Varicella-zosteri viiruse kärbitud glükoproteiin E on ideaalne immunogeen Escherichia coli-põhise vaktsiini kujundamiseks

Varicella-zosteri viirus (VZV) on väga nakkav aine, mis põhjustab nii tuulerõugete kui ka herpes zosteri haigust. Vaatamata kõrgele efektiivsusele on litsentseeritud vaktsiinide puhul endiselt probleeme ohutuse ja juurdepääsetavuse osas. Siin püüdsime toota VZV gE immunogeeni, kasutades E. coli ekspressioonisüsteemi. Leidsime, et gE valgu lahustuvat ekspressiooni ja saagist saab suurendada valgu C-otsa kärpimise kaudu, hõlbustades seeläbi vaktsiini valmistamise tugevat ja skaleeritavat puhastusprotsessi. Plii kärbitud gE (aa 31–358), edaspidi tgE, oli lahuses homogeenne monomeer ja sellel oli suurepärane antigeensus. Lõpuks hindasime ja võrdlesime tgE immunogeensust kaubandusliku viina LAV ja Shingrixi vaktsiiniga. Leidsime, et alumiiniumadjuveeritud tgE oli viina LAV-ga võrreldes immunogeenne. AS01B-ga adjuveeritud tgE kaheannuseline immuniseerimine näitas sama annuse korral samaväärset või paremat tgE-vastaste reaktsioonide ja rakuvahendatud immuunsuse tugevust Shingrixi vaktsiini omadega, eriti IFN-i - -ekspresseerivate osakaalude osas. CD4+ T-rakud. Kokkuvõtteks võib öelda, et see E. coli-vahendatud tgE ekspressiooni meetod pakub kulutõhusat ja skaleeritavat strateegiat ideaalse VZV gE immunogeeni loomiseks nii tuulerõugete kui ka vöötohatise vaktsiinide väljatöötamiseks.

cistanche tubulosa - parandab immuunsüsteemi

tuulerõugete viirus, glükoproteiin E, Escherichia coli, vaktsiin

SISSEJUHATUS

Varicella-zosteri viirus (VZV) on patogeenne inimese alfa-herpesviirus, mis kutsub esile kahte peamist haiguskategooriat: esmane infektsioon tuulerõugetega, mis on väga nakkav haigus, mida iseloomustab villitaoline lööve nahal ja kerged süsteemsed sümptomid, nagu palavik ja halb enesetunne. valdavalt lastel; ja vöötohatis (HZ), viiruse latentne taasaktiveerumine vastusena vananemisest põhjustatud nõrgenenud rakulisele immuunsüsteemile, mis põhjustab valulikku lokaliseeritud vesikulaarset löövet (HZ) koos mitmete muude tüsistustega või ilma (Cohen, 2013; Heininger ja Seward, 2006; Zerboni et al., 2014). Tuulerõuged ja HZ saab ära hoida nõrgestatud elusvaktsiinidega (LAV). Esimese LAV-i tuulerõugete ennetamiseks töötasid välja Takahashi jt. (1974), mis põhines vOka viiruse tüvel ja sai hiljem USA-s tavapäraseks kasutamiseks litsentsi Varivaxi nime all. Sellele järgnes Zostavaxi väljatöötamine ja litsentsimine HZ ennetamiseks (Tseng et al., 2011). Kahjuks on 10 aasta jooksul pärast Varivaxi inokuleerimise algust kinnitatud, et peaaegu 1/3 HZ juhtudest on seotud vOka tüvega (Galea et al., 2008), mis viitab sellele, et vOka võib nakatada ja luua latentsuse nagu metsik. -tüüpi viirust ja seejärel uuesti aktiveerida, et tekitada HZ. Lisaks on Zostavaxi efektiivsus pöördvõrdeline patsiendi vanusega manustamise ajal, kusjuures kõrgem vanus on seotud väiksema efektiivsusega (Oxman et al., 2005). Varasemad uuringud on näidanud, et VZV glükoproteiin E (gE) on virioni ümbrisel ja nakatunud rakupinnal kõige levinum viiruse glükoproteiin. GE on ka üks olulisemaid VZV kaitsvaid antigeene, mis on võimelised tekitama rakulist ja humoraalset immuunsust nii loodusliku tuulerõugete infektsiooni ajal kui ka pärast vOka vaktsineerimist (Arvin, 1992; Oliver et al., 2016). Hiljuti kiideti heaks rekombinantne HZ subühiku vaktsiin Shingrix (HZ/su) HZ ja sellega seotud postherpeetilise neuralgia (PHN) ennetamiseks täiskasvanutel vanuses üle 50 aasta (Shah et al., 2019; Syed, 2018). Kliinilistes uuringutes kutsus Shingrix esile tõhusa, VZV-spetsiifilise rakuvahendatud immuunsuse (CMI), mille üldine vaktsiini efektiivsus oli 97,2% osalejate seas, kes olid vanemad kui 50 aastat ja 91,3% kaitsemääraga osalejatel, kes olid suuremad või võrdsed. 70 aastani. Need leiud näitavad ühiselt märkimisväärselt vähenenud HZ riski vaktsineeritud isikutel, sõltumata vanusest, ja seega tõhusamat vaktsiinivalikut võrreldes ZOSTAVAXiga (Lal et al., 2015; Shah et al., 2019).

