Kvertsetiini kaitsev toime hüpoksiast ja reoksüdatsioonist kahjustatud endoteelirakkudele

Lisateabe saamiseks võtke ühendusttina.xiang@wecistanche.com

Taust: Tserebraalne väikeste veresoonte haigus (CSVD) on kliiniliste sündroomide rühm, mis hõlmab kõiki aju väikeste veresoonte patoloogilisi protsesse, mis võivad põhjustada insulti ja tõsist dementsust. Kuna aga CSVD patogenees pole selge, on ravi piiratud. Endoteelirakkude düsfunktsioon on varasem kui kliinilised sümptomid, nagu hüpertensioon ja leukoos. Seetõttu eeldatakse, et endoteelirakkude ravi on uus läbimurre.kvertsetiin, paljudes taimedes leiduv flavonoid, millel on põletikuvastane ja oksüdatsioonivastane funktsioon. Selle uuringu eesmärk oli uurida kvertsetiini kaitsvat toimet endoteelirakkude vigastustele ja anda põhiteooria hilisemaks kliinikus kasutamiseks.

Meetodid: Inimese aju mikrovaskulaarseid endoteelirakke (HBMEC) kultiveeriti in vitro ja endoteelirakkude vigastusmudel määrati kindlaks hüpoksia ja reoksügeenimise (H/R) abil. Kvertsetiini kaitsvat toimet HBMEC-dele uuriti rakkude elujõulisuse, rakkude migratsiooni, angiogeneesi ja apoptoosi vaatenurgast. Kvertsetiini mehhanismi edasiseks uurimiseksoksüdatiivne stressja endoplasmaatilist retikulumi stressi analüüsiti. Veelgi enam, uuriti ka hematoentsefaalbarjääri (BBB) ​​terviklikkust.

Tulemused: kvertsetiinvõib soodustada HBMEC-de elujõulisust, migratsiooni ja angiogeneesi ning pärssida apoptoosi. Lisaks võib kvertsetiin aktiveerida ka Keap1/Nrf2 signaaliraja, vähendada ATF6/GRP78 valgu ekspressiooni. Edasised uuringud näitasid, et kvertsetiin võib suurendada Claudin-5 ja Zonula occludens-1 ekspressiooni.

Järeldused: Meie katsed näitavad, et kvertsetiin võib kaitsta HBMEC-e H/R eest, mis soodustab rakkude proliferatsiooni, rakkude migratsiooni ja angiogeneesi, vähendades mitokondriaalse membraani potentsiaalset kahjustust ja pärssides raku apoptoosi. See võib olla seotud selle antioksüdatsiooni ja endoplasmaatilise retikulumi stressi pärssimisega. Samal ajal võib kvertsetiin tõsta BBB konneksiini taset, mis viitab sellele, et kvertsetiin võib säilitada BBB terviklikkuse.

Märksõnad: aju väikeste veresoonte haigus, endoteelirakud, kvertsetiin, oksüdatiivne stress, endoplasmaatiline retikulum, hematoentsefaalbarjäär

SISSEJUHATUS

Aju väikeste veresoonte haigus(CSVD) on katustermin, mis hõlmab kõiki patoloogilisi protsesse, mis hõlmavad aju väikeseid veresooni, ning viitab mitmesuguse etioloogiaga kliiniliste, pildistamis- ja patoloogiliste sündroomide rühmale, mis sisaldavad koljusisestest arterioolidest veenidesse (läbimõõt).<400 μm）（wardlaw="" et="" al,2013;="" wardlaw="" et="" al,2019).="" the="" most="" common="" symptoms="" include="" mainly="" new-onset="" subcortical="" small="" infarcts,="" lacunar="" foci="" of="" vascular="" origin,="" cerebral="" white="" matter="" hyperintensities,="" microbleeds,="" cerebral="" atrophy,="" and="" enlarged="" perivascular="" spaces="" (wardlaw="" et="" al,2013).="" with="" the="" progression="" of="" the="" disease,="" subclinical="" and="" early-stage="" patients="" can="" have="" emotional="" abnormalities,="" gait,="" memory,="" disorientation,="" and="" even="" stroke="" and="" dementia="" and="" other="" serious="" consequences.="" up="" to="" 25%="" of="" stroke="" and="" 45%="" of="" dementia="" are="" caused="" by="" csvd(cannistraro="" et="" al,2019),="" which="" brings="" a="" heavy="" socioeconomic="" burden="" and="" is="" a="" major="" problem="" that="" needs="" to="" be="" addressed="" by="" slow="" disease="" and="" health="" strategies.="" scholar="" has="" used="" dynamic="" contrast="" enhanced-mri="" technique="" to="" find="" that="" blood-brain="" barrier(bbb)leakage="" is="" more="" prevalent="" in="" csvd="" patients(zhang="" et="" al,2017).="" extravasation="" of="" blood="" components="" may="" lead="" to="" local="" vascular="" changes="" and="" diffuse="" brain="" tissue="" damage.="" the="" bbb="" is="" a="" junction="" of="" endothelial="" cells,="" pericytes,="" and="" astrocyte="" tight="" junctions(keaney="" and="" campbell,="" 2015).in="" addition,="" more="" and="" more="" scholars="" also="" believe="" that="" endothelial="" dysfunction="" plays="" a="" key="" role="" in="" the="" early="" development="" of="" csvd="" (hainsworth="" et="" al,2015).="" therefore,="" protecting="" endothelial="" cells="" may="" be="" a="" potential="" therapeutic="" strategy="" for="">

