Kuseteede eksosoomid tuvastavad vankomütsiiniga seotud ägeda neerukahjustuse põletikulisi teid

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Linda Awdishu 1,*, Amy Le 1, Jordan Amato 1, Vidhyut Jani 1, Soma Bal 2, Robert H. Mills 1, Marvic Carrillo-Terrazas 1, David J. Gonzalez 1, Ashita Tolwani 3, Anjali Acharya 4, Jorge Cerda 5, Melanie S. Joy 6,7, Paola Nicoletti 8, Etienne Macedo 2, Sucheta Vaingankar 2, Ravindra Mehta 2, Satish P. Ramachandra Rao 9 ja otseste uurijate nimel †

1 Skaggsi farmaatsia ja farmaatsiateaduste kool, California Ülikool, San Diego, CA 92093, USA;a6le@ucsd.edu (AL); jegilmor@ucsd.edu (JA); vgjani@ucsd.edu (VJ); rhmills@health.ucsd.edu (RHM);mac215@health.ucsd.edu (MC-T.); djgonzalez@ucsd.edu (DJG)

2 Meditsiinikool, California Ülikool, San Diego, CA 92093, USA; sobal@ucsd.edu (SB);emacedo@ucsd.edu (EM); svaingankar@health.ucsd.edu (SV); rmehta@ucsd.edu (RM)

3 School of Medicine, University of Alabama, Birmingham, AL 35233, USA; atolwani@uab.edu

4 Albert Einstein College of Medicine, The Bronx, NY 10461, USA; anjali2526@gmail.com

5 Albany Medical College, Albany, NY 12208, USA; jorge.cerda82@gmail.com

6 Neeruhaiguste ja hüpertensiooni osakond, Skaggs School of Pharmacy and Pharmaceutical, Aurora, CO 80045, USA; MELANIE.JOY@cuanschutz.edu

7 Colorado ülikooli meditsiinikool, Aurora, CO 80045, USA

8 Mount Sinai School of Medicine, New York, NY 10029, USA; paola.nicoletti@mssm.edu

9 Michigani ülikooli meditsiinisüsteemi raku- ja molekulaarmeditsiini osakond, Ann Arbor, MI 48109, USA; satishpr@med.umich.edu

* Kirjavahetus: lawdishu@ucsd.edu; Tel.: pluss 858-534-3919

† Otseuurijate liikmelisus on esitatud tänuavaldustes.

Abstraktne:

Taust:Vankomütsiini kasutatakse tavaliselt grampositiivsete organismide, nagu metitsilliiniresistentne Staphylococcus aureus, esmavaliku ravina. Vankomütsiinist põhjustatud ägeneerudvigastus(V-AKI) on teatatud kuni 43 protsendil patsientidest, eriti neil, kelle sihtkontsentratsioon on suurem. Inimeste vigastuste täpne mehhanism on endiselt raskesti mõistetav, kuna hiljutised tõendid on suunatud proksimaalsete tuubulite rakkude apoptoosile. Selles uuringus uurisime V-AKI-ga patsientide uriini eksosoomide valgusisaldust, et veelgi selgitada vigastusmehhanismide ja võimalike vastuste biomarkereid. Meetodid: Analüüsi kaasati V-AKI-ga patsientide uriiniproovid, kes osalesid DIRECT-uuringus ja sobisid tervete kontrollidega UAB-UCSD O'Brieni keskuse biorepositooriumist. Eksosoomid ekstraheeriti lahusti välistamise põhimõtte ja polüetüleenglükooliga indutseeritud sadestamise abil. Valkude identsus ja kvantifitseerimine määrati märgisevaba vedelikkromatograafia-massispektromeetria (LC/MS) abil. Keskmine seerumi kreatiniini tipp oli 3,7 ± 1,4 mg/dl ja aeg kunineerudvigastusoli 4.0 ± 3.0 päeva. Väljakirjutamisel paranes 90 protsenti patsientidest osaliselt; 33 protsenti paranes täielikult 28. päevaks. Viie V-AKI ja 7 kontrollproovi proteoomianalüüsid näitasid kõigis proovides 2009 valku ja 251 valku, mis olid oluliselt seotud V-AKI-ga (Pi-skoor > 1). Peamised eristavad valgud olid komplement C3, komplement C4, galektiini -3-siduv valk, fibrinogeen, alfa-2 makroglobuliin, immunoglobuliini raske konstantne mu ja serotransferriin.

Järeldus:Kuseteede eksosoomid näitavad põletikuliste valkude ülesreguleerimist pärast nefrotoksilist vigastust V-AKI-s. Patofüsioloogiliste mehhanismide selgitamiseks ja võimalike vigastuste biomarkerite valideerimiseks on nende leidude kinnitamiseks vajalikud edasised uuringud.

Märksõnad:vankomütsiin; AKI; nefrotoksilisus; eksosoomid; põletik; täiendada; immuunrajad

Cistanche herbavõib ravida neerukahjustusi

Chengdu Wecistanche oncistanchetooted neerukahjustuste raviks

1. Sissejuhatus

Vankomütsiin on glükopeptiidantibiootikum, mida kasutatakse metitsilliiniresistentsete Staphylococcus aureus'e infektsioonide raviks kriitilises seisundis patsientidel. Nefrotoksilisus on tõsine kõrvaltoime, mis mõjutab 10–20 protsenti ravitud patsientidest ja on seotud haiglas viibimise pikenemise, 30-päevahaiglasse tagasivõtmise määra ja kõigi põhjuste 30-päevasuremusega [1]. Vankomütsiiniga seotud ägeneerudvigastus(V-AKI) on annusest sõltuv ja algab 4–17-päevase raviga. Kuigi V-AKI-d on pikka aega tunnistatud vankomütsiini peamiseks kõrvaltoimeks, on nefrotoksilisuse mehhanismid endiselt halvasti mõistetavad. Vankomütsiini käivitatud rakuliste ja molekulaarsete vastuste mõistmine on võtmetähtsusega mehhanismide mõistmisel ja strateegiate väljatöötamisel, et minimeerida V AKI riski ja sellega seotud kulusid, maksimeerides samal ajal selle efektiivsust infektsioonide ravis. Neerude toksiline reaktsioon näib olevat põhjustatud vankomütsiini otsesest toimest proksimaalsete tuubulite epiteelile [2]. Siiani on V-AKI uurimiseks hiiremudelites kasutatud standardseid toksikogenoomilisi lähenemisviise, kuid inimuuringud puuduvad [3–5]. Loommudelid näitavad, et vankomütsiini manustamine kutsub esile oksüdatiivse stressi, mis võib kaasa aidata neerukahjustusele [6, 7]. Üheks võimalikuks vigastuse mehhanismiks on ravimi püüdmine proksimaalsetesse tubulaarrakkudesse, kuna orgaaniliste katioonide transporterid (OCT) transpordivad seda läbi basolateraalse membraani ja proksimaalsesse tuubulirakku, kuid aktiivseid väljavoolu transpordimehhanisme pole tuvastatud [6 –8].

Eksosoomid on membraanist pärinevad mikrotsüütilised vesiikulid, mis mängivad võtmerolli rakkudevahelises suhtluses ja valkude/nukleiinhapete kohaletoimetamises ning pakuvad potentsiaali uudsete biomarkerite avastamiseks, mis aitavad kliiniliselt diagnoosida.neerudvigastus[9]. On tehtud ettepanek, et eksosoomidel on suurem spetsiifilisus ja tundlikkus biomarkerite avastamisel, mis on tingitud proovide stabiilsusest, võrreldes transkriptoomiliste ja proteoomiliste lähenemisviisidega, mis kasutavad tavalisi seerumi- ja uriiniproove [9]. Selles uuringus testisime hüpoteesi, et uriini eksosoomivalkude muutus vastuseks V-AKI-le aitab selgitada vigastuste mehhanisme ja tuvastada uudseid biomarkereid patsientide seas, kellel on kinnitatud ravimist põhjustatud neerukahjustus. Selleks kasutasime uimastitest põhjustatud neerukahjustuste konsortsiumi (DIRECT) uuringus osalejaid, mis on rahvusvaheline, mitmekeskuseline kohort kliiniliselt otsustatud ravimitest põhjustatud ägedate juhtumite kohta.neerudvigastusja populatsioonipõhised kontrollid, et uurida farmakogenoomika ennustajaid, kasutades kogu genoomi hõlmavat seost. DIRECT-uuringu üksikasju on kirjeldatud jaotises Meetodid ja meie labori hiljutises väljaandes [10].

2. Tulemused

Analüüsidesse kaasati uriiniproovid 22 isikult, 10 V-AKI juhtumilt ja 12 kontrollilt. Patsientide demograafia oli V-AKI juhtude ja kontrollide vahel sarnane ning need on kokku võetud tabelis 1. Ootuspäraselt oli hüpertensiooni, diabeedi ja südamepuudulikkuse esinemissagedus V-AKI juhtude puhul suurem kui kontrollrühmadel (tabel 1).

Kõik V-AKI juhtumid arendasid AKI 2. staadiumit või kõrgemat, nagu on määratletud neeruhaigust parandavate globaalsete tulemuste (KDIGO) kriteeriumidega (joonis 1) [11]. V-AKI tekkis 4.0 ± 3.0 päeva pärast vankomütsiini alustamist. Seerumi kreatiniini (Scr) muutuste ajaline kulg pärast haiglast lahkumist ja pärast seda on näidatud joonisel 1.

Joonis 1. Seerumi kreatiniinisisalduse muutused V-AKI kursuse ajal. Sellel joonisel on kujutatud seerumi kreatiniinisisalduse muutusi 10 juhul vankomütsiiniga seotud ägeda haiguse ajal.neerudvigastushaiglaravist kuni 90. päevani pärast vigastust. Ajapunktid vastavad Drug-Induced Renal InjuryConsortium (DIRECT) uuringu ajapunktidele. Lühendid: SCr=seerumi kreatiniin, haigla=haiglaravi, predrug=enne ravimiga kokkupuudet, DIRI=ravimist põhjustatud neerukahjustuse määratlus täidetud, DrugDC {{8} } ravimi ärajätmine või annuse vähendamine, Nadir Scr=madalaim seerum pärast V-AKI, haiglaravi{11}} haiglast väljakirjutamist

V-AKI juhtumite algsed riskitegurid olid sepsis (30 protsenti), südamehaigused (30 protsenti), suhkurtõbi (30 protsenti), aneemia (20 protsenti), kokkupuude radiokontrastainetega (10 protsenti), maksahaigus (10 protsenti) ja hüpoalbumineemia (10 protsenti) (joonis 2).

Maksimaalselt olid V-AKI juhtumid saanud vankomütsiini kolme ravimi manustamise episoodi. Vankomütsiini ööpäevased annused jäid vahemikku 1000 kuni 4000 mg. Keskmine (kvartiilne vahemik (IQR)) igas manustamisepisoodis veedetud päevade arv on näidatud joonisel 3. Vankomütsiini keskmine (standardhälve (SD)) minimaalne plasmakontsentratsioon, mis on seotud annustamisepisoodidega 1–3, oli tõusnud 20,6 ± 8,1, vastavalt 29,6 ± 16,3, 38,0 ± 13 mg/L. Siiski ei olnud episoodide kontsentratsioonide erinevus statistiliselt oluline (episood 1 vs. 2 p=0,5, episood 2 vs. 3 p=0,41)

Muud tulemuste andmed on kokku võetud tabelis 2. Arvestades vigastuse tõsidust, vajas 20 protsenti patsientidest neeruasendusravi. Haiglas suremus oli 10 protsenti. Haiglast välja kirjutades ei paranenud 90 protsenti patsientidest V-AKI-st. Kuuel patsiendil oli Scr mõõdetud 28. päeval pärast vigastust ja neljal päeval 90. 28. päevaks oli kahel patsiendil kuuest (33 protsenti) AKD, kuid ühelgi neljast ülejäänud patsiendist ei olnud 90. päevaks AKD-d.Neerbiopsiad viidi läbi 20 protsendil V-AKI juhtudest (tabel 2).

12 proovi, mis kvalifitseerusid analüüsimiseks pärast peptiidide ja nende sugulasspektrite sobitamise filtri paigaldamist, sisaldasid kokku 2009 valku. Neid valke analüüsiti edasi. Esiteks viidi läbi peamiste koordinaatide analüüs (PCoA), et võrrelda iga proovi üldist proteoomi. See analüüs näitas olulist eraldumist (PERMANOVA p-väärtus=0.037) AKI ja kontrollproovide vahel (joonis 4), võttes kokku süsteemse taseme fenotüübi ka eksosoomi valgu tasemel, suurendades seega meie usaldust nende andmekogumite suhtes. . Iga valgu ja V-AKI staatuse vahelise seose tugevus järjestati pi-väärtuse mõõdiku abil, mis ühendab p-väärtuse olulisuse ja kordamise muutusega [12].

Joonis 4. Proteoomi koostis eristab V-AKI patsientide ja kontrollide uriini eksosoome. (A) Prooviproteoomide peamiste koordinaatide analüüs. Prooviproteoomi erinevuste arvutamiseks kasutati Bray-Curtise kauguse mõõdikut ja on näidatud peamiste koordinaatide graafik. AKI proovide (punane) ja kontrollproovide (sinine) vahel täheldati eraldumist piki telge 1 ja 3. (B) Boxplot, mis võtab kokku Bray-Curtise kauguse kontroll- ja AKI proovide vahel. AKI ja kontrollproovide statistilist eraldatust, mis on näidatud punktis (A), testiti dispersioontesti (PERMANOVA) permutatsioonianalüüsi abil. Kontroll- või AKI-proovide ja kontrollproovide kauguste võrdlemisel kuvatakse kastiplokid, mis võtavad kokku tulemused.

Järgmisena andsid V-AKI ja kontrollproovide binaarsed võrdlused 42 valku, mis olid märkimisväärselt seotud AKI fenotüübiga, ja 26 valku, mis olid seotud kontrollfenotüübiga (Pi skoor> 1) (täiendav tabel S1). Vulkaani graafik, mis illustreerib iga valguga seotud olulisust ja voltide muutust, on näidatud joonisel 5A. V-AKI juhtude puhul olid peamised eristavad valgud fibrinogeen, komplement C3, komplement C4, galektiini{10}}siduv valk, alfa-2 makroglobuliin, immunoglobuliini raske konstantne mu ja serotransferriin (joonis 5B). V-AKI patsientidel muudetud valkude kategooriate tuvastamiseks viidi läbi oluliste valkude geenikomplekti rikastamise analüüs ja tulemused on kokku võetud täiendavas tabelis S1. Näidati, et mitmetel AKI-fenotüübiga seotud valkudel on põletikuga seotud ja/või põletikulist fenotüüpi vahendavad funktsioonid. Et testida, kas need valgu muutused võivad olla seotud muutustega tsütokiinide signaaliülekandes, viidi läbi tsütokiinide järeldus, mis näitas tugevat seost AKI-ga seotud valkude ja tsütokiinide IL10, IL6 ja TNF vahel. Need tsütokiinid sisaldasid vastavalt 2,8, 2,3 ja 2{24}} korda rohkem ühendusi AKI-ga seotud valkudega kui kontrolliga seotud valkudega, nagu on kokku võetud joonisel 5C. AKI-ga seotud valkude ja järeldatavate tsütokiinide valk-valk interaktsioonivõrgustikud näitasid peamiselt AKI-ga seotud valkude põletikku soodustavaid ühendusi, nagu on kokku võetud joonisel 5D.

Joonis 5. Valgutaseme seosed V-AKI-ga. (A) Vulkaani graafik, mis näitab iga valgu voltimise muutust ja t-testi olulisust V-AKI staatusele. 10 parimat AKI ja kontrollolekuga seotud valku on näidatud vastavalt sinise ja punasega. Teised seotud valgud, mis põhinevad Pi-skooril > 1, on näidatud kollasena. (B) Iga valgu jaoks arvutati Pi skoor, mis arvestab nii korduvuse kui ka t-testi olulisust, ja kantakse graafikule kõige tugevamate seostega valgud. (C) AKI või kontrollvalkudega seotud toptsütokiinid. Võeti kasutusele võrgupõhine tsütokiinide järeldus ja on näidatud tsütokiinid, millel on tugevaim rikastumisskoor kas AKI või kontrolliga seotud valkude suhtes. Punased tulbad tähistavad AKI-ga seotud valkudega seotud tsütokiine, sinised tulbad tähistavad kontrolliga seotud valkudega seotud tsütokiine. (D) AKI-ga seotud valkude ja AKI-ga rikastatud tuletatud tsütokiinide valgu-valgu interaktsioonivõrgustik. Valgusõlmede välisserv on värvunud sõltuvalt seostest pro- või põletikuvastaste tsütokiinidega. Iga sõlme suurus näitab iga valgu statistilise seose tugevust AKI olekuga.

Cistanche tubulosavõib ravida neerukahjustusi

3. Arutelu

Me teatame uudsest lähenemisviisist uriini eksosoomide kasutamiseks, et teavitada ravimite põhjustatud patofüsioloogilistest mehhanismidestneerudvigastuskasutades vankomütsiini prototüüpse neerutoksilise ainena. Üks selle uuringu tugevusi on DIRECT-uuringu [10] hästi iseloomustatud patsienditaseme andmete lisamine, mis töötati välja mehhanismide, sealhulgas ravimite põhjustatud genoomika selgitamiseks.neerudvigastus. 2. või kõrgema staadiumiga AKI-ga isikud puutusid algtasemel kokku tavapäraste riskiteguritega. Kõigil uuritavatel oli vankomütsiini minimaalne kontsentratsioon plasmas märkimisväärselt tõusnud hoolimata sellest, et nad said igapäevaseid annuseid, mis olid väiksemad kui üldiselt aktsepteeritud nefrotoksilisuse lävi 4 g päevas [13]. Paljud katsealused ei paranenud V-AKI-st pärast haiglast väljakirjutamist täielikult ja neil oli vigastusele järgneva kuu jooksul äge neeruhaigus. Nagu oodatud, said vähesed patsiendid neeru biopsia.