cistanche taime suurendav immuunsüsteem

Shingrix on loodud rekombinantsest gE antigeenist, mida ekspresseeritakse hiina hamstri munasarja (CHO) rakkudes, ja liposoomipõhisest adjuvantsüsteemist (AS01B), mis sisaldab 3-Odesatsüül-4′-monofosforüüllipiid A (MPL) ja Quillaja saponaria Molina, fraktsioon 21 (QS21) (Dendouga et al., 2012). Rekombinantsed CHO-rakud nõuavad aga pikka tootmistsüklit ja on seotud keeruka puhastusprotsessiga, mille tulemuseks on kõrge tootmiskulu ja piiratud tarne. Sellisena ei ole Shingrix ideaalne vaktsineerimislahendus laialdaseks kasutamiseks, eriti arengumaades (Kim et al., 2012). Mikroobsed ekspressioonisüsteemid pakuvad imetajate ekspressioonisüsteemide ees mitmeid eeliseid, sealhulgas kiiret kasvu, kultiveerimise lihtsust ja madalamaid tootmiskulusid (Overton, 2014), ning seetõttu kasutatakse neid laialdaselt paljude biofarmatseutiliste ainete ekspressioonil ja tootmisel (Adkins ja Wagstaff, 1998; Monie). jt, 2008; Wu et al., 2012). Rekombinantsete eukarüootsete valkude edukaks ekspressiooniks prokarüootsetes süsteemides tuleb aga tootmise ajal ületada mitmed raskused, näiteks vale voltimine ja translatsioonijärgse modifikatsiooni puudumine (Singh ja Panda, 2005). Vaatamata nendele raskustele võivad mikroobsed ekspressioonisüsteemid pakkuda ideaalset süsteemi laialdaseks kuluefektiivseks vaktsiini tootmiseks ja seetõttu on vaja uurida E. coli ekspressioonisüsteemi antigeene VZV vaktsiini väljatöötamiseks. Eelmises töös näitasime rekombinantse gE (rgE) valgu edukat ekspressiooni putukarakkudes ja saime puhastatud valgud hiire immuniseerimiseks ja mAb tootmiseks (Liu et al., 2015). Sellele tööle tuginedes uurime siin, kas gE valku saab ekspresseerida E. coli-s. Uurisime C-otsa kärbitud gE kandidaatantigeenide mittefusioonilahustuvat ekspressiooni (edaspidi lühendatud gE (tgE) või tgE) E. coli-s ja iseloomustasime puhastatud tgE valke. Näitame, et puhastatud tgE on natiivse gE-ga sarnane antigeenne ja on võimeline indutseerima hiirtel kõrgeid antikehade tiitreid vOka neutraliseeriva aktiivsusega. Võrreldes meie uuringus loodud tgE antigeeni immunogeensust LAV-i ja Shingrixiga, leiame, et meie antigeen mitte ainult ei avalda tõhusat humoraalset vastust, vaid indutseerib ka antigeenispetsiifilist CMI-d. Üldiselt võib meie E. coli strateegia tgE valgu tootmiseks sillutada teed alternatiivsele tööstuslikult toodetud immunogeenile nii tuulerõugete kui ka HZ vaktsineerimiseks.

Tistanche kasulikud omadused meestele - tugevdavad immuunsüsteemi

Cistanche Enhance Immunity toodete vaatamiseks klõpsake siin

【Küsi lisa】 E-post:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

TULEMUSED

Rekombinantse tgE ekspressioon ja puhastamine E. coli-s

VZV gE rakuvälist domeeni kodeerivad DNA järjestused valmistati erinevate N- või C-otsa kärpimisega konstruktsioonidena ja klooniti pTO-T7 vektorisse valgu ekspressiooniks E. coli-s. gE täispikk ekstratsellulaarne domeen kaldus moodustama E. coli-s ekspressiooni ajal inklusioonkehi ja seda sai parandada C-otsa kärpimisega. Erinevatest kärbitud valkudest saavutati parim lahustuvus gE (aa 31–358) konstruktiga (joonis 1A), mida edaspidi nimetatakse kärbitud gE-ks või tgE-ks. Kandidaat tgE ekspresseeriti edukalt lahustuva rekombinantse valguna ja puhastati bakterilüsaatide supernatandist, kasutades kolmeastmelist kromatograafiat labori skaalal edasiseks hindamiseks ja potentsiaalse vaktsiinina väljatöötamiseks. Püüdmiseks kasutati tugevat anioonvahetuskromatograafiat, millele järgnesid keraamilise hüdroksüapatiidi ja hüdrofoobse kromatograafia etapid (joonis 1B). Puhastusprotsessi järjestikustes etappides suurenes tgE puhtus SDS-PAGE-l (joonis 1C). tgE migreerus ligikaudu 40 kD ribana ja näitas head reaktsioonivõimet spetsiifilise antikehaga 1B11 (joonis 1D). Üldsaagis oli umbes 500 ug puhastatud tgE grammi bakterite kohta.