kvertsetiinon flavonoid, mida leidub mitmetes taimedes, näiteks Polygonum cuspidatum Sieb. et Zuccil on tugev antioksüdantne ja põletikuvastane toime ning see võib avaldada kaitsvat toimet mitmesuguste patoloogiliste seisundite, sealhulgas südame-veresoonkonna haiguste, ainevahetushäirete, neurodegeneratiivsete haiguste, diabeedi, vähi ja rasvumise korral (Dok-Go et al, 2003; Comalada et al, 2005; Cho et al, 2006). Eeltöötlemine kvertsetiiniga suurendas märkimisväärselt endogeensete antioksüdantsete ensüümide ekspressioonitasemeid isheemiaga vigastatud loomade hipokampuse CA1 püramiidsetes neuronites, näidates tugevat antioksüdantset ja neuroprotektiivset toimet (Chen et al, 2017). Hiljutised uuringud on samuti leidnud, et kvertsetiinil on neuroprotektiivne toime isheemilise kahjustuse vastu, säilitades samal ajal BBB terviklikkuse (Jin et al, 2019). Selle mõju aju mikrovaskulaarsetele endoteelirakkudele (BMEC) hüpoksia ja reoksüdatsiooni (H / R) vigastuse korral on aga halvasti uuritud ning kvertsetiini sihtvalgust, mis kaitseb BMEC-e, ei ole teatatud.

Oma uuringus uurisime kvertsetiini kaitsvat toimet inimese aju mikrovaskulaarsetele endoteelirakkudele (HBMEC), mida kultuuris H / R vigastas. Samal ajal uurisime täiendavalt selle kaitsva toime võimalikku mehhanismi, et anda teoreetilisem alus kvertsetiini kliiniliseks edendamiseks ja pakkuda uusi ideid CSVD raviks.

