Uurida Cur-indutseeritud autofagia mõju CBMSC vananemisele

Palun võtke ühendustoscar.xiao@wecistanche.comrohkem informatsiooni

2.5. Autofagia inovolod Curi kaitsva toime avaldamisel cBMSC vananemises

Cur-indutseeritud autofagia mõju uurimiseks cBMSC vananemisele moduleeriti autofagia taset RAP-i (200 nM) või 3-MA-ga (5 mM) kasutamisega.3-MA-l on märkimisväärne inhibeeriv toime. autofaagilise aktiivsuse kohta, mis väljendub mikrotuubulitega seotud valgu 1 kerge ahela 3 (LC3), autofagiaga seotud geeni (ATG)7, ATG12 ja unc51-taolise autofaagiat aktiveeriva kinaasi mRNA ekspressiooni olulises allareguleerimises {14}}(ULK1); vähenenud mikrotuubulitega seotud valgu 1 kerge ahela 3 tüüpi Ⅱ/I (LC3-I/I) ekspressioonisuhe; ja p62 suurenenud ekspressioon võrreldes kontrollrühmaga (joonis 5A, B). Seega, võrreldes Cur-rühmaga, täheldati autofagilise aktiivsuse vähenemist 3-MA pluss Cur rühmas (joonis 5A, B). Seevastu RAP rühmas täheldati autofaagilise aktiivsuse suurenemist, mida tõendab LC3, ATG12 ja ATG7 ülesreguleeritud mRNA ekspressioon; LC3-I suurenenud konversioon LC3-II-ks; ja p62 lagunemine (joonis 5A, B).

Esiteks uuriti süstemaatiliselt autofagilist aktiivsust. Autofaagiliste vakuoolide (nimetatakse ka autofagosoomideks) moodustumist hinnati morfoloogilise vaatluse teel ning tulemused näitasid, et Cur rühmas ja RAP rühmas oli rohkem autofaagilisi vakuoole ja LC3 punkte võrreldes kontrollrühmaga, samas kui autofagiliste vakuoolide arv vähenes ja 3-MA ja 3-MA pluss Cur rühmades täheldati vähem LC3 punkte (joonis 5C, E). Lisaks näitas LysoTrackeri värvimine, et RAP ja Cur suurendasid lüsosomaalset hapestumist cBMSC-des ning vähenesid rühmad 3-MA ja 3-MA plus Cur (joonis 5D). Tulemused näitavad, et Cur ja RAP avaldavad autofagia aktiveerimisele sarnast positiivset mõju ja et 3-MA pärsib autofaagilist aktiivsust.cistanche peenise suurus,Kuid 3-MA inhibeerivat toimet autofagiale saab osaliselt päästa Curi kasutamine.

Lisateabe saamiseks klõpsake siin

Kinnitamaks, kas autofagia osaleb CB MSc vananemise reguleerimises, uurisime pärast autofagia soodustamist või pärssimist farmakoloogilise ravi kaudu vananemisega seotud fenotüüpe. Tulemused näitasid, et Cur- ja RAP-rühmades oli vähem SA- -gal-positiivseid rakke, samas kui {{5}-rühmas täheldati SA- -gal-positiivsete rakkude arvu suurenemist. }MA rühm võrreldes kontrollrühmaga. Tähelepanuväärne on, et SA- -gal-positiivsete rakkude arv suurenes märkimisväärselt MA pluss Cur rühmas võrreldes Cur rühmaga (joonis). RT-qPCR analüüsi tulemused näitasid, et ravi RAP-i ja Curiga suurendas SOX-2 ja Nanogi ekspressioonitaset ning vähendas võrreldes IL-6, TNF-a, p21 ja p16 ekspressioonitaset. kontrollrühmaga. Kuid autofagia inhibeerimine 3-MA poolt reguleeris üles p16, p21, TNF- ja IL-6 ekspressiooni (joonis 6C-E). Lisaks suurenes cBMSC-de kolooniate moodustamise efektiivsus võrreldes kontrollrühmaga Cur ja RAP rühmades, samas kui CFU-F arv ja suurus vähenesid oluliselt 3-MA rühmas. Lisaks näidati, et Cur suurenenud mõju kolooniaid moodustavate cBMSC-de arvule saab kaotada eelkonditsioneerimisega 3-MA-ga (joonis 6B).cistanche pulberNeed tõendid näitavad, et RAP ja Cur võivad cBMSC vananemist leevendada, samas kui 3-MA süvendab cBMSC vananemist ja nõrgendab Curi kasulikke mõjusid.