Kärbitud gE iseloomustus

Puhastatud valkude homogeensuse ja settimiskoefitsientide analüüsimiseks kasutati kõrgjõudlusega suuruskromatograafiat (HPSEC) ja analüütilist ultratsentrifuugimist (AUC). Kontrollina kasutati putukarakusüsteemist puhastatud rgE valku (Liu et al., 2015). HPSEC-is ilmnes tgE terav tipp domineerival retentsiooniajal 16, 1 minutit (joonis 2A), mis peegeldab puhastatud tgE valkude suurt homogeensust. AUC-katsetes täheldati domineerivat settimise piiki ~2,3 S juures (joonis 2B), mis võrdub ~39,4 kD-ga, mis näitab, et tgE esineb lahuses monomeerina. Diferentsiaalset skaneerivat kalorimeetriat (DSC) kasutati tgE valgu termilise stabiilsuse testimiseks, jälgides soojusmahtuvust termilise lahtipakkimise protsessi ajal. DSC profiilid näitasid valgu lahtivoltimise ajal ainult ühte termilist üleminekut tgE üleminekutemperatuuri (Tm) väärtusel 63,80 kraadi, mis on võrreldav rgE (63,64 kraadi) omaga (joonis 2C). Puhastatud tgE valkude konformatsioonilise terviklikkuse uurimiseks analüüsisime tgE antigeensust ELISA testi abil, kusjuures kontrollidena toimisid puhastatud rgE valgud, mida ekspresseeriti putukarakkudes. ELISA testis kasutati üheksat monokloonset antikeha, mis võisid ära tunda konformatsioonilisi epitoope (mAb 1B11, 4G4, 14G1) või lineaarseid epitoope (4A2, 11B11, 11B12, 6H6, 10H6, 11E3) (joonis 3). Enamiku antikehade puhul leidsime tgE ja rgE valkude jaoks sarnased keskmise efektiivse kontsentratsiooni (EC50, ng mL−1) väärtused, välja arvatud 1B11, mille reaktsioonivõime oli peaaegu 10- korda madalam, mis viitab nende sarnasele antigeensusele. Need tulemused viitavad sellele, et rgE peamised epitoobid on tgE valgus hästi säilinud.

Joonis 1 (värv võrgus) Valkude ekspressioon ja puhastamine. TgE konstruktsiooni kujunduse skemaatiline esitus. E. coli rakud transformeeriti rekombinantsete plasmiididega, mis kandsid gE (aa 31–358) kärbitud geeni. B, tgE puhastusprotsessi skemaatiline esitus. tgE puhastati lüüsitud supernatandist, kasutades kolmeastmelist kromatograafiat. C, tgE SDS-PAGE profiil puhastusprotsessi ajal. TgE molekulmass on ligikaudu 40 kD. M: molekulmassi marker. Rada 1: rakulüsaadist eraldatud supernatant; rada 2: tgE-d sisaldav fraktsioon Q-FF kromatograafist; rada 3: tgE-d sisaldav fraktsioon CHT kromatograafist; rada 4: butüülkromatograafi fraktsioon, mis sisaldab kõrge puhtusastmega tgE valku. D, puhastatud tgE immunoblotanalüüs.

TgE poolt indutseeritud immuunvastuste analüüs hiirtel

Et võrrelda tgE immunogeensust rgE-ga, koostasime valgud kahe teadustöös tavaliselt kasutatava adjuvandiga: alumiiniumipõhine adjuvant Al-001 ja Freundi adjuvant. Hiiri immuniseeriti kolm korda nädalatel 0, 2 ja 4 annusega 1 ug nii adjuveeritud tgE kui ka rgE suhtes. Erinevate adjuvantpreparaatide immunogeensuse määramiseks kasutati gE-spetsiifiliste antikehade tiitreid ja T-rakkude vastuseid 5. nädalal pärast esimest immuniseerimist. Al-001-ga koostatud tgE vaktsiiniga immuniseeritud hiirtel ilmnesid rgE rühma hiirtega sarnased antikehaprofiilid ja Freundi adjuvandil oli tgE-ga koostamisel parem stimuleeriv toime kui rgE-ga (joonis 4A). Neutraliseerimistiitrid ei näidanud erinevusi hiirtel, keda oli immuniseeritud tgE või rgE vaktsiiniga, erinevate adjuvantidega koostatud tgE neutraliseerivate tiitritega ~103 (joonis 4B). Kuid splenotsüütide CD4+ T-rakkude analüüsimisel intratsellulaarse tsütokiiniga värvimise (ICS) abil kutsusid nii tgE kui ka rgE vaktsiinid esile sarnase gE-spetsiifilise IFN- taseme, võrreldes soolalahuse rühmaga (joonis 4C, ~{ {22}},1% kas vaktsiinirühmade või soolalahuse rühma puhul) ja ainult mõõdukas gE-spetsiifilise IL{{20}} simulatsioon (joonis 4D, ~0,2% vaktsiinirühmade puhul vs. ~0,1 % soolalahuse rühma jaoks). Kokkuvõttes näitavad need tulemused, et tgE/Al-001 ja tgE/Freundi adjuvant kutsuvad esile gE-spetsiifilised immuunvastused, mis on võrreldavad rgE poolt esile kutsututega, eriti tugeva humoraalse vastusega.

TgE tuulerõugete vaktsiinikandidaadi hindamine võrreldes LAV-ga

Järgmisena hindasime BALB / c hiirtel antikehade tootmist ja alumiiniumadjuveeritud tgE valkude püsivust. Kaks rühma hiiri (n=5 rühma kohta) immuniseeriti kolm korda nädalatel 0, 2 ja 4 erinevate annustega 0,5 ug ja 5 ug tgE/Al{{ 8}} (joonis 5A ja B). Antikehade vastuse profiilid näitasid, et tgE valgu esmane inokuleerimine kutsus esile kõrged antikehade tiitrid, mis püsis pärast kahte revaktsineerimist 2. ja 4. nädalal ning saavutas maksimumtaseme 6. nädalal, enne kui langes aeglaselt üle 1{{ 20}}4 seireperioodi jooksul. Erinevatel annustamisrühmadel oli jälgimisperioodil sarnased antikehade tiitri profiilid, 6. nädalal olid sarnased kõrged neutraliseerivad tiitrid. TgE immunogeensust hinnati ja võrreldi viinaga. Poolefektiivset annust (ED50) hiirtel kasutati serokonversiooni mõõtmiseks, kusjuures madalam ED50 viitab paremale immunogeensusele. Balb/c hiired jaotati rühmadesse ja immuniseeriti intraperitoneaalselt alumiiniumadjuvandiga tgE-ga (1, 0.5, 0.25, {{50}}.125, {{). 54}}.0625 või 0.03125 ug; n{{30}}) või vOka vaktsiin (1,000, 500, 250, 125 või 62,5 pfu; n=6) seerialahjendustes. Seerumid koguti 4 nädala pärast ja testiti ELISA abil. Serokonversiooni analüüsiti vastavalt Reedi ja Muenchi meetodile (joonis 5C). Vanuserühmades olid hiirtel serokonversiooni määrad 83%, 100%, 100%, 100%, 50% ja 17% vastavalt 1, 0,5, 0,25, 0,125, 0,0625 ja 0,03125 ug annuste korral. Viinarühmades oli hiirtel madalam serokonversiooni määr 67%, 50%, 33%, 17% ja 0% vastavalt 1, 000, 500, 250, 125 või 62,5 pfu annuste korral. ED50 väärtused olid tgE puhul 0,063 ug ja vOka puhul 449,425 pfu, mis näitab, et tgE immunogeensus väiksemas annuses 0,3 ug oli samaväärne vOka-d sisaldava tuulerõugete vaktsiini ühekordse annusega saavutatavaga (tavaliselt üle 2,{{78} } pfu annuse kohta).

Joonis 2 TgE ja rgE valkude iseloomustus. A, puhastatud tgE HPSEC profiilid. Näidatud on gE retentsiooniaeg. B, puhastatud tgE valgu settimiskiiruse analüüs. TgE settimiskoefitsient ja molekulmass määrati sõltumatult c(s) ja c(M) meetoditega. Punktides (A) ja (B) on tgE näidatud mustana ja punane sinisena. C, puhastatud tgE ja rgE valgu diferentsiaalsed skaneeriva kalorimeetria profiilid.

Joonis 3 tgE ja rgE reaktsioonivõime mAb-dega. mAb-d lahjendati järjestikku ja reageeriti kaetud tgE või rgE valkudega ELISA testis. Reaktsioonid tuvastati, kasutades HRP-märgistatud hiirevastaseid antikehi. Igal lahjendusel mõõdeti samal plaadil korduvaid süvendeid. EC50 väärtused arvutati sigmoidse trendi sobitamisega, kasutades tarkvara GraphPad Prism.

Joonis 4 BALB/c hiirtel testitud tgE ja rgE immunogeensus 1 nädal pärast kolmeannuselist immuniseerimist. A, erinevate adjuvantidega formuleeritud tgE ja rgE antikehade tootmine hiirtel. B, erinevate adjuvantidega formuleeritud tgE ja rgE antikehade tiitrite neutraliseerimine hiirtel. C ja D, tgE või rgE vaktsiinide poolt indutseeritud gE-spetsiifiliste IFN- ja IL-2 vastuste hinnangud.

Joonis 5 Alumiiniumist formuleeritud tgE vaktsiini immunogeensuse testid BALB/c hiirtel. A ja B, tgE/Al-001 antikehade püsivus ja neutraliseerivate antikehade reaktsioon. Tiitreid jälgiti kuni 16 nädalat. C, ED50 hiirtel alumiiniumist valmistatud tgE ja viina jaoks.

TgE Zosteri vaktsiinikandidaadi hindamine võrreldes Shingrixiga

Meie tgE vaktsiini immunogeensuse võrdlemiseks Shingrixiga valmistati lüofiliseeritud tgE valk koos Shingrixi adjuvandiga AS01B. C57BL/6 hiiri immuniseeriti kahe tgE/AS01B või Shingrixi annusega intramuskulaarselt sääreluulihasesse nädalatel 0 ja 4. Antikehade tase pärast esimest immuniseerimist viitas sellele, et Shingrixiga immuniseerimine oli piisav, et esile kutsuda gE-vastaste antikehade kõrge tase. oluliselt kõrgem kui tgE/ AS01B toodetud; pärast teist immuniseerimist ei ilmnenud aga kahe rühma vahel olulist erinevust antikehade tootmises (joonis 6A). Mis puudutab neutraliseerivate antikehade taset, siis tgE/AS01B üheannuseline immuniseerimine põhjustas tühiste neutraliseerivate antikehade tootmist, mis on oluliselt väiksem kui Shingrix. Kuid pärast revaktsineerimist ei näinud me kahe rühma vahel olulist erinevust neutraliseerivate antikehade tootmise osas (joonis 6B). Et kontrollida, kuidas immuniseerimine mõjutab CMI-d, tuvastati pärast esimest ja teist immuniseerimist gE-spetsiifilised IFN- ja IL{14}} tasemed, kasutades ensüümiga seotud immunosorbentpunkti (ELISPOT) testi ja rakusisest tsütokiinide värvimist. TgE/AS01B immuniseerimine kutsus esile kehva humoraalse immuunvastuse võrreldes Shingrixi üksikannusega, kuid näitas võrreldavat potentsiaali IFN- - ja IL-2- tootvate splenotsüütide indutseerimisel (joonis 6C). Tõepoolest, pärast teist immuniseerimist tuvastati tgE/AS01B rühmas võrreldes soolalahuse kontrollrühmaga märkimisväärne arv gE-spetsiifilisi tsütokiini tootvaid rakke, mis olid samuti võrreldavad või paremad kui Shingrixi rühmas (joonis 6D ). Sarnaseid tulemusi täheldati ka voolutsütomeetria analüüsis, kus täheldati sarnases proportsioonis IFN- -ekspresseerivaid CD4+ T-rakke (joonis 6E) ja IL-2-, mis ekspresseerivad CD4+ T-d. rakud (joonis 6F) ja IFN- -CD8+ T-rakud (joonis 6G) tgE/AS01B ja Shingriximmuniseeritud hiirte vahel, olenemata ühekordsest või võimendusannusega immuniseerimisest. Need tulemused näitavad, et bakteriaalsest ekspressioonisüsteemist tuletatud tgE valk võib sobivate adjuvantidega koostamisel esile kutsuda nii humoraalseid kui ka rakulisi immuunvastuseid ja seega võib seda pidada kandidaatantigeeniks VZV vastase vaktsiini genereerimiseks.

Joonis fig 6 tgE immunogeensus C57BL/6 hiirtel. Manustati 5 ug tgE annused koos 50 μL AS01B adjuvandiga. See oli 1/10 Shingrixi vaktsiini annusest. Immuniseerimine viidi läbi nädalatel 0 ja 4. A, tgE/AS01B vaktsiiniga indutseeritud antikehade tootmise võrdlus võrreldes Shingrixiga. Seerumi tiitrid määrati ELISA testiga, kasutades rgE-ga kaetud plaate. B, vOka neutraliseerivate antikehade vastuse võrdlus pärast vaktsineerimist tgE/AS01B vaktsiiniga või Shingrixiga. Antiseerumi neutraliseerimistiitrid 2. nädalal (vasak paneel) ja 6. nädalal (parem paneel) on väljendatud seerumi lahjenduse pöördväärtusena, mille tulemuseks on 50% inhibeerimine. C, 2. nädalal tgE/AS01B vaktsiini või Shingrixi poolt indutseeritud gE-spetsiifiliste IFN- ja IL-2 vastuste hindamine. IFN- - ja IL-2- tootvate splenotsüütide arv arvutati ELISPOT test pärast taasstimuleerimist gE peptiidide kogumiga. D, tgE/AS01B vaktsiini või Shingrixiga indutseeritud gE-spetsiifiliste IFN- ja IL-2 vastuste hindamine 8. nädalal. IFN- - ja IL-2-tootvate splenotsüütide arv arvutati ELISPOT test pärast taasstimuleerimist gE peptiidide kogumiga. E–G, voolutsütomeetria testid gE-spetsiifiliste tsütokiini ekspresseerivate CD4+ ja CD8+ rakkude jaoks. IFN- -tootvate CD4+ T-rakkude, IL-2-CD4+ T-rakkude ja IFN- -tootvate CD8+ T-rakkude osakaal rakud splenotsüütide hulgas määrati.

ARUTELU

VZV gE on humoraalse ja raku poolt vahendatud immuunvastuse peamine sihtmärk loodusliku tuulerõugete infektsiooni ajal ja pärast VZV Oka vaktsineerimist. Shingrix (GSK) on rekombinantne subühiku vaktsiin, mis sisaldab CHO rakkudes ekspresseeritud VZV gE-d ja liposoomipõhist adjuvanti AS01B. Teised tööd on püüdnud uurida HZ-vastaseid subühikute vaktsiine, kasutades CHO-st või uudsete adjuvantidega koostatud putukarakkudest genereeritud gE valke (Cao et al., 2021; Lee et al., 2020; Luan et al., 2022a, Luan et al., 2022b; Wang et al., 2021; Wui jt, 2019; Wui jt, 2021). Siin uurisime ja näitasime, et gE valku saab lahustuvalt ekspresseerida ja E. coli-st puhastada ning seejärel formuleerida subühikulise vaktsiinikandidaadina koos sobiva adjuvandiga, et kutsuda esile mitte ainult tugeva neutraliseeriva tiitri, vaid ka tugeva CMI vastuse.

cistanche taime suurendav immuunsüsteem

E. coli kui ekspressioonisüsteem pakub mitmeid eeliseid: kiire rakkude kasvukiirus, odavad kultiveerimistingimused ning tõhus ja mitmekülgne vahend rekombinantsete valkude tootmiseks. Herpesviirusega seotud antigeenide uurimisel on E. coli-põhise ekspressioonisüsteemi abil olnud mitmeid edusamme. Neutraliseeriv lineaarne epitoop gE (aa 121–135) on sulandatud B-hepatiidi viiruse tuumavalgu (HBc) 149 aminohappega, et toota kimäärseid VLP-sid, mis võivad indutseerida hiirtel VZV-spetsiifilisi neutraliseerivaid antikehi (Zhu et al., 2016). Teises uuringus ekspresseeriti ahvi tuulerõugete viiruse (SVV) homoloogset gE valku E. coli-s, kasutades gE antiseerumi genereerimiseks GST liitmärgist (Gray et al., 2001). Seni ei ole teatatud E. coli-st puhastatud liitmärgiseta VZV gE valgu kui vaktsiinikandidaadi kohta.

gE koosneb kolmest piirkonnast: 544-aa hüdrofiilne ektodomeen koos signaalpeptiidiga (aa 1–30), 17-aa hüdrofoobne transmembraanne piirkond ja 62-aa tsütoplasmaatiline sabapiirkond. Uurisime gE ektodomeeni N- või C-terminaalsetes piirkondades mitut erineva kärbumisega kandidaatmolekule ja leidsime, et nende valkude eksogeenne ekspressioon E. coli-s oli parim kärbitud osa kasutamisel (andmeid ei ole näidatud). Intaktne gE ektodomeen ilma liitmärgiseta kipub moodustama inklusioonkehi, kui seda ekspresseerib E. coli, ja seda on raske puhastada. Testitud kärpimiskandidaatide hulgas oli gE (aa 31–358) valk kõrge lahustuva ekspressiooniga minimaalsete puhastamisraskustega, samuti kõrge puhtusega ja kõrge homogeensusega (joonis 1). Seega peeti seda kärbitud konstruktsiooni ideaalseks kandidaatvaktsiiniks. antigeen. Sellel kärpimisstrateegial võis olla potentsiaalne mõju valgu omadustele, eriti selle antigeensusele. Olime eelnevalt ekspresseerinud rekombinantset gE-d putukarakkudes ja puhastanud selle konstruktsiooni BALB/c hiirte immuniseerimiseks, saades epitoobianalüüsiks 70 gE monoklonaalseid antikehi (Liu et al., 2015). Analüüsi käigus tuvastasime immunodominantse piirkonnana aa 1–194 (andmeid pole näidatud). Sarnased tulemused saadi ka mujal, kusjuures gE-spetsiifilised mAb-d osutasid aa 109–123 ja 160–316 piirkondadele, mis vastutavad antikehade stabiilse antikeha sidumise eest variantisolaatide hulgas (Vafai, 1994). Teises uuringus, milles kasutati rekombinantset hübriidset gE fragmenti-VLP-sid, tuvastasid autorid jäägid 1–134 gE valgu kõige antigeensema piirkonnana ja näitasid, et gE C-ots (jäägid 303–623), mis sisaldas mitmeid tsüsteiinijääke, ei toonud osakesi. pärmis (Fowler et al., 1995), mis viitab sellele, et gE heteroloogne ekspressioon peaks arvestama mitte ainult antigeensusega, vaid ka ekspressiooni lihtsusega. Siin optimeerisime gE valgu pikkust selle tõhusaks lahustuvaks ekspressiooniks koos minimaalse antigeensuse vähenemisega. tgE näitas enamiku joonisel 3 kujutatud antikehade suhtes sarnast reaktsioonivõimet nagu putukarakkudes toodetud rgE, mis viitab sellele, et võtmeepitoobid on E. coli-st puhastatud tgE valguses hästi säilinud. Üks uuring näitas aga, et Shingrixi vaktsiini doonorite poolt äratuntud immunodominantsed CD4+ T-raku epitoobid olid hajutatud kogu gE valgu ulatuses (Voic et al., 2020). Meie uuringus oli tgE immunogeensus identne Shingrixi CHO rakkudest saadud gE immunogeensusega, kui antigeen kombineeriti AS01B adjuvandiga, sarnaselt tõhusate humoraalsete ja CMI vastustega, nagu on näidatud joonisel 5. Need tulemused näitasid, et kärbitud gE prokarüootsest süsteemist tuletatud antigeensus oli sama hea kui eukarüootsest süsteemist pärinev intaktne gE ektodomeen.

cistanche tubulosa - parandab immuunsüsteemi

Erinevatest ekspressioonisüsteemidest saadud gE valkude vahel on märkimisväärseid erinevusi. Kõige silmatorkavamad erinevused on täheldatud translatsioonijärgsete modifikatsioonide, eriti glükosüülimise puhul. Membraani glükoproteiinide O-seotud glükaanid on olulised viiruse glükopeptiidi epitoopide T-rakkude ja antikehade äratundmise seisukohalt ning sellel äratundmisel on suur biomeditsiiniline tähtsus meie katsetes vahendada immuunkaitset viiruste vastu, kasutades subühiku vaktsiine. Glükaanide eemaldamine CHO-K1 rakkudes toodetud gE-st vähendas VZV-positiivsete seerumite reaktiivsust 17%. Seevastu O-glükosüülimine võib häirida B-raku epitoopide immunoreaktiivsust: mõned olulised epitoobid on blokeeritud täiendavate O-seotud glükaanidega (Nordén et al., 2019). Meie uuringus näib, et E. coli-st genereeritud tgE käitub oma immunoreaktiivsuse ja immunogeensuse poolest sama hästi kui putukarakkudest tuletatud rgE, mis viitab sellele, et "paljas" tgE valk on vaktsiinikandidaadina paljulubav. Vaktsiinid, mille antigeeniks on tgE, ei kutsu tõenäoliselt esile mitte ainult kõrgeid IgG tiitreid, mis viitavad selle potentsiaalile tuulerõugete vaktsiinina ilma potentsiaalse viiruse latentsuse riskita, vaid ka kõrget CMI-d, mis viitab selle potentsiaalile ka vöötohatise vaktsiinina. Üldiselt pakub selles uuringus bakteriaalsest ekspressioonisüsteemist tuletatud gE antigeen VZV vaktsiinide väljatöötamiseks palju säästlikumat strateegiat.

Viited

Adkins, JC ja Wagstaff, AJ (1998). Rekombinantne B-hepatiidi vaktsiin: selle immunogeensuse ja B-hepatiidi vastase kaitsetõhususe ülevaade. Biodrugs 10, 137–158.

Arvin, AM (1992). Rakkude vahendatud immuunsus tuulerõugete viiruse vastu. J Infect Dis 166, S35–S41.

Cao, H., Wang, Y., Luan, N. ja Liu, C. (2021). Lipiidide nanoosakeste ja nukleiinsete immunostimulaatoritega koostatud tuulerõugete viiruse glükoproteiini E immunogeensus hiirtel. Vaktsiinid 9 310.

Chen, L., Liu, J., Wang, W., Ye, J., Wen, L., Zhao, Q., Zhu, H., Cheng, T. ja Xia, N. (2014). Varicella-zosteri viiruse neutraliseerimisanalüüsi väljatöötamine, kasutades glükoproteiin K antikeha ensüümiga seotud immunosorbent-punktanalüüsi. J Virol Methods 200, 10–14.

Cohen, JI (2013). Kliiniline praktika: vöötohatis. N Engl J Med 369, 255–263. Dendouga, N., Fochesato, M., Lockman, L., Mossman, S. ja Giannini, SL (2012). Rakkude vahendatud immuunvastused tuulerõugete viiruse glükoproteiini E vaktsiinile, kasutades hiirtel nii TLR agonisti kui ka QS21. Vaktsiin 30, 3126–3135.

Fowler, WJ, Garcia-Valcarcel, M., Hill-Perkins, MS, Murphy, G., Harper, DR, Jeffries, DJ, Burns, NR, Adams, SE, Kingsman, AJ ja Layton, GT (1995). Varicella-zosteri viiruse gE ümbrisevalgu immunodominantsete piirkondade ja lineaarsete B-raku epitoopide tuvastamine. Virology 214, 531–540.

Galea, SA, Sweet, A., Beninger, P., Steinberg, SP, LaRussa, PS, Gershon, AA ja Sharrar, RG (2008). Tuulerõugete vaktsiini ohutusprofiil: 10-aastaülevaade. J Infect Dis 197, S165–S169.

Gray, WL, Mullis, LB ja Soike, KF (2001). Simian tuulerõugete viiruse glükoproteiini ekspressioon E. Virus Res 79, 27–37.

Heininger, U. ja Seward, JF (2006). Tuulerõuged. Lancet 368, 1365–1376.

Kim, JY, Kim, YG ja Lee, GM (2012). CHO rakud biotehnoloogias rekombinantsete valkude tootmiseks: hetkeseis ja edasine potentsiaal. Appl Microbiol Biotechnol 93, 917–930.

Lal, H., Cunningham, AL, Godeaux, O., Chlibek, R., Diez-Domingo, J., Hwang, SJ, Levin, MJ, McElhaney, JE, Poder, A., Puig-Barberà, J., et al. (2015). Adjuveeritud vöötohatise alaühiku vaktsiini efektiivsus vanematel täiskasvanutel. N Engl J Med 372, 2087–2096.

Lee, SJ, Park, HJ, Ko, HL, Lee, JE, Lee, HJ, Kim, H. ja Nam, JH (2020). Glükoproteiin E subühiku ja nõrgestatud tuulerõugete viiruse elusvaktsiinide hindamine, mis on koostatud üheahelalise RNA-põhise adjuvandiga. Immun Inflamm Dis, 8, 216–227.

Liu, J., Zhu, R., Ye, X., Yang, L., Wang, Y., Huang, Y., Wu, J., Wang, W., Ye, J., Li, Y., et al. (2015). Monoklonaalsel antikehal põhinev VZV glükoproteiin E kvantitatiivne test ja selle rakendamine antigeeni kvantitatiivsel määramisel VZV vaktsiinis. Appl Microbiol Biotechnol 99, 4845–4853.

Luan, N., Cao, H., Wang, Y., Lin, K. ja Liu, C. (2022a). Ioniseeritavad lipiidide nanoosakesed suurendasid CpG ODN-ide ja QS21 sünergistlikku adjuvantefekti tuulerõugete-zosteri viiruse glükoproteiini E subühiku vaktsiinis. Pharmaceutics 14 973.

Luan, N., Cao, H., Wang, Y., Lin, K. ja Liu, C. (2022b). LNP-CpG ODN adjuveeritud tuulerõugete viiruse glükoproteiin E indutseeris VZV-ga praimitud hiirtel Shingrix™-iga võrreldava immuunsuse. Virol Sin 37, 731–739.