MATERJALID JA MEETODID

Sööde, reaktiivid ja antikehad

kvertsetiin(purity>98 protsenti osteti ettevõttelt Best Biological Technology Co, Ltd (Chengdu, Hiina). HBMEC-id osteti ettevõttelt Qingqi Biotechnology Development Co., Ltd (Shanghai, Hiina). Veise loote seerum (FBS) saadi ettevõttest Biological Industries (Kibbutz Beit Haemek, Iisrael). Penitsilliin/streptomütsiin ja Dulbecco modifitseeritud kotka sööde (DMEM) osteti ettevõttest Hyclone (GA, Ameerika Ühendriigid). Mitokondriaalse membraani potentsiaali (JC-1) testikomplekt, BCA valgu testikomplekt, 2,7-dikloriidhüdrofluorestseiindiatsetaat (DCFH-DA) ja NP40 lüsaat osteti ettevõttelt Beyotime Biotechnology (Shanghai, Hiina). Fosfataasi preparaat ja täielik proteaasi inhibiitor osteti ettevõttelt Roche (Shanghai, Hiina). Apoptoosi komplekt osteti ettevõttelt BD Biosciences (Sparks, MD, Ameerika Ühendriigid). Malondialdehüüd (MDA), superoksiiddismutaas (SOD), rakkudevaheline rakkude adhesioonimolekul-1 (ICAM-1), veresoonte rakkude adhesioonimolekul-1 (VCAM{{10}} )ensüümiga seotud immunosorbentanalüüs (ELISA) oli (Cambridge, Abcam ostis ettevõtte dfrom1"一Ühendkuningriigist). Tuumafaktoriga E{13}seotud faktori 2 (Nrf2) vastased antikehad, Kelch Like ECH Associated Protein 1 (Keap1), Aktiveeriv transkriptsioonifaktor 6 (ATF6), glükoosiga reguleeritud valk 78 (GRP78), Zonula occludens 1 (ZO-1), Claudin-5, GAPDH osteti ettevõttest Cell Signaling Technology (Danvers, Ameerika Ühendriigid). Mädarõika peroksüdaasiga (HRP) konjugeeritud küülikuvastane IgG saadi firmalt Jackson (Pennsylvania, Ameerika Ühendriigid). SDS-PAGE kiirdoseerimiskomplekt ja ECL kromogeenne lahus osteti ettevõttelt EpiZyme Biotechnology (Shanghai, Hiina). Rakukultuuri ja vigastuste mudel HBMECs kultiveeriti DMEM-is, mis sisaldas 10 protsenti FBS-i ja 1 protsenti penitsilliini-streptomütsiini, 37 °C juures inkubaatoris 5 protsendi CO2-ga. Endoteli tekitamiseks rakukahjustuse korral töödeldi HBMEC-e 12-tunnise hüpoksiaga, millele järgnes 8-tunnine reoksüdeerimine, ja spetsiifilised protseduurid olid järgmised (Warpsinski et al., 2020): HBMEC-e inkubeeriti esmalt seerumivaba söötmega hüpoksiainkubaatoris (1 protsenti). 0,5% CO,94% N) 12 tundi ja seejärel vahetati sööde normaalseks söötmeks, mis sisaldas 10% FBS-i, samal ajal kui neid inkubeeriti normoksia inkubaatoris (95% O2,5% CO2) 8 tundi. Ravi kvertsetiiniga 2 mg kvertsetiini lahustati 331 µl DMSO-s, et moodustada põhilahus kontsentratsiooniga 1 mmol/L ja seda säilitati temperatuuril -20 kraadi. Töölahus lahjendati DMEM-ga kontsentratsioonini 0,1, 0,5, 1, 2, 5, 10 umol/l, milles DMSO protsent oli alla 0,1 protsendi. Kui rakud olid kleepunud, lisati seerumivaba söötmega kvertsetiin ja seejärel asetati plaadid hüpoksia inkubaatorisse. 12 tunni pärast rakud eemaldati, vahetati seerumi söötmega kvertsetiini vastu ja pandi 8 tunniks normoksia inkubaatorisse.

Rakkude elujõulisuse test

MõjudkvertsetiinHBMEC-de elujõulisust uuriti Cell Counting Kit-8 abil vastavalt kasutusjuhendile. Esmalt hinnati kvertsetiini ohutuid doose rakkudele endoteelirakkude kahjustuste puudumisel ning seejärel testiti selle kaitsvat toimet rakukahjustuse korral. Kõiki katsetulemusi korrati vähemalt kolm korda.

Kriimude paranemise ja torude moodustumise test Migratsioonikatsed viidi läbi raku kriimustusmeetodil. Enne kvertsetiiniga töötlemist tõmmati kultiveerimisplaadi põhja sirge risti joon ja pildistati seda 0 h salvestamiseks ning seejärel töödeldi rakke enne salvestamiseks fotode tegemist kvertsetiiniga ja modelleeriti. Eesmine ja tagumine ala vastandati kaks korda.

Raku angiogeenset võimet jäljendava toru moodustumist pandi Matrigel (9-12 mg/ml) kultiveerimisplaadi põhjale, seejärel kanti kvertsetiini ja modelleerimisega töödeldud rakud peale ning 8 tunni pärast tehti pildid. Veresoonte hargnevat põlvkonda analüüsiti ja võrreldi ImageJ abil.

Mitokondriaalse membraani potentsiaalide ja apoptoosi test

Rakkude apoptoosi tuvastamiseks kasutati mitokondriaalse membraani potentsiaali muutust ja apoptoosikomplekti. Mitokondriaalse membraani potentsiaali muutus tuvastati HBMEC-de värvimisega JC-1 fluorestsentssondiga. Lisati JC-1(1×) värvimislahus ja inkubeeriti 37 kraadises inkubaatoris 20 minutit, seejärel pesti kaks korda JC-1(1×) värvimispuhvriga ja lisati lõpuks igasse süvendisse PBS jaoks. . Seejärel kasutati analüüsiks suure sisaldusega rakukujutist.