Kokkuvõttes näitavad need tulemused, et autofagia inhibeerimine 3-MA-ga kiirendab cBMSC-de vananemist, samas kui autofagia aktiveerimine Cur ja RAP-iga leevendab cBMSC vananemist (joonis 6F). Eelkõige nõrgenes Cur'i kaitsvat toimet 3-MA-ga eeltöötlemine (joonis 6F), mis viitab sellele, et Cur-indutseeritud autofagia on potentsiaalne molekulaarne mehhanism cBMSC vananemise parandamiseks.

3. Arutelu

Organismid parandavad pidevalt vigastatud kudesid ja aeglustavad vananemisega seotud protsesse tänu MSC-de iseloomulikele funktsionaalsetele omadustele, mis laialdaselt asuvad erinevates kudedes ja elundites [15]. Kahjuks on vanus ja haigus võtmetegurid MSC vananemisel in vivo ning sisemised ja välised erinevused rakukeskkonnas kiirendavad MSC vananemist in vitro kultuuris, mis mõlemad mõjutavad negatiivselt nende võimet immuunsupressiooniks, diferentseerumiseks ja migratsiooniks, vähendades lõpuks enese efektiivsust. -parandamine ja siirdamine MSC-des [7,14,49-51].cistanche salsa ekstraktOja ja tema kolleegid näitasid, et inimese BMSC-d lõpetasid proliferatsiooni kliinilise astme kultuuride viiendal kuni üheksandal passaažil ja neil ilmnesid tüüpilised vananemisfenotüübid, nagu hüpertroofiline ja lame morfoloogia, rakutsükli kinaasi inhibiitorite p16 ja p21 aktiveerimine, vähenenud proliferatsioonikiirus. ja SA- -gal [52] suurenenud aktiivsus. Ilmselt põhjustab in vitro laienemine vältimatult vananemise enneaegset ilmnemist MSC-des, mida peetakse oluliseks in vitro rakkude vananemisuuringute mudelisüsteemiks [42, A4, A5]. Meie käesolev uuring näitas, et cBMSC-d enne 3. passaaži näitasid ühtlast morfoloogiat, kuid pärast 6. passaaži on täheldatud mitmeid muutusi raku morfoloogias, füsioloogias ja geeniekspressioonis (joonised 2 ja 7), mis on kooskõlas enneaegse vananemisega. .

Cistanche on vananemisvastane toime

Üha rohkem tõendeid näitab, et farmakoloogiline stimulatsioon on paljulubav lähenemisviis MSC-de päästmiseks vananemisest [53, 54]. Seda silmas pidades on paljusid looduslikke ja sünteetilisi ühendeid põhjalikult uuritud, et teha kindlaks nende põletikuvastane, antioksüdatiivne ja vananemisvastane potentsiaal in vivo ja in vitro [15,55]. Looduslikult esineva fenoolühendina on Cur äratanud suurt tähelepanu tänu oma kasulikule mõjule MSC bioloogiale [36,37,56,57]. Siiski tuleks enne erinevate biomeditsiiniliste uuringute rakendamist hoolikalt kaaluda Cur kokkupuute keerulisi mõjusid MSC-dele. Yang ja tema kolleegid teatasid, et Cur kõrge kontsentratsioon (50 ja 100 uM) võib in vitro inimese BMSC-des esile kutsuda ägedat toksilist toimet, samas kui pidev kokkupuude (7 päeva) 10 uM Cur-ga pärsib inimese BMSC proliferatsiooni ja kutsub esile raku apoptoosi [58]. Huvitaval kombel näitas teine ​​uuring, et ravi Cur<20 um)for="" 5="" days="" ameliorates="" h,="" o,-induced="" oxidative="" stress="" in="" human="" adscs[56].="" additionally,="" cur="" preconditioning="" （1="" μm="" and5um）="" for="" 24="" or="" 48h="" can="" help="" to="" maintain="" cellular="" viability="" and="" improve="" the="" lifespan="" of="" rat="" adscs[36,57.="" our="" results="" demonstrated="" that="" cur(1="" um="" and="" 10="" μm）="" was="" able="" to="" maintain="" the="" viability="" of="" cbmscs="" and="" alleviate="" cbmsc="" senescence="" after="" exposure="" for="" 24="" h,="" while="" the="" colony-forming="" efficiency="" of="" cbmscs="" was="" significantly="" decreased="" at="" a="" dose="" of="" 10="" μm（figure="" 3）.="" therefore,="" the="" beneficial="" effects="" of="" cur="" （10="" umd="" may="" be="" attributed="" to="" short-term="" stimulation,="" and="" it="" can="" impair="" the="" proliferation="" potential="" of="" cbmscs="" in="" the="" long="">

