UMOD-i mutatsioonid kroonilise neeruhaiguse korral Taiwanis

Abstraktne:UMODon esimene tuvastatud ja kõige sagedamini muteerunud geen, mis põhjustab autosomaalset domineerimisttubulointerstitsiaalne neeruhaigus(ADTKD). Hiljutised uuringud on näidanud, et ADTKD-UMODon suhteliselt levinud põhjuskrooniline neeruhaigus(CKD). Kuid ADTKD staatusUMODTaiwanis jääb teadmata. Selles uuringus tuvastasime kolm heterosügootiUMODmissense variandid, c.121T > C (p.Cys41Arg), c.179G > A (p.Gly60Asp) ja c.817G > T (p.Val273Phe), kokku 221 valitud kroonilise neeruhaiguse perekonnas (1,36%). Kahest neist missense variantidest, p.Cys41Arg ja p.Gly60Asp, ei ole varem teatatud. In vitro uuringud näitasid, et mõlemal uromoduliini variandil on defektid rakumembraani liikumisel ja kultiveerimissöötmesse eritumisel. Struktuurimudel ennustas muutunud disulfiidsideme moodustumist mõlemas variandis, kuid ennustati, et ainult p.Gly60Asp põhjustab valgu destabiliseerumist. Meie leiud laiendavad mutatsioonispektrit ja näitavad, et ADTKD-UMODaitas kaasa väikesele, kuid olulisele kroonilise neeruhaiguse põhjustajale Taiwani elanikkonnas.

Märksõnad: uromoduliin;krooniline neeruhaigus(CKD); autosoomne domineeriv tubulointerstitsiaalneneeruhaigus(ADTKD); neerupuudulikkus (KF).

KLIKI SIIA, ET HANKIDA CISTANCHE TAIMseid TOIDULISANDI NEEREHAIGUSTE VAHEST

1. Sissejuhatus

ADTKD on haruldane domineeriv pärilik haigus, mida põhjustavad UMOD [1], MUC1 [2], HNF1B [3], REN [4] ja SEC61A1 [5] heterosügootsed mutatsioonid. UMOD on ADTKD esimene tuvastatud ja kõige levinum põhjus ning seda on põhjalikult uuritud [1, 6]. Kuigi ADTKD on haruldane, on see kolmas kõige levinum monogeenneneeruhaiguspärast ADPKD ja IV tüüpi kollageennefropaatiat, kuid ADTKD-UMOD levimus jääb ebaselgeks ning hiljutised uuringud näitavad, et see moodustab kuni 2% KF-ga patsientidest või 0,3% kõigist kroonilise neeruhaigusega inimestest [7, 8]. UMOD kodeerib uromoduliini ja on inimese uriinis kõige rohkem leiduv valk [9]. Uromoduliin on neeruspetsiifiline valk, mida toodavad Henle ahela jämeda tõusva jäseme epiteelirakud ja distaalse keerdunud tuubuli algusosa [10] ning see moodustub oma tsooni kaudu suure molekulmassiga polümeerina. pellucida domeen [11]. Veelgi enam, uromoduliin on tugevalt glükosüülitud valk, millel on seitse N-glükosüülimiskohta ja C-terminali lõpus lõhustatakse seriinproteaasi hepsiini toimel, enne kui see eritub tubulaarsesse luumenisse [9, 12, 13]. Uromoduliini funktsioon hõlmab kaitset kaltsiumoksalaadi kristalliseerumise eest [14], kaitset uropatogeensete bakterite põhjustatud kuseteede infektsioonide eest [15–18] ja Ca2+-K+ ioonikanali reguleerimist [19]. UMOD-mutatsioonide mõju on hilinenud küpsemine, kinnipidamine endoplasmaatilises retikulumis (ER), vähenenud ekspressioon plasmamembraanil ja vähenenud uriinieritus, mis põhjustab ER-i stressi ja voldimata valguvastust [20–22].

ADTKD-UMOD kliinilised fenotüübid on mittespetsiifilised ja hõlmavad kroonilist neeruhaigust, podagra, hüperurikeemiat, normaalset kuni kerget proteinuuriat, perekonna anamneesi olemasolu või puudumist ning enamus haigestunud isikuid, kes alustavad KF-i vanuses 30 kuni 50 aastat [23]. Neerude histoloogia näitab tubulaarset laienemist või atroofiat, tubulaarset basaalmembraani tühistamist või paksenemist, interstitsiaalset fibroosi ja muteerunud uromoduliini akumuleerumist polümorfsete struktureerimata materjalidena, mis ilmnesid PAS-i värvimisega [24, 25].

