Cistanche fenüületanoolglükosiidide terapeutiline toime ja mehhanism tsüklofosfamiidi poolt indutseeritud spermatogeneesile hiirtel
Mar 11, 2022
Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-post:audrey.hu@wecistanche.com
ZHAODong-hai1, ZHANGLei2, ZHANGYan3, QILing1, ZOU Xiang-ming4
[Kokkuvõte]
Eesmärk:Et uurida terapeutilist toimetCistanche fenüületanoidglükosiididtsüklofosfamiidi poolt indutseeritud spermatogeneesiga hiirtel ja esialgselt selgitada selle toimemehhanismi.Meetod:Etanooliga ekstraheerimise meetodCistanche fenüületanoidglükosiidid. Nelikümmend BALB/C hiirt jagati juhuslikult kontrollrühma, mudelrühma ja väikese annusega hiirtCistanche fenüületanoidglükosiidrühm (50 mg·kg-1) ja suure annusega rühm (100 mg·kg-1), kus igas rühmas oli 10 hiirt. Välja arvatud kontrollrühm, süstiti teiste rühmade hiirtele tsüklofosfamiidi (80 mg·kg-1) iga päev 5 järjestikuse päeva jooksul, et valmistada ette spermatogeneesi häirete hiiremudeleid. Pärast viimast manustamist kasutasid hiired väikese ja suure annusega rühmasCistanche fenüületanoidglükosiididanti vastavad annused sondiga ning kontrollrühma ja mudelrühma hiirtele manustati sondiga sama kogus tavalist soolalahust üks kord päevas 30 päeva jooksul. Kakskümmend neli tundi pärast viimast sondimist võeti hiire munandikude. Testosterooni taseme määramiseks hiire munandikoe homogenaadis kasutati ensüümiga seotud immunosorbentanalüüsi. Võrreldi iga rühma spermatosoidide tihedust, spermatosoidide liikuvust ja spermatosoidide ebanormaalsuse määra. Munandikoe morfoloogilisi muutusi täheldati HE värvimisega. Tulemused: Võrreldes kontrollrühmaga vähenes mudelrühma spermatosoidide tihedus ja spermatosoidide liikuvuse määr (P<0.01), the="" rate="" of="" sperm="" deformity="" increased=""><0.01), and="" the="" level="" of="" testosterone="" in="" the="" testicular="" tissue="" homogenate="" decreased=""><0.01). 0.01);="" compared="" with="" the="" model="" group,="" the="" sperm="" density="" and="" sperm="" motility="" of="" mice="" in="" each="" dose="" group="" of="">Cistanche fenüületanoidglükosiididolid oluliselt suurenenud (P<0.01), the="" rate="" of="" sperm="" deformity="" decreased=""><0.01), and="" the="" testicular="" tissue="" the="" level="" of="" testosterone="" in="" the="" homogenate="" increased=""><0.05 or=""><0.01). histological="" observations="" showed="" that="" the="" seminiferous="" tubules="" in="" the="" testis="" of="" the="" model="" group="" were="" atrophied="" and="" degenerated,="" the="" seminiferous="" epithelium="" was="" significantly="" thinner,="" the="" arrangement="" of="" spermatogenic="" cells="" was="" disordered,="" and="" the="" number="" of="" sperm="" in="" the="" cavity="" decreased;="" the="" number="" of="" the="" seminiferous="" epithelium="" in="" the="" testes="" of="" the="">Cistanche fenüületanoidglükosiidrühm suurenes märkimisväärselt, kihid on selgelt eristatavad, spermatogeensed rakud asetsevad korralikult, tihedalt ja korrapäraselt ning luumenis on näha spermat.Järeldus: Cistanche fenüületanoidglükosiididneil on märkimisväärne terapeutiline toime tsüklofosfamiidi poolt põhjustatud spermatogeneesi häirele hiirtel ja selle mehhanism võib olla seotud testosterooni taseme paranemisega munandikudedes.
[Märksõnad]Cistanche fenüületanoidglükosiidid; tsüklofosfamiid; spermatogeneesi häire; hiired, BALB/C
Sotsiaalse rütmi kiirenemise, halbade eluharjumuste ja keskkonnasaaste ning muude tegurite tõttu on meeste viljatuse peamiseks põhjuseks ebanormaalne sperma kvaliteet, nagu oligospermia ja astenospermia [1]. Praegu on oligospermia ja astenospermia raviks vähem ravimeid ning ravitoime pole ilmne. Traditsioonilise hiina meditsiini retseptid või toimeained parandavad hästi meeste reproduktiivfunktsiooni [2-6]. Retseptiravimite laia valiku tõttu ei ole aga selge seos ravimi farmakoloogilise toime ja efektiivsete koostisosade vahel, mis piirab spermatogeensete ravimite propageerimist ja kasutamist. Hiina meditsiini tõhusate koostisosade uurimisel ja arendusel ning selle ravitoimete uurimisel reproduktiivkahjustuste korral on hea rakendusväärtus.Cistanche fenüületanoidglükosiididon üks olulisemaid toimeaineidCistanche deserticola. Tavaliselt on need looduslikud glükosiidid, mis sisaldavad estersidemeid ja oksoglükosiidsidemeid, mille tuumaks on glükoos. Neid leidub laialdaselt kaheidulehelistes taimedes [7]. Uuringud [8] on seda näidanudCistanchefenüületanoidglükosiididvõib kaitsta roti spermat in vitro oksüdatiivsete kahjustuste eest, kuid selle spermatogeneesi kohta pole teateid. See katse uurib Cistanche fenüületanoidglükosiidide terapeutilist toimet tsüklofosfamiidi poolt indutseeritud spermatogeneesiga hiirte spermatogeensele funktsioonile ning annab eksperimentaalse ja teoreetilise aluse selle rakendamiseks.Cistanche fenüületanoidglükosiididspermatogeneesi häirete ravis.
1. Materjalid ja meetodid
1.1. Laboriloomad, peamised reaktiivid ja instrumendid
40 SPF-klassi täiskasvanud BALB/C hiirt, 6-8 nädala vanused, kehamassiga 20-22 g, osteti Jilini ülikooli põhimeditsiinikooli loomkatsete keskusest ja loomasertifikaadi number : SCXK (Kõrgõzstan) 2008-005. Hiiri kasvatati adaptiivselt 5 päeva enne katset. Söötmistingimused: 22 kraadi ~ 25 kraadi, ööpäevane rütm (12h/12h), tasuta joogivesi ja toit. Cistanche on Xinjiang Dakang Trading Company toode. Süstimiseks mõeldud tsüklofosfamiid osteti ettevõttelt Jiangsu Hengrui Pharmaceutical Co., Ltd. (partii number 11061921). Munandikoe homogenaadi testosterooni ensüümiga seotud immuunanalüüsi komplekt osteti ettevõttelt Tianjin Jiuding Medical Bioengineering Co., Ltd. (partii number) 20120812), muud reaktiivid on kõik kodumaised analüütilised kvaliteediklassid. PLUS384 mikroplaadilugeja (MDC Ameerika Ühendriikides), pöördmikroskoop TE2000U (Nikon, Jaapan) ja J-26XP tsentrifuug (Nanodrop, Ameerika Ühendriigid).
1.2 Cistanche fenüületanoolglükosiidi valmistamine
Fenetüülalkoholi glükosiidi kontsentraati saamiseks ekstraheeriti 10 g tsistanši pulbrit püstjahutiga 70% etanooliga kaks korda, iga kord 2 tundi. Kontsentreeritud lahus kromatografeeriti makropoorsel vaigukolonnis D101 ja elueeriti 70% etanooliga, saades Cistanche fenekosiidi alkoholi. UV-spektrofotomeeter tuvastas ekstrakti lainepikkusel 333 nm.
1.3 Loommudeli ja ravimi manustamismeetodi koostamine
Pärast seda, kui 40 isast BALB/C hiirt toideti adaptiivselt 5 päeva jooksul, jagati hiired juhuslikult 4 rühma (igas rühmas 10 hiirt): kontrollrühm, mudelrühm, Cistanche.Cistanche fenüületanoidglükosiididmadala annusega rühm jaCistanche fenüületanoidglükosiididsuurte annustega rühm. Ülejäänud kolmele hiirte rühmale, välja arvatud kontrollrühm, manustati tsüklofosfamiidi intraperitoneaalselt 80 mg·kg -1 iga hiire kohta 5 järjestikuse päeva jooksul, et valmistada spermatogeneesi häirete loommudeleid. Pärast mudeli ettevalmistamist olid hiired väikese ja suure annusega rühmasCistanchefenüületanoid anti vastavalt 50 ja 100 mg·kg-1·d-1. Kontrollrühma ja mudelrühma hiirtele anti võrdsed kogused tavalist soolalahust. Üks kord päevas 30 päeva jooksul. Kõik hiired surmati 24 tundi pärast viimast ravimi manustamist ja kahepoolsed testid. Parem munand fikseeriti formaldehüüdiga. Munand ja munandimanus võeti vasakult küljelt. Munand homogeniseeriti ja tsentrifuugiti 3,000 min 10 minutit. Supernatant võeti ja hoiti testimiseks jääkastis temperatuuril -20. Vasakut munandimanust testiti spermatosoidide tiheduse, spermatosoidide liikuvuse ja deformatsiooni määra suhtes.
1.4 Sperma tiheduse, spermatosoidide liikuvuse ja deformatsiooni määra määramine
Asetage 10 ml sperma toitelahust [9] sisaldav katseklaas konstantse temperatuuriga veevanni, et see eelsoojendaks 37 kraadini, võtke sidekoe ja rasva eemaldamiseks ühepoolne munandimanus, lõigake kude ja asetage see katseklaasi 37 kraadi juures 10 minutit Kui sperma on täielikult vabanenud, tilgutage 1 tilk vererakkude loendusplaadile ja arvutage sperma tihedus vastavalt rakkude loendusmeetodile. Tulemust väljendatakse spermatosoidide arvuna milliliitri kohta; lisaks võtta katseklaasist 5μL sperma suspensiooni ja sama kogus eosiin-Y-d Segage hästi, asetage 10 minutiks toatemperatuurile, lisage katteklaas ja jälgige valgusmikroskoobiga. Surnud spermatosoidid värvitakse roosaks, elusad spermatosoidid ei värvu ja tsütoplasma on läbipaistev. Iga proov loendab 200 spermat, arvutab spermatosoidide elujõulisuse, tulemus väljendatakse protsentides, spermatosoidide elujõulisus=elusseemnerakkude arv / spermatosoidide koguarv × 100 protsenti . Veel 5 µl sperma suspensiooni fikseeriti 5 minutiks metanoolis, kuivatati ja värviti 2-protsendilise eosiini vesilahusega 1 tund, loputati ja föönitati. Otsige väikese võimsusega läätse all osi, kus spermatosoidid kattuvad vähem, ja kasutage suure võimsusega läätse, et kontrollida sperma morfoloogiat. Iga hiir kontrollis 1,000 täielikku spermat. Konksudeta spermapead, banaanikujulised, amorfsed, rasvased pead ja topeltpead hinnati deformatsioonideks. Arvutati sperma deformatsiooni määr ja tulemused väljendati protsentides. Sperma deformatsioonimäär=deformeerunud spermatosoidide arv / spermatosoidide koguarv × 100 protsenti.
1.5 Reproduktiivhormoonide määramine
Munand kooriti membraanilt ära ja asetati viaalinõusse ning eeljahutatud homogeniseerimiskeskkond (0.01 mol·L-1 sahharoos, 0,01 mol ·L-1 Tris-HCl, 0,1mmol·L-1 EDTA-Na2 lahus, pH 7,4), lõigake munandikude oftalmoloogiliste kääridega, valage see klaasist homogeniseerimiskatsuti ja tsentrifuugige 4 °C juures, 000×g 10 minutit madalal temperatuuril ja võtke supernatant. Kasutage ensüümiga seotud immunosorbentanalüüsi komplekti testosterooni taseme mõõtmiseks munandikoe homogenaadis ja testige iga proovi jaoks 3 paralleelset proovi. Eksperimentaalsed etapid ja meetodid viidi lõpule vastavalt komplekti juhistele.
1.6 Munandite morfoloogiline vaatlus
Võtke HE-ga värvitud hiire munandite parafiinilõigud ja jälgige valgusmikroskoobi all spermatogoonia ja spermatogeensete rakkude jaotumist munandikoes.
1.7 Statistiline analüüs
Statistiline analüüs viidi läbi SPSS17.{1}} statistikatarkvara abil. Iga rühma hiirte spermatosoidide tihedus, sperma liikuvuse määr, sperma deformatsiooni määr ja munandite testosterooni tase väljendati x±s-ina ning rühmade võrdlus viidi läbi ühefaktorilise dispersioonanalüüsi abil.
2. tulemused
2.1. Iga hiirte rühma spermatosoidide tihedus, spermatosoidide liikuvus ja sperma deformatsiooni määr
Võrreldes kontrollrühmaga vähenes mudelrühma spermatosoidide tihedus ja elujõulisus (P<0.01), and="" the="" sperm="" deformity="" rate="" increased=""><0.01). compared="" with="" the="" model="" group,="" the="" sperm="" density="" and="" sperm="" motility="" rate="" of="" mice="" in="" each="" dose="" of="">Cistanche fenoksüetanoolglükosiidsuurenenud (P<0.05 or=""><0.01), and="" the="" rate="" of="" sperm="" deformity="" decreased=""><0.05 and=""><0). .01).="" compared="" with="" the="" low-dose="" cistanche="" phenethyl="" alcohol="" glycoside="" group,="" the="" high-dose="" cistanche="" phenethyl="" alcohol="" glycoside="" group="" had="" higher="" sperm="" density="" and="" sperm="" motility=""><0.05), and="" the="" rate="" of="" sperm="" deformity="" decreased=""><0.05). see="" table="">
2.2 Testosterooni tase hiirte munandite kudedes igas rühmas
Testosterooni tase kontrollrühma ja mudelrühma munandikoe homogenaatides oli (10,26±0,57) ja (5,33±0,84) nmol·L-1, vastavalt. Mudelrühma testosterooni tase oli oluliselt madalam kui kontrollrühmal (P<0.01). the="" testosterone="" levels="" in="" the="" testicular="" tissue="" homogenate="" of="" the="" low-dose="" cistanche="" phenethyl="" alcohol="" glycoside="" group="" were="" (7.55±1.21)="" and="" (10.35±0.94)="" nmol·l-1.="" the="" level="" of="" testosterone="" in="" the="" low="" and="" high-dose="" groups="" of="" cistanche="" cistanche="" ethanol="" glycosides="" was="" significantly="" higher="" than="" that="" of="" the="" model="" group=""><0.05 or=""><0.01). the="" testosterone="" level="" in="" the="" testicular="" tissue="" homogenate="" of="" the="">Cistanchecistanche fenetüülglükosiidi suure annusega rühm oli oluliselt kõrgem kui madala annusega rühmas (P<>
2.3 Hiire munandite morfoloogia igas rühmas
Valgusmikroskoobiga vaadeldes olid normaalrühma munandites seemnetorukesed tihedalt paigutatud, sugurakkude tase ja arv olid suured, seemneepiteel oli korralikult paigutatud ja seemnetorukesed olid kõik nähtavad spermatosoididega. Mudelrühmas olid hiirte munandites olevad seemnetorukesed atroofeerunud ja degenereerunud, seemneepiteel oluliselt hõrenenud, epiteelikihtide arv vähenes, paigutus häiritud ja spermatosoidide arv õõnsuses vähenes. Võrreldes mudelirühmaga on väike annusCistanche fenetüülalkoholi glükosiid.
Rühmas suurenes seemnetorukeste seemneepiteeli kihtide arv, epiteeli paigutus oli korrapärasem ja seemnetorukeste kahjustused ilmselgelt paranesid; seemnetorukeste struktuur suures annusesCistanche fenüületanoidglükosiidrühm paranes oluliselt ning seemneepiteeli kihtide arv ja arv suurenes oluliselt. Korralikult paigutatud seemnetorukestes on küpsed spermatosoidid ja struktuur on põhimõtteliselt taas normaalne. Vaata joonist 1 (sisend 6).
3 Arutelu
Tsüklofosfamiid on tavaliselt kasutatav kasvajavastane ravim ja immunosupressant, mis peamiselt häirib DNA alküülimise kaudu mitmesuguseid rakusiseseid bioloogilisi funktsioone. Reproduktiivtoksilisus on tsüklofosfamiidi [3] üks peamisi kõrvalmõjusid, mis võib kergesti põhjustada sperma DNA kahjustusi ja ebanormaalset sperma arengut. Kliinilised uuringud [10-11] näitavad, et tsüklofosfamiidi reproduktiivtoksilisus võib põhjustada asoospermiat või oligospermiat. , Viib viljatuseni või geneetiliste defektide või väärarengute ilmnemiseni järglastel.
Cistanche tubulosaon mitmeaastane kõrgem parasiittaim Leideni sugukonnast. See on tuntud Hiina meditsiin, mis toidab neere ja yangi, toidab verd ja toidab soolestikku. See on tavaliselt kasutatav retseptiravim meeste reproduktiivfunktsiooni häirete traditsiooniliseks raviks [12].Fenüületanoidglükosiididon üks olulisemaid aktiivseid komponenteCistanche[13] ja neil on lai valik farmakoloogilisi toimeid, nagu oksüdatsioonivastane, vananemisvastane ja kasvajavastane [14].
Selles uuringus kasutati tsüklofosfamiidi spermatogeneesi häire hiiremudeli valmistamiseks ja uuriti Cistanche fenüületanoidglükosiidide terapeutilist toimet tsüklofosfamiidi põhjustatud spermatogeneesi häiretele. Tulemused näitasid, et võrreldes normaalrühmaga vähenes mudelrühma spermatosoidide tihedus, vähenes elulemus ja suurenes deformatsioonimäär. Võrreldes mudelrühmaga võivad kõik Cistanche fenoksüetanoolglükosiidide annuserühmad tõhusalt suurendada spermatosoidide tihedust, suurendada spermatosoidide liikuvust ja vähendada sperma deformatsiooni määra. Ülaltoodud tulemused näitavad, et tsistanche fenoksüetanoolglükosiidid võivad soodustada spermatogeneesi ja kaitsta kahjustatud munandit. Munandite morfoloogia tulemused näitasid, et pärast ravi koosCistanche fenüületanoidglükosiid, oli mudelhiirte munandites seemneepiteeli arv oluliselt suurenenud, kihid olid selgelt eristatavad, spermatogeensed rakud olid paigutatud korralikult, tihedalt ja korrapäraselt ning spermatosoidid on nähtavad luumenis, mis viitab sellele, etCistanche fenüületanoidvõib muutuda Shanhe taastab seemneepiteeli struktuuri ja morfoloogia pärast reproduktiivkahjustust.
Testosteroon reguleerib meeste sugurakkude diferentseerumist ja on vajalik tingimus munandite normaalseks arenguks ja sperma normaalseks esinemiseks. Mõned uuringud [15] teatasid, et androgeeniretseptorite selektiivne väljalülitamine munandi Sertoli rakkudes põhjustas sperma arenguhäireid ja meessteriilsust. Selles uuringus kasutati spermatogeensete ainete tootmiseks tsüklofosfamiidi.
Pärast takistuse vigastuste mudelit oli testosterooni tase hiirte munandikoes oluliselt madalam kui normaalses rühmas. Pärast Cistanche fenüületanoidglükosiidide toimet suurenes testosterooni tase igas annuserühmas ja kõrge annuse rühmas oli testosterooni tase oluliselt kõrgem kui väikese annuse rühmas. Arvatakse, et tsistanche fenoksüetanoolglükosiidid võivad soodustada spermatogeneesi, suurendades testosterooni taset munandikoes, et ravida spermatogeenset düsfunktsiooni, kuid selle mõju mehhanism testosteroonile vajab täiendavat uurimist ja arutelu.
Testosteroon reguleerib meeste sugurakkude diferentseerumist ja on vajalik tingimus munandite normaalseks arenguks ja sperma normaalseks esinemiseks. Mõned uuringud [15] teatasid, et androgeeniretseptorite selektiivne väljalülitamine munandi Sertoli rakkudes põhjustas sperma arenguhäireid ja meessteriilsust. Selles uuringus kasutati spermatogeensete ainete tootmiseks tsüklofosfamiidi.
Pärast takistuse vigastuste mudelit oli testosterooni tase hiirte munandikoes oluliselt madalam kui normaalses rühmas. Pärast tegevustCistanche fenüületanoidglükosiidid, tõusis testosterooni tase igas annuserühmas ja testosterooni tase suure annuse rühmas oli oluliselt kõrgem kui väikese annuse rühmas. Arvatakse, et tsistanche fenoksüetanoolglükosiidid võivad soodustada spermatogeneesi, suurendades testosterooni taset munandikoes, et ravida spermatogeenset düsfunktsiooni, kuid selle mõju mehhanism testosteroonile vajab täiendavat uurimist ja arutelu.
[viited]
[1] Wang Yixin, Zheng Jufen. Uus edu meeste viljatuse uuringutes [J]. Chinese Journal of Andrology, 2006, 12(9): 771-774.
[2] Xie Jianxing, Wang Jun, Chen Ming jt. Guilingji kapsli mõju oligospermiaga mudelrottidele. Sperma tootmise roll ja mõju suguhormoonidele [J]. Guangzhou traditsioonilise hiina meditsiini ja farmaatsia ülikooli ajakiri, 2011, 28(6): 621-623.
[3] Zhang Changcheng, Jia Liangliang, Li Shouchao jt. Epimeediumi üldflavonoidid põhjustavad tsüklofosfamiidi minimeerimist. Uuringud rottide spermabarjääri kaitsva toime kohta [J]. Hiina patendimeditsiin, 2010, 32 (12): 2052-2055.
[4] Xu Lei, Wang Rui, Zhang Weixing jt. Shengjingi graanulid tsüklofosfamiidist põhjustatud spermakahjustuse korral takistavad hiirte terapeutilist toimet [J]. Zhengzhou ülikooli ajakiri: Medical Science Edition, 2008, 43(2): 267-270.
[5] Wang Rui, Xu Lei, Zhang Weixing jt. Hiina meditsiini Shengjingi graanulite mõju spermatogeneesi kahjustusega hiirtele Terapeutiliste toimete eksperimentaalsed uuringud [J]. Chinese Journal of Andrology, 2008, 14 (11): 1046-1049.
[6] Guo Kaihua, Gao Fulu, Niu Siyun jt. Heshouwu keetmise mõju vananevate rottide munandikoele Raku Rb/p53 signaaliülekanderaja mõju [J]. Anatomy Journal, 2010, 41(3): 435-439.
[7] Wu Haihong, Xuan Guodong, Liu Chunquan. Cistanche fenüületanoolglükosiidi refluksekstraktsiooni mõju etanoolifaktori uurimisega [J]. Jiangsu põllumajandusteadused, 2009 (1): 250-251.
[8] Li Gang, Zhu Wenbin, Niu Fei jt. Cistanche fenüületanoolglükosiidi mõju roti spermale Välise oksüdatiivse kahjustuse kaitsva toime uurimine [J]. Lishizhen Traditsiooniline Hiina meditsiin ja Materia Medica, 2010, 21(9): 2205-2207.
[9] Chen Deyu, Liu Limin, Xie Qingdong jne. Spermavastased antikehad sperma mitokondriaalsele funktsioonile [J] mõju. Journal of Shantou University Medical College, 2008, 21(1): 4-6.
[10] KenneyLB, Laufer MR, Grant FD, jt. Kõrge teabe risk Highdoseccyclophaphamiddeforsarcomading lapsepõlves [J]. Cancer, 2001, 91(3): 613-621.
[11] JahunkainenK, EhmckeJ, Houm, jt. Munandite funktsioon ja viljakuse säilitamine pahaloomuliste kasvajate korral [J]. BestPrect ResClinEndocrinol Metab, 2011, 25: 287-302.
[12] Gao Zhanyou, Zhou Haitao, Lin Qiang. Cistanche võime seista vastu treeningväsimusele rottidel ja aju vabade radikaalide mõju [J]. Anhui Agricultural Sciences, 2011, 39(16): 9592-9595.
[13] Ren Lu, Gu Xiaohong, Tang Jian jt. Fenüületanoolglükosiidid kultiveeritud Cistanche cistanche Ekstraheerimise ja puhastamise uuringud [D]. Wuxi: Jiangnani Ülikool, 2006, 25(3): 33-36. [14] Jinghui, Zuo Jianfeng, Li Jiaoshe. Fenoksüetanoolglükosiidide farmakoloogiliste uuringute edusammud Näitus [J]. Lishizhen Medicine ja Materia Medica, 2006, 17(3): 440-441.
[15] ChangC, ChenYT, YehSD jt. Infomeedia kevadine TheandrogenreceptorinSertolicells [J]. ProcNatlAcadSci USA, 2004, 101 (18): 6876-6881.
