TUNEL Assay: võimas tööriist neerukahjustuse hindamiseks

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Abstraktne:Terminaalse desoksünukleotidüültransferaasi dUTP hüüdotsa märgistamise (TUNEL) test on pikaajaline test, mida kasutatakse rakusurmaga seotud DNA fragmentatsiooni (3'-OH DNA otsad) tuvastamiseks endonukleaaside poolt. Kuna need ensüümid on eriti aktiivsed neerudes, kasutatakse TUNELi laialdaselt DNA fragmentatsiooni ja rakusurma tuvastamiseks ja kvantifitseerimiseks kultiveeritud rakkudes.neerud rakud ning loomade ja inimeste neerud, mis tulenevadtoksiline või hüpoksiline vigastus. TUNELi varajane iseloomustamine apoptootilise analüüsina on toonud kaasa arvukaid väärtõlgendusi.neerurakk vigastus.Sellegipoolest on TUNEL muutumas üha populaarsemaksneerukahjustushindamine, kuna seda saab universaalselt kasutada kultiveeritud ja koerakkudes ning kõigi rakusurma mehhanismide puhul. Lisaks on see tundlik, täpne, kvantitatiivne, hõlpsasti seostatav teatud rakkude või koeosadega ning seda saab kombineerida immunohistokeemiaga, et võimaldada usaldusväärselt tuvastada rakutüüpe või rakusurma tõenäolisi mehhanisme. Traditsiooniliselt on TUNEL-i analüüs piirdunud TUNEL-signaali olemasolu või puudumisega. Täiendavat teavet rakusurma mehhanismi kohta saab aga TUNELi mustrite analüüsist.

seksuaalse erutuse neeruhäirete ravi cistanche toidulisandi pulbriga

Sissejuhatus DNA on rakus ainus molekul, mida saab parandada, kuid seda ei saa pärast kahjustust täielikult uuesti sünteesida. DNA hävitamine on mitmeastmelise rakusurma protsessi üks viimaseid etappe, mis on potentsiaalselt pöörduv kuni DNA terminaalse fragmenteerumiseni. Seetõttu on viimane pöördumatu rakusurma tavaline atribuut ja mehhaaniline marker [1, 2]. Rakusurmaga seotud DNA fragmentatsiooni "visualiseeritakse" tavaliselt terminaalse desoksünukleotidüültransferaasi dUTP hüüdotsa märgistamise (TUNEL) testi, DNA redeli või komeedi testiga [3]. Impulssvälja elektroforees [4] ja juhusliku oligonukleotiidiga praimitud sünteesi (ROPS) test [5] on veel kaks harva kasutatavat sekundaarset analüüsi. Komeetanalüüsi kasutamine on piiratud ainult in vitro (kultuuritud rakkudega) ja selle kvantifitseerimine on töömahukas [6]. Komeedianalüüside tegemine isoleeritud raku tuumades on võimalik, kuid see on seotud täiendavate segavate teguritega tuumade eraldamise ajal. Teine, DNA redelianalüüs, ei ole kvantitatiivne meetod ja esialgne lootus, et redeli muster vs. määrdumine eristab vastavalt apoptoosi ja nekroosi, lükati ümber, kuna see lähenemisviis osutus ebausaldusväärseks [7]. Kolmest põhimeetodist on TUNEL kõige tundlikum, kõige vähem aeganõudev ja kõige universaalsem. Seda saab kasutada kultiveeritud rakkudes ja kudedes ning kõigi rakusurma mehhanismide jaoks. See on täpne, kvantitatiivne, hõlpsasti seostatav teatud rakkude või koeosadega ning seda saab kombineerida immunohistokeemiaga, et võimaldada usaldusväärselt tuvastada TUNEL-positiivsete signaalidega seotud rakutüüpe või rakukahjustuse mehhanisme [2].

TUNELiga mõõdetavaid DNA katkestusi toodavad peamiselt apoptootilised endonukleaasid. Kõige aktiivsemad endonukleaasid neerudes on desoksüribonukleaas 1 (DNaas I) ja endonukleaas G (EndoG) [8–10]. DNaas I on kõige aktiivsem ja rikkalikum apoptootiline endonukleaas imetajatel [11]. Neerud, süljenäärmed, kõhunääre ja sool on elundid, mis toodavad teadaolevalt suures koguses DNaas I. Süljenäärmete, kõhunäärme ja soolestiku epiteelirakud sekreteerivad DNaas I seedetrakti seedeensüümina. Mõni rakuline DNaas I võitleb peremeesrakkudesse tungiva "võõra" DNA vastu [12]. Sekreteerimata DNaas I kujutab peremeesraku DNA-le varjatud ohtu, kuid tavaliselt ei toimi DNaasid peremeesraku DNA-le enne raku vigastust või surma. Neerudes eritavad DNaas I torukujulised epiteelirakud, arvatavasti viiruste ja bakterite hävitamiseks uriinis. See funktsioon toimub tõenäoliselt koos proteinaasidega, eriti mepriiniga, mis on peamine proteinaas uriinis [13]. Kuigi see kaitseb infektsiooni eest, muudab kõrge aktiivsusega DNaasi olemasolu neerudes selle organi haavatavaks vigastuste suhtes, kus DNaasi aktiivsus on teadaolevalt peremeesrakkudele tsütotoksiline. DNaasid soodustavad toksiliste või hüpoksiliste stiimulite poolt indutseeritud rakusurma ja hävitavad kõik rakusurma tagajärjel vabanenud peremeesneeru DNA rakud.