USRDS aruande [26] rahvusvaheliste võrdluste põhjal on Taiwanil kroonilise neeruhaiguse ja kroonilise neeruhaiguse esinemissagedus ja levimus kõrgeim. Siiski ei ole ükski uuring keskendunud ADTKD-UMOD seisundile Taiwani kroonilise neeruhaiguse populatsioonis. Selles uuringus uurisime ADTKD-UMOD mutatsioonide levimust valitud CKD kohordis Taiwani ühes tertsiaarses keskuses.

2. Materjalid ja meetodid

2.1. CKD isikud ja DNA ettevalmistamine

Sellesse uuringusse kaasati 221 kroonilise neeruhaigusega perekonda (228 isikut) Kaohsiungi meditsiiniülikooli haigla kroonilise neeruhaiguse hooldusprogrammist. Kaasamise kriteeriumid hõlmasid podagra episoode või hüperurikeemiat, mille eGFR oli alla 90 ml/min/1,73 m2 enne 40. eluaastat. Vereproovid, sugupuu teave ja juurdepääs laboritöö tulemustele saadi isikutelt pärast teadliku nõusoleku andmist. Uuring viidi läbi Helsingi deklaratsiooni järgi ja selle kiitis heaks KMUHi institutsiooniline ülevaatusnõukogu (KMUHIRB-G(II)-20160024). Perifeerse vere proovide DNA ekstraheeriti standardmeetodil.

2.2. Eksoomi sekveneerimine ja bioinformaatika analüüs

Exome raamatukogu loomiseks kasutati Nextera Flex for Enrichment and Exome paneeli (CEX V2, Illumina, San Diego, CA, USA). Suuruse valik, järjestuse püüdmine, rikastamine ja elueerimine viidi läbi vastavalt tootja juhistele. Seejärel mõõdeti DNA raamatukogude suurusjaotust TapeStation 4150 (Agilent, Santa Clara, CA, USA) abil, millele järgnes Illumina NovaSeq 6000 sekveneerimine 150 bp paarisotsa lugemisega. Saadud fastq-andmed joondati inimese võrdlusgenoomi järjestusega (GRCh37 / hg19) ja teostasime nukleotiidivariandi kutsumise, kasutades DRAGEN Bio-IT platvormi (Illumina). VCF-faili analüüsiti CLC Genomics Workbenchis (Qiagen, Germantown, MD, USA). Kindlaksmääratud variandid märgistati patogeenseteks/tõenäoliselt patogeenseteks, ebakindla tähtsusega variandiks (VUS) või healoomuliseks vastavalt American College of Medical Genetics and Genomics (ACMG) klassifikatsioonile, kasutades tarkvara VarSome, ja me võrdlesime ClinVaris eksisteerinud variante. , HGMD ja dbSNP andmebaasid. Tuvastatud patogeensed, tõenäoliselt patogeensed ja VUS-i variandid kinnitati Sangeri sekveneerimisega. Sangeri sekveneerimiseks puhastati PCR tooted kreveti leeliselise fosfataas/eksonukleaas I (78390, USB Products, Affymetrix, Santa Clara, CA, USA) töötlemisega ja seejärel sekveneeriti mõlemast otsast termotsüklilise sekveneerimisega, kasutades BigDye® terminaatorit 3.1 sekveneerimist. komplekt (4337458, Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) pärast analüüsi ABI 3730XL DNA analüsaatoril (Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific). Segregatsioonianalüüs viidi läbi, kui pereliikmete DNA oli saadaval. UMOD-i eksoneid 2, 3, 4 ja 5 skriiniti Sangeri sekveneerimisega 221 kroonilise neeruhaiguse perekonna proovis, välja arvatud perekond DY5, mis sai eksoomide sekveneerimise. UMOD jaoks kasutatakse NCBI viitejärjestust NM_003361.4. Nukleotiidide nummerdamiseks ja mutatsioonide või variantide nimetamiseks kasutati standardset nomenklatuuri, mida soovitas Human Genome Variation Society (http//www.hgvs.org/; juurdepääs 18. juulil 2022).