HBMEC-id koguti 6-süvendi plaatidelt, tsentrifuugiti supernatandi eemaldamiseks, seejärel lisati 1 × anneksiin V sidumislahus rakkude puhumiseks ja segamiseks, seejärel lisati FITC anneksiin V värvaine, et inkubeerida pimedas toatemperatuuril 10 minutit. min, lisage propiidiumjodiidi (PI) värvimislahus 5 minutit enne masinat ja tuvastamiseks kasutati Beckmani voolutsütomeetrit.

ELISA

Pärast rakkude töötlemist H / R või kvertsetiiniga koguti supernatant. ICAM-1, VCAM-1, SOD ja MDA tuvastati ELSA komplektide abil vastavalt kasutusjuhendile.

Reaktiivsete hapnikuliikide (ROS) test ROS genereerimise võime tuvastati DCFH-DA sondiga, mida hinnati suure sisaldusega rakukujutise abil ja analüüsiti fluorestsentsi abil, kasutades ImageJ. Western Blotting

HBMEC-id koguti kultiveerimisplaatidelt, rakkudest valkude ekstraheerimiseks kasutati NP40 lüsaati lisavat fosfataasi preparaati ja täielikku proteaasi inhibiitorit. Määrati valgusisaldus ja immunoblotanalüüsi katseteks võeti 30 ug valku. Elektroforeesiks kasutati SDS-PAGE geeli, mis blokeeriti 5% rasvavaba kuiva piimaga pärast PVDF-membraanile 1-tunnist elektriülekannet toatemperatuuril. Seejärel anti-Nrf2(jänes, 1:1,000),anti-Keapl(jänes,1:1,000),anti-ATF6(jänes,1:1,000 ), anti-GRP78(jänes,1:1,000), anti-ZO-1(jänes,1:1,000), anti-Claudin-5( küüliku, 1:1, 000) antikehi inkubeeriti üleöö temperatuuril 4 °C. Pärast järgmise päeva pesemist lisati lahjendatud kitse küülikuvastased sekundaarsed antikehad (IgG HRP, 1:10, 000) ja inkubeeriti 1 tund. Lõpuks töötati tuvastamine välja pärast kolm korda TBST-s pesemist.

Proteoomiline analüüs

HBMEC-e töödeldi H/R-ga kvertsetiini juuresolekul (l umol/L). Seejärel kaabiti rakud rakukaabitsaga õrnalt kultiveerimisplaadilt, koguti krüoviaalidesse, paigutati kiiresti vedelasse lämmastikku ja säilitati seejärel -80 kraadi juures 5 minutit. Proteoomilise analüüsi tegemiseks kasutati iTRAQ tehnoloogiat. p-väärtusega valgud<0.05 and="" ratio="" multiple="" changes="">1.2 või<0.83 were="" defined="" as="" differentially="" expressed="">

Statistiline analüüs

Andmed sobitasid normaaljaotusega ja andmete väljendamiseks kasutati keskmist ± standardhälvet. Statistiliseks analüüsiks kasutati GraphPad Prism 8. Kahte sõltumatut proovi analüüsiti t-testiga ja mõõtmisandmeid kirjeldati keskmise ± standardhälbe (SD) abil. Rühmadevaheline võrdlus viidi läbi ühesuunalise dispersioonanalüüsi (ANOVA) abil. p-väärtus<0.05 indicated="" that="" the="" difference="" was="" statistically="">

TULEMUSED

Tulemused

Kvertsetiini mõju rakkude elujõulisusele

Et testida kvertsetiini mõju rakkude elujõulisusele, uurisime kõigepealt rakkudele ohutut kvertsetiini annust, nagu on näidatud joonisel 1A, mis ei mõjutanud rakkude elujõulisust 0.1-10 umol/L. . Järgmiseks näitasime efektiivse annuse otsimiseks endoteelirakkude kahjustuse põhjal, et kvertsetiin väärtusel 0.1-1 μmol/L võib soodustada rakkude elujõulisust H/R-HBMEC-des, nagu on näidatud joonisel. 1B. Järgnevad katsed viidi läbi selle kontsentratsioonivahemiku ümber. Väärib märkimist, et kui ravimi kontsentratsioon jõudis 10 μmol/L-ni, ilmnes tsütotoksilisus. Arvasime, et kui HBMEC-id H/R kahjustas, väheneb nende taluvus. Seega, kui ravimi kontsentratsioon oli veidi kõrgem, suurenes rakkude kahjustus. Seetõttu tekkis tsütotoksilisus, kui ravimi kontsentratsioon on 10 μmol/L.