Neerudon filtreerivad organid, mis eemaldavad kehast mürgiseid ühendeid. Kõrge DNaasi I aktiivsus neerudes muudab neerurakud väga tundlikuks toksiliste ühendite ja nende ainevahetusproduktide põhjustatud vigastuste suhtes. See muudab TUNELi kõige sobivamaks ja rakendatavamaks meetodiks neerukahjustuse mõõtmiseks. Selles ülevaates keskendume TUNELile kui laialdaselt kasutatavale, informatiivsele ja täpsele analüüsile rakusurma ja koekahjustuse mõõtmiseks neerudes. Arutame TUNELi aspekte, kuna see kehtib neeruhaiguste ja -vigastuste puhul, ning tuvastame TUNELi omadused, tehnikad ja alakasutatud funktsioonid, et edendada selle võimsa analüüsi produktiivset ja asjakohast kasutamist neeruhaiguste uurimisel, diagnostikas ja ravis. Samuti käsitleme erinevaid TUNELi kujutise mustreid, mida saab seostada rakusurma mehhanismidega. Käesolevas ülevaates tõstatatud punktid on üldiselt kohaldatavad TUNELi kasutamisel muudes elundites peale neerude.

Märksõnad:TUNEL; rakusurm; neerud; DNAasid; endonukleaasid; kudede vigastus

TUNELi põhimõttedTUNEL-testi töötasid 1992. aastal välja Gorczyca jt. [14] ja Gavrieli jt. [15], kasutades vastavalt fluorokroomi ja avidiin-peroksidaasi märgistust. Sel ajal oli hädasti vaja uusi meetodeid apoptoosi hindamiseks ja TUNEL täitis selle lünga edukalt. Algselt turustati apoptoosi ajal või sellega seotud DNA ahela katkemise analüüsina [14,16], kuid paremate analüüside puudumisel sai TUNEL kiiresti apoptoosi standardanalüüsiks [17,18]. Teadlased tõdesid aga peaaegu kohe, et TUNEL mõõtis valimatult mis tahes DNA fragmentatsiooni, mitte ainult apoptoosiga seotud fragmente [19–21]. Sellegipoolest oli vajadus apoptootiliste testide järele nii suur, et harvaesinevaid teateid TUNELi apoptoosi suhtes mittespetsiifilise kohta üldiselt ignoreeriti. See tõi kaasa tohutul hulgal valepositiivseid teateid apoptoosist neerudes ja teistes organites, kuni 20 protsenti rakkudest olid apoptootilised isegi ilma vigastusteta [22–25], kui muutused 0,01 protsenti võib olla statistiliselt oluline tõend koekahjustuse kohta.

TUNELi test on viimastel aastatel läbi elanud renessansi pärast apoptoosiuuringute buumi lõppu paar aastat tagasi. Meie PubMedi otsing ajakirjade artiklite kohta, mis hõlmasid termineid "neer" ja "TUNEL", andis aastatel 1992–2020 üle 1500 tulemuse. 2019. aastal avaldati 170 artiklit, mis on suurim arv ühe aasta jooksul viimase 28 aasta jooksul (joonis S1) ja mis moodustavad enamiku selle ülevaate jaoks küsitletud artiklitest. Paljudes uuringutes kasutati TUNEL-positiivsust DNA fragmentatsiooniga seotud rakusurma universaalse mõõdikuna muude rakusurma tüüpide korral, välja arvatud apoptoos. Näiteks ferroptoosi, mis on äsja avastatud programmeeritud mitteapoptootilise rakusurma vorm, mille põhjustab hiirtel neeruisheemia-reperfusiooni (IR) käigus tekkiv oksüdatiivne kahjustus, saab tuvastada TUNELiga [26]. On näidatud, et püroptoos, mis on programmeeritud rakusurma põletikuline vorm, mis erineb apoptoosist ja nekroosist, on seotud TUNEL-positiivsete signaalidega [27, 28]. TUNEL-positiivsust täheldati nekroptoosi ajal, mis aitas kaasa neerutuubulite rakkude järkjärgulisele vähenemisele rottidel, kellele tehti vahesumma nefrektoomia [29]. Neerudes ja teistes kudedes on leitud positiivseid TUNEL-signaale nekroosi [30, 31], düsreguleeritud autofagia [32–35], anoikide [36, 37], mitootilise katastroofi [35, 38], autolüüsi [39], pautolüüsi korral. [39], proptoos [40] ja aponeuroosi [30], mis näitavad, et TUNEL on tõeliselt universaalne pöördumatu rakusurma analüüs.

TUNELi test põhineb 3'OH-otste märgistamisel 3'OH-otsa-spetsiifilise DNA ensüümi, terminaalse desoksünukleotidüültransferaasi (TdT) abil (joonis). DNA polümeraasi või Klenowi fragmendi DNA polümeraasi kasutamine TdT asemel võib aidata määrata 3'OH otste tüüpi (lõhed, pilud või üleulatuvad oligod), kuna DNA polümeraasid vajavad malli (vastassuunaline DNA ahel) ja seega ei märgista. rippuvad või väljaulatuvad DNA otsad. Oluline on meeles pidada, et 3ZOH DNA otste tootmine ei ole ainulaadne apoptootiliste (DNA-d lagundavate) endonukleaaside jaoks. 3'OH DNA otsad on peamine "kommunikaatori" signaal, enamiku DNA ensüümide ühine nimetaja. Neid toodavad ja kasutavad peaaegu kõik eukarüootide DNA ensüümid, sealhulgas DNA parandamise (apuriin/apürimidiin, AP) endonukleaasid, eksonukleaasid, DNA polümeraasid, DNA ligaasid, DNA transferaasid ja topoisomeraasid. Lisaks saab 3'Id 3z-suhkru või 3z-valgu konjugaate vastavalt fosfataaside, glükosülaaside ja proteinaaside abil muuta 3'OH-otsteks. Seetõttu on TUNELi edukaks rakendamiseks ja selle tulemuste tõlgendamiseks vajalik täpne arusaam mõõdetavast.