Hiljuti on Cur bioloogilist aktiivsust laialdaselt kajastatud erinevatel in vitro või in vivo mudelitel, eriti seoses MSC-de bioloogiliste omaduste moduleerimisega. Curi vananemisvastast toimet on sageli arutatud ning on leitud, et Curil on kasulik mõju vananemisele ja vanusega seotud haigustele organismi ja raku tasandil. Selle reguleerimise aluseks olev mehhanism on aga Curi erinevate annuste ja vormide ning vananemismehhanismi tõttu keeruline [19]. Molekulide lagunemise ja organellide ringluse peamise rakusisese mehhanismina mängib autofagia olulist rolli MSC-de kaitsmisel stressitingimuste eest ja raku homöostaasi säilitamisel. Autofagia moduleerimist peetakse uudseks strateegiaks MSC funktsioonide parandamiseks [59]. Oluliste uuringute põhjal kogutud andmete kohaselt avaldab Curi autofagia soodustamine või pärssimine erinevates rakumudelites rahuldavat tsütoprotektiivset toimet [38-40].cistanche varsMeie andmed näitasid, et pärast Cur-ga kokkupuudet täheldati autofaagilise aktiivsuse suurenemist, mis on tuvastatud autofagiaga seotud geenide (LC3, ULK1, Atg7 ja Atg12) ülesreguleerimisega, LC3-II tekkega, rakkude arvu suurenemisega. autofagilised vakuoolid ja happelised vesikulaarsed organellid ning p62 valgu taseme oluline langus (joonis 4). Lisaks peetakse lüsosoomi autofagia jaoks asendamatuks organelliks, samal ajal kui MSC vananemise protsessis täheldati lüsosomaalse pH düsregulatsiooni ja vaakumi H pluss -ATPaasi (v-ATPaasi) aktiivsuse muutumist, soodustades seega lüsosomaalset hapestumist ja autofagiat ning aidates kaasa. MSC vananemise edasilükkamiseks [60]. Yan ja tema kolleegid näitasid, et Cur võib aktiveerida hiire embrüonaalsete fibroblastide (MEF) lüsosoomi funktsiooni ja indutseerida autofagiat, mis on oluline ellujäämissignaal [38]. Samamoodi täheldasime, et Cur-ravi suurendab lüsosomaalset hapestumist cBMSC-des (joonis 4), mis viitab sellele, et Cur võib olla seotud lüsosoomi funktsiooni aktiveerimisega, mis on autofaagilise aktiivsuse suurendamiseks hädavajalik.

