SARS-CoV-2 retseptori, angiotensiini konverteeriva ensüümi 2 koespetsiifiline ekspressioon kroonilise neeruhaiguse hiiremudelites
Mar 22, 2022
Alates 2020. aasta jaanuarist on raske ägeda respiratoorse sündroomi koroonaviirus 2 (SARS-CoV-2) põhjustatud koroonaviirushaigus 2019 (COVID-19) olnud ülemaailmne rahvatervise probleem. SARS-CoV-2 nakkus tuvastatakse, kui viiruse S-valk seondub peremeesorganismi angiotensiini konverteeriva ensüümiga 2 (ACE2) ja siseneb rakku1,2. Seetõttu võib kõrgem ACE2 ekspressioon elundites, mis on SARS-CoV-2 potentsiaalsed sihtmärgid, suurendada COVID{16}}-nakkuse riski. ACE2 on ensüüm, mis mängib olulist rolli reniin-angiotensiini süsteemis (RAS), kus see muudab angiotensiin (Ang) II Ang1-7-ks ja moodustab ACE2-Ang{{21 }}MAS retseptori telg3. Samuti avaldab see organeid kaitsvat toimet, neutraliseerides ACE-Ang II-angiotensiini tüüpi 1 (AT1) retseptori telje4–7 aktiivsust. Varasemad aruanded on näidanud, et ACE2 muudab oma koespetsiifilisi ekspressioonimustreid erinevates tingimustes, sealhulgas südame-veresoonkonna haigused, suhkurtõbi (DM) janeeruhaigused 8–11. Kopsu ACE2 ekspressioon, mis on eriti oluline SARS-CoV-2 infektsiooni korral, väheneb lipopolüsahhariididest põhjustatud ägeda respiratoorse distressi sündroomi korral12. Teine aruanne näitab, et ACE2 ekspressioon on vanematel meestel kõrgem13. Meditsiiniteaduse ja südamemeditsiini osakonnas, Yokohama City University Graduate School of Medicine, 3-9 Fukuura, Kanazawa-ku, Yokohama 236-0004, Jaapan. 2 Südame-veresoonkonna ja metaboolsete häirete programm, Duke-NUSi meditsiinikool, Singapur, Singapur. 3 Meditsiiniosakond, Mount Sinai Beth Israel, New York, NY, USA. 4 Molekulaarbioloogia osakond, Yokohama City University Graduate School of Medicine, Yokohama, Jaapan. 5Otorinolarüngoloogia osakond, pea- ja kaelakirurgia, meditsiinikool, Yokohama City ülikool, Yokohama, Jaapan. 6 Sisemeditsiin, Kanagawa hambaülikool.
Märksõnad;neeruhaigus; neerud; neerude ACE2; neerukuded; neerupuudulikkus
CISTANCHE PARANDAB NEERU-/NEERUHAIGUST
Lisaks on ACE2 ekspressioon ninas ja harus suurem täiskasvanutel kui lastel14. Kuid meie teadmiste kohaselt on vähestes uuringutes uuritud, kuidas kopsu ACE2 ekspressioon muudes haigustes muutub. Patsiendid, kellel on kroonilineneeruhaigus(CKD) on raske COVID{0}}-haiguse oht, kuid puuduvad tõendid COVID-19 suurenenud levimuse kohta kroonilise neeruhaigusega patsientidel 15–21. Arvestades asjaolu, et COVID{5}}-nakkuse korral on vajalik ACE2, võivad need leiud viidata sellele, et kroonilise neeruhaigusega patsientidel ei suurene ACE2 ekspressioon kopsudes. Eelkõige on rakuline ACE2 ekspressioon arvatavasti seotud vastuvõtlikkusega SARS-CoV-ga nakatumise riskile, mis on seotud SARS-CoV-ga{10}}. Neid hüpoteese toetab ka tõsiasi, et madala ACE2 ekspressiooniga lapsed on COVID-ile vähem vastuvõtlikud{12}} kui täiskasvanud23. Seetõttu viisime selle hüpoteesi lahendamiseks läbi katsed, et uurida muutusi kopsu ACE2 ekspressioonis kahte tüüpi CKD mudelhiirtel: adeniiniga indutseeritud (st adeniini hiired) ja aristolochhappega (AA) indutseeritud (st AA hiired). Samuti on uuritud ACE2 ekspressiooni seost RAS-i blokaatoritega. Siiani on näidatud, et RAS-i blokaatorite kasutamine suurendab mõnel juhul elundi ACE2 ekspressiooni 24–27. Hiljutised epidemioloogilised uuringud on näidanud, et RAS-i blokaatorite kasutamine ei suurenda COVID{21}}–30 riski. Lisaks ei suurenenud ACE2 ekspressioon kopsudes, kui normaalsetele hiirtele manustati RAS-i blokaatoreid31. Siiski ei ole teatatud RAS-i blokaatorite mõjust kopsu ACE2 ekspressioonile kroonilise neeruhaiguse kontekstis; see punkt on COVID-i{26}} ja selle tagajärgede tulevaseks haldamiseks hädavajalik. Siin uurisime CKD mudeli hiirtel RAS-i blokaatorite ravist tingitud muutusi kopsu ACE2 ekspressioonis.
TulemusedAdeniiniga indutseeritud CKD mudelhiirtel oli kontrollrühmaga võrreldes märkimisväärne kaalulangus, neerufunktsiooni langus ja kõrgenenud vererõhk (BP). Algtaseme kehakaal (BW) ja süstoolne BP olid kontroll- ja adeniinirühmas identsed. BW suurenes aja jooksul kontrollrühmas, samas kui see vähenes adeniinirühmas; see kehamassi suurenemine oli rühmade vahel oluliselt erinev (joonis 1A). Adeniini rühmas oli süstoolne BP aja jooksul märkimisväärselt tõusnud võrreldes kontrollrühmaga (joonis 1B). 2 nädala pärast oli albumiini eritumine uriiniga adeniini rühmas võrreldes kontrollrühmaga (adeniinihiired 410±8,3 ug/päevas vs kontrollrühmaga 13,6 ± 1,7 ug/päevas, P) oluliselt kõrgem.<0.001; fig. 1e).="" there="" were="" also="" signifcant="" enhancements="" of="" plasma="" creatinine="" and="" blood="" urea="" nitrogen="" (bun)="" levels="" in="" the="" adenine="" group,="" compared="" with="" the="" control="" group="" at="" 2="" or="" 4 weeks="" (creatinine:="" 2 weeks:="" adenine="" mice="" 0.22±0.01 mg/dl="" vs.="" control="" 0.10±0.01 mg/="" dl,=""><0.05; 4 weeks:="" adenine="" mice="" 0.31±0.06 mg/dl="" vs.="" control="" 0.11±0.01 mg/dl,=""><0.01; bun:="" 2 weeks:="" adenine="" mice="" 65.0±7.0 mg/dl="" vs.="" control="" 25.7±0.5 mg/dl,=""><0.01; 4 weeks:="" adenine="" mice="" 61.7±12.5 mg/dl="" vs.="" control="" 25.6±1.6 mg/dl,=""><0.01; fig. 1c,="" d).="" moreover,="" creatinine="" clearance="" also="" showed="" a="" signifcant="" reduction="" in="" the="" adenine="" group="" (2 weeks:="" adenine="" mice="" 170±15 μl/min="" vs.="" control="" 397±25 μl/min,=""><0.001; 4 weeks:="" adenine="" mice="" 136±29 μl/min="" vs.="" control="" 357±31 μl/min,=""><0.001;>
ACE2 ekspressioon neerudes oli adeniiniga indutseeritud CKD mudelhiirtel võrreldes kontrollidega oluliselt vähenenud, samas kui ACE2 ekspressioon kopsudes ei erinenud rühmade vahel.Neeru histoloogia näitas tuubulite heterogeenset suurenemist ja atroofiat, samuti rakulist infiltratsioonineeru-interstitium, adeniini hiirtel. ACE2 värvumist täheldati mõlemas rühmas peamiselt proksimaalsetes tuubulites, kuid adeniini rühmas oli värvumise määr vähenenud (joonis 2A). ACE2 valgu tasetneerud(hinnanguliselt Western blot analüüsiga) näitas adeniini rühmas olulist vähenemist võrreldes kontrollrühmaga nii 2 kui ka 4 nädala pärast (2 nädalat: adeniini hiired 0,55±0). 9}}4 vs kontroll 1.00±0,10, lk<0.001; 4 weeks:="" adenine="" mice="" 0.32±0.07="" vs.="" control="" 0.90±0.07,=""><0.001; fig. 2c).="" in="">neerude ACE2mRNA ekspressioon näitas adeniini rühmas olulist vähenemist 2 nädala pärast (adeniini hiired 0,61±0.04 vs kontroll 1.00±0,03, P<0.001; fig. 2e);="" a="" similar="" tendency="" for="" reduction="" was="" observed="" at="" 4 weeks,="" although="" the="" difference="" was="" not="" statistically="" signifcant="" (fig. 2e).="" lung="" histology="" findings="" did="" not="" differ="" between="" groups;="" ace2="" staining="" was="" observed="" in="" type="" 2="" alveolar="" epithelial="" cells="" (fig. 2b).="" there="" were="" no="" differences="" in="" ace2="" protein="" or="" mrna="" expression="" levels="" in="" the="" lungs="" at="" 2="" or="" 4 weeks="" (fig. 2d,="" f).="" the="" difference="" in="" plasma="" ace2="" activity="" was="" not="" statistically="" signifcant="">
CISTANCHE PARANDAB neeru-/NEerupuudulikkust
AA-indutseeritud CKD mudeli hiirtel oli võrreldes kandjarühmaga märkimisväärne kaalulangus ja neerufunktsiooni langus, samas kui BP rühmade vahel ei erinenud.BW ja süstoolne BP olid vehiikuli ja AA rühmas identsed. Vehiiklirühmas kehamass aja jooksul suurenes, AA rühmas aga vähenes; see kehamassi tõus oli rühmade vahel oluliselt erinev (joonis 3A). Siiski ei olnud rühmade vahel erinevusi süstoolses BP-s (joonis 3B). Võrreldes vehiiklite rühmaga suurenes AA rühmas plasma kreatiniini ja BUN tase, samuti albumiini eritumine uriiniga (kreatiniin: AA hiired 0.40±{{6}) märkimisväärselt }.03 mg/dl versus kandja 0,14±0,01 mg/dl, P<0.001; bun:="" aa="" mice="" 62.8±4.6 mg/="" dl="" vs.="" vehicle="" 29.0±1.4 ="" mg/dl,=""><0.001; urinary="" albumin="" excretion:="" aa="" mice="" 61.3±7.3 ="" μg/day="" vs.="" vehicle="" 9.5±0.9 μg/day,=""><0.001; fig. 3c–e).="" creatinine="" clearance="" also="" showed="" a="" signifcant="" reduction="" in="" the="" aa="" group="" (aa="" mice="" 72±12="" μl/min="" vs.="" vehicle="" 159±13="" μl/min,=""><0.001;>
ACE2 ekspressioon neerudes oli AA-indutseeritud CKD mudelhiirtel võrreldes kontrollidega oluliselt vähenenud, samas kui kopsu ACE2 valgu tase rühmade vahel ei erinenud. Neerude histoloogia analüüs näitas tubulaarset atroofiat ja rakkude infiltratsioonineeru-interstitium AA rühmas. ACE2 värvumist täheldati mõlemas rühmas peamiselt proksimaalsetes tuubulites, kuid AA rühmas oli värvumise määr vähenenud (joonis 4A). ACE2 valgu tasetneerudnäitasid AA rühmas olulist vähenemist võrreldes vehiikli rühmaga (AA hiired {{0}},22±0,03 vs. vehiikul 1.00±0,08, P<0.001; fig. 4c).="" in="" addition,="">neerude ACE2mRNA ekspressioon vähenes oluliselt AA rühmas (AA hiired {{0}},30±0,02 vs. vehiikul 1.00±0,06, P<0.001; fig. 4e).="" lung="" histology="" findings="" did="" not="" differ="" between="">
ACE2 värvumist täheldati 2. tüüpi alveolaarsetes epiteelirakkudes (joonis 4B) ja kopsu ACE2 valgu tasemes ei esinenud rühmade vahel erinevusi (joonis 4D). ACE2 mRNA ekspressioon kopsudes oli AA rühmas oluliselt madalam kui kandjarühmas (AA hiired 0,76±0.04 vs. vehiikul 1.{11} }±0,04, lk<0.01; fig. 4f).="" moreover,="" there="" was="" a="" signifcant="" reduction="" in="" plasma="" ace2="" activity="" in="" the="" aa="" group="" (aa="" mice="" 84.8±2.6="" rfu/min="" vs.="" vehicle="" 98.3±3.0="" rfu/min,=""><0.01;>
Olmesartaan nõrgendas adeniiniga indutseeritud CKD mudelhiirte BP ja uriini albumiini eritumise suurenemist ning kehakaalu langust.Olmesartaanravi vähendas adeniinihiirte kehakaalu langust (joonis 5A). Olmesartaanravi vähendas oluliselt ka süstoolset BP-d nii kontroll- kui ka adeniinirühmas (adeniinihiirtel 131,5±0,4 mmHg vs kontrollrühma 121,2±0,7 mmHg, P<0.001; olmesartan="" mice="" 111.7±1.1 ="" mmhg="" vs.="" control="" 121.2±0.7 ="" mmhg,=""><0.001; adenine+olmesartan="" mice="" 117.2±0.9 ="" mmhg="" vs.="" adenine="" mice="" 131.5±0.4 mmhg,=""><0.001; fig. 5b).="" in="" adenine="" mice,="" olmesartan="" treatment="" improved="" plasma="" creatinine="" level="" (adenine="" mice="" 0.19±0.02="" vs.="" control="" 0.13±0.01,="" p="" <="" 0.01;="" adenine+olmesartan="" mice="" 0.14±0.01="" vs.="" adenine="" mice="" 0.19±0.02,="" p="" <="" 0.01;="" fig. 5c)="" and="" suppressed="" urinary="" albumin="" excretion="" (adenine="" mice="" 67.9="" ±6.7 μg/day="" vs.="" control="" 18.0±3.6 μg/day,="" p=""><0.001; adenine+olmesartan="" mice="" 52.5±2.3="" vs.="" olmesartan="" mice="" 17.4±3.7 μg/day,=""><0.001; adenine-olmesartan="" mice="" 52.5±2.3 μg/day="" vs.="" adenine="" mice="" 67.9±6.7 μg/day,=""><0.05;>
Olmesartaan ei mõjutanud ACE2 ekspressiooni.Kontroll- ja adeniinirühmas ei muutunud olmesartaanravi ACE2 mRNA ega valgu ekspressioonitasemeid neerudes (joonis 6A, C). Pulmonaalses ACE2 mRNA või valgu ekspressioonitasemes kontroll- ja adeniinirühma vahel muutusi ei toimunud (joonis 6B, D). Samuti ei esinenud olulist erinevust plasma ACE2 aktiivsuses (joonis 6E). Uuriti ka ACE2 mRNA ekspressiooni ülemistes hingamisteedes (neelus), kuid rühmade vahel ei täheldatud olulist erinevust (täiendav joonis S1).
AruteluCOVID{0}} pandeemial on olnud ulatuslik mõju kogu maailmas. Eakate ja kaasuvate haigustega inimeste jaoks on oluline teave nakkusohu ja COVID-i{1}} tõsiduse kohta. Maailmas on läbi viidud arvukalt COVID-19 epidemioloogilisi uuringuid, mis on näidanud, et kroonilise neeruhaigusega patsientidel on suurem tõenäosus haigestuda raskesse COVID-i-1917, kuid COVID-19 haigestumus ei pruugi patsientidel olla kõrgem CKD15–21. Nimelt näitasid mitme metaanalüüsi tulemused, et kroonilise neeruhaiguse esinemissagedus COVID-ga patsientidel oli 1,7–5,2 protsenti{12}}–17,21. Lisaks analüüs 5700 patsiendi kohta, kellel on COVID{17}} New
Yorki piirkond näitas, et 8,5 protsendil oli alusvaraneeruhaigus 19. Arvestades, et kroonilise neeruhaiguse hinnanguline levimus on 9,1 protsenti kogu maailmas18 ja ligikaudu 15 protsenti Ameerika Ühendriikides20, ei pruugi SARS-CoV-2 nakkuse risk suureneda võrreldes kroonilise neeruhaiguse esinemisega. ACE2 mängib olulist rolli COVID-191,2 edasikandumises. Lisaks on ACE2 ekspressioonitase hingamisteede rakkudes seotud SARS-CoV-ga nakatumise riskiga, mis on COVID-i tekitajaga sarnane koroonaviirus-1922. Kuna COVID-19 on hingamisteede haigus, on ACE2 ekspressioon kopsudes haiguse edasikandumise oluline komponent. Käesolevas uuringus püstitasime hüpoteesi, et kopsu ACE2 ekspressiooni vähenemine kroonilise neeruhaiguse korral on seotud kõrgenenud COVID{17}} haigestumuse puudumisega. Seda hüpoteesi toetab tõsiasi, et madala ACE2 ekspressiooniga lapsed on COVID-ile vähem vastuvõtlikud{19}} kui täiskasvanud. Kasutasime oma katsetes kahte tüüpi CKD mudelhiiri, et uurida muutusi kopsu ACE2 ekspressioonis seoses CKD patogeneesiga. Adeniinist põhjustatud krooniline neeruhaigus on tüüpiline haiguse loommudel32. Liigne adeniini manustamine võib esile kutsuda kroonilise neeruhaiguse, põhjustadesneeru-torukujuline obstruktsioon ja degeneratsioon, samutineeru-interstitsiaalne fibroos, mis on tingitud 2–8 dihüdroksüadeniini ladestumisest32,33. Seevastu AA-indutseeritud CKD on põhjustatud fibroosi esilekutsumisest AA-indutseeritud tubulaarkahjustusest34. Need kaks mudelit valiti, kuna on näidatud, et BP suureneb adeniinist indutseeritud CKD mudelis35, samas kui see ei suurene AA-indutseeritud CKD mudelis36. Nimelt on hüpertensioon kroonilise neeruhaigusega patsientidel sagedane tüsistus; eeldasime, et oleks kasulik uurida, kas hüpertensiooni olemasolu või puudumine mõjutab kopsu ACE2 ekspressiooni CKD patogeneesis. Tulemused näitasid, etneerude ACE2valgu tase vähenes mõlemas CKD mudelis. Adeniini hiirtel ei olnud 4 nädala pärast mRNA tasemetes olulist erinevust, kuid valgu tase vähenes. Üks selle lahknevuse põhjusi võib olla translatsiooniliste repressioonide kaasamine. Lambert DW et al. näitas, et miR-421 surus alla ACE2 valgu translatsiooni, mõjutamata ACE2 transkripti taset37. Teine uuring näitas ka, et seerumi miR{5}} suurenes kroonilise neeruhaiguse või hüpertensiooniga patsientidel38, 39. Seega adeniini hiirte rühmas, kellel oli pikem kroonilise neeruhaiguse ja hüpertensiooni periood (4 nädalat), oli miR-421
võib suurendada ja pärssida valgu translatsiooni, mille tulemuseks on lahknevus mRNA ja valgu ekspressiooni vahel. Kopsu ACE2 valgu tase ei erinenud mõlemas CKD mudelis võrreldes kontrollide ja kandjatega. Kuigi on intrigeeriv, et AA-indutseeritud CKD mudelis vähenes kopsu ACE2 mRNA ekspressioon, olid meie leiud märkimisväärsemad, kuna me ei leidnud erinevust kopsu ACE2 valgu tasemetes, mis mõjutavad otseselt SARS-CoV{5}} infektsiooni. Lisaks ei erinenud plasma ACE2 aktiivsus mõlemas CKD mudelis võrreldes kontrollide ja kandjatega. Plasmas lahustuv ACE2 loetakse lõhustunuks ja koerakkudest vabanenuks. On teatatud, et plasma ACE2 aktiivsuse suurenemine on seotud ACE2 valgu vabanemise suurenemisega kudedest, mis viitab ACE2 valgu vähenemisele kudedes40. Seega näitavad käesoleva uuringu tulemused, et plasma ACE2 aktiivsus CKD seisundis ei muutunud, et CKD olekus ei muutu kudedes ekspresseeritud ACE2 valgu vabanemine, mis toetab järeldusi, et ACE2 valgu ekspressioon kudedes ei muutu CKD kontekst. COVID-i{15}} ja RAS-i blokaatorite vaheline seos on pideva uurimistööga seotud arutelude keskmes. Varasemad loomkatsed näitasid, et RAS-i blokaatorid reguleerivad koe ACE2 ekspressiooni üles, mistõttu tekkis kartus, et RAS-i blokaatorite kasutamine võib suurendada SARS-CoV{18}}-nakkuse riski. Kuid RAS-i blokaatorite kasutamine nendes varasemates uuringutes viis koe ACE2 ülesreguleerimiseni ainult teatud patoloogilistes tingimustes24,27; see ülesreguleerimine ei ületanud normaalset vahemikku. Teine uuring, milles uuriti kopsu- janeerude ACE2RAS-i blokaatoritega ravitud normaalsetel hiirtel ekspressioon kontrollrühmaga võrreldes ei suurenenud31. Teisest küljest teatati, et RAS-i blokaatorid, nagu kandesartaan ja kaptopriil, suurendasid kopsude ACE2 ekspressiooni normaalsetel rottidel41. Reaalses kliinilises praktikas on mõned epidemioloogilised uuringud RAS-i blokaatorite kasutamise kohta COVID-ga patsientidel-19 näidanud, et nende ravimite kasutamine ei suurenda COVID{5}}–30 riski. Kuid RAS-i blokaatorite mõju kopsu ACE2 ekspressioonile on endiselt vastuoluline. Üheski varasemas uuringus ei ole uuritud RAS-i blokaatorite mõju kopsude ACE2 ekspressioonile CKD kontekstis, kuigi RAS-i blokaatorid on kroonilise neeruhaigusega patsientide raviks hädavajalikud. Käesolev uuring viidi läbi selle lünga kõrvaldamiseks kirjanduses. Reaalse kliinilise praktika täpsemaks modelleerimiseks kasutasime adeniinist põhjustatud CKD mudelit, millel on samaaegne hüpertensioon. Tulemused näitasid, et RAS-i blokaatori olmesartaani manustamine ei suurendanud pulmonaalset ACE2 ekspressiooni võrreldes kontrollidega. Lisaks ei suurenenud vastusena olmesartaanravile ACE2 mRNA ekspressioon ülemistes hingamisteedes, mis on SARS-CoV-2 infektsiooni algne sihtmärk.Neerude ACE2valgu tase vähenes kroonilise neeruhaiguse mudelis; olmesartaani manustamine ei suurendanud neerude ACE2 valgu taset kontroll- ja adeniinihiirtel. Neeru ACE2 taastumise puudumine olmesartaaniga ravitud adeniini hiirtel võis olla tingitud teistsuguse kroonilise neeruhaiguse mudeli kasutamisest, võrreldes eelmise uuringuga27, samuti angiotensiini retseptori blokaatorite ravi suhteliselt lühikesest kestusest25, 27. Siiski parandas olmesartaanravi mitmeid neerupuudulikkuse parameetreid, sealhulgas albumiini eritumist uriiniga. Need tulemused toetavad RAS-i blokaatorite jätkuvat kasutamist kroonilise neeruhaigusega COVID{6}}-ga patsientidel.
CISTANCHE PARANDAB NEeru-/NEERUNEKTSIOONI
Sellel uuringul olid mõned piirangud. Esiteks uuris see ainult muutusi kopsu ACE2 ekspressioonis CKD mudelhiirtel, samas kui see ei uurinud otseselt SARS-CoV-2 infektsiooni. Teiseks jälgisime selles uuringus adeniini hiiri 4 nädalat ja AA hiiri 8 nädalat, kuid tulemused võivad pikema vaatlusperioodi jooksul olla erinevad. Kolmandaks võib ACE2 ekspressioon kopsudes hiirtel ja inimestel erineda. Neljandaks, kroonilise neeruhaigusega patsientidel on COVID{6}} raskusaste tõenäoliselt suurem, kuid me ei saa viidata raskusastme aluseks olevale mehhanismile. Viiendaks ei määra COVID-i vastuvõtlikkust mitte ainult kopsu ACE2 ekspressioonitase{8}}, vaid seda võivad mõjutada ka paljud muud tegurid. Kokkuvõtteks võib öelda, et me ei leidnud muutusi kopsu ACE2 valgu ekspressioonis CKD mudeli hiirtel, sõltumata hüpertensiooni staatusest. Lisaks ei suurendanud angiotensiini retseptori blokaatorite ravi CKD mudelhiirtel kopsu ACE2 ekspressiooni. Need tulemused viitavad hüpoteesile, et COVID{11}} haigestumuse risk ei pruugi kroonilise neeruhaigusega patsientidel suureneda nende stabiilse pulmonaalse ACE2 ekspressiooni tõttu. Need leiud pakuvad ka olulisi põhilisi teaduslikke tõendeid selle kohta, et RAS-i blokaatoreid saab ohutult kasutada kroonilise neeruhaigusega COVID{13}} patsientide ravis.
Materjalid ja meetodid Loomad.See uuring viidi läbi vastavalt riiklike tervishoiuinstituutide juhistele katseloomade kasutamise kohta. Kõik loomkatsed vaatas üle ja kiitis heaks Yokohama City ülikooli loomuuringute komitee (kinnitusnumber: FA{{{{10}}}}), mis vastasid ARRIVE juhistele. Tehti jõupingutusi kasutatud loomade arvu minimeerimiseks ja minimaalsete kannatuste tagamiseks. Hiiri hoiti kontrollitud keskkonnas 12-h valguse-pimeduse tsükliga temperatuuril 25 kraadi. Hiirtel võimaldati vaba juurdepääs toidule ja veele. CKD mudelhiired. Katsed viidi läbi 8–9-nädalaste isaste C57BL/6 J hiirtega pärast 1-nädalast aklimatiseerumist kõigis rühmades. Adeniinikatses toideti hiirtele dieeti, mis segati 0,2 protsenti adeniiniga (0,2 protsenti adeniini pluss 0,3 protsenti NaCl, 3,6 kcal/g, CE{{). 18}}; CLEA, Tokyo, Jaapan; adeniini rühm) või standardse dieediga (0,3 protsenti NaCl, 3,6 kcal/g, CE-2; CLEA; kontrollrühm) 2 või 4 nädala jooksul. AA katses süstiti hiirtele intraperitoneaalselt AA-d (3 mg/kg) kaks korda nädalas 4 nädala jooksul, millele järgnes 4-nädalane taastumisperiood; vehiikulirühmale süstiti vehiikulit (75% dimetüülsulfoksiidi). Olmesartaanravi katses jagati hiired juhuslikult nelja katserühma: (1) kontrollrühm; (2) adeniinirühm, keda toidetakse 0,2 protsendilise adeniiniga segatud dieediga; (3) kontroll-olmesartaani rühm, töödeldud AT1 retseptori antagonisti olmesartaaniga joogivees (4 mg/kg/päevas; Daiichi Sankyo Chemical Pharma Co., Ltd, Tokyo, Jaapan); ja (4) adeniin-olmesartaani rühm, mille annused on identsed rühmade 2 ja 3 annustega.
BP mõõtmine.Süstoolset BP-d mõõdeti saba-manuti meetodil (BP-Monitor MK-2000; Muromachi Kikai Co., Tokyo, Jaapan), nagu eelnevalt kirjeldatud42,43. Kõik mõõtmised viidi läbi vahemikus 9:00 kuni 14:00 h. Iga hiirega viidi läbi vähemalt 10 mõõtmist ja analüüsiks kasutati keskmist väärtust.Reaalajas kvantitatiivne pöördtranskriptsiooni-polümeraasi ahelreaktsiooni analüüs.Kogu RNA ekstraheeriti kopsust,neeru-, ja neelukude kasutades ISOGEN (Nippon Gene, Tokyo, Jaapan); cDNA sünteesiti SuperScript III First-Strand Systemiga (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Reaalajas kvantitatiivne pöördtranskriptsiooni-polümeraasi ahelreaktsiooni analüüs viidi läbi, kasutades ABI PRISM 7000 Sequence Detection System; pöördtranskriptsiooniprodukte inkubeeriti TaqMan PCR Master Mixi ja kohandatud TaqMan sondiga (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), nagu eelnevalt kirjeldatud44,45. Kasutati järgmist TaqMan sondi: ACE2 (Mn01159003_m1). mRNA tasemed normaliseeriti 18S rRNA tasemetele.
Western blot analüüs.Valgu ekspressiooni analüüsiti Western blot meetodil, kasutades koe homogenaate, nagu eelnevalt kirjeldatud 45, 46. Lühidalt, kogu valgu ekstrakt valmistati kudedest naatriumdodetsüülsulfaati sisaldava proovipuhvriga. Iga proovi valgu kontsentratsiooni mõõdeti NanoDrop One'iga (Thermo Fisher Scientific), kasutades standardina veise seerumi albumiini. Võrdsed kogused valguekstrakti igast koeproovist (kopsukoe: 24 ug, neerukude: 10 ug) fraktsioneeriti 5–20-protsendilisel polüakrüülamiidgeelil (Atto, Tokyo, Jaapan). Eraldatud valgud kanti seejärel polüvinülideendifluoriidmembraanile, kasutades iBlot Dry Blotting Systemi (Invitrogen). Membraanid blokeeriti 1 tund toatemperatuuril fosfaatpuhverdatud soolalahusega, mis sisaldas 5 protsenti lõssipulbrit. Membraane inkubeeriti primaarsete ACE2 antikehadega (Ab108252 1:500 [kops] või 1:1000 [neer], Abcam, Cambridge, MA, USA) ja -aktiiniga (A{{16}). }:10 000, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). Membraane pesti ja seejärel inkubeeriti sekundaarsete antikehadega 60 minutit toatemperatuuril. Antikeha-antigeeni reaktsioonide kohad visualiseeriti täiustatud kemoluminestsentssubstraadiga (Merck, Kenilworth, NJ, USA). Pilte analüüsiti kvantitatiivselt, kasutades ChemiDoc Touchi (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Et võrrelda ACE2 valgu ekspressioonitasemeid kopsudes janeerukudedtavalistel hiirtel viidi samal membraanil läbi täiendav Western blot (täiendav joonis S2). Kirjeldatud valgu kogus fraktsioneeriti geelideks ((A) kops: 24/10/1 ug, neer: 24/10/1 ug, (B) kops: 24/12 ug , neer: 0,2/0,15/0,1 ug); kasutati sama ACE2 primaarset antikeha (Ab108252 1:1000, Abcam, Cambridge, MA, USA). Antikeha spetsiifilisuse uurimiseks kasutati ACE{18}}selektiivset blokeerivat peptiidi (ab198988). Western blotting näitas ühte valguriba, mille ACE2-selektiivselt blokeeriv peptiid kaotas (täiendav joonis S3).
Immunohistokeemiline analüüs.Kopsu- janeeru-hiirte kuded fikseeriti 4% paraformaldehüüdiga ja sisestati seejärel parafiini. Nelja mikromeetri paksused lõigud deparastati ja rehüdreeriti; antigeeni otsimine viidi läbi mikrolaineahjus kuumutamisega. Te lõigud blokeeriti endogeense biotiini aktiivsuse vähendamiseks, kasutades peroksidaasi blokeerivat reagenti (Dako, Carpinteria, CA, USA) ja töödeldi 60 minutit 10-protsendilise normaalse kitse seerumiga fosfaatpuhverdatud soolalahuses. Seejärel inkubeeriti sektsioone ACE2-vastase antikehaga, mis oli lahjendatud 1:500 (Ab15348, Abcam). Antikeha spetsiifilisuse uurimiseks uuriti ka immuunvärvimist, jättes välja primaarse Ab ja kasutades selektiivset ACE{11}blokeerivat peptiidi (ab15352). ACE2 värvimine kopsudes janeerukudes täheldati, mida ei täheldatud siis, kui antikeha eelabsorbeeriti ACE{0}}selektiivse blokeeriva peptiidiga (ab15352) või jäeti välja ACE2 antikeha. (täiendav joonis S4).
CISTANCHE PARANDAB NEERU/NEERU VALU
Biokeemiline analüüs.Pärast 5-protsendilise isofluraananesteesia sissehingamist koguti vereproovid südame punktsiooniga toidetud olekus südame punktsioonide abil. Katseloomad tapeti pärast anesteesiat humaanselt. Plasma eraldamiseks tsentrifuugiti täisvereproove kiirusel 3000 p/min (MR-150, Tomy Seiko Co., Ltd., Tokyo, Jaapan) 4 kraadi juures 10 minutit. Saadud plasmaproove hoiti kuni kasutamiseni temperatuuril -80 kraadi. Plasma kreatiniini, BUN, uriini kreatiniini ja uriini albumiini taset mõõdeti Hitachi 7180 autoanalüsaatoriga (Hitachi, Tokyo, Jaapan).
Plasma ACE2 aktiivsus.ACE2 aktiivsust mõõtis TechnoPro R&D Company (Tokyo, Jaapan), kasutades ACE2 aktiivsuse analüüsi komplekti (SensoLyte 39{11}}) temperatuuril 27 kraadi. Proovid lahjendati 1:1{17}}, kasutades ACE2 aktiivsuse analüüsi komplektiga kaasas olevat analüüsipuhvrit. Analüüs viidi läbi 384-süvendiplaatidel. Plasmaproovid, ainult analüüsipuhver (taust) või võrdlusstandardina 4-metüülkumariin-7-amiid (0,16–5 μM) lisati OptiPlate-384 F reaktsiooniplaadile temperatuuril 10 °C. μL/kaev. Kümme, lisati ACE2 substraadi lahust (0,05 mM 4-metüülkumarüül-7-amiid/Dnp analüüsipuhvris) koguses 10 μL süvendi kohta. Pärast reaktsiooni mõõdeti fluorestsentsi intensiivsust (Ex/Em{22}} nm/390 nm) 5-min intervalliga 3 tunni jooksul, kasutades EnSpire plaadilugejat (PerkinElmer, Waltham, MA, USA). Proovide fluorestsentsi intensiivsus igal ajahetkel arvutati proovide fluorestsentsi intensiivsuse põhjal. Iga proovi kalle (RFU/min) määrati graafiku lineaarse lähenduse põhjal ajavahemikul 30 kuni 90 minutit pärast mõõtmise algust.
Statistiline analüüs.Andmed on väljendatud kui keskmine ± keskmise standardviga. Erinevusi analüüsiti järgmiselt. Viidi läbi kahesuunaline dispersioonanalüüs, millele järgnes Bonferroni post hoc analüüs, et määrata aja jooksul erinevusi adeniini ja kontrollrühmade (joonised 1, 2), AA ja vehiiklirühmade (joonis 3A, B) või adeniini ja olmesartaani vahel. rühmad (joonised 5, 6 ja S1). AA ja kandja hiirte vaheliste erinevuste määramiseks kasutati paarituid t-teste (joonised 3C-F, 4). P väärtused<0.05 were="" considered="" statistically="">