Kvertsetiini mõju rakkude migratsioonile ja angiogeneesile

Et uurida kvertsetiini mõju endoteelirakkude migratsiooni- ja angiogeensusele, raviti HBMEC-e kvertsetiini manustamise ajal H / R-ga. Tegime rakkude migratsioonivõime testimiseks kriimustustesti, mis näitas, et H/R-ravi nõrgendas H/R-HBMEC-de migratsioonivõimet võrreldes kontrollrühmaga ja kvertsetiin võib kontsentratsioonis 0 oluliselt soodustada rakkude migratsiooni. .1-1 μmol/L. Tubulogeneesi kasutati in vitro angiogeneesi jäljendamiseks ja selle haru pikkus tähistab angiogeenset võimet. Tulemused näitasid, et H/R-ravi vähendas angiogeenset võimet, kuid kvertsetiin 0.1-1 μmol/L võib selle vigastuse tagasi pöörata, nagu on näidatud joonisel 2.

Kvertsetiini mõju rakkude apoptoosile

Et testida kvertsetiini potentsiaali inhibeerida endoteelirakkude apoptoosi, kasutasime hindamiseks mitokondriaalset membraanipotentsiaali ja apoptoosi. Kui rakud said vigastada apoptootiliste sündmuste tõttu, vähenes mitokondriaalse membraani potentsiaal, tsütoplasmaatiline punane fluorestsents vähenes oluliselt, roheline fluorestsents suurenes ja punane/roheline (R/G) võeti lõpuks kasutusele mitokondriaalse membraani potentsiaali muutumise tähistamiseks. väheneb, kui mitokondriaalse membraani potentsiaal on kahjustatud. Meie tulemused näitasid, et pärast H / R-ravi vähenes rakkude mitokondriaalse membraani potentsiaal, mida näitab suurenenud roheline fluorestsents. Kvertsetiini annuste suurenemisega suurenes punane fluorestsents pidevalt, mis näitab, et kvertsetiin võib annusest sõltuvalt suurendada mitokondriaalse membraani potentsiaali (joonis 3A, C). Lisaks kasutati raku apoptoosi otseseks uurimiseks voolutsütomeetriat. Tulemused näitasid, et HBMEC-idel oli pärast H/R-ravi kõrgem apoptoosi määr, samas kui kvertsetiinil oli 0.1-1 umol/L selge võime inhibeerida apoptoosi (joonis 3B, D).

Kvertsetiini mõju rakkude adhesioonile

Kui endoteelirakud on kahjustatud, tekivad mõned adhesioonimolekulid, nagu ICAM{0}} ja VCAM-1, mis adsorbeerivad mürgiseid aineid BBB-sse ja kahjustavad aju parenhüümi (Hauptmann et al, 2020). Et uurida kvertsetiini mõju H/R-HBMEC-de võimele toota adhesioonimolekule, mõõdeti ELISA abil ICAM-1 ja VCAM-1. Meie uuringus suurendas H/R ICAM-1 ja VCAM-1 taset, kuid kvertsetiini lisamine kontsentratsioonis 0.1-1 umol/L vähendas seda mõju (joonis). 4).

Kvertsetiin võib pärssida oksüdatiivset stressi

Kvertsetiin on tugeva antioksüdantse võimega flavonoid, seetõttu kasutasime ROS-i tuvastamiseks DCFH-DA sondi. Me jälgisime

suurenenud ROS-i teke H/R-ga kokkupuutunud HBMEC-des, mida vähendas märkimisväärselt kvertsetiinravi kontsentratsioonidel {{0}}.1-1 umol/L Samal ajal tuvastasime oksüdatiivse stressi taseme muutused. tooted SOD ja MDA ELISA-ga ning tulemused näitasid, et kvertsetiin kontsentratsioonis 0.1-1 μmol/L suutis vähendada SOD-d ja MDA-d, mida H/R tõstis, mis näitab, et kvertsetiin võib vähendada HBMEC-de kahjustus oksüdatiivse stressi tõttu (joonis 5).

Kvertsetiin võib reguleerida Keap1/Nrf2 ja ATF6/GRP78 valke

Kvertsetiini kaitsemehhanismi edasiseks uurimiseks HBMEC-del analüüsisime selle ekspressioonitasemeidoksüdatiivne stressja endoplasmaatilise retikulumi stressiga seotud valgud. Keap1 / Nrf2 reguleerib teadaolevalt antioksüdantseid vastuseid in vivo . Oksüdatiivne stressikahjustus sunnib endoteelirakke läbima stressireaktsiooni, mille tulemuseks on Keapl/Nrf2 taseme tõus (Warpsinski et al, 2020). Käesolevas uuringus aktiveeris H/R raku antioksüdantide vastuse mehhanismid ja tõusis Keapli ja Nrf2 tasemed, mida saab veelgi tugevdada kvertsetiiniga 0.5-1 umol/L, et suurendada HBMEC-de antioksüdantset võimet. .ATF6/GRP78 on üks radadest, mis reguleerivad endoplasmaatilise retikulumi (ER) homöostaasi. ER stress võib süvendada endoteelirakkude vigastusi (Nie et al, 2020). Meie uuringus aktiveeris ER stressi H/R ning ATF6 ja GRP78 tasemed tõusid. Kvertsetiin l umol/L juures suutis märkimisväärselt vähendada mõlema valgu taset, inhibeerida ER stressi ja kaitsta HBMEC-e H/R vigastuste eest (joonis 6).

Kvertsetiin võib säilitada BBB terviklikkuse

BMEC-id on BBB struktuuri selgroog ja nende surm või apoptoos pärast H/R vigastust mõjutab BBB terviklikkust ja funktsionaalsust (Ding et al, 2019). Selles artiklis kajastati endoteelirakkude funktsiooni ekspressiooni muutuste tuvastamises. BBB-ga seotud valkude ZO-1 ja Claudin-5. Võrreldes kontrollrühmaga oli ZO-1 ja Claudin-5 avaldis

H/R vigastuste vähenemine, mis näitab, et BBB oli kahjustatud ja kvertsetiin võib selle kahjustuse tagasi pöörata kontsentratsioonidel 0.5-1 μmol/L, mis näitab, et kvertsetiin suudab säilitada endoteelirakkude funktsiooni (Joonis 7).

Proteoomiline analüüs

H/R-i vigastatud HBMEC-de diferentsiaalsete ekspressioonivalkude (DEP-de) leidmiseks kvertsetiini juuresolekul või mitte, kasutati proteoomika analüüsi läbiviimiseks ITRAO-d. Valgud, mis näitavad ap<0.05 and="" a="" ratio="" fold="" change="">1.2 või<0.83 were="" defined="" as="" deps.="" in="" our="" study,="" the="" differences="" in="" protein="" among="" the="" control,="" h/r,="" and="" quercetin="" groups="" were="" compared.="" the="" results="" showed="" that="" 172="" proteins="" were="" identified="" as="" deps="" between="" the="" control="" and="" h/r="" groups,="" among="" which="" 94="" were="" upregulated="" and="" 78="" were="" downregulated="" in="" the="" h/r="" group.="" there="" were="" 1,016="" proteins="" identified="" as="" deps="" between="" the="" h/r="" group="" and="" the="" quercetin="" group,="" of="" which="" 553="" were="" up-regulated="" and="" 463="" were="" down-regulated="" in="" the="" quercetin="" group,="" as="" shown="" in="" figure="" 8a.="" between="" control="" vs="" h/r="" and="" h/r="" vs="" quercetin="" group,56="" of="" the="" same="" deps="" were="" shared="" between="" the="" two="" groups.="" the="" expressions="" of="" these="" deps="" were="" analyzed="" by="" hierarchical="" clustering="" as="" shown="" in="" figure="" 8b.="" among="" these="" deps,="" the="" top="" 20="" were="" shown="" in="" table="" among="" these="" 20="" commons,="" insulin="" receptor-related="" protein="" (insrr),="" dual-specificity="" protein="" phosphatase="" 3="" (dusp3),="" annexin="" a2(anxa2),="" hemoglobin="" subunit="" alpha="" (hba1),="" phosphoglycerate="" kinase="" 1="" (pgk1),="" vitronectin="" (vtn),="" glucose-6-phosphate="" isomerase="" (gpi)="" are="" related="" to="" endothelial="">

ARUTELU

CSVD kui suurenev meditsiiniline ja sotsiaalmajanduslik koormus on kiiresti tähelepanu äratanud. Kuid üllataval kombel jääb CSVD patogenees praegu ebaselgeks, mis ei muuda ka selle ravimiseks selget skeemi. Arvestades, et CSVD hilisemad staadiumid võivad areneda raskete tagajärgedeni, nagu insult ja dementsus, võib ravi varajastele kahjustustele suunamine tõhusalt edasi lükata CSVD progresseerumist (Cannistraro et al, 2019). On näidatud, et CSVD varajased patoloogilised muutused seisnevad endoteelirakkude düsfunktsioonis ja selle düsfunktsiooni stabiliseerivad ravimid võivad parandada aju valgeaine haavatavust CSVD kahjustuste korral (Rajani et al, 2018). Arvestades endoteelirakkude rolli CSVD-s, otsustasime HBMEC-de abil uurida traditsioonilise hiina meditsiini kaitsvat toimet endoteelirakkudele.