2.3. Rakukultuur ja mööduv transfektsioon

HEK293 rakke (CRL-1573, ATCC, Manassas, VA, USA) kultiveeriti Kaighni modifikatsioonis Ham's F-12 söötmes (F-12K) (N3520, Merck/Millipore Sigma, Burlington , MA, USA), millele on lisatud 10% kuuminaktiveeritud veise loote seerumit (10437028, Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA), 100 ühikut/ml penitsilliini, 100 µg/ml streptomütsiini (10378016, Scientificrmo Fisher). ) ja 10 ühikut/ml -interferooni (IF002, Merck/Millipore Sigma). Rakke hoiti temperatuuril 37 °C 5% CO2-sisaldusega niisutatud atmosfääris.

HEK293 rakkude mööduv transfektsioon viidi läbi, kasutades Lipofectamine 2000 (11668027, Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Lühidalt, 2,5 µl Lipofectamine 2000 lisati otse 100 µL Optimum söötmesse (31985062, Gibco, Thermo Fisher Scientific) ja inkubeeriti 5 minutit toatemperatuuril. Lipofectamine 2000-Optimum segule lisati kokku 1 µg DNA-d ja inkubeeriti veel 20 minutit. DNA segu lisati inkubeerimise lõpus tilkhaaval seerumivaba söötmega rakukultuuriplaatidele. Rakkude tervisliku seisundi jälgimiseks pärast mööduvat transfektsiooni kasutasime automaatset rakuloendurit LUNA-II™ (Aligned Genetics, Anyang-si, Gyeonggi-do, Korea), et tuvastada trüpaansinist värvivate rakkude elujõulisust teisel ajahetkel ja enamikul juhtudel. transfekteeritud rakud jäid ellu pärast erinevat uromoduliini üleekspressiooni (andmeid pole näidatud).

2.4. Site-Directed Mutagenees

HA-märgistatud metsiktüüpi uromoduliini vektor saadi dr Rampoldilt [27]. Mutatsioonikonstruktsioonid p.Cys41Arg ja p.Gly60Asp loodi QuikChange II Site-Directed Mutagenesis Kit (200523, Agilent) abil vastavalt tootja juhistele. Mutatsioonid kinnitati Sangeri sekveneerimisega

2.5. ELISA ja fraktsioneerimine

Tühi vektor, metsiktüüpi uromoduliin, p.Cys41Arg uromoduliin ja p.Gly60Asp uromoduliini ekspressioonikonstruktid transfekteeriti ajutiselt HEK293 rakkudesse. Pärast mööduvat transfektsiooni koguti sööde 8, 24 ja 32 tunni pärast, seejärel säilitati enne mõõtmist temperatuuril –80 ◦C. Immunoblotimiseks kondenseeriti sööde enne SDS-PAGE elektroforeesi Centri coniga (YM3, ikoon, Merck/Millipore Sigma). ELISA-d kasutati uromoduliini mõõtmiseks söötmes vastavalt tootja juhistele (EHUMOD, Invitrogen, Thermo Fisher Scientific). Lühidalt, sööde ja standardid lahjendati komplektis olevas analüüsilahjendis ja lisati süvenditesse kahes eksemplaris. Pärast 2,5-tunnist inkubeerimist toatemperatuuril pesti süvendeid PBS-ga ja lisati biotinüülitud uromoduliini antikeha. Pärast 1-tunnist inkubeerimist toatemperatuuril pesti süvendid uuesti ja lisati streptavidiini-mädarõika peroksidaasi sekundaarne antikeha. Pärast 45-minutilist inkubeerimist toatemperatuuril pesti süvendid uuesti ja värvus saadi TMB substraadi lahuse lisamisega ja inkubeeriti pimedas toatemperatuuril 30 minutit. Reaktsioon peatati komplektis oleva stopplahuse lisamisega, millele järgnes kohe OD450 ja OD550 lugemine. Kultuurisöötme uromoduliini kontsentratsioon määrati standardkõvera interpoleerimisega.