Uriini eksosoomi/rakuvälise vesiikuli (EV) proteoomika näitas, et V-AKI juhtude puhul olid sihitud diskrimineerivad valgud C3 komplement, C4 komplement, galektiini-3-siduv valk, fibrinogeen, alfa-2 makroglobuliin, immunoglobuliini raske konstantne mu ja serotransferriin. Need eksosoomileiud teavitavad V-AKI vigastusmehhanismidest subtsellulaarsel / ülemolekulaarsel tasemel ja võivad potentsiaalselt toimida biomarkeritena ravimist põhjustatud haigusprotsessi järjepidevuses.

Veres ja uriinis esinevatel eksosoomidel on oluline roll rakkudevahelises suhtluses, koagulatsioonis ja jäätmekäitluses [14]. Pärast toksiiniga seotud ägedatneerudvigastus, võivad tubulaarsetest epiteelirakkudest vabanevad eksosoomid edastada vigastussignaale, et värvata makrofaagide infiltratsiooni ja soodustada tubulointerstitsiaalset põletikku [15]. Põhjendasime, et eksosoomide valgusisaldus erineb V-AKI juhtumite ja tervete kontrollide vahel. V-AKI-s oli kakssada viiskümmend üks valku düsreguleeritud ja need näisid olevat peamiselt seotud põletikuliste ja hüübimisradadega. Nende 251 valgu hulgas näitas meie analüüs, et C3 komplement, C4 komplement, galektiini -3- siduv valk, fibrinogeen, alfa-2 makroglobuliin, immunoglobuliini raske konstantne mu ja serotransferriin olid märkimisväärselt seotud V-AKI juhtudega.

Tuginedes meie tulemustele, et C3 ja C4 olid V-AKI kõige eristavamate eksosoomivalkude hulgas, pakume välja, et komplemendi süsteemi aktiveerimine on seotud vankomütsiini poolt indutseeritud neerutuubulite kahjustusega. See on hästi kooskõlas ka avaldatud kirjandusega, et komplemendi süsteemi aktiveerimine mängib rolli immuunkompleksi glomerulonefriidi ja mitmesuguste neeruhaiguste korral [16]. Isheemiast või nefrotoksiiniga kokkupuutest tingitud komplemendi aktiveerimise poolt vahendatud neerukahjustus AKI-s on seotud süsteemsete põletikuliste sündmustega, mis vallandavad ja soodustavad kaugete elundite vigastusi ja patsientide suremust [17]. Isheemia-reperfusiooni (IR) vigastuse mudelites põhjustavad hüpoksia, ATP ammendumine ja mitokondriaalsed kahjustused reperfusioonil vabade hapnikuradikaalide teket [18]. Tsütokiinid, kemokiinid ja komplemendi aktiveerimine võimendavad põletikku, põhjustades ägedat torukujulist vigastust. Lisaks on C3a ja C5a retseptori puudulikkusega hiired kaitstud IR kahjustuste eest [19, 20]. On näidatud, et IR-kahjustus suurendab komplemendi komponentide kohalikku tootmistneerudendoteeli- ja torukujulised rakud [16,21]. Mitmed uuringud loommudelite ja inimestega on tuvastanud komplemendi valguproduktide, nagu C3 ja C4, suurenenud ladestumise piki tubulaarset basaalmembraani pärast traumat või vigastust.neerud. Sellist suurenenud sadestumise taset ei ole leitud märkimisväärselt peritubulaarses või glomerulite piirkonnas, kuid need on tugevalt koondunud tubulaarsesse membraani, nagu on näha inimeste ja loomamudeli neerude biopsiates [17]. Eksosoomid ja EV-d võivad transportida vereringe komplemendi komponente, kui komplemendi aktiveerimine on düsreguleeritud [22, 23]. Mitmed rakukatsed ja kliinilised vaatlused on kinnitanud, et vabanenud EV-d kannavad ja moduleerivad komplemendi valke ning samaaegselt on nende tootmine põletikulises seisundis võimeline mõjutama ka vereringe vesiikulite arvu [23]. See kahe protsessi vastastikune sõltuvus viib järeldusele, et EV-d võivad olla biomarkeri allikad, sihtmärgid ja terapeutilised kohaletoimetamise ained komplemendi ja immunomoduleerivate ühendite suhtes, mis on AKI põletikuliste mehhanismide ulatuses väga olulised. Meie järeldus, et V-AKI proovid võrreldes tervete kontrollidega, näitavad immuunvastuste rolli vankomütsiini otsesele toksilisusele neerutuubulite rakkudes. Lisaks ülaltoodud valgusisaldusele esindavad uriinist pärinevad eksosoomid/EV-d ka potentsiaalseid mitteinvasiivseid biomarkereid kui alternatiive neeru biopsiale, et tuvastada ja teavitada komplemendi süsteemi rollist ravimite poolt indutseeritud protsessis.neerudvigastus.