Autofagia on valdavalt tsütoprotektiivne mehhanism ja üha rohkem tõendeid on näidanud, et looduslike ja sünteetiliste ühendite vananemisvastased omadused on korrelatsioonis autofagia modulatsiooniga [29,54,61,62]. Kuid autofagia modulatsiooni mõju MSC vananemisele ja vastavatele mehhanismidele ei ole veel täielikult hinnatud ja uuritud. Esialgsed aruanded on näidanud, et autofagia on valdavalt tsütoprotektiivne mehhanism ja autofagia suurenenud tase võib rakkude vananemist edasi lükata, vähendades toksiliste metaboliitide akumuleerumist ja taastades organellide funktsiooni [63]. Huvitaval kombel on hiljutised uuringud näidanud ka seda, et MSC vananemise ajal täheldati autofaagiliste vakuoolide ja autofagiaga seotud valkude (LC3-II, ATG7 ja ATG12) arvu suurenemist, samas kui autofagia inhibeerimist bafilomütsiin A1 ja {{11 }}On näidatud, et MA vähendab SA- -gal-positiivsete rakkude protsenti ning p16 ja p21 ekspressiooni [35]. Cur-indutseeritud autofagia ja selle mõju cBMSC vananemisele vahelise seose edasiseks selgitamiseks moduleeriti autofagiat eeltöötlemisega rapamütsiini või 3-MA-ga. Ilmselgelt leiti, et 3-MA nõrgendab autofagilist aktiivsust, samas kui RAP ja Cur (1 uM) suurendavad oluliselt autofagiat (joonis 5). Kooskõlas varasemate aruannetega [5] näitavad meie leiud ka seda, et autofagia pärssimine 3-MA poolt kiirendas rakkude vananemist cBMSC-des. Cur(1uMand RAP) avaldas autofagia aktiveerimisele peaaegu ühtlast mõju, samas kui analoogsed tsütoprotektiivsed toimed Kuvati cBMSC-d. Seega, kui autofagiat inhibeeris 3-MA, vähenes Curi kaitsev toime (joonis ), mis viitab sellele, et Cur-indutseeritud autofagia on potentsiaalne molekulaarne mehhanism cBMSC vananemise parandamiseks (joonis 7).

Füsioloogilistes tingimustes toimub autofagia kõigis eukarüootsetes rakkudes põhitasemel, et säilitada raku homöostaas. Erinevad stressitingimused võivad aga põhjustada ebanormaalset autofagiat, mis mõjutab raku saatust, välja arvatud juhul, kui autofagia taastub optimaalsele tasemele [41, 44, 64]. Meie tõendid kinnitasid, et Cur-indutseeritud autofagia avaldab kasulikku mõju cBMSC vananemise reguleerimisele. Selle stsenaariumi korral tuleks enne Cur-ravi hoolikalt kaaluda erinevaid stressi tekitavaid stiimuleid ja rakuväliseid sätteid ning huvitav oleks uurida, kas Cur-indutseeritud autofagia võib selektiivselt parandada MSC-de funktsiooni etteantud annuse ja kestusega. Lisaks on nanotehnoloogial põhinev kurkumiini manustamissüsteem näidanud paremat vesifaasi lahustuvust ja biosaadavust [65,66]; see võib olla paljutõotav vahend MSC vananemise edasilükkamiseks ja selle vastu võitlemiseks. Vastus küsimusele, kas autofagia on MSC vananemise edasilükkamise peamine alusmehhanism, nõuab siiski rohkem üksikasju, mida annavad tulevased uuringud.

4. Materjalid ja meetodid

4.1.Loomad

Luuüdi proovid koguti kuuelt tervelt täiskasvanud emaselt hiina maakoeralt (12-kuused). Kõik uuringud kiitis heaks Sichuani Põllumajandusülikooli loomade hooldamise ja kasutamise teaduskonna komitee (loa nr.{3}}) ja need viidi läbi Hiina Rahvavabariigi loomakaitseseaduste eetiliste standardite kohaselt.

4.2. Kurkumiini lahuse valmistamine

Cur (HPLC suurem või võrdne 98 protsenti, CAS number:458-37-7; Solar Science& Technology Co., Ltd., Peking, Hiina) lahustati DMSO-s põhikontsentratsioonini 20 mmol/ L. filtreeriti läbi 0,22 μm orgaanilise mikropoorse filtermembraani ja säilitati temperatuuril -80 kraadi. In vitro uuringuteks valmistati söötmes erinevad Cur lahused.

4.3. Rakukultuur ja ekspansioon

cBMSC-d saadi luuüdist. Rakke kultiveeriti täissöötmes, mis koosnes madala glükoosisisaldusega Dulbecco modifitseeritud Eagle söötmest (LG-DMEM, Gibco Grand Island, NY, USA), 10% veise loote seerumist (FBS, TransGen Biotech Co., Ltd., Peking, Hiina). ) ja 1% penitsilliini/streptomütsiini. 80-90 protsendilise liitumise korral vabastati kleepunud rakud Trypsin Digestion Solutioniga (Beyotime Biotechnology Co., Ltd., Shanghai, Hiina) ja laienesid edasi suhtega 1:2-1:3 [67 ].

4.4. Rakkude kasvu Curie

Et määrata cBMSC-de proliferatsioonivõimet passaažides (P)3,6 ja 9, külvati rakud kolmele 48-süvendiga plaadile (2500 rakku süvendi kohta). Pärast 48-tunnist inkubeerimist vabastati rakud trüpsiini seedimise lahusega ja loendati hemotsütomeetriga. Rakkude loendamise protseduuri korrati iga 48 tunni järel ja seda jätkati 14 päeva.

4.5. CBMSC-de immunofenotüübi tuvastamine voolutsütomeetria abil

Kolmandas passaažis pesti cBMSC-sid PBS-ga ja trüpsiiniti. Rakud (3 × 105 rakku/ml) suspendeeriti uuesti värvimispuhvris ja rakususpensioone (100 μL) inkubeeriti FITC, PE või APC fluorestsentsmärgistatud monoklonaalsete antikehadega pinnaantigeenide CD45, CD34 ja ITGB1 (eBioscience, San Diego, CA, USA) ja mittefluorestsentsmärgistusega CD31, CD90 ja CD105 (Biosynthesis biotechnology Co.Ltd. Peking, Hiina) 15 minutit 4 kraadi juures. Rakke pesti PBS-ga ja inkubeeriti FITC-konjugeeritud kitse küülikuvastase IgG-ga 15 minutit 4 kraadi juures. Pinnaantigeenid tuvastati voolutsütomeetria abil (FACS Calibur, Becton Dickinson, San Jose, CA, USA). Andmete analüüs viidi läbi tarkvaraga CytExpert.

4.6. In vitro diferentseerumisanalüüs

cBMSC-d plaaditi 6-süvendiga plaatidele tihedusega 5 × 104 rakku/ml. 70-80 protsendilise liitumise korral asendati täielik sööde osteogeense või adipogeense diferentseerumist esilekutsuva söötmega ja vahetati iga 3 päeva järel (Cvagen, Suzhou, Hiina). Kaltsiumi sadestumine tuvastati Alizarin Red S värvimisega (Solarbio, Peking, Hiina) pärast 3-nädalast osteogeenset induktsiooni ja lipiidide tilkade kogunemist täheldati Oil Red O värvimise (Solarbio, Peking, Hiina) abil pärast 2-nädalast adipogeenset induktsiooni.

4.7. Cur'i mõju rakkude elujõulisusele

CBMSC-de rakuline elujõulisus määrati CCK{0}}komplekti (Vazyme Biotech Co., Ltd., Nanjing, Hiina) abil.cistanche tubulosa eelised ja kõrvaltoimedcBMSC-sid eelkultuuriti 96-süvendplaadil 24 tundi. cBMSC-sid töödeldi Cur-ga erinevatel kontsentratsioonidel (0.1, 0.5, 1, 5 ja 1{ {14}} umol/L) 12 h, 24 h, 48 h ja 72 h. Rakke töödeldi 0,1 protsendi DMSO-ga, mida kasutati kontrollina. Pärast 2-tunnist inkubeerimist 10 μL CCK-8 lahusega süvendi kohta mõõdeti optilist tihedust mikroplaadilugejaga 450 nm juures (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA). Rakkude suhteline elujõulisus arvutati vastavalt tootja juhistele.

4.8. Kolooniate moodustumise analüüs

CBMSC-de iseenesliku uuenemise efektiivsus tuvastati kolooniaid moodustava ühiku-fibroblasti (CFU-F) testiga. cBMSC-d külvati (3 × 10² rakku süvendi kohta) 6-süvendiga plaatidele. Pärast kahenädalast kultiveerimist fikseeriti rakud 4% paraformaldehüüdiga 30 minutit ja vaadeldi pöördmikroskoobi all (LX73, Olympus Corporation, Tokyo, Jaapan) pärast 1% kristallvioletiga värvimist 10 minutit. CFU-F jaoks loendati rohkem kui 50 rakku. CFU-F efektiivsus arvutati järgmiselt:

CFU-F efektiivsus=CFU-F arv seemnete arvu kohta (300 rakku)[68].

4.9. Beeta-galaktosidaasi värvimise test

Vananemisega seotud -galaktosidaasi (SA{2}}gal) aktiivsust cBMSC-des hinnati SA- -gal värvimiskomplekti (Beyotime Biotechnology Co., Ltd., Shanghai, Hiina) abil vastavalt tootja juhistele. . Pärast värvimist uuriti rakke pöördmikroskoobi all. Rakkude vananemise hindamiseks loendati positiivselt värvitud rakud.

4.10. Pöördtranskriptsiooni reaalajas kvantitatiivne PCR (RT-qPCR)

Kogu RNA ekstraheeriti rakupelletitest, kasutades Trizoli reagendi meetodit. cDNA sünteesiti, kasutades PrimeScriptTM RT reaktiivikomplekti koos gDNA Eraseriga (Takara, Shiga, Jaapan). PCR-praimerid (tabel 2) lisaks GAPDH-le, viidates varasematele uuringutele [67], kavandati, kasutades cDNA järjestustel põhinevat Primer Expressi tarkvara (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). QPCR viidi läbi, kasutades TB Green PCR Mixi (Takara, Shiga, Jaapan) CFX96 Touch reaalajas PCR-tuvastussüsteemis (Bio-Rad, Richmond, CA, USA). Reaktsioonitingimused olid järgmised: 95 kraadi 30 s ja seejärel 39 tsüklit 95 kraadi 5 sekundi jooksul ja 60 kraadi 30 sekundit. Sulamiskõvera analüüs viidi läbi alates 95 kraadist 10 sekundi jooksul, seejärel vahemikus 65 kuni 95 kraadi, suurendades iga tsükliga 0,5 kraadi võrra. GAPDH-d kasutati sisekontrollina kõigi andmete normaliseerimiseks ja suhteline ekspressioon arvutati võrdleva tsükliläve (Ct) meetodi abil.

4.11. Lusosomaalse kasutajaliidese jälgimine LysoTrackeriga

Lüsosoomide jälgimiseks kasutati Lyso-Tracker Red (Beyotime Biotechnology Co., Ltd., Shanghai, Hiina), millel võib lüsosomaalse hapestumise korral ilmneda suurenenud fluorestsentsi intensiivsus. Külvasime cBMSC-d 12-süvendiga plaatidele ja töödeldi neid Cur-ga 24 tundi, seejärel töödeldi rakke 20 minutit Lyso-Trackeriga (60 nM) ja Hoechst 33 342-ga (2 ug/ml). Fluorestsentsi jälgiti pööratud fluorestsentsmikroskoobiga pärast PBS-iga pesemist.

4.12. Immunofluorestsents

CBMSC-d (2 × 1{5}}4 rakku slaidi kohta) külvati objektiklaasidele ja fikseeriti 30 minutiks 4% paraformaldehüüdiga. Pärast 5-minutilist koosinkubeerimist 0,5% Triton X-100-ga (Solarbio, Peking, Hiina) sukeldati lõigud 30 minutiks blokeerimislahusesse. Kaetud vedelik eemaldati ja rakke inkubeeriti anti-LC3B antikehadega (1:1000, Abcam, Cambridge, MA, USA) üle öö 4 kraadi juures, seejärel inkubeeriti fluorokroomiga konjugeeritud sekundaarsete antikehadega (Abcam, Cambridge, MA, USA). 50 minutit temperatuuril 37 °C. Lõpuks värviti rakud DAPI-ga (Beyotime Biotechnology, Shanghai, Hiina) ja jälgiti konfokaalse mikroskoobi all.

4.13.Western blottimise analüüs

Rakuproovid lüüsiti pärast jääkülma PBS-ga pesemist proteaasi inhibiitorit sisaldava koe- ja rakulüsaadiga (Solarbio, Peking, Hiina). Rakulüsaadid, mis sisaldasid 15 ug valku proovi kohta, laaditi naatriumdodetsüülsulfaat-polüakrüülamiidi (SDS-PA) (Solarbio, Peking, Hiina) geelidesse ja eraldati elektroforeesiga. Pärast valkude ülekandmist polüvinülideenfluoriidi (PVDF) membraanile blokeeriti viimane mittespetsiifiliselt 5-protsendilise rasvavaba kuiva piimaga (Solarbio, Peking, Hiina) 1 tund toatemperatuuril. Membraane inkubeeriti üleöö primaarsete antikehadega anti-LC3B (1:2{27}}00, Abcam, Cambridge, MA, USA), anti-p62/SQSTM1 (1:4000, Novus Biologicals, Littleton, NH, USA). ) ja anti- -aktiini (1:1000, Abcam, Cambridge, MA, USA) 4 kraadi juures ning blotte pesti enne sekundaarse antikehaga inkubeerimist TBST-ga (Solarbio, Peking, Hiina). :2000, Abcam, Cambridge, MA, USA) 37 kraadi juures 1 tund. Seejärel töötati membraanid välja kemoluminestsentsreaktiividega (Millipore, Billerica, MA, USA) ja visualiseeriti ChemiDocTM Imaging Systemsiga (Tanon-5200, Shanghai, Hiina). Ribatihedus kvantifitseeriti iga rühma jaoks tarkvara Image-Pro Plus 6.0 abil (Media Cybernetics, Silver Spring, MD, USA) ja normaliseeriti -aktiiniga.

4.14. Transmissioonielektronmikroskoopia (TEM)

Rakupellet seediti ja koguti 1,5 ml tsentrifuugitorusse, seejärel fikseeriti 2,5% glutaaraldehüüdiga (Solarbio, Peking, Hiina) 2 tundi toatemperatuuril. Proovid fikseeriti 1-protsendilise osmiumtetroksiidiga 1 tund pärast PBS-iga pesemist, seejärel suurendasime atsetooni lahustes järk-järgult dehüdratsiooni ja sisestasime need 812 epoksüvaikusse (Beijing Zhongjingkeyi Technology Co., Ltd., Peking, Hiina). Seejärel saadi ultra-mikrotoomist (EM UC7, Leica Microsystems Co., Ltd., Heidelberg, Saksamaa) 50 nm lõigud. Sektsioone värviti uranüülatsetaadiga (Zhongjingkevi, Peking, Hiina) 10-15 minutit ja pliitsitraadiga (Zhongjingkei, Peking, Hiina) 2 minutit. Kõiki isendeid vaadati TEM-is (EM-1400PLUS, JEOL, Akishima, Tokyo, Jaapan).

4.15. Statistiline analüüs

Tulemused saadi kolmest sõltumatust katsest ja kõik andmed esitati kui keskmised ± standardhälbed (SD). Statistilisi väärtusi analüüsiti programmi IBM SPSs Statistics 25 abil ja illustreeriti programmiga GraphPad Prism 9.{2}}(GraphPad Software, San Diego, CA, USA). Statistiliselt olulised erinevused määrati, kasutades ühesuunalist dispersioonanalüüsi (ANOVA) ja Studenti t-testi. p väärtused<0.05 were="" considered="" to="" be="" significant="">

5. Kokkuvõtted

Meie leiud valgustavad seost Curi, cBMSC vananemise ja autofagia vahel. Meie uuringu andmed näitavad, et Cur võib leevendada cBMSC-de vananemisseisundit, aktiveerides samal ajal autofagiat ja soodustades lüsosomaalset hapestumist. Lisaks näitasid täiendavad tõendid, et Cur-indutseeritud autofagia on potentsiaalne mehhanism cBMSC vananemise parandamiseks. Cur võib olla paljutõotav aktivaator ja konservaator MSC-de funktsiooni parandamiseks. Meie arvates ei saa mainimata jätta Cur positiivset mõju vananemisele. Tulevased uuringud peaksid keskenduma Cur reguleerimise mõjule MSC saatusele, et suurendada MSC-de terapeutilist potentsiaali mitmesuguste haiguste, näiteks koekahjustuste ning degeneratiivsete ja põletikuliste haiguste korral.

See artikkel on välja võetud artiklist Int. J. Mol. Sci. 2021, 22, 11356. https://doi.org/10.3390/ijms222111356 https://www.mdpi.com/journal/ijms