. Disulfiraami (DSL, 0,3 μM [18,19], NSC190940, Selleck), pooride moodustumise inhibiitorit, lisati 3 tundi enne HK-2 rakukahjustuse esilekutsumist.

Western blot

Kogu valk ekstraheeriti HK{{0}} rakkudest RIPA puhvriga (Sigma, R0278) ja valgu kontsentratsioon määrati Pierce BCA Protein Assay komplekti (Thermo Fisher Scientific, 23227) abil. Järgmisena eraldati denatureeritud valgud naatriumdodetsüülsulfaat-polüakrüülamiidi geelelektroforeesiga (SDS-PAGE) ja seejärel kanti elektriliselt polüvinülideendifluoriidmembraanidele (Millipore, IPVH00010). Membraanid blokeeriti 60 minutiks 5% rasvavaba piimaga, mis oli lahustatud Tris-puhverdatud soolalahuses, mis sisaldas 0,1% Tween 20 (TBST). Blotte inkubeeriti öö läbi 4 kraadi juures järgmiste asjakohaste primaarsete antikehadega: GSDMD (Abcam, ab209845, 1:1000), VCAM1 (Abcam, ab134047, 1:2000) ja tubuliin (ZSBio, TA{120}}, :5000). Inkubeeriti HRP-ga konjugeeritud sekundaarse antikeha lahjendusega 1:1000 1 tund toatemperatuuril. Pärast viit pesemist TBST-ga inkubeeriti membraane kemoluminestsentssubstraadiga (Millipore, WBKLS0100) 5 minutit ja pildid jäädvustati Image Quant LAS 4000 Mini süsteemiga (GE Healthcare). Poolkvantitatiivne analüüs viidi läbi ImageJ tarkvara abil (Media Cybernetics, Silver Spring, MD).

RNA eraldamine ja RT-PCR analüüs

Kogu RNA ekstraheeriti HK-2 rakkudest, kasutades RNAsimple Total RNA komplekti (Tiangen, DP419) vastavalt tootja juhistele ja pöördtranskribeeriti cDNA-deks, kasutades FastKing RT komplekti (Tiangen, KR116). Kvantitatiivne PCR viidi läbi StepOne Real-Time PCR süsteemi abil (Applied Biosystems, USA) kaheetapiliste meetoditega. Kasutatud praimerite järjestused on näidatud tabelis S4. Võrdlev geeniekspressioon arvutati eelnevalt kirjeldatud 2-ΔΔCt meetodi abil.

Statistiline analüüs

Statistilisteks analüüsideks kasutati GraphPad Prism 6.{1}} tarkvara ja andmed on esitatud keskmistena ± SEM. Kahe rühma võrdlemiseks kasutati kahepoolset paaritu t-testi. Erinevusi P < 0,05="" tasemel="" peeti="" statistiliselt="">

Cistanche saab ravidaDiabeetiline neeruhaigus

Tulemused

Koguvad tõendid on hiljuti näidanud, et tubulointerstitsiaalne patoloogia mängib DKD arengus ja progresseerumises kriitilist rolli(Diabeetiline neeruhaigus). Uuringu eesmärk oli kirjeldada DKD tunnuseid(Diabeetiline neeruhaigus)tubulointerstitsiaalne immuunrakkude infiltratsioon ja tuvastada mõned peamised immuun- ja põletikulised geenid, et anda uudseid teadmisi DKD patogeneesist ja ravist. Selles uuringus uurisime tubulointerstitsiaalse immuunrakkude infiltratsiooni profiili ja tuvastasime püroptoosi kui DKD programmeeritud rakusurma peamise vormi.(Diabeetiline neeruhaigus)bioinformaatika analüüsi abil. VCAM1 tuvastati kõrgeima positsiooniga immuunsüsteemiga seotud sõlmgeenina ja see oli positiivses korrelatsioonis püroptoosi ja infiltreerunud immuunrakkudega. Lisaks kinnitati, et VCAM1 ekspressioon on diabeetilistes tingimustes kultiveeritud neerutuubulite rakkudes suurenenud. FDA poolt heaks kiidetud ravim disulfiraam inhibeeris neerutuubulite rakkude püroptoosi ja vähendas VCAM1 ekspressiooni, põletikuliste tsütokiinide taset ja fibroosi in vitro.