Kuigi paljud varasemad uuringud (vt konkreetseid viiteid järgmistest lausetest) on keskendunud galektiini-3 (Gal-3) rollileneerudvigastus, on galektiini-3 siduva valgu (Gal-3-bp) kohta vähe andmeid. Gal-3 ekspresseerub neerude kogumistorukestes ja soodustab nefrogeneesi, moduleerib raku-raku ja raku-maatriksi interaktsioone ning reguleerib põletikku [24–26]. Henderson et al. vaatas üle Gal-3 rolli põletikus ja leidis, et Gal-3 on kroonilise põletiku ja koekahjustuse korduva osa põhikomponent. See hõlbustab koekahjustuse "müürimist", lükates edasi vigastuse levikut [27]. Lisaks Nishiyama et al. näitas isheemilise AKI-ga rottidel, et Gal-3 mRNA oli ülesreguleeritud ja järgnev reperfusioon näitas immunohistokeemia Gal{11}} suurenemist nefronisegmentides [25]. Tsuchiyama et al. leidis, et Gal-3 manustamine nefrotoksilise seerumi nefriidiga rottidele vähendas valgu eritumist uriiniga, poolkuu moodustumist ja makrofaagide infiltratsiooni vähenemist glomerulitesse [28]. See viitab sellele, et pärast isheemilist või immuunvahendatud vigastust mängib Gal{16}} regeneratsioonis rolli. Gal-3 sugulaspartnerina on Gal-3-bp põhiroll ja selle vankomütsiini ja teiste ainete põhjustatud nefrotoksiliste vigastuste ülesreguleerimise põhjus tulevastes uuringutes hädavajalikuks keskendumiseks.

Meie uuring näitas ka, et kõik kolm fibrinogeeni alaühikut on reguleerimata, mis on hästi kooskõlas varem avaldatud andmetega. Fibrinogeen on lahustuv dimeerne plasmamolekul ja iga dimeer koosneb kolmest polüpeptiidist: alfa, beeta ja gamma [29]. See mängib võtmerolli hemostaasis ja koagulatsioonis, kuid on osutunud oluliseks ka põletikuliste seisundite reguleerimisel [30–32]. Ajay et al. näitas, et fibrinogeeni kättesaadavus on oluline neerufunktsiooni, põletiku ja ellujäämise jaoks [33]. Lisaks võib fibrinogeen omada adhesiivset toimet neerude epiteelirakkudele, mis võib olla kasulik, aidates ära hoida tubulaarset obstruktsiooni [34]. Fibrinogeen on AKI-s märkimisväärselt suurenenud ja ülesreguleeritud ning seda on varem hinnatud kui potentsiaalset biomarkerit AKI varajaseks tuvastamiseks [29]. Hoffman jt uurisid fibrinogeeni muutust pärast isheemiat/reperfusiooni ja tsisplatiini manustamist rottidel ning mRNA reguleeriti üles 30 minutit pärast kahepoolset IR-kahjustust ja saavutas maksimumi 48–72 tunni pärast, samas kui tsisplatiini manustamisel oli fibrinogeeni mRNA ekspressioon tuvastati 24 tunni pärast [29]. Fibrinogeen uriinis tuvastati juba 3 tundi pärast isheemilist reperfusioonikahjustust ja 24 tundi pärast tsisplatiini manustamist, mis vastab suureleneerudvigastusmolekul 1 (KIM-1) [29].

Cistanche eelised: oskab ravidaneerukahjustus

Ajalooliselt on V-AKI jaoks üldiselt aktsepteeritud kahte erinevat patofüsioloogilist mehhanismi, otseste toksiliste mõjude äge tubulaarnekroos ja äge interstitsiaalne nefriit. Neeru proksimaalne tubulaarne epiteel läbib tsütoskeleti terviklikkuse kaotuse, nekroosi ja apoptoosi ägeda tubulaarse nekroosi korral [35]. Nekrootilised rakud vabastavad molekule, mis reguleerivad kaasasündinud immuunsüsteemi üles, kutsudes esile põletikku ja kiirendades torukujulisi vigastusi [35]. Käesolevas uuringus näitasime V-AKI-ga patsientide uriini EV-des põletikulisi markereid. Lisaks leidsime põletikueelse seose tsütokiinide IL10, IL6 ja TNF ning meie parimate AKI-d eristavate valkude vahel. Kokkuvõttes näitavad need andmed, et V-AKI patofüsioloogia on tubulaarne toksilisus koos põletiku ülesreguleerimisega 24–72 tunni jooksul pärast vigastust.

Meie uuringul on mitmeid piiranguid. Väike valimi suurus 22 patsiendist, kes olid meessoost ja valdavalt kaukaasia päritolu, piirab meie leidude üldistavust teiste soo, rasside ja rahvuste suhtes. Teine meie uuringu piirang oli see, et iga patsiendi uriini eksosoomiproovis oli erinev kogus valku, muutes seega spetsiifiliste valkude mõõtmise keeruliseks, eriti väiksemate absoluutkogustega valkude puhul. Kuigi see ei ole tingimata selle uuringu piirang iseenesest, kuna iga inimese võime pakkida valke oma uriini eksosoomidele on loomulikult varieeruv, piiravad mõnede inimeste valkude väiksemad kogused meie võimet teha täiendavaid analüüse ja teha sisukaid järeldusi, mis on üldistatavad. suuremad populatsioonid. Kolmas piirang on ühe ajapunkti valim, mis piirab meie arusaamist AKI kontiinumi erinevates faasides toimuvatest raku muutustest, nt vahetu vigastuse faas, parandusfaas jne. Järjestikune proovide võtmine aitab paremini mõista eksosoomi sisu aja kulgemist. muutused, ravimite akumuleerumisest põhjustatud oksüdatiivne stress ja immuunradade ülesreguleerimine paranemisel. Praeguses uuringus osales patsiente vastavalt Scr-lävedele. Seerumi kreatiniin on ebatäiuslik neerude funktsionaalne biomarker, kuna Scr tõus jääb sageli vigastusest maha [36]. See piirab Scr tundlikkust ja spetsiifilisust varajaseks tuvastamiseksneerudvigastus[36] ja on tehtud uuringuid, mis tuvastavadneerudvigastusbiomarkerid naguneerud vigastusmolekul 1 (KIM1) ja neutrofiilide želatinaasiga seotud lipokaliini (NGAL) nefrotoksilisuse varaseks avastamiseks [37, 38]. Nagu varem teatatud, on biomarkeritel potentsiaal tuvastada nii ilmseid kui ka subkliinilisi ravimite põhjustatud tasemeid.neerudvigastus[39,40].