Pärast kultiveerimissöötme kogumist jätkati kultiveerimisnõu külge kinnitatud rakkude fraktsioneerimist, kasutades subtsellulaarse valgu fraktsioneerimiskomplekti (78840, Thermo Fisher Scientific) vastavalt tootja juhistele. Lühidalt öeldes kogusime võrdses koguses kolme erinevat tüüpi uromoduliini rakulüsaati ja eemaldasime kogu supernatandi, kuni see oli võimalikult kuiv. Lisasime rakupelletile jääkülma tsütoplasma ekstraktsioonipuhvri, mis sisaldas proteaasi inhibiitoreid, inkubeeriti õrnalt segades 10 minutit temperatuuril 4 ◦ C, seejärel tsentrifuugiti 500 × g juures 5 minutit. Eemaldasime supernatandi (tsütoplasmaekstrakti) koheselt puhtasse eeljahutatud katsutisse jääl ja lisasime pelletile proteaasi inhibiitoreid sisaldava jääkülma membraani ekstraktsioonipuhvri. Membraaniosa keeristati 5 sekundit kõrgeimal seadistusel ja inkubeeriti õrnalt segades temperatuuril 4 °C 10 minutit. Pärast 5-minutist tsentrifuugimist 3000 × g juures viisime supernatandi (membraaniekstrakt) jääl olevasse puhtasse eeljahutatud katsutisse. Subtsellulaarset membraani ja tsütoplasmaatilist valku analüüsiti Western blot analüüsiga.

2.6. Immunoblotanalüüs

Valguproovid koguti rakkudest RIPA puhvriga (R0278, Merck/Millipore Sigma) või fraktsioneerimisetapiga. Seejärel määrati valgu kontsentratsioon, kasutades valguanalüüsi värvi (5000006, BIO-RAD, Hercules, CA, USA) ja juurdepääsu võrdsele kogusele valku, seejärel eraldati SDS-PAGE elektroforeesiga. Pärast valkude ülekandmist polüvinülideendifluoriid (PVDF) membraanidele (1620177, BIO-RAD) kasteti PVDF membraan 5% lõssi 1X TBST juures, blokeeriti 1 tund toatemperatuuril ja pesti kolm korda 1X TBST-ga. 5 min. Järgmisena inkubeerisime PVDF-i membraani primaarse antikehaga temperatuuril 4 ◦C üleöö, pesti seda kolm korda 1X TBST-ga 5 minutit ja inkubeerisime sekundaarse antikehaga 1 tund toatemperatuuril. Seda pesti kolm korda 1X TBST-ga 5 minutit pärast sekundaarset antikeha inkubeerimist, seejärel lisasime täiustatud kemoluminestsentsi (ECL) substraadikomplekti (GERPN2134, Merck/Millipore Sigma) ja tuvastasime valgusignaali röntgenprotsessori (MXP{{) abil. 19}}, KODAK, Rochester, NY, USA) röntgenfilmil (Super RX, FUJIFILM, Minato-ku, TKY, JPN). Primaarsed ja sekundaarsed antikehad lahjendati 5% kooritud piimaga 1X TBST-s ja üksikasjalik teave on järgmine: 1:2000 uromoduliini (sc-20631, Santa Cruz, Dallas, TX, USA) ja 1:20 000 küüliku puhul. HRP 2. antikeha (GTX213110-01, GeneTex, Irvine, CA, USA).

2.7. Valgu struktuuri ennustamine

Dünamiiti kasutati metsiktüüpi ja mutantse uromoduliini (http://biosig.unimelb.edu.au/dynamut/; juurdepääs 15. juunil 2022) 3D-struktuuri ennustamiseks, kasutades inimese natiivse uromoduliini (valgu) täispikka struktuuri. Andmepank: 7PFP) [28]. Metsiktüüpi ja mutantse uromoduliini [29–31] disulfiidsideme ennustamiseks kasutati DiANNA-d (http://clavius.bc.edu/~clotelab/DiANNA/; juurdepääs 16. juunil 2022).

2.8. Statistiline analüüs

ImageJ analüüsitarkvara analüüsis ja kvantifitseeris Western blot ribasid. Statistilised analüüsid ja graafikud viidi läbi ja koostati GraphPad Prism8 tarkvara abil (GraphPad Software Incorporation, San Diego, CA, USA) ning esitati keskmine ± SEM. Kahe rühma võrdluseks kasutati paaritu t-testi. Statistilised tulemused märgiti järgmiselt: * p < 0.05; ** p < 0.01; *** p < 0,001. Iga katset korrati vähemalt kolm korda.

Tugiteenus:

E-post:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tel:+86 15292862950

Pood:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop