Vananemine ja pikaealisus on alati olnud organismide võrgutavad teemad. Täiskasvanu tüvirakkude tüübina, millel on võime ennast uuendada

Palun võtke ühendustoscar.xiao@wecistanche.comrohkem informatsiooni

Abstraktne:Mesenhümaalsete tüvirakkude (MSC) vananemine mitte ainult ei takista MSC-de rakendamist regeneratiivses meditsiinis, vaid on ka tihedas korrelatsioonis bioloogilise vananemise ja degeneratiivsete haiguste arenguga. Selles uuringus uurisime kurkumiini (Cur) vananemisvastast toimet koerte luuüdist pärinevatele MSC-dele (cBMSC) ja selgitasime veelgi autofagia modulatsioonil põhinevat võimalikku toimemehhanismi. cBMSC-sid laiendati in vitro standardprotseduuridega, et konstrueerida enneaegse vananemise rakumudel.cistanche dosage redditMeie tõendid näitavad, et võrreldes cBMSC-de kolmanda läbikäiguga täheldati cBMSC-de kuuendal passaažil palju tüüpilisi vananemisega seotud fenotüüpe. Cur-ravi võib parandada cBMSC ellujäämist ja aeglustada cBMSC vananemist vastavalt tähelepanekutele, et ravi Cur (1 uM) võib parandada kolooniaid moodustavate ühikfibroblastide (CFU-F) efektiivsust ja suurendada pluripotentsete transkriptsioonifaktorite (SOX{5}) mRNA ekspressiooni. } ja Nanog), samuti inhibeerib vananemisega seotud beeta-galaktosidaasi (SA- -gal) aktiivsust ja vananemisega seotud markerite (pl6 ja p21) ja põletikueelsete molekulide (kasvaja nekroosifaktor-) mRNA ekspressiooni. (TNF-a) ja interleukiin-6(IL-6)). Lisaks täheldati, et Cur (0.1 uM~10 μM) suurendab autofagilist aktiivsust, mis on tuvastatud mikrotuubulitega seotud valgu 1 kerge ahela 3 (LC3) ülesreguleerimisega, mis on unc51-sarnaselt autofaagiat aktiveeriva kinaasiga. -1 (ULK1), autofagiaga seotud geen (Atg)7 ja Atg12 ning kerge ahela 3 (LC3-II) II tüüpi genereerimine, suurendades seeläbi autofagilisi vakuoole ja happelisi vesikulaarseid organelle. samuti põhjustab p62 valgu taseme olulist langust. Lisaks leiti, et autofagia aktivaator rapamütsiin (RAP) ja Cur parandavad osaliselt cBMSC-de vananemisomadusi, samas kui autofagia inhibiitor 3-metüüladeniin (3-MA) süvendab cBMSC-de vananemist ja Cur-ravi halvendas. suudab taastada allasurutud autofagia ja neutraliseerida 3-MA-indutseeritud cBMSC vananemist. Seega tõstab meie uuring esile Cur-indutseeritud autofagia olulist rolli ja selle mõju cBMSC vananemise parandamisele ning annab uue ülevaate vananemise edasilükkamisest ja MSC-de terapeutilise potentsiaali parandamisest.

Lisateabe saamiseks klõpsake siin

Märksõnad:kurkumiin;vananemine; autofagia; koerte luuüdist pärinevad mesenhümaalsed tüvirakud

1. Sissejuhatus

Vananemine ja pikaealisus on organismide jaoks alati olnud võrgutavad teemad. Kuna mesenhümaalsed tüvirakud (MSC) on täiskasvanud tüvirakud, mis on võimelised end uuenema, pidurdama, diferentseeruma ja migreeruma, asuvad nad laialdaselt erinevates kudedes ja elundites, nagu luuüdis, rasvkoes, amnionivedelikus, platsentas, nabas. nööri ja lihaseid [1, 2] ning neil on oluline roll kudede homöostaasi säilitamisel kogu organismi eluea jooksul [3, 4]. Kogunev tõendusmaterjal on näidanud, et bioloogiline vananemine ja paljude degeneratiivsete haiguste areng võivad olla tingitud MSC vananemisest [5, 6]. Lisaks on MSC-d paljulubavad rakupõhise regeneratiivse ravi allikad, kuid tavaliselt tuleb neid in vitro laiendada, et saavutada ravi jaoks minimaalne siirdamise arv (20-100 miljonit) [7]. Kuid in vitro kultuur ei suuda täielikult simuleerida MSC-de in vivo mikrokeskkonda ja vallandab paratamatult rakkude vananemise [8,9] Vananemine mitootilistes rakkudes toimub vastusena mitmesugustele stressoritele, nagu telomeeride düsfunktsioon [10], DNA. kahjustusi [11], oksüdatiivset stressi [12] ja onkogeeni aktivatsiooni [13] ning viib lõpuks rakkude jagunemise lõppemiseni. Lisaks avaldavad vananevad MSC-d negatiivset mõju bioloogilistele funktsioonidele, sealhulgas immunomodulatsioonile, diferentseerumisele ja migratsioonile [14]. Palju tööd on püüdnud luua tõhusaid strateegiaid vananemise aeglustamiseks MSC-des. Hiljuti on pakutud, et mitmed ravimtaimedest saadud tooted soodustavad organismi tervist ja pikaealisust ning võivad olla paljulubavad vahendid MSC vananemise edasilükkamiseks [15].

Cistanche on vananemisvastane toime

Traditsioonilise hiina meditsiini kurkumist ekstraheeritud hüdrofoobne polüfenool kurkumiin (Cur) on pälvinud suurt tähelepanu tänu oma põletikuvastasele, antioksüdantsele, apoptootilisele, kasvajavastasele ja vananemisvastasele toimele koerakkudes ja teatud haigusmudelites [{ {4}}]. Paljud uuringud on näidanud, et Curil on tervisega seotud eelised vanusega seotud haiguste, sealhulgas osteoartikulaarsete, neuroloogiliste, reproduktiiv- ja südame-veresoonkonna haiguste puhul [20-24]. Vananemine on seotud luu- ja lihaskonna muutustega ning osteoartikulaarsete haiguste tekke ja progresseerumisega. Leiti, et krooniline dieedi sekkumine Curiga parandas keskealiste ahvide käte ja sõrmede motoorset funktsiooni ning avaldas kasulikku mõju vananenud skeletilihastele [25, 26]. Buhrmanni ja kolleegide saadaolevad andmed on näidanud, et Cur võib kondrotsüütide ellujäämist ja põletikulisi reaktsioone tasakaalustades nõrgendada keskkonnast tingitud osteoartriiti [27, 28]. Lisaks avaldab Cur neuroprotektiivset toimet autofagia ja põletiku vahendamise kaudu ning võib seetõttu olla tõhus ravi neurodegeneratiivsete haigustega patsientidele, nagu Alexanderi tõbi, Alzheimeri tõbi ja Parkinsoni tõbi [29,30].

Tõepoolest, asjaolu, et Curil on pleiotroopne aktiivsus, võib seostada nende aktiveerimis- ja kaitsemõjuga MSC-dele [31, 32]. Mitmed uuringud on kinnitanud, et Cur osaleb immunomoduleerivate võimete reguleerimises; MSC-de diferentsiaalne potentsiaal erinevatele rakuliinidele (neurotsüüdid, kondrotsüüdid, adipotsüüdid ja osteoblastid) ning on sellesse protsessi kaasatud mitmetes signaalimehhanismides [2831, 33-35]. Lisaks peetakse Curi ka heaks antioksüdandiks, mis parandab telomeraasi pöördtranskriptaasi (TERT) geeni ekspressiooni suurenemise tõttu roti rasvkoest pärinevate mesenhümaalsete tüvirakkude (ADSC) eluiga [36]. Hiljutine uuring näitas, et p65 inhibeerimine Cur poolt võib takistada rakkude vananemist ja põletikulist aktivatsiooni inimese nabanöörist pärinevates MSC-des [37].cistanche ekstrakti eelisedIlmselgelt on rohkem tähelepanu pööratud Curi vananemisvastasele toimele MSC-des nende tohutu terapeutilise potentsiaali tõttu, kuid selle toime aluseks olevad mehhanismid on endiselt ebaselged. Mõned in vitro uuringute tõendid on kinnitanud, et Curi kasulikud mõjud tuleks seostada selle autofagia moduleerimisega [29, 38-41]. Han ja tema kolleegid näitasid, et Cur suudab kaitsta inimese nabaväädi endoteelirakke (HUVEC-e) H2O2-indutseeritud oksüdatiivsete kahjustuste eest ja et positiivne mõju ilmneb autofagia tugevdamisel fosfatidüülinositool3-kinaasi (PI3K)/Akt/ kaudu. imetajate rapamütsiini (mTOR) inhibeerimise sihtmärk [40]. Teine uuring näitas, et Cur on võimeline soodustama rakkude ellujäämist, inhibeerides hüpoksia/reoksügenatsiooni (H/R) poolt indutseeritud apoptoosi ja liigset autofagiat kardiomüotsüütide seas [41]. Seetõttu sõltub see, kas Cur toimib autofagia positiivse või negatiivse regulaatorina, stressi tekitavast stiimulist ja raku seadistusest ning on vaja rohkem üksikasju, et teha kindlaks, kas autofagia moduleerimine Cur poolt on tõhus strateegia MSC vananemise edasilükkamiseks. Rakusiseste ainete lagunemise ja ringlussevõtu raja põhimõttena mängib autofagia üliolulist rolli raku homöostaasi säilitamisel ja keskkonnasurve talumisel ning sellel on tohutu potentsiaal rakkude vananemise edasilükkamiseks ja vanusega seotud haiguste raviks. Organellide düsfunktsioon ja toksiliste metaboliitide akumuleerumine on vananevate MSC-de peamised omadused [42], mis viitab potentsiaalsele seosele autofagia ja vananemise vahel. Ma ja tema kolleegid leidsid, et vananenud BMSC-de autofaagiline aktiivsus oli noorte BMSC-dega võrreldes vähenenud ja et autofagia inhibiitor 3-metüüladeniin (3-MA) võib kiirendada noorte MSC-de vananemist; seevastu leidsid nad, et autofagia aktivaator rapamütsiin (RAP) võib osaliselt taastada vananenud BMSC-de bioloogilisi omadusi [5]. Hiljutises uuringus uuriti moduleeritud autofagia rolli RAP-i ja 3-MA kasutamise kaudu D-galaktoosi (D-gal) indutseeritud MSC vananemises ja näitas, et RAP leevendas märkimisväärselt MSC vananemist [43]. Huvitaval kombel on mitmed uuringud näidanud, et vananevates MSC-des täheldatakse autofagia suurenemist ja et autofagia on MSC vananemisprotsesside säilitamiseks hädavajalik [44, 45]. Seetõttu on endiselt vastuoluline ja mitmetähenduslik, kas autofagiat võib pidada MSC-de vananemise positiivseks või negatiivseks regulaatoriks. Järelikult oleks huvitav uurida seost autofagia, MSC vananemise ja Cur vahel, mis võiks anda laiema perspektiivi vananemise edasilükkamiseks ja MSC-de terapeutilise potentsiaali parandamiseks.

Selles uuringus oli meie peamine eesmärk selgitada, kas Cur-ravi võib edasi lükata koerte luuüdist pärineva MSC (cBMSC) vananemist ja kas selle aluseks olev mehhanism oli korrelatsioonis autofagia modulatsiooniga. Selleks hindasime fenotüübilist iseloomustust, autofagilist aktiivsust ja geeniekspressiooni pärast Cur-ga kokkupuudet vananevates cBMSC-des, samuti seda, kas seos autofagia ja selle mõju vahel cBMSC-de vananemisele määratakse 3-MA ja RAP-i abil. .

2. Tulemused

2.1. CBMSC-de omadused

CBMSC-sid laiendati in vitro standardsete protseduuridega ja näidati, et need on stabiilselt passeeritud üheksa põlvkonna jooksul (andmeid pole näidatud). CBMSC-d näitasid kogu kultiveerimisprotsessi vältel plastiga kleepuvat ja fibroblastitaolist välimust (joonis 1A). CBMSC-de diferentseerumisvõimet kinnitas adipogeenne ja osteogeenne induktsioon (joonis 1B, C). CBMSC-de immunofenotüüpi hinnati voolutsütomeetria abil. Tulemused näitasid, et rakupopulatsioon ekspresseeris positiivselt CD90, CD105 ja ITGB1 ning negatiivselt CD31, CD34 ja CD45, mis viitab nende pigem mesenhümaalsele kui hematopoeetilisele päritolule (joonis 1 ja tabel 1).

2.2.cBMSC-d kuvavad järk-järgult vananevaid funktsioone koos in vitro laiendamisega

Varajase läbimise cBMSC-del (P1 ja P3) on pikk fusiform või kolmnurkne kuju ja need on pärast kasvu in vitro paigutatud keerisesse (joonis 2A). Seejärel ilmutasid cBMSC-d pikaajalise in vitro kultiveerimise käigus järk-järgult vananemisega seotud fenotüüpe, mida iseloomustas laienenud ja tasane morfoloogia ning proliferatsiooni vähenemine (joonis 2A, B). Lisaks näitasid kolooniaid moodustava ühiku-fibroblasti (CFU-F) testi tulemused, et nii CFU-F arv kui ka kolooniate suurus vähenesid kultiveerimise käigus märkimisväärselt (joonis 2C), mis on kooskõlas allareguleeritud mRNA-ga. pluripotentsete transkriptsioonifaktorite Nanog ja SOX{13}} ekspressioon 6. ja 9. passaažis (joonis 2G).

Vananemisega seotud -galaktosidaas (SA- -gal) on lüsosomaalne ensüüm, mille aktiivsus on tugevas korrelatsioonis raku vananemisega [46]. SA- -gal värvimise tulemused näitasid, et SA- -gal-positiivsete rakkude arv kasvas 7,5±2,4 protsendilt (P3) 65-le.0 ±5.{14}} protsenti (P6) ja 87,3 ± 3,3 protsenti (P9) (joonis 2D).cistanche tšingis-khaanLisaks tuvastati rakutsükli kinaasi inhibiitorite (p21 ja p16) ja põletikueelsete molekulide (TNF- ja IL-6) ekspressiooni suurenemine, mis toimivad vananemisega seotud sekretoorse fenotüübi (SASP) komponentidena. 6. ja 9. lõigul (joonis 2E, F). Seetõttu näitavad cBMSC-d läbipääsust sõltuvat vananevate fenotüüpide suurenemist ja lõpetavad proliferatsiooni 9. passaažil.

2.3. Cur Leevendab cBMSC-de vananevat olekut

6. passaaži cBMSC-sid inkubeeriti Cur puudumisel või juuresolekul annustes 0,1,0,5, 1,5 või 10μmol/mL (μM) 12 h, 24 h, 48 h ja 72 h ning nende rakkude elujõulisust hinnati CCK-8 abil. Tulemused näitasid, et Cur (0.1-10 uM) ei põhjusta cBMSC-des toksilist toimet ja sellel on pärast 24-tunnist töötlemist tuntav mõju cBMSC-de elujõulisuse suurendamisele (joonis 3A). Curi mõju hindamiseks rakkude vananemisele eksponeeriti cBMSC-sid 24 tunni jooksul erinevatele Cur kontsentratsioonidele (0, 1, 1 ja 10 uM). Tulemused näitasid, et SA- -gal-positiivsete rakkude arv vähenes cBMSC-des pärast ravi Cur-ga (1 μM ja 10 uM) oluliselt võrreldes kontrollrühmaga (joonis 3B). CFU-F teste kasutati Cur mõju hindamiseks cBMSC-de (P6) enesereageerimise efektiivsusele. Leiti, et 1 uM Cur annus on kõige tõhusam kontsentratsioon cBMSC-de CFU-F tõhususe parandamiseks. Kuid 10 μM Cur doosil oli ebasoodne mõju cBMSC-de enesereageerimise efektiivsusele (joonis 3C). Lisaks täheldati Curi vananemist leevendavat toimet annuses 1 μM, mis väljendus p16 alareguleerimises, IL-6 ja TNF- ning Nanogi ja SOX-2 ekspressiooni ülesreguleerimine (joonis 3D-F).cistanche eluea pikendamineKokkuvõttes näitavad need tulemused, et Cur annuses 1 uM võib tõhusalt avaldada tsütoprotektiivset toimet vananevatele cBMSC-dele.

2.4. Cur-ravi tõhustatud autofagiline aktiivsus cBMSC-des

Lüsosoomi funktsionaalne aktiveerimine mängib autofagia käigus kriitilist rolli ja lüsosomaalse hapestumise häired kahjustavad lüsosomaalset lagunemisfunktsiooni [38]. Seetõttu tuvastati autofagiline aktiivsus kõigepealt LysoTraceri värvimisega, mis suudab jälgida lüsosomaalset hapestumist. Tulemus näitas, et Cur-iga eelkonditsioneerimine suurendas annusest sõltuvat punase fluorestsentsi intensiivsust cBMSC-des, mis viitas sellele, et lüsosoomide hapestumine oli suurenenud (joonis 4D).

Curi mõju edasiseks hindamiseks cBMSC-de autofagiale kasutasime autofagosoomimarkereid mikrotuubulitega seotud valku 1A/1Belight chain 3 (LC3) ja p62/SQSTM1, mis on autofagilise voo hindamisel kesksed markerid[47,48 ]. Suurenenud autofagilist aktiivsust täheldati cBMSC-des pärast Cur-ga kokkupuudet, mida näitab annusest sõltuv LC{{10}}I konversiooni suurenemine LC3-II-ks koos kiireneva p62-ga. lagunemine (joonis 4A). Lisaks ATG7, ATG12.LC3 mRNA ekspressioon. ja ULK1 reguleeriti pärast Cur-ravi üles (joonis 4B). CBMSC-de ultrastruktuuri uuriti ülekandeelektronmikroskoopia abil. Seejärel täheldasime autofagosoomide ja autolüsosoomide moodustumise suurenemist cBMSC-des pärast ravi Cur-ga annustes 0, 1, 1 ja 10 μM 24 tundi (joonis 4C).cistanche nzImmunofluorestsentsvärvimine näitas ka, et LC3 iseloomulike täppidega fluorestseeruvate punktide arv suurenes märkimisväärselt Cur-töötlusega (joonis 4E). Need tulemused näitasid, et Cur võib soodustada lüsosomaalset hapestumist ja autofagia aktiveerimist annusest sõltuval viisil.

See artikkel on välja võetud artiklist Int. J. Mol. Sci. 2021, 22, 11356. https://doi.org/10.3390/ijms222111356 https://www.mdpi.com/journal/ijms