Kvertsetiin on flavonoid, mida leidub erinevates taimedes (Nawrot-Hadzik et al, 2019). Sellel on tugev antioksüdantne ja põletikuvastane toime ning see võib avaldada kaitsvat toimet mitmesuguste patoloogiliste seisundite korral. Selles uuringus näitasime, et kvertsetiin võib leevendada H / R vigastusi ja mitmed katseandmed kinnitavad meie järeldust, et kvertsetiin võib soodustada rakkude elujõulisust, rakkude migratsiooni, angiogeneesi, suurendada mitokondriaalse membraani potentsiaali ja pärssida apoptoosi.

Arvestades, et kvertsetiinil on tugev antioksüdantne toime, uurisime mehhanismi, mille abil kvertsetiin kaitseb HBMEC-e antioksüdatsiooni seisukohalt. ROS-i taset võib märkimisväärselt tõsta oksüdatiivne stress (Wu et al., 2018) ja ROS-i kuhjumine võib põhjustada paljusid haigusi, sealhulgas südame-veresoonkonna haigusi, endoteeli düsfunktsiooni ja vananemisega seotud haigusi ning neurodegeneratiivseid haigusi (Chen et al., 2015; Jakaria jt, 2018; Santos jt, 2018). Veelgi enam, lipiidide peroksüdatsioonil tekib oksüdatiivne stress, mis toodab MDA-d, mis hävitab organismi oksüdatiivse antioksüdantide tasakaalu ja suurendab endoteelirakkude kahjustusi (Yang et al, 2021).

Keapl / Nrf2 peetakse praegu kõige olulisemaks enese-antioksüdatiivse stressi rajaks ja selle raja aktiveerimine võib oluliselt parandada endoteelirakkude düsfunktsiooni. Eelkõige aitab ROS edendada Nrf2 signaaliraja aktiveerimist (Selimoglu-Buet et al, 2017). Oleme näidanud, et kvertsetiin võib vähendada ROS-i ja MDA teket, suurendades samal ajal Keapl ja Nrf2 valgu ekspressiooni, mis viitab sellele, et kvertsetiin võib nõrgendada endoteelirakkude kahjustusi, vähendades oksüdatiivset stressivastust Keapl / Nrf2 signaaliraja aktiveerimise kaudu.

Mitte ainult see, et püsiv ER-stress aktiveerib voltimata valguvastuse ja muudab antioksüdantsete geenide ekspressiooni, mis viib endoteelirakkude apoptoosini (Tang et al, 2019). Lisaks võib oksüdatiivne stress põhjustada ka valgu voltimise häireid ER-s, provotseerida ER stressi ja süvendada endoteelirakkude vigastusi (Hetz, 2012). ER stressi saab aktiveerida kolmel viisil: PKR-sarnane ER kinaas (PERK), inositool, mis vajab ensüümi 1 (IRE1) ja aktiveeriv ATF-6, mis kaitsevad rakke ER stressi eest homöostaatilistes tingimustes (Hetz et al. ,2020). Kuid väliste kahjulike stiimulite mõjul aktiveerivad need kolm rada ER-i stressireaktsiooni ja kutsuvad esile raku apoptoosi. Lisaks on uuringud näidanud, et ER-i stressivastuse pärssimine võib muuta H/R-indutseeritud endoteelirakkude düsfunktsiooni (Chen et al, 2020). Meie uuringus võib kvertsetiin vähendada H/R-i põhjustatud suurenenud ATF6/GRP78 sisaldust, inhibeerida. endoplasmaatilise retikulumi stressireaktsiooni ja kaitsta endoteelirakke.

