Geneetilise testimise roll neeruhaigustega laste diagnostilises töös: üheainsa asutuse kogemus

AbstraktneEesmärkPärilikud neeruhaigused on laste neerupuudulikkuse peamised põhjused, mille tulemuseks on suurenenud suremus, kõrged tervishoiukulud ja vajadus elundisiirdamise järele. Järgmise põlvkonna sekveneerimistehnoloogiad võivad aidata diagnoosida haruldasi monogeenseid seisundeid, võimaldades optimeerida meditsiinilist juhtimist ja ravivalikuid.

Meetodid Kliiniline eksoomide sekveneerimine (CES) viidi läbi ühest asutusest pärit 191-st pediaatrilisest patsiendist koosneval rühmal, millele järgnes Sangeri sekveneerimine tuvastatud variantide kinnitamiseks ja perekondlike segregatsiooniuuringute jaoks. Tulemused Kõigil patsientidel oli kliiniline neeruhaiguse diagnoos: peamised haiguskategooriad olid glomerulaarhaigused (32,5%), tsiliopaatiad (20,4%), CAKUT (17,8%), neerukivitõbi (11,5%) ja tubulaarne haigus (10,5%). 7,3% patsientidest esines muid haigusi. CES-i ja Sangeri valideerimisel põhinev lõplik geneetiline test saadi 37,1% patsientidest. Suurim avastamismäär saadi tsiliopaatiate (74, 4%), millele järgnesid neerukivitõbi (45, 5%) ja tubulaarsed haigused (45%), samas kui enamik glomerulaarhaigusi ja CAKUT jäid diagnoosimata. Järeldused Tulemused näitavad, et kroonilise neeruhaigusega laste diagnostilises töövoos järjekindlalt kasutatav geneetiline testimine võib (i) kinnitada kliinilist diagnoosi, (ii) anda varajase diagnoosi pärilike seisundite korral, (iii) ja varem tuvastamata haiguste geneetilise põhjuse. haigused ja iv) kohandatud siirdamisprogrammid.

Märksõnad Kliiniline eksoomi sekveneerimine, järgmise põlvkonna sekveneerimine,Neeruhaigused, Geneetiline testimine, Pediaatriline kohort

CISTANCHE EEST HAKKAMISEKS KLIKI SIIALÕPPSTAADIUM NEREHAIGUS

Sissejuhatus

Pediaatrilised nefropaatiad hõlmavad kliinilise pildi, evolutsiooni ja ravivõimaluste osas väga erinevaid haigusi [1–4]. Ligikaudu 30% kroonilise neeruhaigusega (CKD) lastest kannatavad monogeense seisundi all, see protsent suureneb, kui arvestada lõppstaadiumis neeruhaigusega (ESRD) lapsi [5, 6]. Paljud neist lastest jäävad siirdamise ajal diagnoosimata [4, 6, 7]. Nende patsientide diagnoosini jõudmine ei tähenda mitte ainult diagnostilise odüsseia lõppu, vaid pakub mitmeid eeliseid prognoosimise, juhtimise ja ravi seisukohalt.

Uudsed uuringud on järjekindlalt näidanud, et järgmise põlvkonna sekveneerimismeetodite (NGS) rakendamine on oluliselt parandanud pärilike neeruhaigustega (IKD) patsientide diagnostilist tulemust [8]. Viimasel ajal on NGS-i laialdane kasutamine muutnud geneetilise diagnoosi kättesaadavaks mõistliku aja ja taskukohaste kuludega, tekitades küsimuse, kas ja millal tuleks see integreerida rutiinsesse diagnostikatöövoogu [5].

Laste geneetiline diagnoos on erinevate aspektide jaoks ülimalt oluline. Esimene on see, et see võib olla asjakohane haiguse kliinilises lähenemisviisis, tüüpiline näide on nefrootiliste sündroomide puhul, kus podotsüütidega seotud geenide struktuursete variantide tuvastamine on vastu immunosupressiivsetele ravimeetoditele, mida muidu kasutataks rutiinselt mitme perioodi jooksul. kuud [9]. Teine on see, et see võib olla väga oluline lapse perekonna jaoks ja teiste liikmete tuvastamiseks, kes kannavad varianti, mis võib tulevastele põlvedele edasi kanduda. Kui patogeenne variant on proovis tuvastatud, on pereliikmete kaskaadtestimine ja geneetiline nõustamine variandi kandjatel kliinilise geneetika tavapraktika [5]. Kolmas on see, et patogeense variandi teadmine on siirdamise kontekstis hädavajalik, kui doonor võib olla sugulane. Tõepoolest, on ülioluline välistada sama variandi(de) olemasolu elundidoonoril, samuti on oluline tuvastada kõik potentsiaalselt siirdamist vajavad pereliikmed. Neljandaks on see, et mõnel haigusel on pärast elundisiirdamist suur retsidiivi risk, näiteks fokaalne segmentaalne glomeruloskleroos [10] või nende tulemust võib parandada tehtava siirdamise kohandatud valik, näiteks esmase siirdamise korral. hüperoksaluria, mille puhul kombineeritud neeru-maksa siirdamine võib anda parema tulemuse [11]. Lõpuks võib haiguse selge diagnoos olla kasulik, et patsient osaleks kliinilistes uuringutes ja saaks kasu uutest ravivõimalustest [12, 13].

2018. aasta lõpus alustasime koostöös pediaatriliste nefroloogide ja geneetikute vahel geneetiliste testide läbiviimist monogeensete seisundite osas, mis võivad viia ESRDni ja seega siirdamiseni. Meie haigla on Loode-Itaalia suurim haigla, kus elab umbes 5 miljonit inimest. Valisime "üks suurus sobib kõigile" tüüpi analüüsi koos kliinilise eksoomi sekveneerimisega, st ligikaudu 6700 geeniga, mis on seotud monogeensete seisunditega, keskendudes analüüsile kliinilisele kahtlusele kohandatud geenipaneelidele ja seega piirates juhuslikke leide ja järjestuse analüüsi aja vähendamine.

Üldiselt saime selle torujuhtme rakendamisel avaldatud andmetele vastava diagnostilise saagise, mille erinevate kliiniliste kahtluste vahel oli ootuspärane heterogeensus. Saadud tulemused kinnitavad rutiinse geneetilise testimise ja nõustamise olulisust nefropaatiate all kannatavate pediaatriliste patsientide diagnostilises tööprotsessis. Tõepoolest, põhjuslike variantide tuvastamine on nende kliinilise juhtimise ja potentsiaalselt optimaalse elusdoonori valiku jaoks kriitiline.

materjalid ja meetodid

Patsientide värbamine

Uuring põhines Regina Margherita lastehaigla pediaatrilise nefroloogia, dialüüsi ja siirdamise osakonna poolt värvatud 191 järjestikusest pediaatrilisest patsiendist (värbamisel alla 18-aastased) koosneval diagnostilisel rühmal, kes suunati immunogeneetika ja siirdamisbioloogia teenistusse. geneetiline analüüs. Kõik uuringus osalenud patsiendid andsid võimaluse korral mõlema vanema allkirjastatud kirjaliku teadliku nõusoleku.

Proovide ettevalmistamine, sekveneerimine ja bioinformaatika analüüsid

Nukleiinhapete ekstraheerimine perifeersest verest, DNA kvaliteedi analüüs, raamatukogu ettevalmistamine ja sekveneerimine viidi läbi nagu varem teatatud [14]. Sekveneerimisel saadud töötlemata andmed teisendati FASTQ-failidesse ja joondati seejärel Enrichment 3.1.0 või DRAGEN Enrichment tööriistadega (Illumina) ning kaardistati TruSight One Expanded v2.{5}} manifestiga, kasutades Homo Sapiens UCSC GRCh37 genoomi kui viide failide ühe nukleotiidi variantide, koopiaarvu variantide (CNV) ja struktuursete variantide saamiseks. Koopiate arvu tuvastamiseks kasutati lähtejoont, mis koosnes 5 erineva patsiendi sekveneerimisandmetest, mis kõik olid CNV suhtes negatiivsed (vastavalt massiivi võrdlevatele genoomse hübridisatsiooni andmetele). See lähenemisviis võimaldab tuvastada CNV-d isegi seksuaalkromosoomides, kuna võrdlusrühma moodustasid nii naised kui ka mehed ning analüüsitava subjekti sugu täpsustati alati joondamise faasis. Variantide kutsumine ja prioriseerimine tehti kindlaksmääratud kriteeriumide järgi. Huvipakkuva geeni lugemite joondamist ja eksonite katvust kontrollis ja kuvas Integrative Genomics Viewer IGV, mis on vabalt saadaval UC San Diego (California ülikooli) ning MIT Broad Institute ja Harvardi ülikooli (Boston) poolt (//software.broadinstitute. org/tarkvara/igv/). Geneetilises lõpparuandes sisalduvad variandid klassifitseeriti Ameerika Meditsiinigeneetika ja Genoomika Kolledži (ACMG) kriteeriumide järgi.

In silico geenihaiguste nimekirja koostamine

Kliiniliste kahtluste põhjal määratleti geenid, mida tuleb arvesse võtta variantide tuvastamisel ja prioriteetide seadmisel. Loodi in silico geenide loendid, mis sobitasid (i) erinevatest andmebaasidest pärinevad andmed, korreleerides genotüübi fenotüübiga (OMIM, PanelApp England, ClinGen, Malacards) ja (ii) kirjanduse andmetega. Saadaolevaid geeniloendeid uuendatakse kord aastas, tuginedes uutele tõenditele geenihaiguste seose kohta.

Sangeri sekveneerimine ja multipleksligeerimisest sõltuv sondi amplifikatsioon (MLPA)

NGS-i poolt tuvastatud variantide kinnitamiseks ja perede segregatsiooniuuringuteks viidi läbi Sangeri sekveneerimine ja/või MLPA analüüsid. Lühidalt öeldes ekstraheeriti DNA, alustades teisest sõltumatust probandi perifeerse vere alikvoodist ja vanematest. Huvipakkuvaid DNA piirkondi amplifitseeriti PCR abil, kasutades spetsiifilisi katsetingimusi. Amplifitseeritud piirkondade puhtust ja spetsiifilisust kontrolliti 0,8 või 1,5% agaroosgeeliga. Seejärel sekveneeriti amplifitseeritud PCR produktid, kasutades samu praimereid. PKD1 variantide puhul viidi valideerimine läbi pikamaa-PCR-iga, millele järgnes pesastatud PCR, et vältida pseudogeenidest järeldusi.

Tulemused

Geneetilise analüüsi tulemuste tagastamise kriteeriumide määratlemine

We previously reported on the design and set-up of a "kidney" gene panel that comprises>400 geeni, mis kõik on seotud neeruhaiguste eri vormidega [14]. Selle uuringu jaoks rakendasime analüüsi alampaneelidega, mis keskendusid konkreetsele kahtluse kliinilisele kategooriale (nt CAKUT, glomerulopaatia, tubulopaatia jne) ja määrasime analüüsimiseks eelnevalt konkreetse geenirühma. See lähenemisviis piiras analüüsitud geenide arvu, lihtsustades analüüse ja vähendades juhuslike leidude arvu. Alles siis, kui vastava(te) paneeli(de)ga analüüsivälja lõpus oli geneetiline tulemus negatiivne ja (i) kliiniline fenotüüp ei olnud selgelt näidatud või (ii) kattub erinevate haiguskategooriatega, laiendati geneetiline analüüs nn. "neeru täisloend või neerunoom", superpaneel, mis sisaldab kõiki alampaneelides sisalduvaid geene.

Esimese sammuna määratlesime kriteeriumid NGS-i tulemuste tõlgendamiseks. Pärast kliinilise eksoomi sekveneerimise (CES) ja andmete joondamise läbiviimist määrati asjakohaste variantide filtreerimiseks analüüsi torustik. Täpsemalt, kliinilise kahtluse põhjal filtreeriti tuvastatud variandid erinevate haiguste makrokategooriate jaoks spetsiifiliste in silico geenide loendite põhjal. Sünonüümsed variandid, mis ei mõjuta splaissimise mehhanismi, või intronilised variandid, mis splaissingupiirkonnas ei vastandu, jäeti välja, võttes arvesse ainult mittesünonüümseid, mõttetuid, kaadri nihkeid ja splaissimist mõjutavaid variante. Kaasati kümme, ainult haruldast varianti (sagedus alla 1% populatsioonis) ja variante, mille alleeli sagedus patsiendil oli vähemalt 0,2 ja katvus vähemalt 20 lugemist. Ülejäänud variandid märgiti ja kureeriti täiendavalt (i) pärimisviisi, (ii) nukleotiidide säilimise, (iii) valgu mõju, skooride kontrollimiseks erinevate andmebaaside ja (iv) kirjanduse, kui neid on, põhjal. Siinkohal loetleti filtreeritud variandid niinimetatud "tehnilises aruandes". Tehnilist aruannet tõlgendas meditsiinigeneetik, et koostada lõplik geneetiline aruanne patsiendi ja tema perekonna jaoks. Geneetilise konsultatsiooni käigus pakuti välja perekonna segregatsiooni uuringud, et (i) kinnitada proovis olevad variandid ja (ii) kaasata / välistada mittepõhjuslikud variandid, mis põhinevad nende segregatsioonil perekonnas (joonis 1).

Nende kriteeriumide vastuvõtmisega saime määratleda kolm erinevat geneetiliste aruannete kategooriat. Esiteks "veenev aruanne", mis sisaldas patogeenseid (C5) ja tõenäoliselt patogeenseid (C4) variante. Teateid tundmatu tähtsusega variantide (C3) kohta peeti lõplikuks ainult siis, kui need olid täielikult kooskõlas kliinilise pildiga ja kui perekonna segregatsiooniuuringud kinnitasid nende võimalikku rolli. Teiseks "ebakindel aruanne", mis sisaldas CES-i poolt tuvastatud C3 variante, mida ei ole veel või ei saanud perekonna segregatsiooniuuringute kontekstis valideerida, või C4/C5 variante, mis ei olnud kliinilise fenotüübiga täielikult kooskõlas. Kolmandaks "ebaselge aruanne", mis sisaldas (i) negatiivset CES analüüsi, mis tähendab, et NGS ei tuvastanud ühtegi varianti; (ii) üksikud variandid retsessiivsetes geenides; ja (iii) C3 variandid, mis ei ole kooskõlas kliinilise fenotüübiga, mis tuvastati analüüsi laiendamisel kõigileneeruhaigustega seotud geenid(Joonis 1).

Värbatud kohordi põhijooned

Selles uuringus kirjeldatakse 191-st pediaatrilisest patsiendist (0–18-aastased) koosnevat rühma, kelle pediaatriline nefroloogiaüksus suunas 2018. aasta novembrist kuni 2022. aasta maini järjestikku geneetilisele analüüsile, kusjuures igal aastal registreeriti keskmiselt 50 uut patsienti. . Geneetilise testimise kriteeriumid olid (i) nefropaatia, mis oli seotud positiivse neeruhaiguse perekonna anamneesiga või (ii) kliiniline kahtlus monogeense seisundi kohta või (iii) vajadus välistada monogeenne seisund (nagu nefrootiliste sündroomide puhul, kui monogeensed versus mittemonogeensed haigused on prognoosi ja ravi seisukohalt kliiniliselt olulised).

Kohort jaotati kliinilise kahtluse alusel, võttes arvesse 6 erinevat haiguse makrokategooriat: neeru- ja kuseteede kaasasündinud kõrvalekalded (CAKUT; n=34), tsiliopaatiad (n=39), glomerulopaatia (n=62), neerukivitõbi (n=22), tauopaatiad (n=20) ja muud haigused, mis hõlmasid ka sündroomilisi fenotüüpe (n=14). Välja arvatud CAKUT ja tubulopaatiad, mis näitasid võrdset jaotumist naiste ja meeste vahel, esines kõigis teistes kategooriates meessoost subjekte (joonis 2a). Värbamise vanust vaadates ei esile tõstetud oluliselt erinevat jaotust erinevate rühmade vahel, keskmine vanus oli vastavalt 6,7 kuni 10 aastat "muude haiguste" ja glomerulopaatiate puhul. Keskmist vanust vaadeldes näitasid CAKUTi haigused kaasasündinud fenotüübi järgi madalaimat väärtust (4,6 aastat vanad). Etnilise päritolu seisukohast, sõltumata vaadeldavast haiguse makrokategooriast, olid enamik patsiente eurooplased, järgnesid aafriklased, kusjuures vaid mõned patsiendid olid Aasia, Ladina-Ameerika või ristand (joonis 2b). Kohordi hulgas oli ainult 8 patsiendil sugulussugulased vanemad.

Joonis 1 Geneetilise andmete analüüsi konveier ja variandi kaasamise kriteeriumid. Analüütilise konveieri skemaatiline esitus, mis on vastu võetud variandi tuvastamiseks ja prioritiseerimiseks, sealhulgas kõik sisse- ja väljafiltrimiskriteeriumid. Saadud variandid lisati lõplikku geneetilisse aruandesse. Võimaluse korral viidi läbi variandi(de) valideerimise ja perekonna segregatsiooni uuringud. Geneetilised aruanded klassifitseeriti näidatud kriteeriumide alusel lõplikuks, ebakindlaks või ebaselgeks. Selle klassifikatsiooni põhjal arvutati meie järgmise põlvkonna sekveneerimise (NGS) töövoo diagnostiline kiirus. 1 kg: 1000 genoomi andmebaas; Alt fr: muudetud sagedus; C3: tundmatu tähtsusega variant; C4: tõenäoliselt patogeenne variant; C5: patogeenne variant; AR: autosoomne retsessiivne

Lõpuks, kui võtta arvesse neeruhaiguste perekonna ajalugu, võttes arvesse mees- ja naissoost isikuid, ilmnes positiivsete ja negatiivsete juhtumite jaotuse heterogeensus, võttes arvesse erinevaid haiguskategooriaid. Üldiselt ei iseloomustanud enamikku värvatud kohorti ja soost sõltumata positiivset perekonna ajalugu, nagu on näidatud CAKUTi, glomerulopaatiate, tauopaatiate ja muude neeruhäirete puhul. Kuid tsiliopaatiate ja nefrolitiaasi puhul esines märkimisväärsel osal juhtudest positiivne perekond, mille jaotus naiste ja meeste vahel oli erinev (13 juhtu 22-st tsiliopaatiate ja 5 12-st nefrolitiaasi juhtudest; joonis 2c).

Kliinilisest vaatenurgast oli kohort üsna heterogeenne, hõlmates erinevaid esmaseid haigusi (joonis 2d). Nende hulgas olid enim korduvad kliinilised kahtlused polütsüstiline neeruhaigus (n=27), CAKUT (n=25), nefrootiline sündroom (n=19), fokaalne segmentaalne glomeruloskleroos (FSGS; n =14) ja Alporti sündroom (n=13; joonis 2d).

Wecistanche'i tugiteenus - Hiina suurim tsistanšeksportija:

E-post:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tel:+86 15292862950

Lisateabe saamiseks ostke:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop

25% EHHINAKOSIIDI JA 9% AKTEOSIIDIGA LOODUSLIKU ORGAANILISTE KISTANŠEKSTRAKTIDE SAAMISEKS KLIKI SIIN