Hiina ravimtaimede meditsiini Cistanche mõju varajasele embrüo-loote arengule
Mar 08, 2022
Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-post:audrey.hu@wecistanche.com
Li Yufang 1, Xu Qinwei 2, Zhang Li 2, Zhang Wenchang 2, Feng Shutang 3*
[Abstraktne]Kasutage sigaembrüodin vitro viljastamisest uurimiseks ja võrdlemiseks. Lisamise mõjuhiina keelravimkoostisainedCistancheja Astragaluse arendamiseksvarajased embrüodmeediumis NCSU{{0}} tõestati. Katse tõestas, et: (1) mahusuhe 0,10 protsentiCistancheja 0.10 protsenti Astragalust lisati kultuuripuljongile jaCistanchelisarühm Blastotsüstide esinemissagedus (15,76 protsenti) oli oluliselt kõrgem kui tühirühmal (9,26 protsenti) (P<0.05). the="" blastocyst="" rate="" of="" the="" astragalus-added="" group="" (10.09%)="" and="" the="" blank="" group="" (9.26%)="" were="" not="" significantly="" different="" (p="">0.05), mis näitab sedaCistanchedeserticolavõib oluliselt edendadavarane embrüonaalnearengut. (2) Kui kontsentratsioon (V/V) onCistancheon {{0}}.05 protsenti ja 0,10 protsenti , on blastotsüstide määr (17,02 protsenti ja 16,75 protsenti) oluliselt kõrgem kui tühja rühmas (0) (P<0.01) and="" 0.15%="" group="" (8.94%)=""><0.05). (3)="" adding="" 0.10%="" traditional="">hiina keelravimCistanchesöötmes 2-rakustaadiumis oli blastotsüstide arengumäär (13,81 protsenti) oluliselt kõrgem kui 4-rakufaasis (7,53 protsenti) (P<0.05), and="" compared="" with="" the="" addition="" of="">Cistanchebefore cleavage (13.67%) ) Is slightly higher, but the difference is not obvious (P>0.05).
Arengukeskkonna erinevuste tõttu in vivo ja in vitro onembrüodkahjustatakse vabade radikaalide poolt varase sigade in vitro kultiveerimise ajalembrüod, põhjustades rakkude metabolismi häireid või DNA, RNA ja valkude kahjustusi [1]. Selleks et veelgi parandada külmutatud spermaga in vitro viljastamise arengukiirust, uuriti selles katses teatud kontsentratsiooni lisamistCistancheja Astragalus, et parandadaembrüoarenduskeskkond in vitro.
1. Materjal ja meetodid
1. 1 Kultuuritingimused:
Sigade munarakkude in vitro küpsemine, in vitro viljastamine ja varajaste embrüote in vitro kultiveerimine viidi läbi inkubaatoris 5% CO2 ja maksimaalse küllastunud niiskusega 39 kraadi.
1.2 Reaktiivid ja sööde:
Ootsüütide küpsemise põhivedelik on NCSU{{0}}, munarakkude pesuvedelik on PVA-TL-HEPES vedelik, väetamisvedelik on Tris-puhver (mTBM), mis sisaldab 0,1 protsenti BSA-d ja sperma pesuvedelik on Dubecco oma 0,1 protsendi BSA-ga. Fosfaatpuhverdatud soolalahus (DPBS), sperma sulatusvedelik on BTS, kummulivedelik on 1 mg/mL hüaluronidaasi PBS, munarakkude operatsioonivedelik on HEPES-puhverdatud NCSU-23 ja varajaste embrüote põhikultuurivedelikku on täiendatud 0 0,4 protsenti BSA NCSU-23, lisage (V/V) 0,05 protsenti ~0,15 protsenti Cistanche'i vastavalt vajadusele, kasutage sperma sulatamiseks BTS-i. Enne kasutamist eelsoojendage ja tasakaalustage rohkem kui 4 tundi inkubaatoris, mis sisaldab 5 protsenti CO2 õhku ja maksimaalselt 39 kraadist küllastunud niiskust [2].
1.3 Hiina meditsiini Cistanche keetmismeetod:
Tistanche lahus: võtke 5 g ja asetage see 100 ml keeduklaasi, lisage ülipuhas vesi ja kastke see ülipuhtasse vette, keetke kõrgel tulel ja hoidke keemiseni 20 minutit, seejärel koguge. supp; Korrake ülaltoodud protsessi, koguge 3 korda järjest, konstantne maht 100 ml-ni, 0,22 μm filter varu. Astragaluse lahus: Võtke 5 g ja pange see 100 ml keeduklaasi, lisage ülipuhas vesi ja kastke, keetke kõrgel tulel ja keetke 20 minutit, seejärel koguge ravimsupp; korrake ülaltoodud protsessi, koguge 3 korda järjest, määrake mahuks 100 ml, filtreerige 0,22 μm varu.
Hiina meditsiinTaimne:Cistanche
1.4 Sea munarakkude in vitro küpsemine:
Emiste munasarjad koguti Pekingi Pengchengi toidutapamajast, pandi 0,9 protsenti antibiootikume sisaldavasse tavalisse soolalahusesse, mis oli umbes 38 kraadi juures, transporditi 4 tunni jooksul tagasi laborisse ja pesti kolm korda tavalise soolalahusega. Kasutage 12-mõõturnõelaga 10 ml süstalt, et eraldada munarakud, mille munasarja pinnal on 2-6 mm läbimõõduga folliikulid. Peske 3–4 korda TL-HEPES lahuses ja 3–4 korda NCSU-23 lahuses, mida on rohkem kui 4 tundi süsinikdioksiidi inkubaatoris tasakaalustatud. Viige 20–30 munarakku rühmana 100 μL-sse, lisage 10 protsenti PFF, 10 IU/mL HCG, 10 IU/mL PMSG, 10 ng/mL EGF NCSU-23 tilka ja kultiveerige umbes 22 tundi, muutke söödet NCSU-23 tilkadele 10% PFF-iga, 10 ng/ml EGF-iga ja jätkake kultiveerimist 44–46 tundi[3].
1.5 Sperma mahutavus ja in vitro viljastamine:
Valmistage mTBM lahus ilma kofeiini ja BSAta ning tasakaalustage seda 48 tundi inkubaatoris 5% CO2 ja maksimaalse küllastunud niiskusega 39 kraadi, reguleerides pH väärtust vahemikus 7,2–7,8; lisage kofeiin ja BSA 44 tundi enne kasutamist ning jätkake tasakaalustamist. Sperma kvaliteeti testiti ja 10 ml tsentrifuugiti kiirusel 900 p/min 3 minutit, suspensiooni jaoks lisati 10 ml DPBS lahust, mis sisaldas 0,1 protsenti BSA-d, ja tsentrifuugiti 900 p/min 3 minutit [3]; pärast 1 ml TBM-i lahuse suspendeerimist kallutati seda 60 kraadi. Ülesvoolu energia kogumise töötlemine viiakse läbi inkubaatoris 5% CO2 õhuga ja maksimaalse küllastunud niiskusega 39 kraadi 1 tunni jooksul [3–5]. Munarakkude ja kummuli rakukompleks, mis küpseb 44–46-ni, asetatakse 0,1 protsenti hüaluronidaasi sisaldavasse munarakkude pesulahusesse ja kummulirakud eemaldatakse pipetiga ja seejärel eksponeeritakse munarakud. Peske kolm korda tasakaalustatud TBM-is ja lõpuks pange kõik 10-15 tükid 50 μL TBM-i rühma ja oodake sperma [6, 7]. Süstige TBM-i sisaldavate munarakkude tilgakesse 50 μL ülesvoolu spermat TBM-i sisaldavatesse munarakkudesse ja viljastage 6 tundi inkubaatoris 5% CO2 ja maksimaalse küllastunud õhuniiskusega 39 kraadi.
1.6 Viljastatud munarakkude varajane areng ja avastamine:
Pärast 6-tunnist viljastamist töödeldi ootsüüte NCSU-23-ga, mis oli puhverdatud operatsioonivedelikuga HEPES või NCSU- 23, mille BSA oli embrüokultuuri vedelikus 0,4 protsenti. 23 Loputage 3 korda, vahetage sööde tasakaalustatud 0,4% BSA NCSU-23 tilga vastu ja inkubeerige rohkem kui 8 päeva. Kontrollige hüpoteetiliste viljastatud munarakkude jagunemissagedust 2. päeval, morula määra (pluss blastotsüstide määr) 6. päeval ja blastotsüstide määra 8. päeval [8]. Kõiki uuriti ja registreeriti kehapeegli all.
1.7 Eksperimentaalne disain:
1.7.1 Traditsioonilise hiina meditsiini koostisosade Cistanche mõju embrüo varasele arengule.
Wuzhishani siga[8] Pärast mahtuvustamist, kehavälist viljastamist, viljastamine lõpetatakse ja pärast lõhustumist vahetatakse embrüoid, kuni need lisatakse 0,1 protsendini (V/V). Viljastatud munade ja varajaste embrüote arengu jälgimiseks kasvatati tsistanši, 0,1 protsenti astragalust ja NCSU-23 (0,4 protsenti BSA) ilma oluliste koostisosadeta (tühi rühm). ja hinnata kahe traditsioonilise hiina meditsiini komponendi mõju varajasele in vitro embrüo arengule.
1.7.2 Cistanche kontsentratsiooni mõju embrüote varasele arengule.
Wuzhishani sea sperma on mahukas ja läbib in vitro viljastamise. Pärast väetamise lõppu muudetakse vedelikuks {{0}} protsenti (tühi rühm), 0.05 protsenti, 0,1 protsenti ja vastavalt 0,1 protsenti. 15% Cistanche NCSU-23 (0,4% BSA) puhul jälgige viljastatud munarakkude arengut ja hinnake Hiina meditsiini komponendi Cistanche erinevate kontsentratsioonide mõju varasele in vitro embrüo arengule.
1.7.3 Cistanche'i lisamise perioodi mõju embrüo varasele arengule.
Wuzhishani sea sperma on mahutav ja läbib in vitro viljastamise. Pärast viljastamise lõppu jaguneb viljastatud munarakk {{0}}rakufaasi ja viljastatud munarakk jaguneb 4-rakufaasiks, vedelik vahetatakse ja lisatakse eraldi. 0.1% Cistanche NCSU-23 (0,4% BSA), jälgige viljastatud munarakkude arengut ja hinnake tsistanši lisamise mõju varasele in vitro embrüo arengule erinevates etappides.
1.8 Statistiline analüüs:
Kasutage SPSS13.{1}} hii-ruut (χ2) testi ja ühesuunalist dispersioonanalüüsi.
2. Analüüsi tulemus
2. 1 Traditsioonilise hiina meditsiini koostisosade mõju varasele embrüo arengule
As shown in Table 1, in the Cistanche and Astragalus group, the morula rate was not significantly different from that of the blank group (P>0.05). Kahe rühma blastotsüstide määr oli kõrgem kui tühja rühma oma ja Cistanche rühma blastotsüstide määr erines tühja rühma omast. Märkimisväärne (P<0.05). it="" is="" believed="" that="" cistanche="" has="" a="" better="" effect="" on="" promoting="" early="" embryonic="">
2.2 Hiina meditsiini koostisosa Cistanche kontsentratsiooni mõju varasele embrüo arengule
Nagu on näidatud tabelis 2, on Cistanche lisamisel mahukontsentratsioonis 0.05–0,10 protsenti embrüokultuurivedelikus parem soodustav toime WZSP külmutatud spermavedeliku in vitro viljastamise embrüotele. ja blastotsüstide arengukiirus erineb oluliselt tühja rühma omast (P<0.05); the="" blastocyst="" development="" rate="" of="" 0.15%="" cistanche="" deserticola="" was="" 0,="" which="" was="" significantly="" different="" from="" other="" groups=""><0.01). it="" means="" that="" if="" the="" concentration="" of="" cistanche="" is="" too="" high,="" it="" may="" cause="">
2.3 Hiina meditsiini koostisosa Cistanche lisamise mõju varajasele embrüo arengule
As shown in Table 3, after testing and analysis, the addition of Cistanche at a volume concentration of 0.10% at the 2-cell stage has a better-promoting effect on the WZSP frozen sperm liquid in vitro fertilization-embryo, and there is no significant difference from the addition before the cleavage (P>0.05). Siiski oli oluline erinevus võrreldes 4 raku lisamisega (P<0.05); it="" indicated="" that="" the="" addition="" of="" cistanche="" at="" a="" volume="" concentration="" of="" 0.10%="" in="" the="" 2="" cell="" stage="" was="" most="" suitable="" for="" early="" embryo="">
3. Arutelu
Võrreldes normaalse arengugaembrüodin vivo, IVF-i arengukeskkond viljastatudembrüodon oluliselt erinev. Protsessi käigusembrüokasvamine ja jagunemine, tekib suur hulk No, vabu radikaale ja mõningaid mürgiseid aineid, mis on embrüo kasvule ebasoodne. Normaalselt arenevad embrüod organismis suudavad need ebasoodsad tegurid elimineerida sisekeskkonna ainevahetuse kaudu; need ebasoodsad tegurid kogunevad alati in vitro viljastamise embrüo kasvukeskkonda. Traditsioonilinehiina keelravimkoostisosaCistanchevõib olla kontsentratsiooni vähendamise ja teatud vabade radikaalide kõrvaldamise funktsioon, et veelgi parandada külmutatud spermaga in vitro viljastamise arengukiirust. Katses uuriti teatud kontsentratsiooni lisamistCistancheja Astragalus. Tulemused kinnitasid, et Astragalusel ei olnud tõhusat mõju in vitro kultuurikeskkonna parandamisele. Õige kontsentratsioonCistancheavaldab teatud edendavat mõjuvarajane embrüoarengut, kuid kui kontsentratsioonCistancheületab teatud kontsentratsiooni, on sellel ka pärssiv toimeembrüoarengut.
Uurisime täiendavalt selle erinevaid mõjusidCistanche, traditsioonilinehiina keelravimkomponenti erinevates etappides ja katses leiti, etvarajased embrüodon hilisemas etapis kõrgem arengumäär, kuicistanchelisatakse 2-lahtri etapis. Võimalik põhjus on retseptori väliskeskkonnas. Lämmastikoksiid (NO) on signaalmolekul ja tsütotoksiline faktor, millel on lai valik bioloogilisi toimeid. NO mõju onvarajane embrüoarengut tuleks jälgidavarane embrüonaalnearengustaadiumis, mis võib olla põhjustatud ühest 2-rakublokaadi (2-rakublokaadi) põhjustest imetajate embrüokultuuris ning sigade in vitro blokeerimine toimub 4-rakufaasis [ 9]. Traditsioonilise lisaminehiina keelravimKoostisosad võivad teatud määral kõrvaldada NO vaba radikaali ja leevendada ebasoodsaid tegureidembrüokasv [10].
Cistanche
Viited
[1] Comport M. Kolm vabade radikaalide poolt indutseeritud rakurahu mudelit[J]. Chem Biol Interact, 1989, 72 (1/2):1- 56.
[2] Pan Dengke. Uuring kloonitud sea somaatiliste rakkude arengut mõjutavate tegurite kohtaembrüod[D]. Peking: Hiina põllumajandusülikool, 2005.
[3] Zhang Yunhai. Uuringud kloonitud sigade tootmise kohtaembrüodkasutades somaatiliste rakkude tuumaülekande tehnoloogiat [D]. Peking: Hiina põllumajandusülikool, 2005.
[4] Lu Shengsheng, Zhang Yanling, Shi Deshun jt. Veise seerumi ja sea folliikulite vedeliku lisamise mõju küpsemise ajal sea munarakkude tuumaküpsele javarane embrüonaalneareng pärast kehavälist viljastamist [J]. Heilongjiang Animal Husbandry and Veterinary Medicine, 2002, (8):1- 3.