BBB peamise komponendina hõlmavad endoteelirakkude funktsioonid nende terviklikkuse säilitamist. BBB düsfunktsioon põhjustab vedelike, valkude ja muude plasmakomponentide lekkimist perivaskulaarsetesse kudedesse, kahjustades veelgi aju vasodilatatsiooni ja toitainete transporti (Wardlaw et al, 2019). Kui endoteelirakud on kahjustatud ja BBB terviklikkus hävib, võib endoteelirakkude kaitsmine veelgi säilitada BBB terviklikkust. Claudin-5 ekspresseerub kõrgelt BMEC-des ja on seotud reguleerimiseks vajalike tihedate ühendusahelate selgroo moodustamisega. BBB läbilaskvus (Yang et al, 2020). Endoteelirakud ankurdatakse aktiini tsütoskeleti külge karkassvalkude, nagu ZO-1, abil, luues endoteelirakkude vahel tihedad ühendused, mis säilitavad BBB tiheduse (Zhang et al, 2020). Meie uuringus kasutati BBB terviklikkuse tähistamiseks väljendeid claudin-5 ja ZO-1. Meie tulemused näitasid, et Claudiini-5 ja ZO-1 valgu tase langes H/R-vigastuse saanud HBMEC-des, mis näitab, et BBB terviklikkus oli häiritud ja kvertsetiin võib seda vigastust vähendada, suurendades claudiini{{ 9}} ja ZO 1 valgu taset.

Lisaks märgistati kvertsetiini potentsiaalsete sihtmärkide leidmiseks HBMEC-del i-TRAQ rakkudesse. Pärast proteoomilist analüüsi uuriti 20 levinumat erinevalt ekspresseeritud valku. Nende hulgas on INSRR, DUSP3,

ANXA2, HBA1, PGK1, VTN, GPI on seotud endoteelirakkudega. INSRR-i peetakse kasvaja endoteeli markeriks ja selle üleekspressioon võib soodustada angiogeneesi (Nowak-Sliwinska et al, 2019). Rekombinantne ANXA2 võib vähendada endoteeli läbilaskvust hüpoksiliste ja põletikuliste tegurite kahjustuse seisundites, mis näitab, et ANXA2 võib olla seotud endoteelirakkude tiheduse säilitamisega (Li et al, 2019). Inimese emakakaela lõikude värvimisel leiti DUSP3 tugev ekspressioon endoteelirakkudes ning katsed näitasid ka, et DUSP3 on vajalik põhilise fibroblastide kasvufaktori poolt indutseeritud mikrovaskulaarse kasvu jaoks (Amand et al. 2014). On näidatud, et HBAl ekspressioon endoteelirakkudes kontrollib veresoonte toonust ja funktsiooni (Sangwung et al., 2017). Arvatakse, et PGK1 vähendab ka aterogeneesi (Zhang et al, 2020). Veelgi enam, VTN-i peetakse vaskulaarse vigastuse korral trombide tekkeks kriitiliseks (Bowley et al, 2017). GPI on rikastatud reumatoidartriidiga patsientide sünoviaalkoe mikrovaskulaarsetes endoteelirakkudes hüpoksilises keskkonnas ja reguleerib vaskulaarse endoteeli kasvufaktori sekretsiooni reumatoidartriidi sünoviaalsetest fibroblastidest, et kutsuda esile angiogeneesi (Lu et al, 2017). Lisaks uuritakse Varikotseeli poolt vahendatud viljatusega seotud ekspresseeritud valgud näitasid, et Nrf2 oli ANXA2 ülesvoolu regulaator (Panner Selvam et al, 2021). PGK1 inhibeerimine võib aktiveerida Keapl / Nrf2 rada ja stimuleerida raku kaitsvat antioksüdantset vastust (Bollong et al, 2018). Need kaks valku võivad olla kvertsetiini potentsiaalsed sihtmärgid Keapl/Nrf2 raja kaudu. Edasised uuringud võivad kontrollida nende valkude rolli kvertsetiini mõjul H / R-HBMEC-dele.

Tõsi, kvertsetiin võib avaldada endoteelirakkudele kaitsvat toimet. Kuid konkreetsed tegevuse eesmärgid nõuavad veel täiendavat uurimist ja see, kas on täiendavaid tegevusviise, jääb teadmata.

Kokkuvõttes näitas see uuring, et kvertsetiin säilitas hematoentsefaalbarjääri terviklikkuse, kaitstes endoteelirakke. Molekulaarsel tasandil võib kvertsetiin mängida rolli endoteelirakkude kaitsmisel, kaitstes oksüdatiivse stressi eest Keapl/Nrf2 raja kaudu ja pärssides endoplasmaatilise retikulumi stressi ATF6/GRP78 raja kaudu. See uuring paneb aluse TCM-ile CSVD raviks, kaitstes endoteelirakke.