Võrreldes kahe teise peamise DNA fragmentatsiooni mõõtmise meetodiga, DNA redeli ja komeedi analüüsiga, on TUNELi eeliseks see, et see põhineb DNA otste tuvastamisel, mitte fragmentidel (joonis 2). Teoreetiliselt peaks TUNEL olema algse (madala) DNA fragmentatsiooni tuvastamiseks tundlikum ja lineaarsem kui DNA redel või komeet, millel mõlemal on väikeste suure liikuvusega fragmentide kogunemise viivitusperiood. Igal juhul on uuringutel, mis ühendavad TUNELi kas komeediga )41,42] või DNA redeliga [43,44, mõningane eelis, kuna see tuvastab maksimaalse tundlikkusega varajase DNA fragmentatsiooni.

TUNELi rakendusedTUNELi kasutatakse neerukahjustuste tuvastamiseks ja kvantifitseerimiseks kliinilistes ja põhilistes toksikoloogilistes uuringutes mitmesugustes rakendustes, sealhulgas meditsiinilises ravis [45], keskkonnas [46], põllumajanduses [41] ja tööstuses [47] ning loomadel [48]. ] ja toiduteadused [49]. TUNEL on rakendatav kõikidele rakutüüpidele, elunditele ja liikidele, millel on DNA ja DNaasid, mis hõlmavad peaaegu kõiki liike. TUNELit on kasutatud neerukahjustuste tuvastamiseks ja kvantifitseerimiseks paljudel loomadel, sealhulgas sebrakaladel [50], Jaapani riiskaladel [51], kanadel [48], liivahiirtel [52], hiirtel [41], rottidel [45], jänesed [53], minisead [54] ja inimesed [55]. TUNELi oluline eelis on see, et seda saab kasutada nii fikseeritud kultiveeritud rakkudes kui ka fikseeritud kudedes. See tagab metoodilise järjepidevuse in vitro ja in vivo tulemuste võrdlemiseks uuringutes, mille käigus saab mehhanisme uurida kultiveeritud neerurakkudes, samas kui in vivo mõjusid hinnatakse loomade neerudes. Kasutada võib ka kõike, mis jääb tervete rakkude ja kudede vahele, sealhulgas kultiveeritud rakusferoide [56] ja ex vivo neerulõike [57, 58].

TUNELi intensiivsus signaali tugevuse või TUNEL-positiivsete rakkude arvu osas võib olenevalt DNaaside aktiivsusest liikide lõikes varieeruda. Meie kogemuse kohaselt on roti neerul aktiivsem DNaas I kui hiire neerul ja TUNEL-positiivne signaali tugevus korreleerub sellega. Kui neeru võrrelda teiste organitega, on selle TUNEL-positiivne signaal väga intensiivne ja sarnane teiste kõrge DNaas I aktiivsusega organitega, nagu sooled ja süljenäärmed. Spektri teises otsas täheldatakse madalaimat TUNEL-positiivset signaali tugevust aju- ja kasvaja-/vähirakkudes, kus DNaasi I ekspressioon on kõige tõenäolisemalt inaktiveeritud alternatiivse splaissimisega kodeerivas piirkonnas [59]. TUNEL-positiivset signaali täheldatakse kõigis neerurakkudes. Keskmiselt on torukujuline epiteel kahjustatud sagedamini kui glomerulid, eriti ägedate vigastuste korral (joonis 3A). See korreleerub hästi seda tüüpi rakkudes valitseva DNaas I aktiivsusega. Otsustades meie katsetes täheldatud soo- ja vanuseerinevuste põhjal, on DNaas I isasloomadel rikkalikum ja aktiivsem kui emastel ja keskealistel loomadel võrreldes vanade või vastsündinud loomadega. Siiski ei ilmne TUNEL-positiivsuses selget erinevust seoses soo või vanusega, tõenäoliselt seetõttu, et see on silmapaistev või domineerivad muud tegurid. Mõnes neerumudelis (nagu isheemia-reperfusioon) indutseeritakse DNaas I [9]; samas kui teistes see ei ole ja võib isegi olla alla surutud (näiteks tsisplatiini toksilisuse korral) [10]. On näidatud, et endonukleaaside aktiveerimine, kui see on olemas, toimub esimese 24 tunni jooksul pärast neerukahjustust [9, 60, 61]. Seetõttu ei olnud üllatav, et vähemalt pooli TUNELi rakendustest neeruuuringutes selles ülevaates kasutati ägeda neerukahjustuse (AKI) jaoks, kuna AKI hindamine toimub sageli 24–72 tunni jooksul pärast vigastust, kui endonukleaasid on kõige aktiivsemad. . AKI uuringute loetelu on pikk ja sisaldab toksilisi, septilisi, siirdamis- ja hüpoksilisi vigastusi. Selles töös uurisime nendes uuringutes mõjutatud mudeleid, kokkupuutetüüpe, ravimeetodeid, hindamise ajakavasid ja rakutüüpe. Uuritud uuringud hõlmasid neerukahjustuse ja kroonilise neeruhaiguse ägedaid ja segatüüpi ägedaid ja kroonilisi.

See, kas TUNEL-positiivse signaaliga neerukahjustust täheldatakse tuubulites või glomerulites, sõltub kahjustava aine või haiguse tüübist. Näiteks kirjeldati inimestel luupuse nefriiti ja nikli nanoosakeste kahjustusi kui rangelt glomerulaarseid TUNEL-positiivseid signaale [62, 63]. Teisest küljest tekitasid rottidel isheemia-reperfusioon ja streptosototsiinist põhjustatud diabeetiline nefropaatia TUNEL-positiivseid rakke ainult tuubulites [64, 65]. Proksimaalsed tuubulid, Henle silmus, distaalsed tuubulid ja kollektiivsed kanalid on isheemia-reperfusiooni mudelites sageli TUNEL-positiivsed. TUNEL-positiivseid rakke nii glomerulites kui ka tuubulites kirjeldati rottidel, kes puutusid kokku selliste ravimitega nagu tsüklosporiin A [66] ja doksorubitsiin [67] või tarbekaupadega, nagu tsinkoksiidi nanoosakesed [68], ning suhkurtõve rotimudelis [68]. 69]. Septilise šoki põhjustatud AKI inimestel seostati ka nii glomerulaarsete kui ka tubulaarsete TUNEL-positiivsete rakkudega [70]. kägistatud suletud ahelaga peensoole obstruktsioon põhjustas TUNEL-positiivsuse neerus 3 tunni jooksul [87].

AKI võib tekkida pärast siirdamist ja hüpoksilisi vigastusi. Allotransplantaadi äratõukereaktsioon inimestel on tavaliselt seotud TUNEL-positiivsete rakkude arvu suurenemisega [88, 89]. Pärast külma isheemiat täheldati TUNEL-positiivseid rakke tavaliselt 2–24 tunni jooksul reperfusiooni ajal [90] või kitsamalt 14–17 tunni jooksul pärast isheemiat [91] ja mõnikord täheldatakse meid ikka veel 7 päeva pärast. siirdamise äratõukereaktsioon [92]. Samamoodi täheldati isheemia-reperfusioonimudelites TUNEL-positiivseid rakke kõige sagedamini 24 tundi pärast reperfusiooni [44, 93, 94] või vahemikus 4 [95, 96] kuni 72 tundi [97]. Nii siirdamise kui ka isheemilise AKI uuringutes lokaliseeriti TUNEL-positiivsed rakud distaalsetes ja proksimaalsetes tubulaarsetes epiteelirakkudes [44,93]. Hiirelneerudpärast isheemia-reperfusioonikahjustust kirjeldati TUNEL-positiivseid rakke koondunud kortikomedullaarsesse ristmikusse, mis on isheemilise kahjustuse tavaline sihtmärk [98].

Inimese siirdamisel täheldati segatüüpi ägedat ja kroonilist vigastust, mille puhul toksiline kokkupuude, haigusseisundid ja/või hinnangud olid samas uuringus nii ägedad (st tunnid, päevad) kui ka kroonilised (st nädalad, kuud, aastad). äratõukereaktsioon (biopsia 1 nädal kuni 3 aastat pärast siirdamist) [88], sigade hepatiit E viirusinfektsioon (7 ja 14 päeva pärast inokuleerimist) [52], CO2 pneumoperitoneumi põhjustatud stress hüdronefrootilise haiguse korralneerud(2-nädalane hüdronefroos, 2 päeva pärast pneumoperitoneumi) [53], madu mürgist põhjustatud mesangiaalne proliferatiivne glomerulonefriit (1–14 päeva pärast süstimist) [99], ühepoolne kusejuha obstruktsioon (1–14-päevane obstruktsioon) [100], uranüülatsetaadiga kokkupuude (1–28-päevane kokkupuude) [101], aristokoolhappe nefropaatia (5 ja 30-päevane kokkupuude) [102] ja vastsündinute hüperoksia (testitud 1–60 sünnitusjärgset päeva, hüperoksiaga kokku puutunud 14. päeva) [103]. Neliteist päeva pärast mõju on seda tüüpi puhul väga levinud hindamisaegneerukahjustused[52,53,99,101,103]. Enamikul juhtudel paiknesid TUNEL-positiivsed rakud tuubulites ja kollektiivsetes kanalites. Ainsaks erandiks oli maomürgi toksilisus, mis kahjustas peamiselt glomeruleid [99].

Kroonilineneerudhaigus (CKD), mida määratletakse kui esinemistneerudkahjustus või vähenenud glomerulaarfiltratsiooni kiirus (GFR) inimestel kauem kui 3 kuud, on samuti tavaline TUNEL-i hindamise objekt, mis võib kindlaks teha, kas krooniline neeruhaigus on seotud progresseeruva haigusega.neerukahjustus.Kõige sagedamini uuritud krooniline neeruhaigus, mille puhul TUNELi kasutatakse, on diabeetiline nefropaatia. TUNEL-positiivsusega tuvastatud vigastus tekkis tuubulites ja podotsüütides [69] diabeedihaigetel, kellel oli diabeet enne TUNEL-i testimist 7–30 aastat [104 105] ja 2–16 nädalat pärast streptozototsiinravi närilistel [106, 107]. Sarnast TUNEL-positiivset histopatoloogiat teatati ka immunoglobuliin A nefropaatia korral [22]. Luupusnefriidi ja membranoproliferatiivse glomerulonefriidi korral täheldati TUNEL-positiivsust peamiselt glomerulites [62,108,109]. Teisest küljest täheldati tsisplatiini [110], klorokiini [45], doksorubitsiini [67], finasteriidi [23], takroliimuse [111] ja levetiratsetaami [24] ravimiohutuse uuringutes enamasti tubulaarseid kahjustusi. Sarnaselt kirjeldati tubulaarsete TUNEL-positiivsete rakkude poolt tuvastatud jätkuvat ägedat vigastust kusihappe nefropaatia [112], metioniinipuuduse [48], keskkonnatoksiinide mikrotsüstiini-LR [50] ja kaadmiumi [113] uuringutes ning seos kaltsiumoksalaadiganeerudkivid [114] ja lupjuvad nanoosakesed [115]. Kuigi progresseeruva neerukahjustuse tuvastamine kroonilise neeruhaiguse ajal TUNEL-testi abil on kasulik diagnostiline tööriist, oleks TUNEL-testi kombineerimine immunohistokeemiaga (IHC) vigastuse mehhanismi määramisel võib-olla veelgi informatiivsem.

TUNELi kvantifitseerimise ja kolokaliseerimise tehnikad

TUNELi kvantifitseerimise meetodid on erinevad. Enamikus aruannetes on TUNEL-positiivsed rakud/tuumad kvantifitseeritud rakkude/tuumade koguarvu protsendina [83 116 117]. See näib olevat õige asi, kuigi TUNEL-positiivsete rakkude arv ei vasta tõenäoliselt täpselt surnud rakkude arvule. Mõned rakud ei pruugi olla saavutanud tuvastatavat DNA fragmentatsiooni taset, samas kui teised võisid makrofaagid juba elimineerida. Kasutatakse ka TUNEL-positiivsete rakkude arvu kvantifitseerimist ruutühiku (mm2) kohta [118], kuid see meetod tundub vähem täpne, kuna see sõltub alade asukohast ja rakutüübi sisaldusest. Kortikaalsed lõigud sisaldavad enamasti glomeruleid, torukesi, veresooni ja medullaarseid kiiri, samas kui medullaarsed lõigud sisaldavad peamiselt Henle silmuseid, kogumiskanaleid ja veresooni. Kvantifitseerimine "Fifieldi kohta" sõltub kindlasti sellest, mis väljaga on tegemist [72 119], ja kvantifitseerimine "sektsiooni kohta" on veelgi enam määratlemata [61 120]. Halvasti tuvastatud mõõtmised, nagu "histoloogiline skoor" [121], "apoptootiline indeks" [113], "apoptoosi määr" [92], "apoptoosi protsent" [122] või töötlemata kontrolli protsent [123, 124], näivad olevat olla veelgi vähem asjakohased ning muuta tõlgendamise keeruliseks ja mitte võrreldavaks enamiku uuringutega.

Rakusurm naaberrakkudes algab ebaühtlaselt, kuna see sõltub vaskularisatsioonist, rakutsüklist ja muudest muutujatest. Selle tulemuseks on sageli koe rakkude ebaühtlane TUNEL-värvimine [45, 96, 125]. Üllataval kombel ei kasutata TUNEL-positiivse signaali üldist intensiivsust TUNEL-i mõõtmiseks, hoolimata sellest, et see sõltub otseselt DNA fragmentatsiooni astmest. Võib-olla seetõttu, et rakke peetakse surnuks sõltumata TUNEL-signaali intensiivsusest, kuna rakk ei saa olla "surnum", kui TUNEL-i värvimine on intensiivsem. Kuigi TUNELi tulemuste kvantifitseerimiseks on raske võrrelda uuringuid, mis kasutavad mitmesuguseid meetodeid, on TUNEL-positiivsete rakkude hulk kontrollloomadel tavaliselt alla 2 protsendi [75,99,100,116,126]. Äge vigastus on seotud TUNEL-positiivsuse ~5–40-kordse suurenemisega [79,126,127]. Kroonilise vigastuse ajal on TUNEL-positiivsete rakkude arv veidi väiksem, ~2–20- korda [29,43,65] võrreldes töötlemata kontrollidega.

Esialgne diaminobensidiini (DAB) värvimisel põhinev TUNEL-test oli mõeldud valgusmikroskoopia jaoks [14,15]. Seda traditsioonilist meetodit kasutati endiselt kahes kolmandikus käesolevas ülevaates uuritud uuringutes ja valdavas enamuses inimese biopsia uuringutes. Kvantifitseerimine toimub käsitsi rakkude loendamisega ja kuigi täpne, on see aeganõudev. Sageli ei kasutata kvantifitseerimist üldse ja tulemused esitatakse töödeldud ja värvitud proovide kujutiste abil, mis on lihtsad tõendid rakusurma toimumise kohta. Automatiseerimine võib kiirendada kvantifitseerimisprotsessi [128,129]. Siiski ei saa DAB-d kombineerida ühegi teise värvimisega samas proovis ja seega saab DAB-põhine TUNEL pakkuda ainult surnud rakkude arvu, ilma rakutüübi (välja arvatud visuaalne tuvastamine) või rakusurma mehhanismi tuvastamiseta.

Kui inimuuringud tuginevad valdavalt DAB-põhisele TUNELile, kasutades valgusmikroskoopiat, siis ligikaudu pooled loomkatsetest kasutavad FL-fluorestsentsmikroskoopiat (joonis 3). Fluorestseeriv TUNEL on visuaalselt atraktiivne, kergesti tõlgendatav ja sellel on mitmeid olulisi eeliseid. Lisaks täpsele kvantifitseerimisele TUNEL-positiivsete tuumade või värvi keskmise intensiivsuse tuvastamise abil saab FL-fluorestseeruvat TUNEL-signaali histokeemia jaoks kolokaliseerida teiste värvidega (nt DAPI) (joonis 3A) või IHC (joonis 3B). Viimases võib valgumarkerite kasutamine aidata tuvastada TUNEL-positiivseid signaale, mis on seotud erinevateneerudsektsioonidesse või anda teavet rakusurma tüübi kohta. Me ei leidnud ühtegi näidet TUNELi kohta, mis oleks kombineeritud topelt IHC antikehade värvimisega. Kuigi selline kombinatsioon oleks väga informatiivne, näiteks teatud rakutüüpide rakusurma mehhanismi tuvastamiseks, võivad sellise värvimisega seotud tehnilised raskused kaaluda üles eelised.

Identifitseerimineneerudrakutüüp pole kogenud inimesele kindlasti probleemneerudpatoloog [104]. Seetõttu kasutatakse rakutüübi tuvastamiseks täiendavaid markereid, näiteks CD31 kasutamist endoteelirakkude identifitseerimiseks [130], harva. Siiski kasutatakse koekahjustuse iseloomustamiseks sageli IHC valgumarkereid. Enamikus uuringutes kasutatakse TUNEL-positiivsust ainsa apoptoosi tõendina. Teistes uuringutes on tõdemus, et TUNEL-positiivsus ei ole apoptoosi suhtes spetsiifiline, viinud paljude morfoloogiliste (nt hematoksüliini ja eosiini või perioodilise happe-Schiffi värvimise), biokeemiliste ja IHC-markerite kombineerimiseni TUNEL-värvimisega, et kinnitada apoptoosi. Kaspaasist sõltuva apoptoosi kõige sagedamini kasutatav marker on lõhustatud (aktiivne) kaspaas-3, kasutades antikeha, mis ei tunne ära täissuuruses kaspaasi-3 [131,132]. Nii TUNELi kui ka lõhustatud kaspaasi{12}} testid näitasid roti isheemia-reperfusiooni korral ainult tubulaarset, mitte glomerulaarset värvumist [64]. Teistes kaspaasiuuringutes kasutati kaspaasi-1 [27], -9 [53], -11 [28] ja -12 [75]. Teised apoptootilised markerid hõlmasid B-raku lümfoomi 2 (Bcl2) perekonda valke Bcl-2 [27], Bcl2L1 [43], Bcl-xl [71], Bax [99], Bak [49] ja Bad. [43]; apoptootiline retseptor Fas [52] ja apoptootiline retseptor-ligand FasL [66]; forkhead box (FOX) valgu transkriptsioonifaktorid Fox01 [133] ja Fox03 [27]; ja tsütokroom c [53]. Põletik tuvastati kasvaja nekroosifaktor-alfa (TNF) IHC abil [134]; kasvaja kasvufaktorid TGF [66] ja TGF- 1 [135]; seriini/treoniini kinaas 1 (SGK1) [135]; elektronide ülekande flavoproteiin, beeta-subühik (ETF ) [136]; Januse kinaas-2 (JAK2) [137]; signaalimuundur ja transkriptsiooni 3 aktivaator (STAT3) [137]; aktiveeritud B-rakkude (NF-κB) tuumafaktori kappa-kerge ahela võimendaja [137] ja selle inhibiitorvalk IκB [137]. Sestneerudvigastuse hindamine, neerukahjustuse molekul-1 (KIM-1) [24], akvaporiini-1 kanal (AQP-1) [45], hüpoksiaga indutseeritav tegur {{7} }alfa transkriptsioonifaktor (HIF-1 ) [103], Asc-tüüpi aminohappe transporter-1 (Asc-1) [121], rapamütsiini (mTOR) [131] kinaasi imetaja sihtmärk , ja transglutaminaasi II [89]. Oksüdatiivse neerukahjustuse uurimiseks kasutati selliseid markereid nagu 8-hüdroksüguanosiin (8OHdG) [102], neutrofiilide želatinaasiga seotud lipokaliin (NGAL) [102], NAD-sõltuv deatsetülaas sirtuiin-1 (SIRT1) [138]. ja heemoksügenaas 1 (HO-1) [90]. Intensiivselt uuriti kinaase, sealhulgas c-Jun N-terminaalse kinaasi (JNK) rada [101], fosfoinositiidi 3-kinaasi/valgu kinaasi B/tuumafaktori erütroidi 2-seotud faktori 2 transkriptsioonifaktorit (PI3K/). Akt/Nrf2) rada [46], panneksiin-1 (PANX1) plasmamembraani lõhe ühendusvalk [26] ja mitogeen-aktiveeritud proteiinkinaas/ekstratsellulaarne signaaliga reguleeritud kinaas (MAPK/ERK) [26]. Apoptootiliste endonukleaaside uuringud hõlmasid kaspaasiga aktiveeritud DNaasi (CAD) [139], DNaas I [108] ja EndoG [139] ning DNA kahjustuse markerite hulka kuulusid kasvajavalk p53 (p53) [99] ja dünamiiniga seotud valk 1 (PARP1). ) [66]. Mõned uuringud pidasid kasulikuks ka endoplasmaatilise retikulumi stressi poolt vahendatud apoptoosi ja koekahjustuse hindamist [75].