1. Bioinformaatika analüüsi töövood

Töövoo põhietapid on näidatud joonisel 1. Esmalt hindasime DKD-ga patsientide immuunrakkude infiltratsiooni tubulointerstitsiaalsetes kudedes(Diabeetiline neeruhaigus). Seejärel avastati GSEA ja GSVA abil püroptoos, peamine rakusurma vorm tubulointerstitiumis. Järgmisena sõelusime läbi immuunrakkude infiltratsiooniga tihedalt seotud geenide loendi ja tuvastasime sõlmpunkti geenid. Korrelatsioonianalüüs viidi läbi infiltreerunud immuunrakkude, püroptoosi ja ülemise sõlmpunkti geeni VCAM1 vahel. Lisaks viidi läbi VCAM1 kliiniline valideerimine ja immunovärvimise valideerimine. Lõpuks viisime läbi in vitro uuringu, et kinnitada bioinformaatika analüüsi tulemusi.

2. Immuun- ja stroomarakkude dekonvolutsiooni analüüsid

Kasutasime xCelli, mis genereerib rakutüübi rikastamise skoori, kasutades hulgi geeniekspressiooni andmeid, et määrata kindlaks rakutüübid, mis võivad olla seotud tubulointerstitsiaalse kahjustusega.diabeetiline neeruhaigus. Iga proovi kohta saadi 64 rakutüübi rikastumisskoorid, sealhulgas 34 tüüpi immuunrakke ja 30 tüüpi stromaalseid ja muid rakke (joonis 2 (a)). DKD immuunmaastiku tuvastamiseks illustreeriti 34 immuunrakkude rikastamise skoori soojuskaarti(Diabeetiline neeruhaigus)tubulointerstitium (joonis 2(b)). Võrreldes tavaliste kontrollidega oli suurem osa T-rakkude rikastamise skooridest DKD-ga patsientidel suhteliselt kõrgem(Diabeetiline neeruhaigus), välja arvatud CD4 pluss Tcm, Tregs, Th1 rakud, CD8 pluss naiivsed T-rakud ja NKT rakud. ADC-de ja cDC-de rikastumisskoorid olid DKD-ga patsientidel kõrgemad(Diabeetiline neeruhaigus)kui kontrollidel, samas kui Pro-B-rakkude rikastamise skoorid olid DKD-ga patsientidel madalamad. Enamiku monotsüütide/makrofaagide ja granulotsüütide alamhulkade rikastumisskoorid ei erinenud DKD vahel oluliselt(Diabeetiline neeruhaigus)ja normaalsed kuded, välja arvatud M1 makrofaagid ja neutrofiilid ning eosinofiilid (tabel 1).

Joonis 2. Immuunrakkude infiltratsiooni analüüs xCelliga DKD tubulointerstitiumis(Diabeetiline neeruhaigus). (a) Tubulointerstitiumi 64 rakutüübi rakuskooride võrdlus DKD ja kontroll-neerukoe vahel GSE30529 andmekogumis. (b) DKD immuunmikrokeskkonna rakuline maastik(Diabeetiline neeruhaigus). Soojuskaart kujutab kõigi proovide iga immuunrakutüübi rakutüübi rikastamise skoori. DC, dendriitrakk; Tcm, keskmälu T-rakk; Tem, efektiivne mälu T-rakk; T δ rakk, gamma delta T rakk.