Monie, A., Hung, CF, Roden, R. ja Wu, TC (2008). Cervarix: vaktsiin HPV 16, 18-seotud emakakaelavähi ennetamiseks. Biologics 2, 97–105.

Nordén, R., Nilsson, J., Samuelsson, E., Risinger, C., Sihlbom, C., Blixt, O., Larson, G., Olofsson, S. ja Bergström, T. (2019). Varicella-zosteri viiruse rekombinantne glükoproteiin E sisaldab glükaan-peptiidi motiive, mis moduleerivad B-raku epitoope diskreetseteks immunoloogilisteks signatuurideks. Int. J. Mol. Sci., 20, 954.

Oliver, SL, Yang, E. ja Arvin, AM (2016). Varicella-zosteri viiruse glükoproteiinid: sisenemine, replikatsioon ja patogenees. Curr Clin Microbiol Rep 3, 204–215.

Overton, TW (2014). Rekombinantse valgu tootmine bakteriaalsetes peremeesorganismides. Drug Discov Today 19, 590–601.

Oxman, MN, Levin, MJ, Johnson, GR, Schmader, KE, Straus, SE, Gelb, LD, Arbeit, RD, Simberkoff, MS, Gershon, AA, Davis, LE jt. (2005). Vaktsiin vöötohatise ja postherpeetilise neuralgia ennetamiseks vanematel täiskasvanutel. N Engl J Med 352, 2271–2284.

Shah, RA, Limmer, AL, Nwannnunu, CE, Patel, RR, Mui, UN ja Tyring, SK (2019). Shingrix vöötohatise jaoks: ülevaade. Nahateraapia Lett 24, 5–7. Singh, SM ja Panda, AK (2005). Bakterite inklusioonikeha valkude lahustumine ja ümbervoltimine. J Biosci Bioeng 99, 303–310.

Syed, YY (2018). Rekombinantne vöötohatise vaktsiin (Shingrix®): ülevaade vöötohatise kohta. Narkootikumide vananemine 35, 1031–1040.

Takahashi, M., Otsuka, T., Okuno, Y., Asano, Y., Yazaki, T. ja Isomura, S. (1974). Elusvaktsiini kasutatakse tuulerõugete leviku tõkestamiseks haiglates viibivatel lastel. Lancet 304, 1288–1290.

Tseng, HF, Smith, N., Harpaz, R., Bialek, SR, Sy, LS ja Jacobsen, SJ (2011). Vöötohatise vaktsiin vanematel täiskasvanutel ja sellele järgneva vöötohatise oht. JAMA 305, 160–166.

Vafai, A. (1994). Antikehasidumissaidid varicella zoster viiruse gpI(gE) glükoproteiini kärbitud vormidel. Vaktsiin 12, 1265–1269.

Voic, H., de Vries, RD, Sidney, J., Rubiro, P., Moore, E., Phillips, E., Mallal, S., Schwan, B., Weiskopf, D., Sette, A., et al. (2020). CD4+ T-rakkude epitoopide tuvastamine ja iseloomustamine pärast Shingrixi vaktsineerimist. J Virol 94, e01641-20.

Wang, Y., Qi, J., Cao, H. ja Liu, C. (2021). Immuunvastused varicella-zosteri viiruse glükoproteiinile E, mis on formuleeritud polü(piim-koglükoolhappe) nanoosakeste ja nukleiinhappeadjuvantidega hiirtel. Virol Sin 36, 122–132.

Wu, T., Li, SW, Zhang, J., Ng, MH, Xia, NS ja Zhao, Q. (2012). E-hepatiidi vaktsiini väljatöötamine: 14-aastane odüsseia. Hum Vaccin Immunother 8, 823–827.

Wui, SR, Kim, KS, Ryu, JI, Ko, A., Do, HTT, Lee, YJ, Kim, HJ, Lim, SJ, Park, SA, Cho, YJ jt. (2019). Rakkude vahendatud immuunsuse tõhus esilekutsumine hiirtel katioonse liposoomipõhise adjuvandiga lüofiliseeritud tuulerõugete viiruse glükoproteiini E suhtes. Vaktsiin 37, 2131–2141.

Wui, SR, Ko, A., Ryu, JI, Sim, E., Lim, SJ, Park, SA, Kim, KS, Kim, H., Youn, H. ja Lee, NG (2021). TLR4 agonisti / katioonse liposoomi adjuvandi mõju tuulerõugete viiruse glükoproteiin E vaktsiini efektiivsusele: antigeeni esitlemine, omastamine ja kohaletoimetamine lümfisõlmedesse. Farmaatsia 13, 390.

Zerboni, L., Sen, N., Oliver, SL ja Arvin, AM (2014). Varicella zosteri viiruse patogeneesi molekulaarsed mehhanismid. Nat Rev. Microbiol. 12, 197–210.

Zhu, R., Liu, J., Chen, C., Ye, X., Xu, L., Wang, W., Zhao, Q., Zhu, H., Cheng, T. ja Xia, N. (2016). Väga konserveerunud tuulerõugete viiruse vastane epitoopvaktsiini kandidaat indutseerib hiirtel neutraliseerivaid antikehi. Vaktsiin 34, 1589–1596.