Arvestades suurt hulka küsitletud mehaanilisi uuringuid ja TUNELi ja IHC markeritega kombineerimise eelist rakusurma mehhanismide tuvastamiseks, võib eeldada, et paljud uuringud kasutavad nende kahe vahel kolokalisatsiooni. Analüüsi võib läbi viia pikslite kaupa kolokaliseerimisega TUNEL-positiivsete rakkude ja IHC-markerite vahel, IHC-markeri keskmise intensiivsusega TUNEL-positiivsetes piirkondades või TUNEL-positiivse signaali intensiivsuse abil IHC-marker-positiivsetes piirkondades. Kahjuks on seda TUNELi eelist kasutatud vaid üksikutes uuringutes. TUNEL-positiivsed rakud kolokaliseeriti lõhustatud kaspaasiga-3neerudtuubulid atsetaminofeeni toksilisuse ajal rottidel [74]. IHC kolokaliseerimine TUNEL-positiivse signaaliga võimaldas Habu nefriidi ajal tuvastada mesangiaalrakkude rakusurma [99]. Valgusmikroskoopias viidi kolokaliseerimine toksilisuse mehaaniliste markeritega läbi jadalõikudes, nagu on teatanud Ott et al. [89].

TUNELi probleemid ja piirangud

TUNELiga töötamisel võib esineda mitmeid võimalikke probleeme ja neid tuleks oodata. Üks on see, et 30OH DNA otsad ei esine mitte ainult rakusurma ajal endonukleaasi toime tulemusena, vaid ka normaalse vahemetaboliidina peaaegu kõigis ensümaatilistes reaktsioonides DNA-ga. Peamine rakufunktsioon, mis toodab 30OH-otste, on DNA süntees, mille käigus paljud Okazaki fragmendid võivad teoreetiliselt tekitada valepositiivse TUNEL-signaali, eriti testi väga tundlike modifikatsioonide korral. ajalneerukahjustus,DNA parandamine võib samuti kaasa aidata vale-TUNEL-positiivsete signaalide tekkele AP endonukleaasi toime tulemusena. Massiivne oksüdatiivne neerukahjustus, mis on põhjustatud keemilisest (vesinikperoksiid, bleomütsiin) või füüsilisest (gammakiirgus) kahjustusest, võib suurendada 30OH otste arvu, suurendades valepositiivseid TUNEL-i näitu, välja arvatud endonukleaasi poolt vahendatud DNA fragmentatsioonist.

Sagedamini ja tõenäolisemalt võivad TdT reaktsiooni valesti seatud katsetingimused (aeg, temperatuur, ensümaatiline aktiivsus või kofaktorid) põhjustada kunstlikult kõrgendatud TUNEL-positiivse signaali tausta. Kuigi pole veel määratletud, mida peetakse normaalseks lähtetasemeks töötlemata neerukoe proovide puhul, tundub usutav, et umbes 1 protsent rakkude koguarvust oleks mõistlik arv. Kindlasti on 10-protsendiline või kõrgem taust selge tõend kas iseloomustamata ja rafineerimata analüüsitingimustest või kõrvalekaldest proovide sobivatest säilitamistingimustest.

Teine oodatav probleem on madal DNaasi I aktiivsus teatud rakutüüpides (nt endoteelis),neerudsektsioonid (nt glomerulid) või patoloogilised koed (nt kasvajad). Nendel rakkudel peaks olema madal TUNEL-positiivsus, mitte seetõttu, et nad on vigastustele vastupidavad, vaid seetõttu, et TUNELis ei ole piisavalt endonukleaasi aktiivsust mõõdetava signaali tekitamiseks. Meie kogemuse kohaselt võivad isegi muutused vahemikus {{0}},01–0,1 protsenti TUNEL-positiivsetest rakkudest olla statistiliselt olulised ja neid saab kasutada kindla tõendina neeru (teise koe) vigastuse kohta.

Lõpuks tekib probleem TUNELi värvimise kvantifitseerimisega siis, kui DNA fragmentatsiooni hulk on liiga suur, näiteks rakusurma hilises staadiumis või suure intensiivsusega vigastuste korral, kus järelejäänud DNA-d ei saa DAPI-ga korralikult värvida, kuna on lahti võetud. topeltheeliks (joonis 3D). Nendel juhtudel on TUNEL-positiivsed signaalid "õhus rippumas" ega näi olevat seotud tuumaga. Patoloogi kohustuseks on tõlgendada neid pigem TUNEL-positiivsete rakkudena kui artefaktina. Fluorestseiiniga märgistatud TUNELi puhul on oht tuvastada koe taustautofluorestsents TUNEL-positiivsusena [140]. Sellistel juhtudel on soovitatav lülituda punase spektriga TUNEL [51,54].