3. Tunnusmärgi geenikomplektide GSVA ja GSEA

DKD bioloogiliste protsesside uurimiseks viisime läbi GSE30529 andmestiku tunnusgeenide komplekti GSVA ja GSEA(Diabeetiline neeruhaigus)tubulointerstitium. Interferoon-alfa vastus, gamma-interferoon ja komplemendi signaalirajad aktiveerusid oluliselt DKD-ga patsientide tubulointerstitsiaalse kahjustuse patogeneesis (joonis 3 (a)) ja kuvatakse GSVA tulemuste kokkuvõte. tabelis S1. Seejärel teostasime kolme geenikomplekti GSEA-d ja leidsime, et need olid andmekogumis positiivselt rikastatud. Normaliseeritud rikastumisskoorid (NES) olid 1,89, 1,89 ja 1,7{{10}}, normaliseeritud p väärtused (NOM p väärtused) 0.000, 0,002 ja 0,019, vastavalt (joonis 3(bd)). Kõik GSEA abil tuvastatud oluliselt rikastatud rajad on näidatud tabelis 2. Need andmed viitavad sellele, et tubulointerstitsiaalne immuunvastus mängib olulist rolli DKD patogeneesis(Diabeetiline neeruhaigus).

4. Rakusurma erinevate vormidega seotud geenikomplektide GSEA ja GSVA

Rakusurm hõlmab püroptoosi, nekroosi, nekroptoosi, apoptoosi, ferroptoosi ja autofagiat, millel on erinevad patofüsioloogilised mehhanismid ja signaalirajad. On teatatud, et programmeeritud rakusurma erinevad vormid on seotud põletikuliste ja immuunvastustega. Koostasime GeneCardsist mitut tüüpi rakusurma geenikomplektid (tabel S2) ja seejärel teostasime nii GSEA kui ka GSVA, et uurida rakusurma osalust tubulointerstitsiaalses põletikus DKD-ga patsientidel.(Diabeetiline neeruhaigus). GSEA näitas, et ainult püroptoosi geenikomplektid olid DKD-ga patsientidel oluliselt rikastatud(Diabeetiline neeruhaigus)võrreldes tavaliste kontrollidega (NES=1.65, FDR q väärtus=0.023, FWER=0.013) (joonis 3(e)). Samal ajal oli püroptoosi GSVA skoor kõigi analüüsitud rakusurma tüüpide hulgas kõrgeim (tabel S3). Selle tulemuse põhjal võib püroptoos mängida rolli tubulointerstitsiaalsete vigastuste patogeneesis DKD-ga patsientidel(Diabeetiline neeruhaigus).

Joonis 3. Geenikomplekti rikastamise analüüsid (GSEA) ja geenikomplekti variatsioonianalüüsid (GSVA). ( a ) 50 tunnuse geenikomplekti GSVA tulemuste barplot. (b)-(d) GSEA tulemused „Hallmark_ interferoon-alpha response“, „Hallmark_ interferoon-gamma response“ ja „Hallmark komplement“. e) püroptoosi GSEA tulemus.

5. Korrelatsioon püroptoosi rikastamise skooride ja immuunrakkude infiltratsiooni vahel

Püroptoosi GSVA rikastamise skoorid korreleeriti immuunrakkude infiltratsiooni osakaaluga, viies läbi Pearsoni korrelatsioonianalüüsi, et hinnata püroptoosi ja immuunrakkude infiltratsiooni vahelist seost. Me täheldasime olulist korrelatsiooni 15 tüüpi immuunrakkude ja püroptoosi vahel (joonis 4), mis viitab tihedale koostoimele immuunrakkude ja püroptoosi vahel.