4. Materjalid ja meetodid

4.1. Patsiendi valik

Analüüsi kaasati 10 V-AKI-ga patsiendi uriiniproovid, kes osalesid DIRECT-uuringus [10], ja 12 tervet kontroll-uriiniproovi UAB-UCSD O'Brieni keskuse biorepositooriumist. Kontrollisikud sobitati uuritavatega soo, rassi ja vanuse kümnendi järgi ning neil ei olnud vankomütsiini kokkupuudet ega teadaolevatneerudvigastus. DIRECT-uuring on rahvusvaheline uuring, mis uurib ravimite põhjustatud farmakogeneetilisi ennustajaidneerudvigastuskasutades kogu genoomi hõlmavat juhtumite ja populatsioonipõhiste kontrollide assotsiatsiooniuuringut [10]. DIRECT-uuringu kiitis heaks institutsionaalne uurimisnõukogu (IRB #121651) ja kõigilt osalejatelt saadi enne registreerimist kirjalik teadlik nõusolek, mis hõlmas salvestatud proovide kasutamist tulevaste analüüside jaoks. AKI defineeriti DIRECTis kui neerufunktsiooni järsk langus, mida demonstreeris mõni järgmistest kriteeriumidest: (1) seerumi kreatiniini (Scr) absoluutne tõus (suurem või võrdne 0,3 mg/dl või suurem või võrdne 26,4 µmol/ L) (48-h ajaaknas) Scr võrdlusväärtusest, (2) Scr protsentuaalne suurenemine 50% või rohkem (1,5 korda võrdlusväärtusest) seitsme päeva jooksul, (3) uriini vähenemine väljund (dokumenteeritud oliguuria<0.5 ml/kg/h="" for="">6 h) vaatamata piisavale vedelikuga elustamisele, kui see on asjakohane, (4) Scr absoluutne vähenemine, mis on suurem või võrdne 0,3 mg/dL või suurem või võrdne 26,4 µmol/L (48- piires). h ajaaken) võrdlusväärtusest Scr ja (5) Scr suhteline vähenemine 50% või rohkem (1,5 korda võrdlusest) seitsme päeva jooksul. Uuringusse kaasati patsiendid, kellel oli pärast vankomütsiiniga kokkupuudet 2. staadiumi AKI või kõrgem. Kliinilised andmed, sealhulgas demograafia, haiguslugu, füüsilise läbivaatuse leiud, elutähtsad näitajad, vere ja uriini keemilised näitajad, biopsia tulemused ja ravimite annustamise andmed, koguti järgmistel ajahetkedel: (1) haiglaravi, (2) vankomütsiini ravi alustamine, ( 3) vigastuse tipphetk, (4) ravimi kasutamise katkestamine või annuse vähendamine, (5) vigastuse lahendamine, (6) haiglast väljakirjutamine, (7) 28 päeva ja (8) 90 päeva pärast vigastust. Vankomütsiini annustamise episood määratleti annuse või sageduse muutusena. Äge neeruhaigus (AKD) on defineeritud kui 1. staadiumi või kõrgema AKI püsimine 7 päeva või rohkem pärast kokkupuudet [41]. Patsiendid liigitati AKD-ga haiglast väljakirjutamisel, kui AKI 1. või kõrgem staadium püsis ja aeg haiglast lahkumiseni oli pikem kui seitse päeva. Kõigilt osalejatelt võeti uriini- ja täisvereproovid. Kõik V-AKI juhtumid otsustasid põhjusliku seose kindlakstegemiseks kaks sõltumatut nefroloogi (EM, JC, RL). Meetodite täielik kirjeldus on varem avaldatud [10].

4.2. Eksosoomide ettevalmistamine ja proteoomiliste andmete kogumine

Uuringus DIRECT osalejatelt koguti uriini- ja vereproovid ning proovid külmutati enne eksosoomide valmistamist temperatuuril –80 ◦C. Selles analüüsis kasutatud uriiniproovid valiti neerukahjustusele kõige lähemal olevast ajavahemikust 24–72 tundi pärastneerudvigastus. Eksosoomid ekstraheeriti külmutatud AKI uriiniproovidest, kasutades sisemist protokolli, mis töötati välja lahusti välistamise põhimõttel, kasutades polüetüleenglükooli (PEG) indutseeritud sadet, nagu on kirjeldatud Rao et al. eksosomaalsete valkude hiljutine publikatsioon [42] tehti enne geeltrüpsiniseerimist, kasutades NuPAGE bisTris10% akrüülamiidi 12 süvendiga geele, et eraldada 40 µl valku kontroll- ja AKI uriiniproovide eksosoomidest.