TUNELi mustrid lisateabe allikana

Mitmeid TUNELi mustreid saab selgelt eristada ja kasutada võimaliku mehhanismi ja vigastuse astme määramiseks (tabel 1, joonis 3). Tavaliselt tekib ainult tuumade tüüpi TUNEL-muster kerge vigastuse tõttu, samas kui tugevam vigastus (st kõrgem kokkupuude) põhjustab tuumade või rakkude tugevamat värvimist ja lagunemist. Rangelt apoptootiline TUNEL-muster on tuuma killustumine apoptootiliste kehade moodustumise tagajärjel (joonis 3E). TUNEL-positiivsete tuumade väikseid fragmente, mis on tõenäoliselt apoptootilised kehad, nähti roti isheemia-reperfusioonis 24–72 tunni jooksul [97]. 14 päeva pärast isheemia-reperfusioonikahjustust rottidel täheldati ka apoptootilisi kehasid TUNEL-märgistusega neerutuubulaarses epiteelis ja interstitsiumis [141]. Lavendliõli annuste suurendamine vähendas ainult tuumade TUNELi mustreid ja muutis need tsütoplasmaatilise lekkega nekroositaoliseks TUNELiks [94]. Viimane oli tingitud tuumaümbrise hävimisest, mis oli tingitud proteinaaside ja lipaaside toimest nekroosis. Tsütoplasmaatilist TUNELi (joonis 3F), mida nähti TUNEL-positiivse tsütoplasmana, täheldati valgusmikroskoopias rabdomüolüüsi mudelis roti tuubulites [142] ja podotsüütides, mida kultiveeriti kõrge glükoosisisalduse juuresolekul, ja diabeetilise nefropaatia korral hiirtel [135]. Tsütoplasmaatilist TUNELi kirjeldati ka neeruisheemia-reperfusioonis hiirtel, kasutades FL fluorestseeruvat TUNELi [98], ja isheemia-reperfusioonis rottidel valgusmikroskoopiat kasutades [143]. Elavhõbekloriidist põhjustatud sügav ja eranditult torukujuline kahjustus tugeva tsütoplasmaatilise TUNELi värvumisega, mis viitab tuumamembraani kahjustusele [60]. Kui vigastus jätkub või kahjustava aine annus suureneb, saab tsütoplasmaatilise TUNELi muuta hajutatud TUNELi "sägaseks" pildiks (joonis 3G), mis on tingitud raku hävimise hilistest staadiumist, mis on tingitud nekroosist ning raku tsütoplasma ja prahi lekkimisest. Näiteks täheldati tsisplatiiniga töödeldud hiirtel [71, 72] ja rottidel [144] nii tsütoplasmaatilist kui ka hajutatud TUNELi ning streptozototsiini poolt indutseeritud diabeetilistel rottidel podotsüütide kahjustust [145]. Dispergeeritud nekrootilist TUNELi täheldati ka uranüülatsetaadist põhjustatud nefrotoksilisuse ajal hiirtel [101]. Lõpuks, veel üks TUNEL-signaali muutuja, millele tähelepanu pöörata, on TUNEL-positiivsete signaalide intensiivsus, mis võib lahtriti erineda sõltuvalt iga raku katkestuste arvust (vigastuse aste), nagu on dokumenteeritud mõnes uuringus [45,96,125 ]. Mudelite puhul, milles täheldatakse erinevat TUNEL-signaali intensiivsust, on soovitatav kvantifitseerida nii TUNEL-positiivsete objektide arv kui ka värvumise keskmine intensiivsus.

Järeldused

Apoptootiliste endonukleaaside, eriti DNaas I ja EndoG kõrge aktiivsuse tõttu neerudes, on TUNELi kasutamineneeruuuringud ja -diagnooson väga informatiivne. See võib muutuda veelgi kasulikumaks, kui TUNELi kasutatakse apoptoosi tuvastamise meetodina pärast selle esialgset kasutamist. TUNELi rakendamine eranditult apoptoosiuuringute jaoks on hea näide sellest, kuidas teadust võib valesti kasutatud meetodiga kogemata valesti suunata. Vaatamata selle kasutamisele peamiselt ägeda vigastuse analüüsina, saab TUNELi edukalt rakendada nii AKI kui ka kroonilise neeruhaiguse hindamiseks. Kuid kroonilise neeruhaiguse korral peaks TUNEL-positiivsuse aste olema madalam kui ägeda vigastuse korral. Kuna endonukleaaside (peamiselt DNaas I) aktiivsus on torukujulises epiteelis palju suurem kui teistes neerusektsioonides, peetakse neerutuubulite vigastusi tavaliselt silmatorkavamaks. Siiski saab TUNELi abil uurida ka glomerulaar- või vaskulaarseid vigastusi, kui vigastus esineb tegelikult nendes sektsioonides. FL fluorestseeruva TUNELi kolokaliseerimine IHC-markeritega võimaldab tuvastada ja seostada rakutüüpe ja rakusurma mehhanisme TUNEL-signaalidega. TUNELi kvantifitseerimine võib anda väärtuslikku teavet rakusurma astme kohta ja pildianalüüsi tarkvara kasutamine võib selles osas olla väga kasulik. Arvestades TUNELi mustrite mitmekesisust, on tungivalt soovitatav luua ja demonstreerida esinduslikke pilte

TUNEL signaalid, mida peetakse positiivseks. Lõpuks tuleks TUNELi mustreid kasutada lisateabe allikana, näiteks rakusurma mehhanismi ja toksilisuse astme kohta. Näiteks võib TUNEL-positiivsete apoptootiliste kehade eristamine, tsütoplasmaatiliste TUNEL-signaalide olemasolu või hajutatud TUNEL-mustrid aidata tuvastada apoptootilisi vs. nekrootilisi TUNEL-positiivseid rakke, et uurimis- ja diagnostikatulemusi täpsemalt tõlgendada.

seksuaalse erutuse neeruhäirete ravi