6. Tuumgeenide avastamine

Neeru torukujuliste rakkude ja interstitsiaalsete immuunrakkude vahelise seose edasiseks uurimiseks viidi läbi diferentsiaalne ekspressioonianalüüs. DKD vahel tuvastati nelisada kaheksa DEG-d(Diabeetiline neeruhaigus)rühm ja kontrollrühm, millest 65 olid allareguleeritud ja 343 ülesreguleeritud (joonis 5). Immuunsüsteemiga seotud DEG-de tuvastamiseks laaditi alla immuunsüsteemiga seotud geenide loend ja kahest andmekogumist (DEG-d ja immuunsüsteemiga seotud geenide loend) saadi Venni diagrammi kaudu üheksakümmend neli keskuse immuungeeni (joonis 6 (a)). Nende üheksakümne nelja sõlmpunkti immuungeeni PPI analüüs näitas 97 sõlme ja 694 interaktsiooni (joonis S1). MCC algoritmi abil arvutatud 30 parimat sõlme tuvastati jaoturigeenidena (joonis 6 (b) ja tabel 3). Seejärel viidi läbi rummu geenide rikastamise analüüs. Allotransplantaadi äratõukereaktsioon, gamma-interferoon, põletikuline reaktsioon, interferoon-alfa vastus, epiteeli-mesenhümaalne üleminek ja komplement olid tunnusanalüüsi kõige rikastatud punktid. "Reumatoidartriit", "tsütokiini retseptori interaktsioon", "Toll-like retseptorite signaalirada", "läkaköha" ja "NF-kappa B signaalirada" olid kõige rikastatud KEGG terminid. "Rakulise vastuse gamma-interferoon", "kemokiini aktiivsus", "leukotsüütide rakkude ja rakkude adhesioon" ja "tsütokiinide tootmise reguleerimine" olid GO terminitest kõige rikastatud (joonis 6 (c)). Lisaks tuvastas MCODE hindamissüsteem kaks klastrit, mille skoor oli suurem või võrdne 5-ga. PTRPC, TRIM22, PSMB8, KNG1 ja CXCL6 olid moodulis 1 (joonis 6(d)) ja CD1C kõrgema sõlmeastmega jaoturisõlmed, EGF, FCER1G, CD3D ja CD48 olid mooduli 2 jaoturisõlmed (joonis 6(e)).

7. Korrelatsioon VCAM1 ekspressiooni ja infiltreeruvate immuunrakkude vahel

Tuvastatud sõlmpunkti geenide hulgas tuvastati kõrgeim geen VCAM1 DKD immuunkeskuse geenina(Diabeetiline neeruhaigus). VCAM1 ekspressioon suurenes DKD-ga patsientidel märkimisväärselt(Diabeetiline neeruhaigus)(Joonis 7 (a)). Korrelatsioonianalüüs näitas, et VCAM1 ekspressioon oli positiivses korrelatsioonis CD4 pluss T-rakkudega (r=0.6877, P=0.0004), CD4 pluss T-mälurakud (r=0.7102, P=0.0002), Th2 rakud (r=0.7358, P < 0,0001),="" cd8="" pluss="" tcm="" (r="" {{18="" }}.6026,="" p="0.0030)," t="" δ="" rakud="" (r="0.5864," p="0.0041)," nk="" rakud="" (r="0.5692," p="0.0057)," makrofaagid="" (r="0.5068," p="0.0161)," m1="" makrofaagid="" (r="0.4441," p="0" .0384),="" adc-d="" (r="0.4814," p="0.0233)" ja="" cdc-d="" (r="0.6562," p="0.0009)," kuid="" korreleerusid="" negatiivselt="" naiivsega="" cd8="" pluss="" t-rakud="" (r="−0,4909," p="0,0204)" ja="" nkt-rakud="" (r="−0,5548," p="0,0074)" (joonis="" 7(b)="">

8. Korrelatsioon VCAM1 ekspressiooni ja püroptoosi vahel

Pearsoni korrelatsioonianalüüs viidi läbi, et uurida, kas VCAM1 ekspressioon on DKD-ga patsientide tubulointerstitiumis ülesreguleeritud.(Diabeetiline neeruhaigus)on seotud püroptoosiga. VCAM1 ekspressioon oli tihedalt seotud püroptoosiga (r=0.6118, P=0.0025) (joonis 7(c)), mis näitab, et püroptoos võib indutseerida VCAM1 ekspressiooni.