Geeliekstraktid ühendati proteolüüsi vältimiseks puhvriga, mis sisaldas 75 mM NaCl (Sigma, St. Louis, MO, USA), 3% naatriumdodetsüülsulfaati (SDS, Fischer, Arnold AFB, Tullahoma, TN, USA), 1 mM NaF (Sigma, St. Louis, MO, USA), 1 mM beeta-glütserofosfaat (Sigma, St. Louis, MO, USA), 1 mM beeta-glütserofosfaat (Sigma, Sigma, St. Louis, MO, USA), 1 mM naatrium ortovanadaat (Sigma, St. Louis, MO, USA), 10 mM naatriumpürofosfaat (Sigma, St. Louis, MO, USA), 1 mM fenüülmetüülsulfonüülfluoriid (PMSF, Sigma) ja 1 × Complete Mini EDTA vaba proteaasi inhibiitori tablett kõik 50 mM HEPES-s (Sigma, St. Louis, MO, USA), pH 8,5. Valkude denatureerimiseks lisati võrdne kogus 8 M uureat 50 mM HEPES-is, pH 8,5, ja sondi ultrahelitöötlus viidi läbi kahe 10- s intervalliga 25% amplituudiga. Valgud redutseeriti, alküüliti ja kustutati ditiotreitooli ja jodoatseetamiidi abil, nagu eelnevalt kirjeldatud [43]. Valgud sadestati, lisades jääl olevatele proovidele trikloroäädikhapet (Sigma, St. Louis, MO, USA) ja granuleerides valke tsentrifuugimise teel temperatuuril 4 °C. Valgugraanuleid pesti kaks korda jääkülma atsetooniga. Valgugraanuleid kuivatati 56 ◦C juures 30 minutit, seejärel resuspendeeriti 1 M uureas 50 mM HEPES-is, seejärel digereeriti öö läbi toatemperatuuril 6 µg LysC-ga (Wako, Richmond, Virginia Ühenduse osariik, USA), millele järgnes {{27} }h seedimine sekveneerimisastmega trüpsiiniga (Promega, Fitchburg, WI, USA) temperatuuril 37 ◦C. Proovid soolast eemaldati C18 Sep-Paksi abil ja valgud kvantifitseeriti [44]. Kokku 1,0 ug valku proovi kohta analüüsiti vedelikkromatograafia-tandem-massispektromeetria (LC-MS [2]) abil, kasutades 85-minutilist vedelikkromatograafilist gradienti seadmel Easy-nLC 1000 (Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA, USA). ühendatud Orbitrap Fusion massispektromeetriga (Thermo Fischer Scientific).

Kromatograafia viidi läbi kodus tõmmatud ja pakitud 30 cm kolonnis, mis oli kolmekordselt täidetud 0,5 cm, 0,5 cm ja 30 cm 5 µm C4, 3 µm C18 ja 1,8 µm C18 ning kuumutatakse temperatuurini 60 ◦C. Esmalt laaditi peptiidid rõhul 500 baari, millele järgnes kromatograafia gradient vahemikus 6 kuni 25 protsenti atsetonitriili 70 minuti jooksul, millele järgnes 5-min gradient kuni 100 protsenti atsetonitriili, mida hoiti 10 minutit. Elektropihustusioniseerimine viidi läbi, rakendades 2000 V pinget läbi roostevabast terasest T-ristmiku, mis ühendas analüütilise kolonni ja Easy-nLC süsteemi. Igale proovile järgnes kaks pesu, alustades gradiendiga 3 kuni 100 protsenti atsetonitriili 15 minuti jooksul ja veel 10 minutit 100 protsenti atsetonitriiliga. Laengumassi (m/z) vahemikku 375–1500 skaneeriti peptiidide jaoks, mille laengu olekud olid vahemikus 2–6. Piikide kvantifitseerimiseks kasutati tsentroideeritud andmeid. Omandamine viidi läbi andmetest sõltuvas positiivsete ioonide režiimis. Proteome Discoverer versioonis 2.1 otsiti töötlemata spektreid Homo sapiens'i UniProti (www.uniprot.org (juurdepääs 5. novembril 2017)) võrdlusandmebaasi abil, kasutades Sequest algoritmi [18] koos pöördandmebaasi lähenemisviisiga, mida kasutati peptiidide ja valede avastamise kontrollimiseks. määrad (FDR) 1 protsendini [17]. In silico trüpsiini seedimine vastavalt otsinguparameetritele koos peptiidi minimaalse pikkusega kuue aminohappega. Otsinguseaded hõlmasid ka metioniinide oksüdatsiooni dünaamilist modifikatsiooni ja tsüsteiinide karbamidometüülimise staatilist modifikatsiooni. Eelkäija massi tolerantsiks määrati 50 ppm ja fragmendi massi taluvuseks 0,6 Da.

Lisaks spektraalsetele vastetele ja valkudele, mis on piiratud<1% fdr,="" peptide="" matches="" were="" further="" screened="" to="" only="" include="" peptide="" spectral="" matches="" (psms)="" identified="" with="" high="" confidence.="" the="" summed="" abundance="" of="" the="" area="" under="" the="" curve="" of="" ms1="" peaks="" associated="" with="" psms="" was="" used="" to="" represent="" protein="" abundances.="" to="" help="" account="" for="" run-to-run="" variation="" in="" lc-ms2="" experiments,="" the="" raw="" protein="" abundances="" were="" next="" normalized="" by="" a="" two-step="" process.="" in="" the="" first="" step,="" protein="" abundances="" were="" divided="" by="" the="" average="" abundance="" of="" a="" given="" protein="" throughout="" the="" experiment="" divided="" by="" the="" median="" of="" the="" protein="" averages="" observed="" throughout="" the="" experiment.="" in="" the="" second="" step,="" the="" adjusted="" protein="" abundances="" were="" divided="" by="" the="" median="" protein="" abundances="" observed="" within="" their="" respective="" samples="" divided="" by="" the="" median="" protein="" abundance="" observed="" in="" the="" entire="" experiment.="" records="" of="" the="" normalization="" and="" analysis="" of="" proteomics="" data="" are="" available="" in="" a="" jupyter="" notebook="" form="" at="">

4.3. Proteoomika andmete analüüs

Proteoomikaandmete analüüsi kirjed laaditi Jupyteri sülearvuti vormingus üles Githubi hoidlasse (juurdepääs 3. märtsil 2021)). Põhikoordinaatide analüüs (PCoA) viidi läbi kasutades Qiime2 (versioon 2019-7) [45]. Aja mitmekesisuse core-metrics käsku kasutati proovide vahekauguste arvutamiseks Bray-Curtise mõõdiku abil ja visualiseerimiseks PCoA abil. Kontroll- ja V-AKI proovide vahekauguste statistiline analüüs viidi läbi paaripõhise PERMANOVA testi abil käsu "qiime diversity beeta-group significance" kaudu. Nende tulemuste boxplot-visualisatsioon loodi merepõhise paketi kaudu (juurdepääs 3. märtsil 2021)). V-AKI juhtumite ja kontrollsubjektide binaarne võrdlus viidi läbi scipy paketi ((kasutus 3. märtsil 2021) abil, kasutades sõltumatut ebavõrdse dispersiooniga t-testi. Iga valgu ja V-AKI staatuse vahelise seose tugevus järjestati pi-väärtuse meetrika abil, mis ühendab p-väärtuse olulisuse ja kordamise muutusega [12]. Nagu eelnevalt kirjeldatud [46], määrati olulisi seoseid pi-väärtusega > |1|. Iga valgu seos V-AKI staatusega kanti vulkaanidiagrammile, et veelgi tõsta esile kõrgeima järjestusega valkude asukohta-10. Geenikomplekti rikastamise analüüs viidi läbi DAVID-serveri abil [47], võrreldes olulisi valke (pi-väärtus > |1|) kõigi andmekogumis tuvastatud valkude taustaga. Seotud funktsionaalsete rikastuste klastrid on esitatud täiendavas tabelis S1.

To test for a relationship between V-AKI-associated proteins and inflflammatory cytokines, a recently developed network-based cytokine inference approach was utilized [48]. Briefly, a list of cytokines (TGFb, TNF, IFN, IL1-40, CXCL1-16, CCL1-27) was submitted alongside signifificantly altered proteins (pi-value > |1|) to the STRING-db tool [49]. Connections between proteins were determined using all interaction sources and a minimum interaction score >0.4. Esmalt filtreeriti tsütokiinid, et neil oleks vähemalt viis ühendust oluliselt muudetud valkudega. Seejärel võrreldi iga tsütokiini ja V-AKI-ga seotud või kontrolliga seotud valkude vaheliste ühenduste osakaalu V-AKI või kontrolliga seotud valkude vaheliste ühenduste koguarvuga. Et võtta arvesse erinevusi igal tsütokiinil teiste valkudega seotud ühenduste arvus, võrreldi seda väärtust järgmisena ühenduste arvuga, mis igal tsütokiinil oli kõigi oluliselt muudetud valkudega. Valitud tsütokiinide rikastumisskoorid joonistati nende seoste kohta kas V-AKI- või kontrolliga seotud valkudega. Lõpuks visualiseeriti V-AKI-ga seotud valkude ja V-AKI-ga seotud valkudega rikastatud ühendustega tsütokiinide täpsustatud otsing nende interaktsioonide jaoks, kasutades Cytoscape'i versiooni 3.5.1 [50]. Valk-valgu interaktsioonivõrgustikud kaunistati iga V-AKI-ga seotud valgu suuruse määramisega vastavalt nende pi-skoori seosele V-AKI staatusega ja värviti, võttes järeldatava seose rikastatud tsütokiinidega, millel on põletikuvastane või põletikuvastane toime.

draakoni ürdid cistanchesaab ravidaneerukahjustus

5. Kokkuvõtted

Püüdsime paremini mõista V-AKI vigastuste mehhanismi kliiniliselt otsustatud juhtumite põhjal ja huvitaval kombel leidsime, et komplement, galektiini -3 siduv valk ja fibrinogeen olid märkimisväärselt seotud V-AKI-ga. Varasemate ja meie uuringute tulemused viitavad komplemendisüsteemi ja põletikuliste radade rollile V-AKI-s. Kuigi vankomütsiini põhjustatud kahjustuste ja sellest tulenevate parandusradade molekulaarsete protsesside kinnitamiseks on vaja suuremaid uuringuid, näitavad tulemused, et uriini eksosoomid võivad anda olulist teavet patofüsioloogiliste mehhanismide kohta ja võivad olla ravimite põhjustatud biomarkeriteks.neerudvigastus.

Autori kaastööd:

Kontseptualiseerimine, LA ja SPR, metoodika, SV, SPR, DJG, RM; tarkvara, DJG, RHM, formaalne analüüs, LA, AL, RHM; uurimine, AL, JA, VJ, SB, MC-T., PN; kirjutamine — algse eelnõu ettevalmistamine, AL, JA, VJ, LA; kirjutamine – läbivaatamine ja toimetamine, RHM, DJG, MC-T., AT, AA, JC, MSJ, EM, RM, PN; järelevalve, SV, SPR; projektihaldus, LA; rahastamise omandamine, LA Kõik autorid on käsikirja avaldatud versiooni läbi lugenud ja sellega nõustunud.

Rahastamine:

Seda uuringut rahastas rahvusvaheline tõsiste kõrvaltoimete konsortsium. MCT-d toetas T32 koolitustoetus DK007202.

Institutsioonilise ülevaatenõukogu avaldus: uuring viidi läbi vastavalt Helsingi deklaratsiooni juhistele ja selle kiitis heaks California ülikooli San Diego inimsubjektide uurimistöö kaitseprogramm (IRB#121651).

Teadliku nõusoleku avaldus: Kõigilt uuringusse kaasatud isikutelt saadi teadlik nõusolek

Tänuavaldused:

Soovime tunnustada DIRECTi uurijate panust: Dinna Cruz, Stuart Goldstein, Patrick Murray, Andrew Davenport, Andrew Lewington, DavidSelewski, Michael Zappitelli, Marlies Ostermann, Li Yang, Bhavna Pandya, Patrick Brophy, DanielaPonce, Julia Steinke, Josee Bouchard, Carlos Irarrazabal, David Askenazi, Nitin Kolhe, RolandoClaure-Del Granado, Nadine Benador, Clare Castledine, Jonathan Barratt, Sunil Bhandari, AlyssaRiley, Ayse Akcan-Arikan, TK Davis, Christopher Farmer, Mark Thomas, Fred Pang , Hansjoerg Rothe.

Huvide konfliktid:

Autorid ei kinnita huvide konflikti.

Autor: "Uriini eksosoomid tuvastavad vankomütsiiniga seotud ägeda neerukahjustuse põletikulisi teid", autor Linda Awdishu

---Int. J. Mol. Sci. 2021, 22, 2784