9. VCAM1 ekspressiooni kontrollimine, kliiniline tähtsus ja immunofluorestsentsvalideerimine

Tegime DKD-ga patsientide asjakohase analüüsi(Diabeetiline neeruhaigus)ERCB-st, et kinnitada VCAM1 ekspressiooni muutus DKD-s(Diabeetiline neeruhaigus)tubulointerstitium. Järjepidevalt olid VCAM1 mRNA tasemed DKD-ga patsientidel oluliselt kõrgemad(Diabeetiline neeruhaigus)(Joonis 8(a)). VCAM1 ekspressioon oli negatiivses korrelatsioonis glomerulaarfiltratsiooni kiirusega (GFR) (r=−0.5920, P=0.0123) (joonis 8(b)) ja positiivses korrelatsioonis seerumiga kreatiniini tase (r=0.5189, P=0.0328) (joonis 8(c)). Lisaks teostasime VCAM1 immunofluorestsentsvärvimise DKD-ga patsiendi neerukoes(Diabeetiline neeruhaigus)ja leidis, et neerutuubulite VCAM1 ekspressioon oli normaalsete neerudega võrreldes oluliselt ülesreguleeritud (joonis 8 (d)).

10. DSL inhibeeris HG-indutseeritud HK-2 rakkude püroptoosi, VCAM1 ekspressiooni ja põletikku

Me eksponeerisime kultiveeritud HK-2 rakke kõrge glükoosisisaldusega (HG) ja TNF-ga 48 tunniks, et täpsemalt määrata seos tubulaarsete rakkude püroptoosi, VCAM1 ekspressiooni ja tubulointerstitsiaalse immuunvastuse vahel DKD-ga inimestel.(Diabeetiline neeruhaigus). Kuna rakulise püroptoosi tuum on lõhustatud GSDMD poolt indutseeritud membraanipooride moodustumine, tuvastasime Western blot analüüsi abil GSDMD N-terminaalse domeeni (GSDMD-NT) ja VCAM1 tasemed. Nii HG kui ka TNF- kutsusid esile GSDMD-NT taseme olulise tõusu, mis näitab GSDMD-vahendatud püroptoosi esinemist (joonis 9 (a)). VCAM1 ekspressioon suurenes statistiliselt oluliselt HG ja TNF-rühmades (joonis 9(b)). Disulfiraam (DSL) on tõhus GSDMD pooride moodustumise inhibiitor [18]. Eeltöötlus DSL-iga leevendas GSDMD-NT taseme tõusu, mis näitab, et raku püroptoos oli alla surutud. Samal ajal vähenes VCAM1 ekspressioon DSL-ga eeltöödeldud HG- ja TNF-rühmades (joonis 9 (ab)). Järgmisena määrati qPCR abil põletikuliste tsütokiinide profiil. Tulemused näitasid, et HG poolt indutseeritud MCP-1, IL-1 ja IL-18 mRNA ülesreguleeritud tasemed langesid pärast DSL-i eeltöötlust oluliselt. TNF-rühmas langes IL-1 tase DSL-i eeltöödeldud rühmas oluliselt ning MCP-1 ja IL-18 tase oluliselt ei muutunud. Üheski rühmas ei leitud olulisi muutusi IL-6 ja IL-8 mRNA tasemetes. Oluline on see, et TGF- 1 mRNA tase langes ka DSL-i eeltöödeldud rühmades. Seega suurendasid püroptootilised torukujulised rakud VCAM1 ekspressiooni diabeetilistes tingimustes ja püroptoosi tühistav ravi inhibeeris VCAM1 ekspressiooni, põletikku ja fibroosi HK-2 rakkudes.

Cistanche saab ravidaDiabeetiline neeruhaigus

II osa vaatamiseks klõpsake siin

Alates: "Vaskulaarsete rakkude adhesioonivalgu 1 identifitseerimine ja kontrollimine immuunsüsteemiga seotud keskusgeenina, mis on seotud tubulointerstitsiaalse kahjustusega diabeetilise neeruhaiguse korral", Yan Jia et al.

---BIOEHNIKA 2021, VOL. 12, EI. 1, 6655–6673